Роль описторхоза в нарушении апоптоза эозинофилов и клинико-эпидемиологические особенности бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном очаге opisthorchis felineus

На правах рукописи

ДЕЕВ Иван Анатольевич

РОЛЬ ОПИСТОРХОЗА В НАРУШЕНИИ АПОПТОЗА ЭОЗИНОФИЛОВ И КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ В ГИПЕРЭНДЕМИЧНОМ ОЧАГЕ Opisthorchis felineus

14.01.08 – педиатрия

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск – 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН	Огородова Людмила Михайловна
доктор медицинских наук	Петровский Фёдор Игоревич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор	Новик Геннадий Айзикович
доктор медицинских наук, профессор	Козлова Людмила Вячеславовна
доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН	Балаболкин Иван Иванович
Ведущая организация: ФГБУ ГНЦ РФ Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства

Защита состоится «18» октября 2011 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 001.023.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центра здоровья детей РАМН по адресу: 119296, Москва, Ломоносовский проспект, 2/62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждении Российской академии медицинских наук Научного центра здоровья детей РАМН по адресу: 119296, Москва, Ломоносовский проспект, 2/62.

Автореферат разослан « »___________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.м.н. Тимофеева А.Г

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы данные официальной статистики, представляемые органами управления здравоохранения разных стран, свидетельствуют о росте распространённости аллергических болезней, в том числе и бронхиальной астмы (БА), как во взрослой, так и в детской популяциях [Биличенко Т.Н., 1997; Научно-практическая программа. Бронхиальная астма у детей, 2004; Баранов А.А., 2011]. Однако, увеличение доли пациентов, страдающих БА, по данным официальных медицинских отчётов, может быть объяснено разными факторами. Так, например, рост распространённости болезни в популяции был зарегистрирован после внедрения в реальную клиническую практику международных регламентирующих документов по диагностике и лечению астмы, появления медицинских стандартов ведения таких больных, реализации образовательных программ для пациентов.

Результаты крупных стандартизированных (International Study of Asthma and Allergy in Childhood - ISAAC) эпидемиологических исследований относительно распространённости астмы в детской популяции, проведённых в 53 странах мира с интервалом в 5 лет и более, не подтверждают данных официальной статистики о росте распространённости БА в целом в популяции, хотя в некоторых регионах (отдельные города и населённые пункты Англии, Германии, США, России и др.) такая тенденция была обозначена исследователями [Neil Pearce, 2004; Мачарадзе Д.Ш., 2005; Намазова-Бакранова Л.С., 2009].

В этой связи сегодня актуальным является обсуждение вопроса относительно влияния на распространённость астмы и аллергии социально-экономических условий, а также многочисленных внешнесредовых факторов. Согласно данным отдельных эпидемиологических исследований, в течение последних десяти лет значительный рост распространённости аллергических болезней отмечается в развитых странах, в то же время уровень аллергопатологии в развивающихся регионах остается на прежнем уровне [Romagnani S., 2004; Yazdanbakhsh M., 2004; Savelkoul H.F., 2006]. Такие данные могут быть объяснены с позиции «гигиенической гипотезы», т. е. являются обусловленными различным уровнем жизни людей, когда экспозиция аллергенов, особенности питания и наличие гельминтной инфекции могут модифицировать риск развития аллергии [Strachan D.P., 1989].

Некоторыми исследователями показано, что от различных внешнесредовых факторов, например, гельминтной инвазии, зависит не только распространённость астмы в популяции, но и выраженность клинических проявлений болезни [van den Biggelaar AH et al., 2000; Flohr et al., 2010]. По всей видимости, это может быть обусловлено модулирующим влиянием гельминтов на иммунную систему человека [van Riet E et al., 2007; Yang J et al., 2007; Wilson MS et al., 2010; Flohr et al., 2010]. Данные экспериментальных исследований демонстрируют обратную взаимосвязь наличия длительной гельминтной инвазии и активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА [Hartmann S et al., 2009; Zepeda N, at al., 2010].

В настоящее время известно, что ключевую роль в патогенезе БА играет персистирующее воспаление респираторного тракта, следствием которого являются типичные симптомы болезни – приступы экспираторного удушья, одышка, кашель, а выраженность и частота вышеуказанных симптомов рассматриваются как основные критерии при оценке степени тяжести заболевания [GINA, 2009]. Говоря о персистирующем атопическом воспалении респираторного тракта, как о ключевом понятии в патогенезе астмы, нельзя не отметить роль апоптоза в формировании и поддержании воспалительного процесса.

Накопление эозинофилов в очагах воспаления зависит от ряда факторов, таких как селективная адгезия и миграция, а также повышение жизнеспособности в ответ на воздействие факторов роста (ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-6). Внутриклеточные медиаторы, высвобождаемые эозинофилами при БА, как известно, обладают гистотоксическим эффектом, вызывая повреждение тканей и воспаление дыхательных путей. Для ограничения этого повреждающего действия в нормальных условиях эозинофилы элиминируются путём апоптоза [Lamb, J.P. at al., 2005; Walsh GM at al., 2005]. Однако, отмечено, что при БА эти клетки гибнут преимущественно по некротическому пути (супрессия апоптоза), высвобождая медиаторы воспаления и провоспалительные цитокины.

В связи с этим, апоптотическая гибель эозинофилов рассматривается как важный механизм ограничения воспалительного процесса. Сегодня мы располагаем собственными данными (n=100, возраст 11,3±0,71 лет, проспективное исследование) относительно особенностей регуляции системы апоптоза эозинофилов при астме у детей. Установлено, что степень апоптоза эозинофилов у пациентов, страдающих БА, ассоциирована с клиническими проявлениями болезни, функциональными параметрами и показателями, отражающими степень воспалительной активности дыхательных путей [Огородова Л.М. с соавт., 2005].

Результаты проведённых нами исследований свидетельствуют, что при астме у детей апоптотическая активность эозинофилов снижена за счёт высокой экспрессии антиапоптотических эффекторов (bcl-2, bcl-xL, bcl-w, ИЛ-5) и конституитивно низкой активности мРНК проапоптотических факторов (bах, bcl-xS, bak, p53), что обусловливает увеличение клеток, гибнущих по некротическому пути, а, следовательно, приводит к поддержанию воспалительной активности в дыхательных путях за счёт гистотоксического эффекта, оказываемого провоспалительными медиаторами эозинофилов [Zhai D. At al., 2003; Огородова Л.М. с соавт., 2005]. При этом назначение противовоспалительной терапии БА ассоциировано не только с восстановлением клинических и функциональных параметров болезни, но и увеличением апоптотической активности эозинофилов [Сазонов А.Э. с соавт., 2006].

На сегодняшний день опубликовано достаточное количество данных относительно влияния гельминтной инвазии на степень апоптотической активности иммунокомпетентных клеток, в том числе эозинофилов и мононуклеаров периферической крови. Многие исследователи полагают, что это защитный механизм, реализуемый глистами для собственной «маскировки» от иммунной системы хозяина (человека) [Zepeda N et al., 2010]. Так, в некоторых исследованиях показано, что инвазия ленточного червя Taenia crassiceps ассоциирована с увеличением апоптотической активности эозинофилов периферической крови человека [Copitin N. et al., 2010]. Подобные эффекты описаны Solano S at al. (2010), Tato P et al. (2010) у животных in vivo и in vitro (кровь животных и человека), при этом авторы предполагают, что активация каспазного каскада в клетках иммунной системы обусловлена экскреторно-секреторными продуктами гельминта (ЭСП – продукты жизнедеятельности).

Другие исследователи описывают эффект, индуцирующий апоптоз, при инвазии лёгочного сосальщика Paragonimus westermani [Shin MH, 2000; Min DY et al., 2004]. Установлено, что регуляция апоптотической активности при данном гельминтозе, прежде всего, связана с активацией каспазы-3 ЭСП и снижением экспрессии ИЛ-5, ИЛ-3 и ГМКСФ, при этом авторы приводят данные об отсутствии зависимости степени апоптоза эозинофилов периферической крови человека от фазы инфекции и количества особей гельминта.

Усиление апоптоза эозинофилов и нейтрофилов описано при шистосоматозе (Schistosomes). Исследователи указывают на два возможных механизма увеличения апоптотической активности – активация каспазного каскада в клетке (каспаза 3) и взаимодействие ЭСП гельминта с FAS – рецептором [Jenkins SJ et al., 2005]. Подобные исследования проведены для Fasciola hepatica, Trichinella spiralis, Ascaris, Filarial, Heligmosomoides polygyrus (нематоды), при этом, результаты, представленные авторами относительно активации апоптоза иммунокомпетентных клеток (эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты), являются сопоставимыми [Matsumoto K. At al., 2007; Muoz-Guzmn M.A. at al., 2010; Park H.K. at al., 2011].

Помимо приведённых данных относительно влияния гельминтной инвазии на механизмы регуляции апоптотической активности иммунокомпетентных клеток, в специализированной медицинской литературе есть информация, свидетельствующая о модифицирующем влиянии гельминтозов на уровень провоспалительных маркеров (ИЛ-5, ИЛ-4) и клинические параметры, отражающие активность воспаления дыхательных путей при астме [Огородова Л.М. с соавт., 2002]. Так, в исследовании, опубликованном Евдокимовой Т.А. с соавт., 2002 (n=150, возраст от 6 до 16 лет) показано, что при БА, сочетанной с описторхозной инвазией, пациенты имеют меньшую степень гиперреактивности дыхательных путей, большие значения ОФВ1 и ПСВ в сравнении с неинфицированными детьми, страдающими астмой. При этом в случае сопутствующего паразитоза отмечены достоверно низкие значения ИЛ-5 и ИЛ-4 в периферической крови пациентов, меньшее количество эозинофилов назального секрета и индуцированной мокроты в сравнении с детьми без гельминтной инвазии. Проведение дегельминтизации (через 4 недели наблюдения) было ассоциировано с увеличением реактивности бронхов к метахолину и повышением уровня провоспалительных цитокинов в периферической крови пациентов.

Исследования, опубликованные Flohr et al. (2010), также свидетельствуют о снижении уровня провоспалительных цитокинов при различных аллергических болезнях в хроническую фазу гельминтной инвазии, а также об увеличении активности апоптоза Т-клеток, экспрессии ИЛ-10 и ИЛ-2. По всей видимости, заражение человека гельминтами может рассматриваться как фактор, предотвращающий прогрессирование воспаления при атопической БА.

Таким образом, приведённые данные свидетельствуют, что гельминты вносят существенный вклад как в распространённость астмы в популяции, так и в особенности клинического течения болезни (модулируют воспалительную активность в дыхательных путях). Учитывая тот факт, что Западная Сибирь является гиперэндемичным очагом описторхоза, а поражённость местного населения данным гельминтом на отдельных территориях достигает 44-97%, изучение роли гельминтных инвазий в механизмах регуляции воспаления при БА у детей является актуальной задачей в гиперэндемичных по распространенности гельминтозов регионах [Балашева И.И., с соавт., 1990; Бронштейн А.М. с соавт., 2004; Огородова Л.М. с соавт., 2009; Колчанов Н.А., 2010]. Изучение эпидемиологической характеристики механизмов регуляции апоптоза эозинофилов в популяции детей, больных БА, и здоровых пациентов в зависимости от гельминтной инвазии позволит сформулировать новые положения гигиенической гипотезы и представит возможность идентификации молекулярных мишеней для разработки методов первичной профилактики астмы у детей, проживающих в гиперэндемичных регионах по О. felineus.

Цель: установить особенности регуляции апоптоза эозинофилов при хроническом описторхозе как механизма, определяющего клинико-эпидемиологическую характеристику бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном очаге О. felineus.

Задачи:

1. Оценить уровень заболеваемости хроническим описторхозом и распространённость гельминтной инвазии О. felineus в детской популяции Томской области в зависимости от района проживания детей.
2. Изучить уровень заболеваемости и клинические особенности течения бронхиальной астмы, сочетанной с инвазией О. felineus, и без гельминтоза в детской популяции по данным регистра больных астмой и программы мониторинговой диспансеризации детей Томской области «ДИСПАН».
3. Оценить продукцию цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИФН- ), а также уровень мРНК супрессоров (bcl-2, bcl-xL, ИЛ-5) и агонистов (bах, bcl-xS, p53) апоптоза эозинофилов у здоровых, при бронхиальной астме сочетанной с инвазией О. felineus и без неё в популяции детей г. Томска и Томской области.
4. Изучить активность каспазы - 3 в эозинофилах периферической крови у детей, больных бронхиальной астмой, инфицированных О. felineus и без гельминтной инвазии; сопоставить полученные результаты с аналогичными параметрами в группе здоровых детей.
5. Установить вклад описторхоза в механизмы регуляции апоптоза эозинофилов периферической крови у детей, страдающих бронхиальной астмой, сопоставить полученные результаты с аналогичными параметрами в группе здоровых детей.
6. Провести сравнительный анализ клинико-функциональных параметров бронхиальной астмы у детей, проживающих в регионе с высокой и низкой распространенностью описторхозной инвазии, и изучить ассоциацию этих параметров с показателями апоптоза в группах детей с наличием или отсутствием инвазии О. felineus.
7. Изучить эффективность используемой фармакотерапии бронхиальной астмы у детей в популяции с низкой и высокой распространённостью О. felineus и сопоставить полученные данные с показателями апоптотической активности эозинофилов (как маркёра воспалительной активности).

Научная новизна. Впервые в российской клинической практике выполнено клинико-эпидемиологическое исследование бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном регионе по О. felineus. Впервые с целью верификации наличия инвазии О. felineus применен ПЦР – анализ (полимеразная цепная реакция), установлено, что распространенность гельминтоза, вызываемого О. felineus, в детской популяции в Томской области составляет 27,68%. Впервые на основании данных ПЦР – анализа проведено разделение районов Томской области на эндемичные и гиперэндемичные территории по уровню распространённости инвазии О. felineus.

Приоритетными являются данные о клинико-эпидемиологической характеристике бронхиальной астмы у детей в гиперэндемичном очаге О. felineus. Впервые проведён анализ заболеваемости бронхиальной астмой в детской популяции Томской области (n=143853, возраст от 0 до 17 лет) в зависимости от уровня распространённости инвазии О. felineus. Установлено, что данный показатель значимо различался в эндемичных и гиперэндемичных районах, при этом заболеваемость астмой была ниже в территориях, имеющих высокие показатели распространённости О. felineus (эндемичные районы – 90,95 на 1000 населения соответствующего возраста, гиперэндемичные районы – 57,15 на 1000; p<0,001).

Впервые показано, что пациенты, страдающие бронхиальной астмой, сочетанной с хроническим описторхозом, имеют меньшую степень неспецифической реактивности дыхательных путей, а также низкую интенсивность кожной реакции при проведении кожных аллергопроб (prick-тест) в сравнении с детьми, больными изолированной астмой.

Новыми являются данные об особенностях цитокинового профиля у детей, страдающих астмой в зависимости от наличия инвазии О. felineus. Установлено, что хронический описторхоз сопряжён с низким уровнем провоспалительных цитокинов Th2 – профиля (ИЛ-4, ИЛ-5) и высоким содержанием ИЛ-2 и ИЛ-10. Впервые представлены данные (полученные на репрезентативной выборке) свидетельствующие об угнетении Тh2 – варианта иммунного ответа у детей, больных астмой, сочетанной с хроническим описторхозом, что ассоциировано с низкой активностью воспаления у таких больных (низкая неспецифическая реактивность дыхательных путей, низкая интенсивность кожной реакции при проведении prick - тестирования).

Впервые проведен анализ апоптотической активности эозинофилов при бронхиальной астме у детей на фоне сопутствующей хронической инвазии О. felineus. Установлено, что изолированная астма характеризуется высоким уровнем мРНК антиапоптотических (ИЛ-5, bcl-2) и конститутивно низкой экспрессией мРНК проапоптотических модуляторов апоптоза (bax, bcl-xS, p53), что сопряжено с массивной гибелью эозинофилов по некротисческому пути, и как следствие этого, с гистотоксическим влиянием медиаторов, выделямых эффекторными клетками воспаления. В случае наличия сочетанной патологии (БА + хронический описторхоз) содержание мРНК антиапоптотичсеких эффекторов (ИЛ-5, bcl-2) резко снижено и сопоставимо с аналогичными параметрами в группе контроля, что свидетельствует о значимом протективном влиянии хронической инвазии О. felineus на регуляцию воспаления при астме у детей.

Получены новые данные об активности ключевого фермента, запускающего каспазный каскад – каспаза-3 при астме, сочетанной с хронической инвазией О. felineus. Важное теоретическое значение имеют экспериментальные данные, демонстрирующие, что наличие хронического описторхоза при бронхиальной астме сопряжено с увеличением активности каспазы-3 в эозинофилах периферической крови в сравнении с пациентами, страдающими изолированной астмой, что свидетельствует о восстановлении механизмов регуляции программируемой клеточной гибели эффекторных клеток на фоне гельминтной инвазии. Впервые сопоставлены данные, характеризующие степень акивности апоптоза эозинофилов с клиническими параметрами болезни у детей, страдающих бронхиальной астмой в зависимости от наличия хронической инвазии О. felineus. Установлено, что активность каспазы-3 и уровень мРНК антиапоптотических эффекторов обратнопропорциональны степени реактивности дыхательных путей, и как следствие этого, степени активности воспаления при астме.

Полученные данные корреспондируют с результатами некоторых зарубежных исследований, проведённых в популяциях пациентов, страдающих астмой в сочетании с другими трематодозами, что подчёркивает научную ценность и воспроизводимость полученных в рамках нашего исследования результатов.

Практическая значимость. Полученные данные об особенностях эпидемиологической характеристики бронхиальной астмы в детской популяции в Томской области (в очаге, эндемичном по О. felineus) могут быть рекомендованы к использованию при планировании эпидемиологических исследований в аналогичных территориях (эндемичность по гельминтной инвазии). Также представленные в работе результаты, касающиеся особенностей заболеваемости астмой у детей в эндемичном очаге гельминтоза, должны учитываться при исследовании влияния внешнесредовых факторов риска и планировании диагностических и лечебных мероприятий органами управления здравоохранением.

Полученные данные относительно особенностей клинической характеристики астмы у детей на фоне хронического гельминтоза (низкий уровень неспецифической реактивности дыхательных путей, низкая интенсивность реакции при кожном аллергологическом тестировании) должны учитываться в реальной клинической практике при диагностике астмы в случае наличия инвазии О. felineus у детей.

Установленные механизмы регуляции программируемой клеточной гибели эозинофилов при астме в зависимости от наличия гельминтной инвазии позволяют предположить, что дегельминтизация может привести к увеличению активности аллергического воспаления в дыхательных путях, повышению уровня реактивности дыхательных путей, что требует изменения протоколов ведения таких пациентов, дополнительного мониторинга контроля бронхиальной астмы, изменения объёма противовоспалительной терапии.

Установленные особенности регуляции апоптоза эозинофилов у детей, страдающих бронхиальной астмой, сочетанной с гельминтной инвазией (низкий уровень провоспалительных цитокинов, сниженная экспрессия мРНК антиапоптотических эффекторов, высокая активность каспазы-3) и ассоциированные с апоптотической активностью клинические параметры астмы, характеризующие активность воспаления (низкая степень неспецифической реактивности дыхательных путей и интенсивность реакции при проведении кожного аллерготестирования) могут быть использованы как теоретические знания для разработки новых фармакологических стратегий лечения и профилактики бронхиальной астмы и других аллергических болезней у детей.

Используемые в работе методы (ПЦР – диагностика О. felineus, оценка уровня мРНК антиапоптотических и проапоптотических эффекторов, определение активности каспазы-3) могут быть рекомендованы для применения в реальной клинической практике с целью верификации инвазии О. felineus, а также для детекции активности воспаления при бронхиальной астме у детей.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на XIII Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», (г. Томск, 2009 г.), XIV Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», (г. Москва, 2010 г.), XVI Конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», (г. Москва, 2011 г.), X Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2009 г.), на XII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2011 г.), на проблемной комиссии по педиатрии, на заседаниях кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета СибГМУ (г. Томск, 2009 - 2011 г.г.).

Внедрение полученных результатов. Полученные результаты используются в работе Областного детского центра клинической иммунологии и аллергологии (ОГУЗ «Областная детская больница», г. Томск), отделении клинической иммунологии и аллергологии МЛПУ №4 г. Новокузнецка. Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета для студентов педиатрического, лечебного, медико-биологического факультетов, на кафедре общей врачебной практики ФПК и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, кафедре фармакологии, клинической фармакологии с курсом аллергологии и клинической иммунологии ГОУ ВПО ХМАО-Югры «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», на кафедре педиатрии медицинского института ГОУ ВПО ХМАО-Югры «СурГУ».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы, включая 20 статей в журналах, реферируемых ВАК РФ, 1 из которых опубликована в зарубежном журнале, цитируемом в базе данных Web of Science. Издана 1 монография, 5 клинических рекомендаций для педиатров «Аллергология и иммунология», 1 учебное пособие, рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по специальности 040200 - педиатрия.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 248 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и 21 таблицей. Список источников цитируемой литературы включает 337 работ, из которых 53 отечественных и 284 зарубежных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с целью и поставленными задачами спланировано комплексное исследование, которое проведено в три этапа (рис. 1). Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, г. Томск), Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (ЦНИЛ, г. Томск), Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (УРАН ИЦиГ СО РАН, Новосибирск), общеобразовательных средних школ и муниципальных учреждений здравоохранения г. Томска и Томской области (с. Александровское, г. Асино, с. Бакчар, с. Каргасок, г. Колпашево, с. Парабель, с. Тегульдет, с. Первомайское, с. Молчаново, с. Зырянское, с. Мельниково, с. Кожевниково, с. Кривошеино, с. Подгорное), а также Областного государственного учреждения здравоохранения «Областная детская больница» (ОГУЗ «ОДБ», г. Томск). Данное исследование спланировано по требованиям ГОСТ Р 52379-2005 и проведено в соответствии с протоколом, утверждённым на заседании независимого локального комитета по этике при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (выписка № 374 от 15.05.2008 года). Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ «Механизмы регуляции активности каспазы-3 при бронхиальной астме и описторхозе у детей», № 09-04-99121-р_офи (Региональные конкурсы ориентированных фундаментальных исследований).

Объем выборок для каждого этапа комплексного исследования определялся с учетом предварительных эпидемиологических данных о распространенности астмы, уровня инвазии О. felineus и показателях охвата диспансерным наблюдением детей г. Томска и Томской области.

1. Статистическое исследование заболеваемости БА сочетанной с инвазией О. felineus по данным программы мониторинговой диспансеризации детей Томской области

Для определения частоты встречаемости астмы и описторхоза (О. felineus), а также сочетанной патологии в популяции детей Томской области (n=143853; возраст от 0 до 17 лет; данные по состоянию на 25 декабря 2008 года) использована деперсонифицированная база данных программного продукта ДИСПАН (Программа мониторинговой диспансеризации детей Томской области «ДИСПАН»). Программа разработана коллективом авторов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, Департамента здравоохранения Томской области и ОГУЗ «ОДБ» г. Томска (Огородова Л.М., Сальников В.А., Горячкина Н.И., Деев И.А., Камалтынова Е.М., Дружинина И.В., Астрелина Ю.И. - свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007614597).

В качестве критериев включения в исследование использованы возрастные границы от 0 до 17 лет (возрастные рамки указаны на момент 25.12.2009) и адрес места жительства - г. Томск и Томская область.

2. Клинико - эпидемиологическое исследование

Выборка пациентов для участия в исследовании сформирована случайным образом из базы данных программы ДИСПАН с учётом показателей распространённости астмы и аллергии в г. Томске и Томской области (Камалтынова Е.М., Деев И.А., 2001, 2004, 2006), уровня инвазии Оpisthorchis felineus (Огородова Л.М., Фёдорова О.С., 2006). Распределение участников исследования в зависимости от региона проживания (высокий уровень и низкий уровень распространённости О. felineus) было 1:1 (рис. 1).

Критерии включения:

• возраст старше 7 лет (до этого возраста невозможно проведение исследования функции лёгких), проживающие в г. Томске и Томской области;
• подписанное добровольное согласие родителей (или официальных опекунов) на участие в исследовании.

Таким образом, общее количество детей, включённых в эпидемиологическое исследование, составило 1500 человек, при этом их распределение в зависимости от региона проживания в соответствии с проведённым ранее распределением выглядело следующим образом:

• дети, проживающие в г. Томске, Кожевниково, Зырянское, Асино, Первомайское (низкая частота встречаемости О. felineus) n=750;

• дети, проживающие в сёлах Парабель, Александровское, Подгорное, Молчаново, Колпашево, Кривошеино, Каргасок, Тегульдет, Бакчар (высокая частота встречаемости О. felineus) - n=750;

Методы, использованные при выполнении исследования:

1. Клинический метод:

• сбор медицинского анамнеза, анализ медицинской документации (выписки из истории болезни, Ф112), интервьюирование пациентов и их родителей (информация о течении БА, частоте симптомов, приеме 2-агонистов короткого действия, получаемой базисной терапии, применении СКС, выяснялся анамнез на предмет диетических традиций в семье – употребление в пищу «сырой» рыбы);
• физикальное обследование, заполнение индивидуальной регистрационной карты;
• антропометрия;
• оценка уровня контроля бронхиальной астмы с использованием АСТ-теста [Nathan R.A., 2004];
• взятие венозной крови для последующего иммунологического и молекулярно-генетического исследований.

2. Функциональный метод:

• исследование пиковой скорости выдоха (ПСВ) по стандартной методике с использованием пикфлоуметров Mini-Wright, фактические значения оценивали относительно должных в зависимости от роста [S. Godfrey, 1972];

• исследование функции внешнего дыхания (ФВД) и обратимость бронхиальной обструкции проводили по стандартным методикам на аппарате MasterScope, Erih Jaeger GMBH (Германия), в соответствии с требованиями ATS Standardization of Spirometry;

• исследование бронхиальной гиперреактивности (БГР) проводили с использованием спирографа MasterScope Erich Jaeger GMBH (Германия) и небулайзера APSpro, этой же фирмы; все тесты выполнены в соответствии с требованиями ATS Standardization of Spirometry.

3. Аллергологический метод:

• проведено кожное аллерготестирование в соответствии со стандартами, утвержденными Европейской Академией Аллергологии и Клинической Иммунологии с использованием стандартизованных экстрактов аллергенов пищевой, бытовой, пыльцевой и эпидермальной групп (n=22) (ALK-Abell, Испания).

4. Паразитологический метод:

• копроовоскопия (использовали овоскопический метод толстого мазка по Като).

5. Иммунологические методы:

• определение уровня IgE проводили одностадийным (сэндвич) твердофазным иммуноферментным анализом тест-системами «Диаплюс» фирмы Roche (Швейцария), уровень IgE выражали в МЕ/мл.
• уровни ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФН- определяли твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем «ИФА-Бест» ЗАО «Вектор-Бест», (Новосибирск, Россия), спонтанную продукцию цитокинов оценивали в сыворотке крови и выражали в пг/мл.

6. Молекулярно-генетический метод (ПЦР-диагностика описторхоза):

• проводили молекулярно-генетическое исследование на наличие яиц О. felineus в стуле. Исследование проведено в соответствии с протоколом, разработанным сотрудниками Сибирского государственного медицинского университета и Медицинского центра Лейденского Университета (Нидерланды).

3. Исследование механизмов регуляции апоптоза

Исследование механизмов регуляции апоптоза в зависимости от наличия астмы и инвазии О. felineus in vitro проведено на ограниченной выборке пациентов, которые были рандомизированы из детей, включённых в эпидемиологическое исследование в соответствие с критериями, обеспечивающими формирование однородных групп данных, что продиктовано требованиями статистического анализа в малочисленных выборках.

Критерии включения:

1. дети, принимавшие участие в эпидемиологическом исследовании механизмов регуляции апоптоза, рандомизированные в группы по следующим стратифицирующим признакам:

• наличие диагноза БА (в соответствии с критериями GINA, 2006) при отсутствии адекватной базисной терапии более 12 недель до момента включения в исследование, не имеющие в анамнезе и на момент исследования гельминтных инвазий (трёхкратная копроовоскопия, ПЦР кала на О. felineus, дуоденальное зондирование - отрицательный результат; отсутствие клинических и лабораторных признаков любых других гельминтозов) – группа 1 (n=10);
• наличие диагноза БА (в соответствии с критериями GINA, 2006) при отсутствии адекватной базисной терапии более 12 недель до момента включения в исследование, имеющие на момент исследования яйца О. felineus по данным копроовоскопии или дуоденального зондирования и ПЦР кала на О. felineus (положительный результат) при отсутствии клинических и лабораторных признаков любых других гельминтозов – группа 2 (n=18);
• дети, имеющие на момент исследования инвазию О. felineus по данным копроовоскопии или дуоденального зондирования и ПЦР кала на О. felineus (положительный результат) при отсутствии клинических и лабораторных признаков любых других гельминтозов и любых других болезней в стадии компенсации и/или декомпенсации – группа 3 (n=14);
• условно здоровые дети (группа здоровья I-II), не имеющие в анамнезе и на момент исследования гельминтных инвазий (трёхкратная копроовоскопия, ПЦР кала на О. felineus, дуоденальное зондирование - отрицательный результат, отсутствие клинических и лабораторных признаков любых других гельминтозов) – группа 4 (n=11);

2. подписанное родителями (или опекунами) дополнительное информированное согласие об участии.

Методы, использованные при выполнении исследования:

1. молекулярно-биологический метод (определение уровня экспрессии мРНК генов bcl-2, bax, p-53, ИЛ-5):

• использовали взвесь эозинофилов, выделенных на градиенте плотности фиколл-верографина. Тотальную РНК выделяли с помощью набора TRIZOL™ (GibcoBRL, Life Technologies), Поли A-РНК получали на колонках с олиго-dT целлюлозой (ICN, США) и проводили реакцию, обратную транскрипции, в течение 1 часа при 37 0C. Полученную кДНК амплифицировали со специфическими праймерами. Экспрессия глицеральдегид 3-фосфат дегидрагеназы (ГАФД), использовалась как положительный контроль экспрессии мРНК. Детекцию продуктов амплификации проводили в 1,2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Оценку специфичности продуктов амплификации проводили с помощью «nested–ПЦР». Полученные результаты выражали в виде доли (в процентах) от экспрессии мРНК ГАФД, которую принимали за 100 %.

2. Молекулярно-генетический метод (ПЦР-диагностика описторхоза):

• проводили молекулярно-генетическое исследование на наличие яиц О. felineus в стуле. Исследование проведено в соответствии с протоколом, разработанным сотрудниками Сибирского государственного медицинского университета и Медицинского центра Лейденского Университета (Нидерланды).

3. Паразитологический метод:

• копроовоскопия (использовали овоскопический метод толстого мазка по Като).

4. Биохимический метод (определение активности каспазы – 3):

• исследование проведено в культуре клеток (эозинофилы) по методике производителя реактива (кат. № 1008-200, “Biovision” USA; www.biovision.com).

Для составления баз данных использован программный продукт «Microsoft Excel 2003» (Microsoft Corporation, 1983-2003), анализ данных, полученных в результате всех представленных в диссертации исследований, проводили при помощи программы «STATISTICA for Windows 6.0» (Statsoft Inc., 1984-2001) и «NCSS and PASS» [Jerry Hintz, 2000].

Статистический метод

Все данные группировались в соответствии с поставленной целью и задачами. Частота встречаемости заболеваний в зависимости от стратифицирующих признаков (пол, возраст, влияние факторов риска и др.) рассчитывалась как отношение числа лиц, у которых зарегистрировано исследуемое состояние, к числу всех пациентов, включённых в статистическое исследование. Заболеваемость рассчитывалась на 1000 населения соответствующего возраста. Для сравнения частот качественных признаков использовали критерий 2 с поправкой по Йетсу, также использовали точный тест Фишера. Для анализа вероятностей рассчитывали отношения шансов и 95% доверительный интервал. Для сравнения средних значений количественных показателей применяли t – критерий Стьюдента, тест Манна – Уитни, Крускала – Уоллиса в зависимости от количества сравниваемых несвязанных групп. Для анализа корреляционных взаимосвязей между рассматриваемыми признаками применялся метод ранговой корреляции Спирмена. Данные представлены в виде Х±х, где Х – среднее арифметическое, х – стандартное отклонение. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Статистическое исследование заболеваемости БА, сочетанной с инвазией О. felineus, по данным программы мониторинговой диспансеризации детей Томской области

Исследование заболеваемости БА было проведено с использованием базы данных программного продукта ДИСПАН, содержащей информацию о 143853 детях Томской области, что составляет 69,3% от всей детской популяции региона. Индивидуальная карта каждого пациента, содержащаяся в программе ДИСПАН, представлена данными об основном диагнозе и сопутствующих состояниях, потребности в медицинской помощи, наличии инвалидности, условиях воспитания ребёнка и т.д.

Для проведения исследования распространённости инвазии О. felineus в детской популяции на территории Томской области из базы данных программы мониторинговой диспансеризации ДИСПАН была сформирована случайная выборка пациентов в возрасте от 7 до 15 лет (вне зависимости от наличия или отсутствия диагноза: хронический описторхоз). Для формирования выборки использовалась компьютерная программа – генератор случайных чисел, интегрированная в программу ДИСПАН (модуль программы). Отбор в выборку проводился по 6-значным номерам, которые присваивались детям при введении в программу ДИСПАН. Объём выборки рассчитан по формуле, применяемой для определения репрезентативной выборки в маркетинговых исследованиях [Голубков Е.П., 1998]. Рассчитанный объем репрезентативной выборки составить 1059 человек, в связи с отказом родителей подписать информированное согласие, отсутствием первичной документации и другими причинами анализировались данные 896 детей.

Пациентами, имеющими инвазию, считали детей с положительным результатом копроовоскопического исследования (в случае отрицательного результата при первой овоскопии исследование проводилось трехкратно) и позитивным тестом идентификации ДНК О. felineus в кале. Кроме того, наличие инвазии определяли в случае отрицательного результата копроовоскопии, но при позитивном тесте идентификации ДНК О. felineus в кале и наличии соответствующего анамнеза и клинических проявлений описторхоза.

Средний возраст пациентов, включённых в исследование, составил 10,51±2,52 лет, при этом группы детей по гендерному признаку были сопоставимы с учётом условного распределения мальчиков и девочек в популяции 1:1 (49,54% и 50,55% соответственно при p=0,98). Анализ распространённости О. felineus в детской популяции Томской области показал, что 27,68% пациентов, включённых в исследование, имели все необходимые критерии для положительного заключения относительно наличия гельминтной инвазии. Стратификация полученных данных в зависимости от уровня распространённости инвазии О. felineus (< 25% и > 25%) показала, что дети, проживающие преимущественно в северных или северо-восточных районах Томской области, имеют большую распространённость гельминтной инвазии (35,14%) в сравнении с пациентами из южных территорий – p<0,001 (табл. 1). При этом вариабельность изучаемого параметра в гиперэндемичных по инвазии О. felineus районах Томской области составила почти 30% от 27,78 в Молчаново до 57,14% в Тегульдете.

Распределение включённых в исследование детей по гендерному признаку в зависимости от района проживания (гиперэндемичный или эндемичный) было сопоставимым, что свидетельствует об отсутствии ассоциации уровня распространённости инвазии О. felineus с признаком половой принадлежности в изучаемой популяции детей. Распределение детей в зависимости от наличия или отсутствия гельминтной инвазии О. felineus по районам проживания Томской области представлено на рис. 2. Приведённые данные демонстрируют, что зона распространённости инвазии в исследуемой детской популяции распространяется на северные районы Томской области с пиком в с. Тегульдет и с. Каргасок. Такое распределение О. felineus, по всей видимости, может быть обусловлено диетическими традициями в семьях, нарушением гигиенических требований по приготовлению и обработке рыбы, а также близким расположением водных бассейнов с высоким уровнем промежуточных хозяев гельминта первого и второго порядка (пресноводный моллюск и рыбы семейства карповых).

Рис. 2. Распространённость инвазии О. felineus у детей в Томской области в зависимости от района проживания (% детей, имевших положительный ПЦР на антиген О. felineus)

Примечание: Александровский район (1), Асиновский район (2), Бакчарский район (3), Верхнекетский район (4), Зырянский район (5), Каргасокский район (6), Кожевниковский район (7), Колпашевский район (8), Кривошеинский район (9), Молчановский район (10), Парабельский район (11), Первомайский район (12), Тегульдетский район (13), Чаинский район (14), Шегарский район (15).

Таблица 1

Распространённость О. felineus у детей в разных районах Томской области

Район проживания	Все, n	Критерии наличия О. felineus (табл. 1)
		n		%
		Opi+	Opi-	Opi+	Opi-
Районы с высокой распространённостью О. felineus#	444	156	288	35,14*	64,86
Районы с низкой распространённостью О. felineus##	452	92	360	20,35	79,65
Всего	896	248	648	27,68	72,32

Примечание: * - p<0,001 по сравнению с аналогичным параметром в эндемичных районах Томской области; # - уровень распространённости О. felineus > 25%: Парабель, Александровское, Подгорное, Молчаново, Колпашево, Кривошеино, Каргасок, Тегульдет, Бакчар; ## - уровень распространённости О. felineus < 25%: Кожевниково, Зырянское, г. Томск, г. Асино, Первомайское.

Полученные результаты соответствуют данным, представленным в отчётах Роспотребнадзора по Томской области относительно заражённости О. felineus рыб в таких реках как Обь, Чулым, Четь, Чичка-Юл и Улу-Юл, на берегах, которых расположены все гиперэндемичные районы (распространённость инвазии О. felineus > 25%). Для изучения уровня заболеваемости БА и хроническим описторхозом в детской популяции Томской области в зависимости от региона проживания пациента все данные, представленные в регистре программного продукта ДИСПАН (n=143853), были стратифицированы согласно результатам, полученным в рамках исследования распространённости инвазии О. felineus (эндемичные районы – распространённость инвазии О. felineus < 25%, гиперэндемичные районы - > 25%).

Таблица 2

Заболеваемость бронхиальной астмой и хроническим описторхозом у детей в Томской области (по данным ДИСПАН, 2009) в зависимости от района проживания

Район проживания	n	БА, n	Заболевае-мость на 1000	Хронический описторхоз, n	Заболевае-мость на 1000
Районы с высокой распространённостью О. felineus#
Александровское	1784	54	30,27	54	30,27
Парабель	2220	133	59,91	133	59,91
Каргасок	4131	252	61	252	61
Колпашево	7862	408	51,9	408	51,9
Бакчар	2548	160	62,79	160	62,79
Тегульдет	1438	96	66,76	96	66,76
Молчаново	2584	156	60,37	156	60,37
Подгорное	2348	142	60,48	142	60,48
Кривошеино	2766	181	65,44	181	65,44
Итого	27682	1582	57,15^,^^	1582	57,15^,^^
Районы с низкой распространённостью О. felineus##
г. Томск	94931	8507	89,61	8507	89,61
Зырянка	2712	265	97,71	265	97,71
Первомайское	3658	354	96,77	354	96,77
г. Асино	7043	710	100,81	710	100,81
Кожевниково	4040	391	96,78	391	96,78
Мельниково	3786	339	89,54	339	89,54
Итого	116171	10566	90,95	10566	90,95
Всего в ТО	143853	12148	84,45	12148	84,45

Примечание: # - уровень распространённости инвазии О. felineus > 25%; ## - уровень распространённости инвазии О. felineus < 25%; ^ - p<0,001 по сравнению с аналогичным параметром для районов с низкой распространённостью О. felineus; ^^ - p=0,032 по сравнению со средним по области значением заболеваемости.

Проведённый анализ данных показал, что в гиперэндемичных по О. felineus районах Томской области заболеваемость хроническим описторхозом была значимо более высокой в сравнении с эндемичными регионами (109,28 на 1000 населения vs 43,84 соответственно, p<0,001) – табл. 2. При этом максимальные показатели заболеваемости установлены в Каргасокском (120,07 на 1000) и Тегульдетском (120,31 на 1000) районах Томской области. Стратификация пациентов по гендерному признаку не показала значимых различий заболеваемости хроническим описторхозом в зависимости от половой принадлежности пациентов, при этом соотношение мальчиков и девочек, имеющих диагноз данного гельминтоза, во всей изучаемой популяции было сопоставимым (47,69% vs 52,31% соответственно).

Распределение заболеваемости БА в детской популяции Томской области в зависимости района проживания пациентов представлено в табл. 2. Установлено, что данный параметр в гиперэндемичных регионах был достоверно ниже в сравнении с эндемичными (57,15 на 1000 населения vs 90,95 – p=0,001). При этом показатель заболеваемости астмой у детей, проживающих в районах Томской области, где распространённость О. felineus превышала 25%, был сопоставимым вне зависимости от территориального образования. Самый высокий показатель заболеваемости БА, по сравнению с другими территориями Томской области, был зарегистрирован в эндемичном по уровню распространённости инвазии О. felineus Асиновском районе (100,81 на 1000, p<0,05 по сравнению с другими районами области). Стратификация пациентов по гендерному признаку показала значимые отличия заболеваемости астмой у детей в зависимости от половой принадлежности пациентов. Установлено, что доля мальчиков, больных БА, в изучаемой популяции была больше в сравнении с девочками (66,78% vs 33,22% соответственно), при этом такие результаты получены как для гиперэндемичных, так и эндемичных территорий региона. Статистические различия заболеваемости, полученные по гендерному признаку, сопоставимы с результатами крупных эпидемиологических исследований распространённости астмы, выполненных в разных регионах России, в том числе и Томской области, с использованием стандартизированных методов [Камалтынова Е.М. с соавт., 2005; Намазова – Баранова Л.С., 2009; Огородова Л.М., 2009].

Распределение показателей заболеваемости хроническим описторхозом и астмой во всей популяции детей в зависимости от района проживания показало определённую ассоциацию между гемильминтной инвазией и БА. Проведённый корреляционный анализ показал наличие отрицательной взаимосвязи между такими параметрами как заболеваемость хроническим описторхозом и астмой в детской популяции Томской области (r=-0,27; p=0,042), что свидетельствует о значимо меньшем количестве пациентов, страдающих астмой при высокой заболеваемости хроническим описторхозом. Полученные нами данные сопоставимы с результатами некоторых исследований, указывающих на ассоциацию распространённости гельминтной инвазии и БА в популяциях эндемичных по Ascaris lumbricoides, S. Japonicum, Paragonimus westermani [van den Biggelaar AH et al., 2000; Flohr et al., 2010].

2. Клинико-эпидемиологическое исследование

Клиническая характеристика пациентов, включённых в исследование

Согласно протоколу исследования в соответствии критериями включения/исключения в работу включены данные о 1561 ребёнке. Выборка сформирована случайным образом из регистра детей, представленного в программе мониторинговой диспансеризации детского населения Томской области ДИСПАН. Распределение участников исследования в зависимости от региона проживания было 1:1 (высокий уровень - >25% и низкий уровень распространённости О. felineus - <25% в соответствии с результатами исследования распространённости инвазии О. felineus).

Средний возраст всех, включённых в исследование детей, составил 10,35±2,83 лет, при этом значимых различий в зависимости от региона проживания не установлено. Распределение по гендерному признаку в исследуемой популяции было равномерным (47,92% - мальчики, 52,08% - девочки), статистических различий по полу в зависимости от места жительства пациентов не зарегистрировано. Для изучения цитокинового профиля в зависимости от наличия или отсутствия у пациентов гельминтной инвазии О. felineus случайным образом сформированы четыре группы пациентов: 1 - дети больные астмой без сопутствующего гельминтоза; 2 - пациенты, страдающие БА сочетанной с хроническим описторхозом (при условии клинических проявлений описторхоза и наличия инвазии О. felineus по данным ПЦР и копроовоскопии); 3 - дети, имеющие изолированный диагноз хронического описторхоза (при условии клинических проявлений описторхоза и наличия инвазии О. felineus по данным ПЦР и копроовоскопии); 4 – условно здоровые пациенты (группа контроля). Общее количество детей, включённых в данный этап исследования - 211 человек (104 мальчика и 107 девочек).

Средний возраст всех пациентов составил 10,32±2,72 лет, при этом различий по данному параметру между группами не установлено. Распределение пациентов по полу внутри исследуемых групп было сопоставимым (p>0,05). Отсутствие статистических различий по таким параметрам как пол и возраст свидетельствует об однородности сформированных групп, что позволяет проводить сравнительный анализ данных пациентов. Стаж болезни в случае БА превышал 4 года, а продолжительность хронического описторхоза (согласно данным анамнеза и первому положительному результату овоскопического исследования) составила 4,68±2,21 лет. Пациенты, имеющие диагноз хронического описторхоза, в силу разных обстоятельств по поводу данной патологии лечения не получали.

Дети, страдающие астмой на момент включения в исследование, имели неконтролируемое течение БА. Уровень контроля болезни по данным АСТ - теста составил 19,37±5,28 балла. Отсутствие контроля астмы можно объяснить недостаточным объёмом фармакотерапии, а также нерегулярным применением лечения или полным отсутствием какого-либо базисного препарата. Все пациенты, учитывая неконтролируемое течение, имели клинические проявления, характерные для БА. Так, например, средняя частота дневных симптомов составила 1,47±0,38 раза в неделю, ночных - не превышала одного эпизода в течение последних 7 дней. Потребность в 2-агонистах короткого действия в среднем составила 1,82±0,75 раза в этом же временном интервале. У большинства детей отмечалось умеренное ограничение физической активности. Обострения астмы были редкими (не более двух в год), характеризовались сезонностью. Показатели пикфлоуметрии в 62% случаев соответствовали «зеленой зоне» (ПСВ более 80% от должных величин).

Клиническое обследование пациентов с целью выявления симптомов, характерных для хронического описторхоза у детей, страдающих астмой и имеющих инвазию О. felineus (данные копроовоскопии и ПЦР - диагностикума), показало, что 70,00% из них предъявляли типичные жалобы на боль в области правого подреберья, ощущения дискомфорта в эпигастрии. Каждый второй ребёнок (54,86%), включённый в данную группу исследования, отмечал такие симптомы как головная боль, тошнота (42,50%), снижение аппетита (57,50%). Беспричинная рвота, слабость, головокружение, боли в мышцах и суставах регистрировались в меньшем количестве случаев.

Проведённый в рамках исследования анализ клинических данных показал, что такие параметры как частота дневных и ночных симптомов, количество эпизодов применения 2 – агонистов (в режиме по требованию), уровень контроля астмы (по данным АСТ - теста) статистически не различались у пациентов, страдающих астмой или имеющих сочетанную патологию (БА + хронический описторхоз). Такие результаты могут быть объяснены с позиции фармакотерапии: часть пациентов не использовала назначенное лечение или применяла базисные препараты в несоответствующих степени тяжести дозах.

Исследование функции лёгких, проведённое всем пациентам, страдающим астмой, также не позволило установить значимые различия основных параметров ФВД (ОФВ1, ФЖЁЛ, ПСВ) в зависимости от наличия гельминтоза. Учитывая результаты спирометрии (все пациенты, включённые в исследование, имели значение ПСВ и ОВФ1 более 75% от должной величины) детям, включённым в группу 1 (БА) и 2 (БА + хронический описторхоз) был проведён провокационный метахолиновый тест. Положительный результат бронхопровокационного теста (РС20 8 мг/мл) был зарегистрирован у всех пациентов, вне зависимости от группы наблюдения.

Среднее значение показателя РС20 у больных БА составило 1,72±1,15 мг/мл, при этом статистических различий в зависимости от тяжести заболевания (лёгкая - 1,90±1,28 мг/мл, среднетяжёлая - 1,64±1,23 мг/мл, тяжёлая - 1,70±1,27 мг/мл) не установлено – рис. 3. Аналогичный параметр в группе больных астмой, сочетанной с хроническим описторхозом, был значимо (p=0,021) выше 2,48±1,19 мг/мл в сравнении с показателями пациентов, страдающих изолированной БА. При этом статистических различий в зависимости от тяжести астмы для детей группы 2 (БА + хронический описторхоз: лёгкая астма – 2,53±1,26 мг/мл, среднетяжёлая – 2,47±1,29 мг/мл, тяжёлая – 2,45±1,24 мг/мл) не установлено – рис. 3.

Рис. 3. Показатель РС20 (мг/мл) в метахолиновом тесте у больных изолированной астмой и БА, сочетанной с хроническим описторхозом

Примечание: * - р<0,05 при сравнении показателя РС20 в метахолиновом тесте у пациентов в группах с изолированной астмой и сочетанной патологией.

Полученные данные свидетельствуют о высокой степени реактивности дыхательных путей к неспецифическому раздражителю (метахолин) у детей, больных изолированной БА, и сочетанной патологией. При этом статистически сопоставимые результаты у пациентов, имеющих разную тяжесть (внутри исследуемых групп), возможно объяснить, прежде всего, отсутствием адекватной противовоспалительной терапии астмы и наличием неконтролируемого течения у всех больных, включённых в данный этап исследования. Интерпретируя полученные данные, стоит отметить, что уровень гиперреактивности дыхательных путей – это обратный значению РС20 параметр, а значит неспецифическая реактивность бронхов у детей, больных астмой, сочетанной с хроническим описторхозом, достоверно меньше в сравнении с группой детей, имеющих изолированную БА. Учитывая отсутствие различий параметра РС20 внутри групп 1 (БА) и 2 (БА + хронический описторхоз) в зависимости от тяжести астмы, а также факт сопоставимости данного параметра между мальчиками и девочками, можно, предположить сопряжённость хронической гельминтной инвазии и бронхиальной гиперреактивности дыхательных путей.

Принимая во внимание установленный факт ассоциации степени БГР и активности воспалительного процесса в бронхах при астме [Kay A.B., 1995, 1998; Laprise C. et al., 1999; Bousquet J. et al., 2000; Humbles A.A. et al., 2004; Огородова Л.М. с соавт., 2005], полученные в рамках данного исследования результаты могут свидетельствовать о меньшей выраженности воспаления в дыхательных путях больных, страдающих БА, сочетанной с хроническим описторхозом. Такое влияние гельминтов, относящихся к трематодам, многие исследователи связывают с особенностями жизнедеятельности паразита в организме человека и филогенетически сформировавшимися механизмами управления иммунной системой хозяина [Littlewood D.T.J., 1999].

Анализ результатов проведённого prick – тестирования показал, что все пациенты, страдающие изолированной астмой и БА, сочетанной с хроническим описторхозом имели положительные аллергопробы, причём максимальное количество пациентов было сенсибилизировано к бытовым и эпидермальным аллергенам. Положительные prick – тесты были также зарегистрированы в группе пациентов, больных хроническим описторхозом (13,46%) и у здоровых детей (11,76%). Каждый третий ребёнок, страдающий изолированной астмой или сочетанной патологией (БА + хронический описторхоз), имел сенсибилизацию к D. pter., шерсти кошки, таракану, пыльце берёзы, для каждого пятого пациента в данных группах в качестве триггера установлены арахис и яблоко. Структура сенсибилизации у детей, страдающих изолированной БА и сочетанной патологией, была сопоставимой в данных группах.

Стандарт проведения prick – тестов предполагал измерение большого (D) и малого диаметра (d) папулы в миллиметрах (количественный метод), что позволило оценить интенсивность кожной реакции на установленный триггер. Интенсивность prick – тестов в группах пациентов больных астмой, вне зависимости от отсутствия или наличия хронического гельминтоза, достоверно превышала значения группы контроля, что согласуется с данными литературы – табл. 3.

Таблица 3

Интенсивность (коэффициент (D+d)/2, мм) кожной реакции на prick-тесты к различным аллергенам у детей, включённых в исследование

Аллергены	Коэффициент (D+d)/2, мм^
	БА	БА+Opi	Opi	Здоровые
D. pter.	4,25±1,34	3,14±1,19*	3,12±1,32*	3,30±1,40*
Подсолнечник	2,79±1,13	2,50±1,10	1,38±0,21*,**	1,59±0,17*,**
Пшеница	2,00±1,12	2,00±1,18	2,20±1,26	1,78±0,27*
Таракан	2,50±1,28	1,73±0,18*	1,50±0,33*	1,88±0,23*
Молоко	2,25±1,16	2,50±1,25	2,75±1,39	1,45±0,21*,**,#
Томат	2,17±1,17	1,56±0,24*	1,39±0,12*	1,72±0,20*
Яйцо	2,50±1,22	1,87±0,25*	2,00±0,20*	2,22±0,20
Лебеда	2,81±1,28	2,09±0,32*	2,13±1,23*	2,23±1,18*
Яблоко	3,93±1,47	2,38±1,20*	1,90±0,21*,**	2,23±1,11*
Берёза	4,31±1,22	3,37±1,22*	2,61±1,31*,**	2,31±1,14*,**
Амброзия	2,14±1,13	2,47±1,10	2,55±1,38	2,35±1,12
Арахис	3,58±1,24	2,86±1,29*	2,20±1,26*,**	2,40±1,29*
Рыба	5,11±1,46	4,94±1,59	2,40±1,17*,**	2,58±1,28*,**
Полынь	2,93±1,32	1,86±0,29*	2,19±1,13*	2,31±1,27*
Шерсть кошки	4,35±1,35	3,14±1,48*	3,11±1,31*	2,99±1,27*
Гистамин	5,13±1,46	3,97±1,48*	3,68±1,55*	3,56±1,43*
Контроль	0,00	0,00	0,00	0,00

Примечание: ^ - коэффициент (D+d)/2, где D – наибольший диаметр папулы при анализе prick – тестов в мм, d – наименьший диаметр папулы при анализе prick – тестов в мм; * - p<0,05 по сравнению с коэффициентом (D+d)/2 в группе детей, страдающих астмой (БА); ** - p<0,05 по сравнению с коэффициентом (D+d)/2 в группе детей, страдающих сочетанной патологией (БА+Opi); # - p<0,05 по сравнению с коэффициентом (D+d)/2 в группе детей, страдающих хроническим описторхозом (Opi).

Выраженность кожных аллерготестов у детей, страдающих сочетанной патологией (БА + хронический описторхоз), к таким аллергенам как D. pter., таракан, томат, яйцо, лебеда, яблоко, берёза, арахис, полынь, шерсть кошки, была достоверно меньше в сравнении с группой пациентов, страдающих изолированной астмой – табл. 3. При этом интенсивность prick - тестов на гистамин, для детей, страдающих астмой, сочетанной с хроническим гельминтозом, была также значимо меньше (p<0,05) в сравнении с пациентами, больными только БА – табл. 3.

Характеристика цитокинового профиля при бронхиальной астме у детей, сочетанной с хроническим описторхозом

Современная концепция БА связана с персистирующим воспалением респираторного тракта, следствием которого являются типичные проявления болезни – удушье, одышка, кашель [Черняк А.В. с соавт., 2001; GINA, 2009]. Выраженность и частота вышеуказанных симптомов рассматриваются как основные критерии при оценке степени тяжести и уровня контроля болезни. Воспаление дыхательных путей, прежде всего следствие гистотоксического эффекта провоспалительных медиаторов, высвобождаемых иммунокомпетентными клетками.

В рамках данного исследования с целью оценки влияния хронической гельминтной инвазии О. felineus на регуляцию механизмов иммунного воспаления, у всех пациентов, страдающих астмой, сочетанной патологией (БА + хронический описторхоз), изолированным хроническим описторхозом был определён уровень цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФН-), а полученные данные сопоставлены с показателями группы контроля.

Анализ уровня ИЛ-4 в сыворотке крови пациентов, больных астмой показал, что данный параметр достоверно больше значений группы контроля, при этом в сравнении с детьми, страдающими хроническим описторхозом и сочетанной патологией, также установлены достоверные отличия (p<0,05) – рис. 4А.

Рис. 4. Уровень ИЛ-4 (А) и ИЛ-5 (Б) в сыворотке крови у пациентов, включённых в исследование

Примечание: * - при сравнении БА с группой контроля, с группой БА+Opi и с группой Opi p<0,05 р=0,041.

При сопоставлении уровня ИЛ-4 в группах пациентов, страдающих изолированным описторхозом и сочетанной патологией (БА + хронический описторхоз), с данными группы контроля значимых различий не зарегистрировано. Низкие значения ИЛ-4 в сыворотке крови больных описторхозом и сочетанной патологией также представлены в работах некоторых исследователей [Черногорюк Г.Э. с соавт., 2005; Огородова Л.М., 2010]. Содержание ИЛ-5 в сыворотке крови было максимально высоким только в группе детей, больных изолированной астмой, при этом уровень ИЛ-5 достоверно отличался от значений, определённых для больных, страдающих сочетанной патологией и хроническим описторхозом, а также от показателей в группе контроля (рис. 4Б). По всей видимости, учитывая результаты статистического анализа уровней ИЛ-4 и ИЛ-5, О. felineus может оказывать некоторое влияние на механизмы регуляции иммунного ответа при астме, изменяя цитокиновый профиль. Эти данные могут быть объяснены с позиции длительного существования гельминта в организме хозяина, что может быть следствием филогенетически сформировавшегося механизма сосуществования О. felineus и человека.

Анализируя данные уровня ИЛ-2, установлено, что в случае изолированной астмы данный параметр более чем в два раза был ниже значений группы контроля, при этом также достоверно отличался от показателей пациентов, больных хроническим описторхозом и сочетанной патологией (БА + хронический описторхоз) – рис. 5А.

Рис. 5. Уровень ИЛ-2 (А) и ИЛ-10 (Б) в сыворотке крови у пациентов, включённых в исследование

Примечание: * - при сравнении БА с группой контроля, с группой Opi и группой БА+Opi р<0,05; ** - при сравнении с группой контроля р<0,012, *** - при сравнении Opi с группой БА + Opi р=0,047.

Стоит отметить, что уровень исследуемого провоспалительного цитокина (ИЛ-2) в группах детей, страдающих гельминтозом (вне зависимости от наличия астмы), был в 1,5 раза выше контрольных значений. По всей видимости, наличие хронической гельминтной инвазии у больных астмой сопряжено с изменением цитокинового профиля в сторону Тh1, что может быть объяснено с позиции влияния антигена О. felineus как мощного инфекционного триггера для иммунной системы человека. Подобные результаты описаны лишь для гельминтоза, вызываемого трематодой Schistosoma mansoni в исследованиях в модели БА на животных (мыши) и в экспериментальных работах (in vitro) [Maria Ilma ArajoII et al., 2004; Joseph A. Jackson et al., 2009].

Содержание ИЛ-10 в сыворотке крови больных астмой сопоставимо с контрольными значениями, при этом значимо отличалось от показателей зарегистрированных для детей, страдающих сочетанной патологией и изолированным гельминтозом (рис. 5Б). Уровень ИЛ-10 в случае хронического описторхоза (вне зависимости от наличия астмы) более чем в два раза превышает показатели группы контроля, при сочетанной патологии (БА + хронический описторхоз) - значимо меньше в сравнении с пациентами, страдающими изолированным гельминтозом (рис. 16). Высокие значения ИЛ-10 при астме на фоне гельминтной инвазии (in vitro; in vivo в моделях на животных и в группах людей - дети) описаны некоторыми отечественными авторами для О. felineus [Огородова Л.М., Фёдорова О.С., 2010], а также приведены в зарубежной литературе для Schistosoma mansoni, haematobium и japonicum [van den Biggelaar AH et al., 2000; Mo HM, Lei JH et al., 2008; Yang J et al., 2007; Pacfico LG et al., 2009].

Анализ содержания ИФН- в сыворотке крови пациентов, включённых в исследование, показал, что в случае изолированной астмы данный параметр отличался только при сравнении с группами Opi и БА + Opi. При этом пациенты, страдающие хроническим описторхозом (вне зависимости от наличия БА), по уровню ИФН- отличались от группы здоровых лиц. Полученные результаты могут свидетельствовать об увеличении активности клеток Th1 профиля иммунного ответа при наличии хронической инвазии О. felineus, что подтверждает предположение о модулирующем влиянии гельминта на активность иммунного ответа у пациентов, страдающих атопической патологией.

Проведённый статистический анализ позволил установить наличие отрицательной ассоциации уровня ИЛ-4 и ИЛ-5 с показателем РС20 в метахолиновом тесте (r=0,21; р<0,05), что свидетельствует об увеличении неспецифической реактивности дыхательных путей при высоких значениях уровня провоспалительных цитокинов. В этой связи более низкая БГР у пациентов, страдающих сочетанной патологией, в сравнении с больными изолированной астмой, может быть объяснена влиянием длительной инвазии О. felineus на уровень цитокинов Th2 профиля.

Таким образом, проведенное исследование показало, что хроническая инвазия О. felineus вносит определённый вклад в модуляцию иммунного ответа при БА у детей, что обусловлено низкими значениями провоспалительных цитокинов и высоким

3. Исследование механизмов регуляции апоптоза

Анализ экспрессии мРНК ИЛ-5 (внешний модулятор апоптоза) показал, что для пациентов, страдающих астмой, характерна высокая (по сравнению с группой контроля) активность мРНК данного антиапоптотического фактора (рис. 6А). Подобные данные опубликованы отечественными и зарубежными авторами, при этом исследователи связывают высокий уровень мРНК ИЛ-5 при астме с низкой апоптотической активностью эффекторных клеток воспаления при астме, что сопряжено с персистенцией воспаления в дыхательных путях [Spinozzi, F. At al., 2008].

Активность мРНК ИЛ-5 в группе пациентов, страдающих изолированным хроническим описторхозом, была сопоставима с контрольными значениями. При этом установлено, что уровень мРНК ИЛ-5 у астматиков превышал значения аналогичного параметра в группе детей, больных хроническим описторхозом, в 1,9 раза (p=0,039) – рис. 18. Несмотря на статистически значимые различия активности мРНК ИЛ-5 при сравнении полученных данных у пациентов, страдающих сочетанной патологией (БА + Opi), с больными изолированной астмой и детьми группы контроля, различий между показателями, зарегистрированными при инвазии О. felineus, вне зависимости от наличия астмы не установлено – рис. 6А.

Рис. 6. Экспрессия мРНК ИЛ-5 (А) и bcl-2 (Б) в эозинофилах у детей, включённых в исследование

Примечание: * - р=0,024 при сравнении активности экспрессии мРНК ИЛ-5 в группе БА с группой контроля; p=0,041 при сравнении группы БА + Opi с группой контроля; ** - р=0,021 при сравнении группы БА + Opi с группой БА; p=0,039 при сравнении группы Opi с группой БА.

Подобные результаты могут быть объяснены с позиции супрессорного влияния гельминтов (трематоды) на активность клеток Th2 профиля, являющихся основными источниками провоспалительных цитокинов (концепция down - регуляции) [D. Jankovic, M.C. Kullberg, P., 2004]. По всей видимости, низкие значения уровня ИЛ-5 в сыворотке крови у пациентов, больных астмой, сочетанной с хронической инвазией О. felineus (рис. 6А), сопряжены с супрессорным влиянием продуктов жизнедеятельности гельминтов на активность мРНК данного провоспалительного цитокина.

Экспрессия внутриклеточного антиапоптотического эффектора bcl-2 также была высокой при астме в сравнении с данными других групп. При этом в случае гельминтной инвазии (вне зависимости от наличия БА) показатели, отражающие активность мРНК bcl-2, были меньше аналогичного параметра установленного для детей, больных изолированной астмой, и отличались от контроля (рис. 6Б). Уровень мРНК проапоптотического эффектора bax был сопоставим во всех исследуемых группах и не имел отличий в сравнении с контролем (p>0,05) - рис. 7А. Подобные данные, свидетельствующие о конститутивной экспрессии мРНК bax для пациентов, страдающих астмой (вне зависимости от степени тяжести и уровня контроля болезни), опубликованы в отдельных зарубежных и отечественных источниках [J. Zangrilli, N. Robertson, 2000].

Рис. 7. Экспрессия мРНК bax (А) и p53 (Б) в эозинофилах у детей, включённых в исследование

Примечание: * - р>0,05 при сравнении активности экспрессии мРНК bax в группе контроля с другими группами.

Активность мРНК транскрипционного фактора р53 у детей, больных БА, зарегистрирована как низкая в сравнении с группой контроля (рис. 7Б). При этом показатель, характеризующий экспрессию мРНК р53, сопоставимый с контролем, установлен только для пациентов, страдающих изолированным хроническим описторхозом. В случае сочетанной патологии (астма + хронический описторхоз) уровень мРНК р53 был значимо ниже, чем в контроле, и сопоставим с аналогичным показателем, зарегистрированным при изолированной астме – рис. 7Б. Учитывая большую активность экспрессии мРНК проапоптотического транскрипционного фактора р53 у пациентов, имеющих сочетанную патологию (БА + Opi), по сравнению с группой детей, больных астмой (не смотря на отсутствие достоверных различий между данными группами), можно предположить, что длительная гельминтная инвазия О. felineus способствует инициации активности мРНК р53 и увеличивает вероятность реализации программируемой клеточной гибели в эффекторных клетках воспаления.

Таким образом, результаты, полученные при исследовании экспрессии мРНК антиапоптотических (ИЛ-5, bcl-2, bcl-xl) и проапоптотических (bах, bcl-xS, р53) эффекторов, свидетельствуют о нарушении механизмов регуляции программируемой клеточной гибели эффекторных клеток при астме. В основном, такие данные обусловлены высокой активностью мРНК модуляторов антиапоптотической направленности при конститутивно низкой экспрессии проапоптотических эффекторов. В случае сочетанной патологии зарегистрирована меньшая (в сравнении с изолированной астмой) активность мРНК модуляторов программируемой клеточной гибели антиапоптотической направленности (ИЛ-5, bcl-2), при некотором увеличении уровня мРНК проапоптотических факторов (p53, bcl-xS). Подобные результаты могут свидетельствовать о большей апоптотической активности эозинофилов в случае астмы, сочетанной с хронической гельминтной инвазией О. felineus.

Изменение активности каспазы – 3 при бронхиальной астме у детей, сочетанной с инвазией О. felineus

Для определения интенсивности апоптотической гибели эозинофилов у пациентов, больных астмой, в зависимости от наличия или отсутствия хронической инвазии О. felineus, проведено исследование активности каспазы-3, в рамках которого оценивалось количество единиц каспазы в час на миллиграмм белка (U/mg) – рис. 8.

Результаты проведённого исследования свидетельствуют, что активность каспазы-3 в случае изолированной астмы значимо ниже в сравнении с группой контроля (р=0,039), что свидетельствует о меньшей степени апоптоза эффекторных клеток воспаления у детей, больных БА.

Анализ результатов измерения активности каспазы-3 у пациентов с сочетанной патологией показал, что данный параметр был сопоставим в представленных группах, при этом в 1,75 раза превышал значения, зарегистрированные для детей, включённых в группу контроля, и для пациентов, страдающих изолированной астмой – рис. 9. Такие данные свидетельствуют, что наличие хронической гельминтной инвазии О. felineus сопряжено с высокой апоптотической активностью эффекторных клеток воспаления при астме, что, вероятно, может быть ассоциировано с уменьшением количества эозинофилов, гибнущих по некротическому пути, а значит, сопровождается ограничением гистотоксического эффекта на ткани дыхательных путей.

Проведённый корреляционный анализ показал наличие взаимосвязей между уровнем неспецифической реактивности дыхательных путей (PC20), активностью каспазы-3 и экспрессией мРНК проапоптотических и антиапоптотических эффекторов в группах детей, больных изолированной астмой, хроническим описторхозом и сочетанной патологией (БА + Opi) – рис. 9. Учитывая тот факт, что после активации каспазы-3 запускается необратимый каспазный каскад, обусловливающий реализацию программируемой клеточной гибели (характеристика апоптотической активности эффекторных клеток воспаления), статистический анализ ранговой корреляции Спирмена был проведён с позиции возможных ассоциаций клинических и функциональных параметров астмы, уровня мРНК проапоптотических и антиапоптотических эффекторов с активностью ключевой эффекторной каспазы (каспаза-3).

Рис. 8. Активность каспазы – 3 в эозинофилах у детей, включённых в исследование

Примечание: * - р=0,039 при сравнении активности каспазы - 3 в группе БА с группой контроля; p=0,016 при сравнении группы Opi с группой контроля; p=0,029 при сравнении группы БА + Opi с группой контроля; ** - р=0,040 при сравнении группы Opi с группой БА; при сравнении группы БА + Opi с группой БА; *** - U/mg - единиц каспазы на миллиграмм белка.

Проведённый статистический анализ показал наличие положительной корреляционной связи активности каспазы-3 с показателем РС20 у детей, страдающих изолированной астмой (r=0,21; p=0,023), что свидетельствует о снижении уровня неспецифической реактивности дыхательных путей при БА (показатель РС20 и уровень БГР – обратные показатели) в случае высокой апоптотической активности эффекторных клеток воспаления (рис. 9, сектор Б). Подобные результаты получены для групп пациентов, больных хроническим описторхозом, а также детей, имеющих сочетанную патологию (БА + Opi) – рис. 9 (сектор А, В).

Также установлено, что активность каспазы-3 положительно ассоциирована с уровнем мРНК транскрипционного фактора р53 во всех исследуемых группах, имеющего проапоптотическую направленность, что свидетельствует о значимом влиянии экспрессии мРНК р53 на увеличении активности апоптотической гибели эффекторных клеток воспаления (рис. 9, сектор А, Б, В). В этой связи, учитывая представленные корреляционные связи, можно обсуждать ключевую роль реализации клеточной гибели эозинофилов по апоптотическому пути в ограничении гистотоксического влияния биологических внутриклеточных медиаторов при астме. При сопоставлении показателей экспрессии мРНК р53 и активности каспазы-3 у пациентов, страдающих астмой, в зависимости от наличия или отсутствия хронической инвазии О. felineus, принимая во внимание установленные корреляционные взаимосвязи, можно констатировать, что гельминтоз ассоциирован с большей активностью ключевой эффекторной каспазы (каспаза-3), а значит, усиливает реализацию программируемой клеточной гибели эффекторных клеток воспаления при астме, что, вероятно, приводит к уменьшению воспалительной активности в дыхательных путях.

Рис. 9. Результаты корреляционного анализа (взаимосвязь активности каспазы – 3 с другими параметрами у детей в зависимости от исследуемой группы)

Примечание: на рисунке представлены корреляционные связи, при которых р<0,05; - корреляционный анализ для группы БА + Хр. описторхоз (А); - для группы Бронхиальная астма (Б); - для группы Хр. описторхоз (В);