Клиническое значение определения генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у беременных с синдромом потери и уродствами плода.

На правах рукописи

КАНОКОВА ИННА НИКОЛАЕВНА

Клиническое значение определения генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у беременных с синдромом потери и уродствами плода.

14.01.01. Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА 2010

Работа выполнена в Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Бицадзе Виктория Омаровна

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор Торчинов Амирхан Михайлович

- доктор медицинских наук, профессор Сичинава Лали Григорьевна

Ведущее учреждение: Московский областной научно-исследовательский

институт акушерства и гинекологии МЗ РФ.

Защита состоится «_____»__________2011г ____часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова (119992, г. Москва ул. Трубецкая д 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первого МГМУ

имени И. М. Сеченова (117998 г. Москва, Нахимовский проспект д. 49).

Автореферат разослан «_____»__________2011г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Шулутко Александр Михайлович.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы

Молекулярные механизмы влияния гипергомоцистеинемии на здоровье женщины интенсивно изучаются последние 20 лет. Стали известны генетические и приобретенные факторы риска развития гипергомоцистеинемии. Установлена роль гипергомоцистеинемии в развитии сосудистых расстройств и несосудистых нарушений, проявляющихся клинически инсультами, инфарктами, тромбозами, повышенным риском развития онкологических заболеваний. Артериальные и венозные тромбозы, а также тромбоэмболии во время беременности и в послеродовом периоде зачастую связаны с приобретенными и генетически обусловленными формами тромбофилии. Риск тромбоэмболических осложнений во время беременности, которая сама по себе способствует формированию тромботической наклонности при предсуществующей тромбофилии значительно повышается [den Неijег и соавт. 1996, Ducloу-Воuthогs АS, Тгillоt N., 2003]. Гипергомоцистеинемия – один из факторов рождения детей с пороками развития (дефекты нервной трубки, косолапость, пр.) и осложненного течения беременности (гестоз, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты и др.), бесплодия и невынашивания беременности вследствие повреждения эндотелия и активации микротромбообразования, что приводит к нарушению маточного и фетоплацентарного кровообращения. Целью научного поиска на данный момент является разработка патогенетической профилактики основных акушерских осложнений [Макацария А.Д., Киселеаа-Романова Е.А., Кролл Ж.Б., Бухаева Я.Ш.,1999, R.М. Вегtinа, Rodger I, Вiсk, 1998 и др].

Концентрация гомоцистеина в плазме крови зависит от генетических факторов, а также физиологических особенностей организма, образа жизни человека, наличия сопутствующих заболеваний и приема лекарственных препаратов. Мутации ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина, приводящие к развитию гипергомоцистеинемии, включают как минимум 92 мутации цистатионин--синтетазы (CBS) и 24 мутации метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). Могут иметь место также мутации других ферментов, в частности метионин-синтетазы, ферментов синтеза коэнзима кобаламина и др. Развитие молекулярной медицины, клинической гемостазиологии, молекулярной генетики и активное внедрение новейших научных достижений в клиническую практику, позволяют расширить диагностические возможности и совершенствовать профилактику осложнений беременности, в том числе синдрома потери и внутриутробных уродств плода.

Цель исследования.

Цель планируемого исследования – изучение патогенеза и совершенствование принципов профилактики синдрома потери и внутриутробных уродств плода.

Основные задачи исследования.

1. Изучить частоту генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у женщин с синдромом потери плода в анамнезе.

2. Изучить частоту генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у женщин с внутриутробными уродствами плода.

3. Провести клинико-лабораторные параллели между гипергомоцистеинемией и наличием генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у женщин с синдромом потери и внутриутробными уродствами плода в анамнезе.

4.Оценить прогностическое значение определения уровня гомоцистеина у пациенток с генетическими полиморфизмами ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина и синдромом потери и внутриутробными уродствами плода в анамнезе.

5. Оценить эффективность профилактики повторных потерь плода и внутриутробных уродств плода с учетом генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина.

Научная новизна работы.

Впервые в нашей стране будет проведено исследование, посвященное роли генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у женщин с синдромом потери и внутриутробными уродствами плода.

Впервые будет изучен спектр и частота генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у матерей и отцов с синдромом потери и внутриутробными уродствами плода в анамнзе.

Впервые будет оценено прогностическое значение выявления генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина, у беременных с синдромом потери и уродствами плода.

Впервые, с учетом наличия генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в обмене гомоцистеина у пациенток с синдромом потери плода и внутриутробными уродствами плода, будет разработана профилактика, начинаемая с предгравидарного периода, и оценена ее эффективность.

Практическая значимость.

С учетом современных аспектов понимания патогенетических механизмов генетической тромбофилии выработаны наиболее рациональные принципы диагностики, терапии и профилактики осложнений, вызванных гипергомоцистенемией. Разработан алгоритм обследования супружеских пар с синдромом потери плода и уродствами плода в анамнезе с учетом патогенетической роли генетически детерминированной гипергомоцистеинемии. Проведенное исследование раскрывает роль гипергомоцистеинемии как причины развития антенатальной гибели и уродств плода с одной стороны, и как фактора, утяжеляющего течение беременности, с другой. Назначение комплексной превентивной терапии супружеским парам, за 2 месяца до планированной беременности, включающей коррекцию гипергомоцистеинемии, позволяет снизить смертность и развитие множественных пороков у плода. Назначение корригирующей гемостаз терапии у пациенток с отягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом, а также с осложненным течением беременности и родами, кроме того, является профилактикой тромботических осложнений в послеродовом периоде, что снижает риск материнской заболеваемости и смертности благодаря нормализации показателей гемостаза. Выявление гипергомоцистеинемии при настоящей беременности является прогностически важным, так как позволяет в дальнейшем у этих пациенток проводить профилактику акушерских осложнений при последующих беременностях, а также профилактику таких заболеваний как инфаркты, инсульты и др.

Положения, выносимые на защиту.

1. Наличие отягощенного акушерского анамнеза – антенатальная гибель плода и уродства плода, является основанием для проведения лабораторных исследований и выявление генетически обусловленных форм тромбофилии и гипергомоцистеинемии у обоих супругов
2. Наличие мутаций ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина и приводящих к развитию гипергомоцистеинемии является наиболее неблагоприятным фактором риска антенатальной гибели плода и уродств плода
3. Уровень гомоцистеина в плазме крови может быть прогностическим критерием для оценки тяжести течения осложнений беременности
4. Патогенетически обоснованное лечение тромбофилии и гипергомоцистеинемии уменьшает тяжесть течения основных осложнений беременности и снижает риск развития множественных пороков и гибель плода.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты проведенного исследования внедрены в практику Медицинского Женского Центра, Перинатального центра для беременных с сердечно-сосудистой патологией и нарушениями гемостаза на базе городской клинической больницы № 67 г. Москвы.

Апробация работы.

Основные положения работы изложены на расширенной конференции кафедры акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета ММА им. И.М.Сеченова, на Х всероссийском форуме «Мать и Дитя».

Публикации результатов работы.

По теме диссертации опубликовано 5 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 35 работ на русском и 189 – на иностранных язык. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

а) Клинические данные

Для осуществления цели исследования на основании разработанных клинико-лабораторных критериев, было обследовано в общей сложности 104 супружеские пары в возрасте от 21 до 39 лет с антенатальной гибелью плода и уродствами плода в сроке беременности с 28 недель до 39 недель. Из них 62 женщины первородящие, 40 – повторнородящие. Исследования проводились спустя 2 месяца - 1 год после антенатальной гибели плода. Основную группу составили 125 (62,5%) мужчин и женщин с высоким содержанием гомоцистеина в крови у одного из супругов и 52(50%) супружеские пары с гипергомоцистеинемией у обоих супругов. Контрольную группу составили 50 супружеских пар, получавших превентивную терапию фолатами в течение 2-х месяцев до наступления планированной беременности.

Основная группа была разделена на 3 подгруппы:

I подгруппа– 75 (74%) пациенток с повышенным содержанием гомоцистеина в крови.

II подгруппа – 50 (48%) мужчин с высоким уровнем гомоцистеина в крови.

III подгруппа – 52 (50%) супружеские пары с повышенным содержанием гомоцистеина в крови.

IV группа- контрольная группа: 50 супружеских пар (48%), получавших превентивную терапию фолатами в течение 2-х месяцев до наступления планированной беременности.

Распределение по возрасту в 1-й, 2-й, 3-й подгруппах было практически одинаковым (р>0,05). Пациентами с повышенным уровнем гомоцистеина в крови являлись женщины и мужчины в возрасте 30 лет и старше. Это еще раз подтверждает, что возраст и пол являются двумя важными детерминантами, определяющими концентрацию гомоцистеина, при этом с возрастом происходит значительное повышение его концентрации, а также концентрация у мужчин превосходит таковую у женщин. У женщин I подгруппы (75пациенток) антенатальная гибель плода сочеталась с множественными пороками у плодов (рис. 1). Признаки фето-плацентарной недостаточности были выявлены у 22 (29%) плодов; мальформации головного мозга у 17 плодов (23%случаев); пороки мочеполовой системы у 16 плодов (21%случаев); пороки сердечно-сосудистой системы у 7 плодов (9% случаев); синдром Дауна 1 у плода (1,3%); гипоплазия плаценты в сочетании с гипотрофией и незрелостью плода у 12 плодов (16% случаев) рис.1.

У 52 супружеских пар с гипергомоцистеинемией в анамнезе также имела место антенатальная гибель и уродства плода (52% случаев). Анализ характера уродств плода показал наличие множественных пороков развития, а также фето-плацентарной недостаточности у 7 (27%) плодов; мальформации головного мозга у 5 плодов (19%случаев); пороки мочеполовой системы у 4 плодов (15%случаев); пороки сердечно-сосудистой системы у 3 плодов (12% случаев); синдром Дауна у 3 плодов (12%); гипоплазия плаценты в сочетании с гипотрофией и незрелостью плода у 4 плодов (15% случаев). Из приведенных данных видно, что, частота развитий уродств плода достоверна выше у супружеских пар с гипергомоцистеинемией (р<0,05).

Большинство пациенток I подгруппы были первородящие - 48пациенток (64%случаев), 27(36%случаев) повторнородящие. Среди супружеских пар первородящих было 14 пациенток(54%случаев), повторнородящих- 12 пациенток(46%случаев). Обращает на себя внимание высокий процент искусственных абортов у повторнобеременных пациенток с гипергомоцистеинемией. Процент самопроизвольных абортов и неразвивающихся беременностей также достоверно выше у женщин с гипергомоцистеинемией, чем у женщин в контрольной группе (р<0,05).

Особое значение уделялось сбору анамнеза у пациентов с повышенным содержанием гомоцистеина в крови – семейного акушерского и семейного тромботического. У 36 пациентов супружеских пар (78% жен-н и 62% муж-н), 33 женщин (44% случаев) и 39 мужчин (78% случаев) I и II подгрупп был отягощен семейный тромботический анамнез, а семейный акушерский анамнез у 37 пациенток I подгр. (49% случаев) и 19 пациенток III подгр. (73% случаев). У мужчин II подгруппы (78% случаев), родственники страдали сосудистой патологией чаще, чем у женщин I подгруппы(44%случаев) (р<0,01). Но, что представляется особенно интересным, у 37 (49%) пациенток I подгруппы отягощен семейный тромботический анамнез, а при анализе репродуктивной функции этих же пациенток, у 24 (64%), родственники имели самопроизвольные выкидыши, неонатальную смерть плода, антенатальную гибель плода. Особого внимания заслуживают супружеские пары с гипергомоцистеинемией- III подгруппа. Здесь сосудистая патология у родственников встречалась достоверно чаще, чем в I и II подгруппе (р<0,05), следовательно, и сосудистая патология встречалась чаще и, как следствие, развитие у них акушерских осложнений. Средний возраст менархе пациенток всех подгрупп составил 13 лет, продолжительность менструального цикла 30 дней, продолжительность менструации - 5 дней. Из анамнеза следует, что у пациенток III подгруппы гинекологические заболевания встречались чаще, чем у женщин I подгруппы (р<0,05). Так у 38% пациенток III группы в анамнезе было бесплодие I, у 31% бесплодие II, у 54% мастопатия. Среди часто встречавшихся заболеваний в подгруппах были хронический сальпингоофорит, миома матки, эктопия шейки матки, мастопатия (р<0,05). Так же имела место дисфункция яичников, что также могло отразиться на репродуктивной функции. Был исследован инфекционный профиль пациентов, который включал в себя бактериологическое и бактериоскопическое исследование в пробе из цервикального канала методом ПЦР. Обращает на себя внимание большой процент пациентов всех подгрупп с инфекционными заболеваниями, таких как, Ureaplasma Urealitica, Mycoplasma hominis, Chlamidia trachomatis, Candida albicans, При изучении сопутствующих и ранее перенесенных экстрагенитальных заболеваний, было выявлено, что у мужчин I подгруппы достоверно чаще встречалась артериальная гипертензия (44%случаев) и пролапс митрального клапана (50%случаев), чем в остальных подгруппах (р<0,5), а у женщин I подгруппы преобладала варикозная болезнь вен нижних конечностей (44%случаев) (р<0,05). Среди пациентов супружеских пар с гипергомоцистеинемией у женщин чаще встречалась миопия средней и высокой степени (38%), а у мужчин перенесенный острый тромбофлебит (12%). обращает на себя внимание, что проспективно у 2-х (4%) пациенток был выявлен Дефицит XIII фактора.

Структура осложнений течения беременностей, завершившихся антенатальной гибелью и уродствами плода у женщин с повышенным содержанием уровня гомоцистеина в крови представлены в таблице 1:

Осложнения течения бер-ти	Контрольная группа (25 чел)	Женщины с повыш. сод-ем уровня гомоц-а в крови (общее кол-во 75)	Супружеские пары с гипергомоцистеинемией (26жен-н)
Самопроизвольные выкидыши на сроке до 14 нед.	1(4%)	__________	_________
Угроза прерывания беременности	2(8%)	35(47%)*	18(69%)*
СЗРП Легкая ст. Средняя ст. Тяжелая ст.	1(4%)	22(29%) 24(32%)* 17(22%)	3(12%) 5(19%) 7(30%)*
Гестоз Легкая Средняя Тяжелая	2(2%)	5(7%) 22(29%)* 18(24%)	8(30%) 5(19%) 10(38%)*
Маловодие	1(4%)	7(9%)	6(23%)*
Многоводие	3(12%)	3(4%)	5(19%)
Антенатальная гибель плода	0(0%)	75 (75%)	26(26%)
Анемия	1(4%)	9(12%)	6(23%)
Низкое прикрепление плаценты	6(12%)	3(4%)	3(12%)
Неполное предлежание плаценты	0(0%)	4(5,3%)	7(30%)*
Полное предлежание плаценты	0(0%)	10(13%)	4(15%)*
Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты	2(8%)	7(9%)	5(19%)

При анализе осложнений беременностей было установлено, что угроза прерывания беременности возникала в процессе гестации во всех обследованных подгруппах. Особенно часто это осложнение наблюдалось в подгруппе, где гомоцистеин был повышен у обоих супругов, соответственно у 69,%, (р<0,01) по сравнению с I подгруппой женщин с высоким гомоцистеином (47%) и контрольной группой (4%). СЗРП также встречался во всех подгруппах, но здесь обращает на себя внимание высокая частота этого осложнения в III подгруппе 38% случаев (р<0,01). Кроме того, пациентки обследованных подгрупп имели и другие осложнения беременности: неполное и полное предлежание плаценты, маловодие, ПОНРП (р<0,01). Таким образом, пациентки с гипергомоцистеинемией имели указание в анамнезе на отягощенную наследственность по сосудистой патологии (тромбозы различной локализации у ближайших родственников), наличие, варикозно-расширенных вен, отягощенный акушерский анамнез (мед.аборты, выкидыши, преждевременные роды, нефропатия в предыдущую беременность), тяжелый гестоз, ПОНРП, СЗРП и антенатальная гибель плода в 100% случаев в данную беременность. Эти акушерские осложнения могли быть обусловлены наличием скрытых дефектов гемостаза, что не могло не отразиться на течении их настоящей беременности.

2. Лабораторные данные.

Анализ коагулограмм:

Нами проведено исследование состояния системы гемостаза у 104 супружеских пар с антенатальной гибелью и уродствами плода в анамнезе.

Особое внимание уделяли исследованию состояния плазменного и тромбоцитарного звеньев свертывающей системы крови. При этом оценивали общую свертываемость крови по данным коагулограммы и тромбоэластограммы, звено ингибиторов свертывания крови и фибринолиза. Диагностику ДВС синдрома по уровню Д-димера. Результаты гемостазиограмм представлены в таблице 2;.

Таб.2 Показатели плазменного звена системы гемостаза и тромбоэластограммы (ТЭГ) в обследованных группах.

Функция тромбоцитов		АЧТВ (сек.)	ТЭГ			Диагностика ДВС
			“r+k” (мм)	Ма (мм)	ИТП (у.е.)	РКМФ	D-ди-мер
Нормальные АДФ (n= Значения 30-50)		20,0–40,0 (30,0+10,0)	19,0–27,0 (23,0+4,0)	48,0–52,0 (50,0+2,0)	20,0–40,0 (30,0+10,0)	Отр.	<0,5 *10-3
I группа (75%)	50±15	26,0+4,0	16,0 + 3,0	58,0 + 5,5	35,0 + 5,0	+++	1,5 +0,25
II группа (50%)	70±10	26,0 + 5,0	15,5 + 2,5	58,0 +6,0	35,5 + 5,5	++	1,0+0,25
III группа	60±10	26,0±5,0	15,0±3,5	58,0±6,0	35,0±5,5	+++	2,0±0,25
Контр. группа (50%)	40±5	24,0 + 2,0	19,0 + 3,0	53,0 +3,0	21,0 + 3,0	Отр.	<0,5

У пациентов с антенатальной гибелью и уродствами плода в анамнезе и гипергомоцистеинемией, вне беременности имелись существенные изменения в системе гемостаза, проявляющиеся гиперкоагуляцией в плазменном звене (90% случаев), повышение уровня маркеров тромбофилии (Д-димер, ТАТ) у 70% пациентов, повышение агрегации тромбоцитов в 45% случаев и в 30% случаев – тромбоцитопатия потребления.

Следующим этапом нашего исследования было определение уровня гомоцистеина в плазме крови у пациентов основных и контрольной групп генетические исследования.

Как видно из приведенных данных концентрация гомоцистеина в плазме крови у пациентов в 3-х подгруппах достоверно выше, чем в 4-ой контрольной группе.

Исследования групп с повышенным содержанием гомоцистеина в крови на наличие мутаций ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина и приводящих к развитию гипергомоцистеинемии (5 параметров- мутация метилентетрагидрофолат редуктазы MTHFR C677T, полиморфизм «66A/G» редуктазы метионин синтетазы (MTRR), полиморфизм «2756» метионин синтетазы (MTS), полиморфизм «1958 G/A» метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (MTD), полиморфизм «1298 A/С» метилентетрагидрофолат редуктазы (MTАС) выявили, что у 64 пациентов (63%случаев) имело место одна или более гомозиготных форм мутаций, а у 79 пациентов (78%случаев) 3 и более гетерозиготных форм мутаций (рис 4).

Методы исследования:

Выявление генетически обусловленных форм тромбофилии: молекулярный анализ генетических дефектов ферментов гемостаза метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) C677T, полиморфизм «66A/G» редуктазы метионин синтетазы (MTRR), полиморфизм «2756» метионин синтетазы (MTS), полиморфизм «1958 G/A» метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (MTD), полиморфизм «1298 A/С» метилентетрагидрофолат редуктазы (MTАС) выполнялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукты ПЦР становятся видимыми в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием благодаря их флюоресценции в ультрафиолетовом свете. В результате полимеразной цепной реакции (38 циклов) образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой HinfI не сопровождается его расщеплением при отсутствии мутации С677Т (дорожки 2 и 5 рис. 5), полное расщепление с образованием фрагментов ДНК длиной 116 и 79 пар нуклеотидов (дорожка 8), происходит при наличии гомозиготной формы мутации и при гетерозиготной мутации - частичное расщепление.

Определение D-димера производилось с помощью латекс-теста Dimertest (Agen, Australia), который основан на взаимодействии высокоспецифичных антител к D-димеру, фиксированных на латексных частицах. D-димер характеризует перекрестную полимеризацию фибрина в процессе внутрисосудистого свертывания крови; является одним из наиболее специфических тестов диагностики ДВС-синдрома, тромбофилии и тромбоза. Определение общего гомоцистеина в данное время
проводят иммуноферментным методом. Классическим методом определения
концентрации ГЦ является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с масс - спектрометрией.

Результаты исследований. Обсуждение полученных результатов.

Мы наблюдали 50 супружеских пар с генетически детерминированной гипергомоцистеинемией, обратившихся за консультацией в связи с антенатальной гибелью и уродствами плода в анамнезе. Они и составили

4-ю- контрольную группу наблюдения. Средний возраст пациентов контрольной группы составлял от 21- 39 лет. Первородящих было 14 пациенток, повторнородящих 11 пациенток. Анализ характера уродств плодов у этих пациенток показал наличие развития множественных пороков. Пациентки контрольной группы имели отягощенный гинекологический анамнез, так у 38% пациенток в анамнезе было бесплодие I, у 31% бесплодие II. Среди часто встречавшихся гинекологических заболеваний в подгруппах были хронический сальпингоофорит, миома матки, эктопия шейки матки, мастопатия. Из экстрагенитальных заболеваний у пациенток супружеских пар с гипергомоцистеинемией чаще встречалась миопия средней и высокой степени (38%). Проспективно у 2-х (4%) пациенток был выявлен Дефицит XIII фактора. Сосудистая патология у родственников пациентов контрольной группы встречалась у 78% женщин и 62% мужчин, а у 73% женщин отягощен акушерско-тромботический анамнез. Все пациенты контрольной группы были обследованы на инфекционный спектр еще до беременности. Хламидийная, уреаплазменная и микоплазменная инфекции были излечены в процессе подготовки к беременности, титры антител к краснухе, цитомегаловирусу и герпесу были в пределах нормальных значений. Структура осложнений течения беременности, завершившейся антенатальной гибелью и уродствами плода у женщин контрольной группы включала: угроза прерывания беременности 69% случаев, маловодие 23%случаев, гестоз тяжелой степени 38% случаев. Кроме того, пациентки имели и другие осложнения беременности: неполное и полное предлежание плаценты 30% и 15% всех случаев, ПОНРП 19%, СЗРП 30% случаев. При исследовании генетических форм тромбофилии было выявлено, что у пациентов контрольной группы имела место одна или более гомозиготных форм мутаций и 3 и более гетерозиготных форм мутаций ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина. У всех пациентов были нарушения в системе гемостаза, проявляющиеся гиперагрегацией тромбоцитов, гиперкоагуляцией в плазменном звене гемостаза, а также появлением маркеров активации внутрисосудистого свертывания крови. Уровень гомоцистеина в крови у них составлял в среднем 15±5,5 ммоль\л. За два месяца до планирования беременности супругам проводили измерение гомоцистеина в крови, исследования гемостаза. Супружеские пары контрольной группы, для снижения уровня гомоцистеина в крови получали в течение 2-х месяцев до планирования беременности превентивную терапию фолиевой кислотой в дозе 4-5 мг\ в сутки и витаминами группы В, которые назначали пациенткам до конца беременности и еще на 2 недели послеродового периода. Фолиевую кислоту применяли в таблетках в дозе 4-5 мг в день. Витаминами группы В: пиридоксина гидрохлорид В6 по 10-20 мг в сутки, витамин В12 по 200-400 мкг/сут внутримышечно через день по 10 инъекций на курс. С дальнейшим переходом на таблетированные формы (пентавит, «мультитабс- комплекс В»). Назначали профилактическую противотромботическую терапию, которая включала элементы неспецифической и специфической профилактики. Под неспецифической профилактикой подразумевали назначение диеты с ограничением жиров, легкоусвояемых углеводов, соли; применение средств, повышающих активность антиоксидантной системы (полиненасыщенные жирные кислоты омега-3, витамин Е 400 ME), лечебную физкультуру. Параллельно проводили лечение имеющихся очагов инфекции (периодонтиты, хронический тонзиллит, хронический пиелонефрит и т.д.) Особое внимание обращалось на наличие факторов предрасполагающих к тромбофилическим осложнениям (прием оральных контрацептивов, курение, иммобилизация). Специфическая профилактика состояла в назначении антикоагулянтной терапии. Пациентам с варикозной болезнью для повышения тонуса сосудов назначали детралекс (по 1-2 таблетки в день), мазь «лиотон 1000» местно, курсами по 3-4 недели. Для коррекции гемостаза препаратами выбора антикоагулянтной терапии являются низкомо­лекулярные гепарины (НМГ) в связи с их достаточно высокой эффективностью и меньшим риском нежелательных реакций. Эти препараты вводятся подкожно 1-2 раза в сутки в дозе, подобранной с учетом массы тела, не требуют лабораторного мониторирования, не поступают трансплацентарно в организм плода, редко осложняются геморрагиями и почти не вызывают гепарин-индуцированной тромботической тромбоцитопении, не вызывают остеопороза. В качестве антикоагулянта прямого действия использовали препарат низкомолекулярного гепарина "Фраксипарин" (надропоринат кальция, М.м. 4500д), который назначали в индивидуально подобранной дозе, подкожно, 1-2 раз в сутки, и в цикле зачатия, обоим супругам, и при нарушениях гемостаза пациенткам в течение всей беременности. Препарат отменялся за сутки до родов или кесарева сечения во избежание геморрагических осложнений. Через 12 часов после родов или операции терапию фраксипарином в сочетании с другими составляющими патогенетического лечения( фолиевая кислота, витамины группы В в тех же дозировках) возобновляли и продолжали в течение 10 дней послеродового периода с оценкой состояния гемостаза. На фоне лечения через месяц у всех пациентов концентрация гомоцистеина снизилась в среднем до 10,5 ммоль\л, а еще через 2 недели уровень гомоцистеина приблизился к границам нормы и составил 7,5 ммоль\л.

Всем беременным пациенткам контрольной группы было проведено комплексное обследование, которое включало общеклинические, лабораторные, специальные методы исследования: контроль уровня гомоцистеина в крови и коррекция гемостаза на протяжении всей беременности.

Для оценки внутриутробного состояния плода проводилось ультразвуковое исследование в динамике, кардиомониторный контроль и доплерометрическое исследование маточно-плацентарного и плодового кровотоков. Задержка внутриутробного развития плода - средняя степень во время данной беременности наблюдалась в 1 случае (4%). СЗРП тяжелой и средней степени тяжести не наблюдалась. Маловодие у беременных данной группы наблюдалась у 1 беременной (4%), многоводие у 3 беременных (12% случаев). Низкое прикрепление плаценты наблюдалось у 3 беременных это 12% случаев. У 2 беременных (8%случаев) наблюдался гипертонус стенок матки, выявленный при УЗ-исследовании. Эти беременные получали терапию бета-миметиками (гинипрал по 2г/сут) в сочетании с антагонистами кальция (финоптин по 80мг/сут), дезагреганты (курантил по 75-150мг/сут и/или трентал по 300 мг/сут, тромбо-Асс 50-100мг/сут). Самопроизвольные выкидыши на сроке до 14 недель произошли у 1 беременной (4%) случаев. При цитогенетическом исследовании абортивного материала хромосомной патологии не обнаружено. В 2-х случаях (8%) у беременных наблюдались признаки гестоза, легкой степени тяжести. Несмотря на проводимую терапию, у 2-х беременных (8%) в III триместре произошла ПОНРП. При более углубленном исследовании этих пациенток был обнаружен наследственно обусловленный дефицит XIII фактора свертывания. Следует заметить, что абсолютное большинство родов были своевременными - 23 (92%). Преждевременные роды произошли у 2-х пациенток (8% случаев). Самопроизвольные срочные роды были у 16 пациенток (64%), у 9 пациенток (36%), роды закончились путем операции кесарева сечения: Показаниями к операции кесарево сечение были: в 2-х случаях (8%), на сроке до 37 недель –преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, в 1 (4%) – слабость родовой деятельности и первые роды в 37 лет; в 3-х(12%) -отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (бесплодие I, гинекологические заболевания, инфекции) и у 3 пациенток (12%) - повторное кесарево сечение при несостоятельности рубца на матке. Хроническая внутриутробная гипоксия плода у пациенток с гестозом была диагностирована в 2-х случаях (8%), причем нарушений дыхательной функции у плодов не отмечалось. Важно отметить, что кровопотеря, вызванная операцией кесарева сечения, не превышала допустимые значения. В двух случаях (8%) имела место стимуляция родовой деятельности на фоне первичной слабости родовой деятельности, преждевременное излитие вод – 8 (38 %), раннее излитие вод – в 5(23,8%) случаев. Средняя продолжительность родов составила 8,86±1,81 часа. Длительность безводного промежутка в среднем была 7,52±2,11 часа. Обвитие пуповины вокруг шеи отмечено у 5(23,8%) плодов. Родовой травматизм матери отмечался у 15 рожениц (60%) случаев и не был тяжелым, встречались комбинированные травмы: разрывы малых половых губ и стенок влагалища – 5 (20%), разрывы шейки матки – 6 (24%). Эпизиотомия была произведена у 4(16%) рожениц. Кровотечение в раннем послеродовом периоде наблюдалось в 2 случаях (8%), у двух пациенток было произведено ручное отделение плаценты (8%).Все беременности завершились рождением здоровых детей. Средняя оценка детей по шкале Апгар составляла 8-9 баллов. Средняя масса тела новорожденных - 3320±400г. В послеродовом и послеоперационном периодах всем родильницам было проведено обследование состояния системы гемостаза. Пациентки с гипергомоцистеинемией продолжали получать коррегирующую терапию по выше приведенной схеме.

Выводы.

1. Гипергомоцистеинемия и генетическая предрасположенность к нарушениям фолатного цикла как интегральный фактор риска выявлена у 75% женщин, 48% мужчин и 50% супружеских пар.
2. У 50% супружеских пар гипергомоцистеинемия сочеталась с пороками развития плода: фето-плацентарная недостаточность (с уродствами плода) (27%), мальформации головного мозга (19%), пороки мочеполовой системы (15%), пороки сердечно-сосудистой системы (12%), синдром Дауна: (12%), гипоплазия плаценты в сочетании с гипотрофией и незрелостью (15%).
3. У всех пациенток повышение гомоцистеина в крови сочеталось наличием множественных пороков развития плода, таких как, фето-плацентарная недостаточность (с уродствами плода) 29%, мальформация головного мозга (23%), пороки мочеполовой системы (21%), сердечно-сосудистой системы(9%), синдрома Дауна (1,3%), гипоплазия плаценты в сочетании с гипотрофией и незрелостью плода (16%) случаев.
4. У большинства пациентов и женщин, и мужчин с антенатальной гибелью плода и уродствами плода имели сочетания гипергомоцистеинемии с гомозиготными (63%) и гетерозиготными формами мутаций (78%) ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина и приводящих к развитию гипергомоцистеинемии (мутация метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T, полиморфизм «66A/G» редуктазы метионин синтетазы (MTRR), полиморфизм «2756» метионин синтетазы (MTS), полиморфизм «1958 G/A» метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (MTD), полиморфизм «1298 A/С» метилентетрагидрофолат редуктазы (MTАС).
5. У пациентов с антенатальной гибелью и уродствами плода в анамнезе и высоким уровнем гомоцистеина в крови, был отягощен семейный тромботический анамнез: в 44%случаев у женщин, в 78% случаев у мужчин, и в 84% случаев супружеских пар. При этом у 43% пациенток был отягощен семейный репродуктивный анамнез (выкидыши, СВЗРП, АПГ, ПОНРП у мамы, бабушек, сестер).
6. У пациентов с антенатальной гибелью и уродствами плода в анамнезе и гипергомоцистеинемией, вне беременности имелись существенные изменения в системе гемостаза, проявляющиеся гиперкоагуляцией в плазменном звене (90% случаев), повышение уровня маркеров реальной тромбофилии (Д-димер, ТАТ) у 70% пациентов, повышение агрегации тромбоцитов в 45% случаев и в 30% случаев – тромбоцитопатия потребления.
7. Патогенетически обоснованное применение фолатов в большой дозе(4-5мг) и витаминов группы В, полиненасыщенных жирных кислот омега-3, витамин Е 400 МЕ/сут., а также НМГ в процессе подготовки к беременности, контроль за уровнем гомоцистеина и применение этих препаратов в течение всей беременности, позволило предотвратить повторные репродуктивные потери и развитии ассоциированных с гипергомоцистеинемией патологий со стороны матери плода во время беременности.

Практические рекомендации.

1. При ведении пациенток с такими осложнениями как, антенатальная гибель и уродства плода, необходимо учитывать возможную роль скрытой тромбофилии в развитии этих осложнений. Поэтому таких пациенток нужно обследовать на наличие генетической и приобретенной тромбофилии, в том числе гипергомоцистеинемию, помимо исследований состояния свертывающей системы крови.
2. Схема обследования этих пациенток должна включать:

- исследование системы гемостаза для обнаружения возможных изменений в системе гемостаза. При условии повышения концентрации маркеров тромбофилии (ТАТ и Д-димера) показано назначение противотромботической профилактики еще в фертильном цикле.

- определение концентрации гомоцистеина в плазме крови. Определение концентрации гомоцистеина также необходимо при наличии у пациентки ряда соматических заболеваний и других факторов, являющихся причиной развития приобретенной формы гипергомоцистеинемии. Показано определение концентрации гомоцистеина в плазме крови и оценка этого показателя с учетом возраста женщины.

- генетические исследования с целью выявления мутации ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина и приводящих к развитию гипергомоцистеинемии (мутация метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T, полиморфизм «66A/G» редуктазы метионин синтетазы (MTRR), полиморфизм «2756» метионин синтетазы (MTS), полиморфизм «1958 G/A» метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (MTD), полиморфизм «1298 A/С» метилентетрагидрофолат редуктазы (MTАС).

3. При обнаружении врожденной или приобретенной гипергомоцистеинемии начиная с фертильного цикла, а, также в течении всей беременности в состав комплексной терапии следует включать фолиевую кислоту в дозе 3-4 мг/сут, витамины группы В: пиридоксина гидрохлорид В6 по 10-20 мг в сутки, витамин В12 по 200-400 мкг/сут внутримышечно через день по 10 инъекций на курс. В дальнейшем при снижении уровня гомоцистеина следует переходить на поддерживающие дозы фолиевой кислоты и таблетированные формы витаминов группы В (пентавит, мультитабс- комплекс В). Также в терапию должны быть включены полиненасыщенные жирные кислоты омега-3, витамин Е 400 МЕ/сут., препарат низкомолекулярного гепарина "Фраксипарин" (надропаринат кальция), который назначается в индивидуально подобранной дозе, подкожно, 1-2 раз в сутки, и в цикле зачатия, обоим супругам, и при нарушениях гемостаза пациенткам в течение всей беременности.

4. Эффективность проводимой терапии нужно оценивать по снижению агрегации тромбоцитов, концентрации низко- и высокомолекулярных фрагментов ПДФ, уровню Д-димера, а также по снижению уровня гомоцистеиа в плазме крови и в динамике клинической картины через каждые 2 недели.
5. В послеродовом периоде, по показаниям, проводят атикоагулянтную терапию под контролем показателей гемостазиограммы в течение 7-14 дней. Родильницам с гипергомоцистенемией продолжают терапию витаминами группы В, фолиевой кислотой под контролем уровня гомоцистеина в плазме крови.
6. Пациенток с отягощенным личным/семейным или акушерским/тромботическим анамнезами следует обследовать на предмет наличия гипергомоцистеинемии и других форм тромбофилии.
7. Учитывая причины развития приобретенной гипергомоцистеинемии и возможность сочетания генетически детерминированной гипергомоцистеинемии с приобретенной формой следует, подчеркнуть важность рекомендаций по изменению образа жизни и характера питания.

Публикации по теме диссертации.

1. В.О. Бицадзе, С.М. Баймурадова, И.Н. Талалаева. «Фолат-дефицитные состояния и уродства плода»// Журнал Российского общества Акушеров и Гинекологов 2008, №2, с. 42-48.
2. Талалаева И.Н. «Фолат-дефицитные состояния и уродства плода»// Материалы Х Юбилейного Всероссийского научног форума «Мать и дитя», Москва, 29.09.- 02.10.2009г., г. Москва, 207-208.
3. I.N. Talalaeva, V.O. Bitsadze, Z.K. Gadaeva «The genetically determined hyperhomocysteinemia and antenatal fetal death»//Thrombosis Research, Praga, Grech Republic, February 6-8, 2009, р.160.
4. И. Н. Талалаева «Патогенез и профилактика уродств плода, вызванных фолатдефицитными состояниями»// «ВРАЧ», 2009г, № 10, с. 57-60.
5. A.D. Makatsariya, V.O. Bitsadze, I.N. Talalaeva “ Pathogenetic prophylaxis in parents with genetically determined of antenatal fetal death”//The journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine, Granada, Spain, May 26-29, 2010, р.624.