Патоморфология, профилактика и коррекция плацентарной недостаточности у крыс (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
Кузнецов Роман Александрович
ПАТОМОРФОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА И КОРРЕКЦИЯ
ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У КРЫС
(экспериментальное исследование)
14.00.15 - патологическая анатомия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Перетятко Любовь Петровна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Коган Евгения Александровна
заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор
Милованов Андрей Петрович
Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный
медико-стоматологический университет
Защита состоится «____»____________________2008 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.040.01 при ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации по адресу: 117418, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.
Автореферат разослан «_____»________________2008 г.
Учёный секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Варшавский В.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Синдром плацентарной недостаточности на протяжении последнего десятилетия не утратил своего ведущего значения как в формировании перинатальной патологии, так и в качестве основной причины анте- и постнатальной смерти (Мурашко Л.Е., 1996; Афанасьева Н.В., Стрижаков А.Н., 2004). В настоящее время по данным различных авторов частота плацентарной недостаточности колеблется от 30 до 77% и не имеет тенденции к снижению (Савельева Г.М., 1991; Радзинский В.Б., 1999; Орджоникидзе Н.В.,1999; Тютюнник В.Л., 2003).
В решении указанной проблемы большую роль играет изучение клинических и патоморфологических основ плацентарной недостаточности. Исследователями разработаны клинико-морфологические классификации, отражающие различные взгляды на патогенетическую и морфологическую сущность этого синдрома и его значение в клинической практике (Калашникова Е.П., 1986; Милованов А.П., 1999; Волощук И.Н., 2002; Глуховец Б.И., 2002).
В экспериментальной медицине созданы различные модели нарушений в системе «мать-плацента-плод», в основном имеющие своей целью воспроизведение синдрома задержки внутриутробного развития плода. В качестве повреждающего фактора предложены гипобарическая гипоксия (Спасов А.А., 2005), чрезмерные физические нагрузки (Домрачев А.А., Савченков Ю.И., 1996), солевая диета (Beausjour A., 2003; Мясникова В.В., 2005), исключение из пищевого рациона аминокислот, жирных кислот и железа (Glocker T.M., 2000; Lewis R.M., 2001; Doherty C.B., 2003), а также оперативные вмешательства, направленные на нарушение маточно-плацентарного кровотока (Гармашева Н.Л., Константинова Н.Н., 1978; Клименко П.А., 1982). Назначение вышепредставленных моделей заключается не только в их создании и возможности изучения особенностей патогенеза синдрома задержки развития плода и плацентарной недостаточности, но и в их использовании на этапе доклинических испытаний для оценки эффективности новых лекарственных средств, разрабатываемых для коррекции вышеуказанной патологии.
Однако на данном этапе исследований недостаточно изучены плацентарные механизмы развивающейся внутриутробно задержки развития плода, не определен патоморфологический субстрат нарушений маточного и плацентарного кровотока в эксперименте. С учетом актуальности темы и научно-практической необходимости выявления патоморфологических критериев экспериментальной плацентарной недостаточности проведено настоящее исследование.
Цель исследования
На экспериментальной модели выявить механизмы патогенеза и разработать морфологические диагностические критерии плацентарной недостаточности у крыс.
Задачи исследования:
- Изучить структурные особенности и патогенез экспериментальной плацентарной недостаточности у крыс.
- Оценить эмбриолетальность и соматическое развитие плодов крыс при нарушенном маточно-плацентарном кровообращении.
- Разработать морфологические диагностические критерии экспериментальной плацентарной недостаточности.
- Изучить влияние природных гуминовых соединений, экстрагированных из торфа, на маточное, плацентарное кровообращение и соматическое развитие плодов крыс в условиях плацентарной недостаточности.
Научная новизна исследования
Впервые изучены механизмы формирования плацентарной недостаточности, созданной в эксперименте у крыс путем нарушения маточного и плацентарного кровотока, и установлены плацентарные механизмы синдрома задержки внутриутробного развития плода.
Впервые на данной модели выявлен патоморфологический субстрат плацентарной недостаточности у крыс, который представлен незавершенной гестационной перестройкой артерий плацентарного ложа с последующими дисциркуляторными расстройствами в самой плаценте в виде тромбоза синусоидов базальной части, ишемии краевых отделов лабиринта и выраженного полнокровия центральных отделов с формированием эритроцитарных стазов в просвете материнских лакун и плодовых капилляров.
Впервые при плацентарной недостаточности у крыс установлена зависимость между структурными изменениями в последах и уровнем экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста и фактора Виллебранда.
Впервые в условиях нарушенного маточного и плацентарного кровотока показано, что гуминовые соединения, экстрагированные из торфов Верхневолжского региона, стимулируют развитие адаптивных реакций в плаценте и, следовательно, профилактируют развитие плацентарной недостаточности и задержки внутриутробного развития плода.
Научно-практическая значимость исследования
Разработаны морфологические диагностические критерии экспериментальной плацентарной недостаточности у крыс. Представленные диагностические критерии могут быть использованы на стадии доклинических испытаний для оценки эффективности новых лекарственных препаратов, применяемых с целью профилактики и коррекции плацентарной недостаточности.
Основные положения, выносимые на защиту:
- При перевязке на 15 день гестации 1/3 пучка преплацентарных артерий у крыс развивается плацентарная недостаточность, сопровождающаяся задержкой внутриутробного развития плода и увеличением показателя постимплантационной гибели эмбрионов.
- Патоморфологическим субстратом развивающейся в эксперименте плацентарной недостаточности являются незавершенное гестационное ремоделирование артерий плацентарного ложа, тромбозы материнских синусоидов, ишемия лабиринта в краевых отделах плаценты, дилятация и неразрешенные стазы эритроцитов в материнских лакунах.
- Природные гуминовые соединения в условиях плацентарной недостаточности у крыс стимулируют развитие адаптивных процессов в последе и плацентарном ложе, предотвращают гибель эмбрионов и задержку внутриутробного развития плода.
Апробация диссертационного материала
Основные положения работы доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях молодых ученых ФГУ «ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» (2002, 2003, 2004); региональной научной конференции «Молодая наука – развитию Ивановской области» (Иваново, 2005); Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2005); Республиканской научно-практической конференции «Кардиологические проблемы в акушерстве, гинекологии и перинатологии» (Иваново, 2006); IX Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2007); Ивановском областном научном обществе патологоанатомов (Иваново, 2007).
Результаты исследования оценены серебряной медалью на VII Международном салоне промышленной собственности «Архимед-2004» в разделе медицина и бронзовой медалью на V Московском международном салоне инноваций и инвестиций за разработку «Новые препараты из торфа» (2005).
Работа выполнялась при поддержке гранта РФФИ № 05-04-96405 и гранта Президента РФ НШ-2245.2003.4.
Личное участие автора
Автором лично проведен эксперимент, морфометрия, иммуногистохимическое исследование, статистическая обработка полученных результатов, анализ полученных данных, их обобщение и выводы.
Публикация результатов исследования
По результатам диссертационного исследования опубликовано 11 работ, из них в журналах, рецензируемых ВАК - 2.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 99 фотографиями. Библиографический указатель содержит 94 отечественных и 101 иностранных источников.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте использованы 30 лабораторных беременных крыс линии Вистар, 264 плода и такое же количество последов, полученных от самок, а также сегменты маточных рогов с плацентарным ложем каждого из последов.
Эксперимент выполняли с учетом сезонного и суточного ритма биологической активности животных. Протокол эксперимента, содержание животных и выведение их из опыта были составлены в соответствии с принципами биоэтики, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Для получения потомства к самкам в стадии проэструса-эструса подсаживали самцов в соотношении 1:4. Первый день беременности устанавливали на основании обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках самок. В соответствии с задачами исследования экспериментальные животные были разделены на три группы. На 21 день беременности, за день до предполагаемых родов, проводили эвтаназию животных с помощью этаминал-натрия в дозе 60 мг/кг, затем осуществляли аутопсию самок и плодов.
Контрольную группу (1-я группа) составили 10 беременных крыс, которым на 15 день беременности выполняли лапаротомию с последующим послойным ушиванием передней брюшной стенки. От самок контрольной группы было получено 85 плодов и 85 последов.
На самках 2-й группы (10) создавали модель недостаточности маточно-плацентарного кровообращения по методу Н.Л. Гармашевой и Н.Н. Константиновой (1978). На 15 день беременности у крыс лигировали 1/3 пучка преплацентарных артерий у каждого плодовместилища обоих рогов матки. Лигатуру накладывали атравматичной иглой с монофиламентной полипропиленовой нитью толщиной USP 4/0. Экспериментальное нарушение маточного и плацентарного кровообращения проводили под этаминал-натриевым наркозом в дозе 40 мг/кг. От крыс 2-й группы получено 84 плода и 84 последа, составивших группу с экспериментально нарушенным маточным и плацентарным кровообращением.
Самкам 3-й группы (10), получавшим в течение всей беременности гуминовые соединения с водой в стандартных индивидуальных поилках, как и самкам 2-й группы создавали модель недостаточности маточно-плацентарного кровообращения по указанной методике. Суточная доза исследуемых соединений составила 10 мг/кг массы тела. По завершении эксперимента от крыс 3-й группы получено 95 плодов и 95 последов, составивших группу, в которой осуществлялась профилактика и коррекция нарушений маточно-плацентарного кровообращения гуминовыми соединениями.
Природные гуминовые вещества получены путем водного экстрагирования из торфа Верхневолжского региона в лаборатории, возглавляемой д.т.н., профессором Ю.А.Калинниковым (Ивановский институт химии растворов РАН). В эксперименте применяли 1 % раствор гуминовых соединений, содержащий следующий набор микроэлементов: Fe, Na, Mg, K, Mn, Cu.
У самок и извлеченных плодов определяли основные параметры физического развития (массу тела, длину тела, длину хвоста). При визуальном исследовании последов оценивали степень кровенаполнения, изменения формы, цвета, консистенции. Осуществляли органометрию последа с измерением массы, объема, площади материнской поверхности плаценты и длины пуповины.
Изучение последов и плацентарного ложа на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях проводилось с использованием обзорных методов (окраска гематоксилином и эозином, по Маллори, метиленом-азур-II-фуксином), морфометрии, элективных методов (выявление ДНК по методу Фельгена-Россенбека и РНК по методу Браше, PAS-реакция) и трансмиссионной электронной микроскопии. С помощью автоматизированной программы Видео-Тест Мастер «Морфология 4.0» определяли площадь материнских лакун и плодовых капилляров лабиринтного отдела плаценты, площадь и относительное количество артерий и артериол в базальном отделе плаценты и плацентарном ложе, толщину плацентарного барьера. Используя 100-точечную измерительную сетку, высчитывали удельный объем структурных компонентов плаценты и плацентарного ложа.
С целью исследования функции структурных компонентов маточно-плацентарного кровообращения в тканях плаценты и плацентарного ложа иммуногистохимическим методом определяли экспрессию сосудисто-эндотелиального фактора роста и фактора Виллебранда. Реакцию проводили на парафиновых срезах после предварительной демаскировки антигена путем двукратного кипячения в цитратном буфере по 5 минут в СВЧ-печи при мощности 650 Вт. Эндогенную пероксидазу блокировали 1% раствором перекиси водорода. В качестве первичных антител использовались мышиные моноклональные антитела класса IgG2a к сосудисто-эндотелиальному фактору роста в рабочем разведении 1:50 и кроличьи поликлональные антитела класса IgG к фактору Виллебранда в разведении 1:100 («Abcam», Великобритания). Визуализацию комплексов антиген-антитело проводили стрептавидин-биотиновым пероксидазным методом при помощи системы детекции LSAB2 System, HRP («Dako», Германия). Для проведения негативного контроля первичные антитела замещали 0,1 % раствором бычьего сывороточного альбумина, а также исключали вторичные антитела. Результаты иммуногистохимической реакции оценивали в 10 полях зрения микроскопа, по 100 клеток в каждом, при увеличении х400. Индекс экспрессии изучаемых факторов высчитывали по формуле:
Индекс экспрессии = Р(i)·i/100,
где i – интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3;
Р(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.
Для оценки возможного эмбриотоксического действия изучаемых соединений рассчитывали показатели преимплантационной, постимплантационной и общей эмбриональной гибели.
Цифровой материал обработан с использованием стандартного пакета программного обеспечения “Excel-2000”. Вычисляли средние арифметические значения, ошибки средних арифметических. Достоверность различий между вариационными рядами с нормальным типом распределения оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Для малых выборок использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
- Морфология маточно-плацентарного кровообращения у крыс
при неосложненном течении беременности
Средняя масса последов крыс контрольной группы составила 530,33±5,88 мг, объем 0,79±0,01 см3, площадь материнской поверхности 160,73±2,16 мм2. К 21 дню развивающейся в физиологических условиях беременности плацента крыс состоит из базальной зоны и лабиринтного отдела (табл. 1). Структурную основу базальной части составляют базофильные клетки, имеющие полигональную форму, округлое, центрально расположенное гиперхромное ядро с одним или двумя ядрышками. В базофильной цитоплазме определяются мелкие и средние вакуоли. Среди базофильных клеток базального отдела плаценты крыс группами по 30-40 располагаются крупные гликогеновые клетки, имеющие округлую форму, небольшое компактное ядро в центре и светлую вакуолизированную цитоплазму. В цитоплазме определяются различной величины PAS-положительные амилазочувствительные гранулы. На границе базального отдела и плацентарного ложа матки крыс находится зона фибриноида. Кроме указанной зоны, фибриноид в виде мелких очажков локализуется между базофильными клетками в перицеллюлярном матриксе. В состав базальной части плацент крыс входят кровеносные сосуды синусоидного типа, несущие материнскую кровь к лабиринту. Сосуды окружены базофильными клетками. Средняя площадь материнских синусоидов базальной зоны составила 5745,7±216,5 мкм2 в центре плаценты и 7594,9±452,3 мкм2 на периферии органа.
Таблица 1
Удельный объем структурных компонентов плаценты
| Структурные компоненты, % | Отдел плаценты | 1 группа (n=30) | 2 группа (n=30) | 3 группа (n=30) | |
| лабиринт | Хориальная пластинка | Центр | 1,87±0,11 | 1,77±0,09 | 1,73±0,07 |
| Край | 1,79±0,09 | 1,85±0,12 | 1,9±0,12 | ||
| Ветвистый хорион | Центр | 2,65±0,14 | 2,84±0,19 | 2,79±0,12 | |
| Край | - | - | - | ||
| Трофобласт | Центр | 19,13±0,21 | 16,41±0,12 *** | 13,51±0,15 *** ^^^ | |
| Край | 14,65±0,25 | 14,16±0,16 | 13,89±0,16 * | ||
| Материнские лакуны | Центр | 28,84±0,27 | 24,63±0,15 *** | 31,19±0,30 *** ^^^ | |
| Край | 33,85±0,36 | 27,99±0,28 *** | 31,77±0,18 *** ^^^ | ||
| Плодовые капилляры | Центр | 17,80±0,22 | 12,69±0,08 *** | 15,91±0,118 *** ^^^ | |
| Край | 18,33±0,11 | 16,58±0,14 *** | 17,64±0,29 * ^^ | ||
| Гликогеновые клетки лабиринта | Центр | 0,98±0,12 | 1,07±0,09 | 0,93±0,06 | |
| Край | 1,36±0,16 | 1,4±0,13 | 1,83±0,10 * ^^ | ||
| базальная зона | Материнские сосуды базального | Центр | 9,10±0,09 | 7,06±0,09 *** | 11,65±0,13 *** ^^^ |
| Край | 7,82±0,35 | 6,70±0,09 ** | 8,90±0,19 ** ^^^ | ||
| Гликогеновые клетки базального отдела | Центр | 2,35±0,09 | 1,29±0,08 *** | 2,93±0,13 *** ^^^ | |
| Край | 2,71±0,17 | 2,36±0,13 | 2,99±0,13 ^^^ | ||
| Базофильные клетки | Центр | 15,70±0,26 | 14,48±0,06 *** | 12,53±0,15 *** ^^^ | |
| Край | 16,35±0,24 | 13,08±0,10 *** | 13,75±0,14 *** ^^^ | ||
| Фибриноид | Центр | 1,81±0,12 | 12,87±0,12 *** | 4,12±0,07 *** ^^^ | |
| Край | 3,23±0,26 | 10,35±0,16 *** | 5,02±0,21 *** ^^^ | ||
| Патологические очаги | Центр | - | 5,37±0,10 *** | 2,67±0,13 *** ^^^ | |
| Край | - | 5,53±0,29 *** | 2,29±0,17 *** ^^^ | ||
Достоверность различий между группами 1-2 и 1-3: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001
Достоверность различий между группами 2-3: ^ - p<0,05; ^^ - p<0,01; ^^^ - p<0,001
Основными структурными компонентами лабиринтного отдела плаценты крыс при неосложненном течении беременности являются плодовые капилляры и материнские лакуны, разделенные трехслойным трофобластом. Большое количество митохондрий, развитая сеть эндоплазматического ретикулума, многочисленные пиноцитозные везикулы в клетках трехслойного трофобласта, разделяющего материнское и плодовое звено плацентарного сосудистого русла, обеспечивают активный трансплацентарный транспорт и трофику развивающегося плода. Сформированные на клеточной мембране трофобласта первого слоя микроворсинки способствуют не только увеличению обменной поверхности, но и стабилизации реологических свойств крови, необходимых для адекватной гемоциркуляции в материнских лакунах плаценты (Милованов А.П., 1999). Гистологическое строение плацент, характеризующееся наличием островков гликогеновых клеток в лабиринтном отделе, трансформацией базофильных клеток в гликогеновые, преобладанием удельного объема лабиринтного отдела над базальным, сближением плодового и материнского кровотоков за счет истончения плацентарного барьера, свидетельствует об их структурной зрелости (Левкович Л.Г.,, 1993; de Rijk E.P., 2002). Об уровне обменных процессов в последе при неосложненном течении беременности у крыс свидетельствуют соответствующая сроку гестации гистохимическая активность ДНК и РНК в трофобластических клетках и амниотическом эпителии, а также накопление гликогена в гликогеновых клетках лабиринта и базальной части, что согласуется с полученными ранее результатами [Лаговская И.В., 1997; Шевченко Л.Ф., 2000).
Основными структурными компонентами плацентарного ложа матки крыс являются децидуальные клетки и проходящие среди них преплацентарные кровеносные сосуды, а именно артерии и вены (табл. 2). Средняя площадь сечения преплацентарных артерий равна 22937,4±1751,3 мкм2.
В последах контрольной группы экспрессия сосудисто-эндотелиального фактора роста выявлена в трофобластических, децидуальных клетках и эндотелиоцитах. Аналогичная локализация изучаемого фактора отмечена многими исследователями в плацентах различных биологических видов животных и человека (Bogic L.V., 2001; Reynolds L.P., 2005; Wei P., 2004). По мнению Pfarrer C.D. et al. (2006), сосудисто-эндотелиальный фактор роста оказывает влияние на сосудистую проницаемость, плацентарный обмен, а также аутокринным путем регулирует миграционную активность инвазивного цитотрофобласта, опосредованно улучшая кровоснабжение органа и трофику плода.
Таблица 2
Удельный объем структурных компонентов плацентарного ложа матки
| Структурные компоненты | 1 группа (n=30) | 2 группа (n=30) | 3 группа (n=30) |
| Децидуальные клетки, % | 61,6±1,2 | 61,1±1,0 | 50,4±1,9 *** ^^^ |
| Артерии, в т.ч. - с гестационной перестройкой - без гестационной перестройки, % | 20,9±0,9 16,8±0,9 4,1±0,3 | 13,5±0,4 *** 6,5±0,4 *** 7,0±0,3 *** | 24,4±1,3 * ^^^ 20,1±1,2 * ^^^ 4,3±0,4 ^^^ |
| Вены, % | 8,0±0,5 | 7,0±0,4 | 9,1±0,5 ^^^ |
| Инвазивный цитотрофобласт, % | 6,5±0,3 | 3,4±0,3 *** | 5,4±0,3 * ^^^ |
| Гладкомышечные клетки, % | 2,9±0,2 | 3,6±0,3 * | 3,9±0,3 ** |
| Патологические очаги, в т.ч. -некроз, % - отек, % - воспаление, % | – – – – | 11,4±0,7 *** 1,5±0,2 *** 6,8±0,4 *** 3,1±0,2 *** | 6,9±0,5 *** ^^^ 0,6±0,1 *** ^^^ 2,2±0,2 *** ^^^ 4,1±0,3 *** ^^ |
Достоверность различий между группами 1-2 и 1-3: * - p<0,05 ** - p<0,01 *** - p<0,001
Достоверность различий между группами 2-3: ^ - p<0,05 ^^ - p<0,01 ^^^ - p<0,001
Локализация фактора Виллебранда в последе и плацентарном ложе матки соответствует общепринятому представлению о нем как о маркере эндотелия (Zhang E.G., 2002). В проведенном исследовании обнаружена экспрессия фактора Виллебранда не только в трофобластических клетках, выстилающих материнские лакуны лабиринта, но и базофильных клетках, окружающих синусоиды базальной части плаценты. Локализация фактора в базофильных клетках, по нашему мнению, связана с их специализацией по эндотелиальному типу.
От крыс контрольной группы получено 85 плодов со средней массой 3,79±0,04г и длиной тела 42,86±0,17 мм, что свидетельствуют об их развитии в физиологических условиях и зрелости (Гладкова А.И., 1992; Брюхин Г.В., 1995). Показатели пре-, постимпланатационной и общей эмбриональной гибели в группе крыс с неосложненным течением беременности составляют соответственно 10,6±1,5 %, 6,9±3,0 % и 17,0±2,2 %, что согласуется с данными ряда исследователей (Бородин Ю.И., 1992; Западнюк И.П., 1974; Спасов А.А., 2005).
- Морфологическая характеристика структурного субстрата
плацентарной недостаточности при экспериментальных нарушениях
маточного и плацентарного кровообращения
В группе с экспериментально нарушенным маточным и плацентарным кровотоком масса плацент (476,57±6,75 мг) крыс достоверно (р<0,001) снижена на 10 %, объем (0,72±0,01 см3) и площадь материнской поверхности (148,04±1,53 мм2) – соответственно на 9 % и 8 %. Аналогичную тенденцию в изменении органометрических параметров последов установили исследователи, проводившие ранее в эксперименте полное или частичное лигирование маточных артерий на 16-18 день беременности у крыс (Клименко П.А., 1982; Pan S.L., 2002). Снижение массы и объема плацент мы связываем с ишемией органа, о чем свидетельствует достоверное уменьшение удельного объема материнских лакун и плодовых капилляров в лабиринтной части плаценты (табл. 1).
Структурная перестройка маточного и плацентарного кровообращения, обусловленная перевязкой преплацентарных артерий, заключается, прежде всего, в неполной гестационной трансформации преплацетарных артерий, что подтверждается снижением удельной доли сосудов с завершенной перестройкой в 2,5 раза (табл. 2).
Такие артерии имеют тонкую стенку, площадь их просвета уменьшается до 11457±802 мкм2. Кроме того, в структуре плацентарного ложа крыс данной группы уменьшена удельная доля инвазивного циторфобласта (табл. 2), принимающего непосредственное участие в гестационной перестройке артерий. Подобные изменения в плацентарном ложе матки описаны у человека при гестозах, артериальной гипертензии беременных, плацентарной недостаточности, внутриутробной задержке развития плода и играют, по мнению исследователей, ведущую роль в развитии перечисленной патологии (Милованов А.П., 1999; Глуховец Б.И., 2002).
Следствием незавершенного ремоделирования артерий плацентарного ложа матки являются тромбоз материнских синусов базальной части периферических отделов плацент 2-й группы и ишемия соответствующих зон лабиринта с достоверным уменьшением площади сечения материнских лакун и плодовых капилляров (рис. 1). Площадь функционирующих материнских сосудов базальной части достоверно уменьшается и составляет 4470,2±222,7 мкм2 в центральных отделах и 4757,6±208,6 мкм2 на периферии.
Рис. 1 Площадь материнских лакун и плодовых капилляров
лабиринтного отдела плаценты, мкм2
Возможности адаптации структур в плацентах крыс к изменившимся условиям кровоснабжения ограничены по сравнению с человеком, они проявляются в основном увеличением количества, площади и степени кровенаполнения материнских синусоидов, лакун и плодовых капилляров. В плацентах крыс с нарушенным маточным и плацентарным кровотоком адаптационные процессы представлены только дилятацией материнских лакун в центральных отделах органа (рис. 1). Выраженное полнокровие лакун приводит к замедлению кровотока и развитию стазов в них, поэтому механизмы указанной адаптации малоэффективны. Подобные изменения, свидетельствующие о несостоятельности адаптации плацентарного кровообращения у крыс, обнаружены ранее исследователями при гипобарической гипоксии (Шевченко Л.Ф., 2000).
Таким образом, в плацентарном ложе и последах крыс 2-й группы развиваются дисциркуляторные расстройства, следствием которых является повреждение клеток и тканей. Свидетельство тому – расширение зон фибриноидного некроза, некробиоза и некроза клеток базальной части плацент, вакуолизация и фрагментация ядер трехслойного трофобласта. Удельный объем перечисленных структурных повреждений составил 15 % в центральных отделах плаценты и 18% на периферии. Повреждение ультраструктур трехслойного трофобласта, выполняющего функцию плацентарного барьера у крыс, проявляется уменьшением количества и деформацией микроворсинок на поверхности цитолеммы, деформацией ядер, деструкцией крист и просветлением матрикса гипертрофированных митохондрий, дилятацией и дегрануляцией цистерн эндоплазматического ретикулума. Гиперплазия и гипертрофия органелл в трофобластических клетках на начальных этапах компенсации завершается в стадию декомпенсации их деструкцией, что приводит к увеличению толщины плацентарного барьера. Перечисленные изменения в клетках являются следствием ишемии и кислородного голодания (Серов В.В., Пауков В.С., 1975). По мнению Корниловой Н.К. (2003) ультраструктурная патология щеточной каймы трофобластического эпителия является одной из основных причин снижения противосвертывающей функции в плаценте и гиперкоагуляции крови в материнском кровотоке. Уменьшение пиноцитозных везикул в цитоплазме клеток трехслойного трофобласта свидетельствует о снижении трансплацентарного транспорта. Альтерация структур плодных оболочек при нарушенном маточном и плацентарном кровотоке у крыс завершается расширением зоны фибриноида, коагуляцией цитоплазмы и десквамацией амниотического эпителия. При этом меняется ультраструктура эпителиоцитов амниона. В цитоплазме клеток преобладают расширенные дегранулированные цистерны эндоплазматичекого ретикулума и митохондрии с деструкцией внутренних крист. Цитоплазма отдельных клеток содержит гомогенный бесструктурный субстрат, который, по нашему мнению, является результатом полной деструкции органелл. Щеточная кайма эпителиоцитов с уменьшенным количеством укороченных и утолщенных микроворсинок. Вышепредставленная ультраструктурная патология клеток амниотического эпителия является следствием гипоксии.
Повреждение микроворсинок первого слоя трофобластических клеток, выстилающих материнские лакуны в плаценте и выполняющих функцию эндотелия, приводит, по нашему мнению, к гиперкоагуляции материнской крови и развитию вышеописанных тромбозов и стазов. Подтверждением нашего предположения является увеличение индекса экспрессии фактора Виллебранда (рис.2), являющегося маркером эндотелиальной дисфункции, на 20 % в лабиринтном и на 25 % в базальном отделах плацент, что согласуется с данными Varol E. (2005) и Balen S. (2007). Литературные данные свидетельствуют о повышении экспрессии изучаемого фактора в эндотелиальных клетках пуповины при гемической гипоксии (Trampont P., 2004) и преэклампсии (Roberts J.M., 1992).
Рис. 2 Индекс экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора Виллебранда (vWF) в плацентарном ложе и последе, у.е.
Уменьшение экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста в клетках децидуальной ткани, эндотелии сосудов плацентарного ложа матки на 13 % и клетках базальной части плаценты на 10 % по сравнению с показателями при неосложненном течении беременности (рис. 2), по нашему мнению, является следствием деструкции ультраструктур клеток, синтезирующих изучаемый фактор. Наши данные согласуются с исследованиями Крукиера И.И (2006), свидетельствующими о снижении синтеза VEGF плацентой при синдроме плацентарной недостаточности у женщин, а также с результатами эксперимента, проведенного Regnault T.R. et al. (2003) на модели внутриутробной гипоксии и задержки развития плода у овец. Работами указанных авторов (Regnault T.R. et al., 2003) показано, что в плаценте овец при плацентарной недостаточности, созданной путем гипертермии, происходит нарушение синтеза VEGF и повреждение его рецепторов. С другой стороны Bartha J.L. et al. (2003) указывают на увеличение концентрации сосудисто-эндотелиального фактора роста в крови женщин с преэклампсией, сопровождающейся плацентарной недостаточностью. Однако, по мнению Padavala S. et al. (2006) решающее значение при оценке задержки внутриутробного развития плода имеет соотношение в плацентарной ткани самого фактора и его рецепторов. При уменьшении оксигенации материнской крови в эксперименте авторы наблюдали сверхсинтез растворимого VEGF-рецептора (sVEGF-1), блокирующего действие изучаемого фактора. По нашему мнению, уменьшение синтеза VEGF трофобластическими и эндотелиальными клетками сопровождается снижением миграционной активности инвазивного цитотрофобласта и задержкой новообразования сосудов в плацентарном ложе и последе, что приводит в свою очередь к нарушению формирования адаптационных процессов со стороны маточного и плацентарного кровотока.
Развивающиеся в плацентах крыс 2-й группы дисциркуляторные расстройства и повреждение трофобластических клеток влияют на трофическую функцию органа. Происходит достоверное (р<0,001) снижение гистохимической активности ДНК и РНК в клетках трофобласта и амниотического эпителия по сравнению с контролем. Практически полное отсутствие гранул РНК в цитоплазме трехслойного трофобласта согласуется с ультраструктурными изменениями этих клеток в виде дегрануляции эндоплазматической сети. Подобные результаты, свидетельствующие об уменьшении содержания РНК и ДНК в плацентарной ткани при лигировании маточных артерий у крыс, получены ранее Velasco E.G. et al. (1973). В специализированных клетках лабиринта и базальной части плаценты, а также в амниотическом эпителии резко снижается количество гликогена, а в центральных отделах достоверно уменьшен удельный объем гликогеновых клеток (табл. 2), что указывает на дефицит энергетического субстрата для обеспечения активного транс- и параплацентарного транспорта и согласуется с результатами экспериментов, воспроизводящих высокогорную гипоксию (Лаговская И.В., 1997; Шевченко Л.Ф., 2000). Поскольку в процессе гестации у крыс базофильные клетки базальной зоны последа трансформируются в гликогеновые (Davies T., 1968), то уменьшение удельного объема последних является дополнительным признаком структурной незрелости плацент при нарушении маточного и плацентарного кровотока.
Таким образом, вышеописанные дисциркуляторные нарушения в сочетании с альтерацией трофобластических клеток в плацентах и плацентарном ложе матки крыс 2-й группы составляют, по нашему мнению, патоморфологический субстрат хронической плацентарной недостаточности, развивающейся в результате лигирования 1\3 пучка преплацентарных артерий на 15-й день беременности. В ходе эксперимента установлено, что в основе патогенеза плацентарной недостаточности у крыс при этом способе моделирования нарушений маточного и плацентарного кровотока лежит незавершенная гестационная перестройка артерий плацентарного ложа, сопровождающаяся уменьшением васкуляризации маточно-плацентарной области и развитием дисциркуляторных расстройств в плаценте. Циркуляторная гипоксия тканей последа приводит к повреждению структуры клеток трофобласта и амниотического эпителия, что в свою очередь ведет к нарушению транспортной, барьерной, трофической и синтезирующей функций плаценты. Кроме того, деструкция щеточной каймы клеток первого слоя трехслойного трофобласта, сопровождающаяся повышением экспрессии фактора Виллебранда, вероятно, способствует гиперкоагуляции материнской крови и усугубляет по принципу «порочного круга» расстройства кровообращения в плаценте. Совокупность патоморфологических изменений, обнаруженных в плаценте и плацентарном ложе у крыс при лигировании преплацентарных артерий, позволяет провести аналогию с маточно-плацентарной формой (по А.П. Милованову, 1999) хронической плацентарной недостаточности у человека, в основе которой лежит прогрессирующая облитерация спиральных артерий, связанная с недостаточностью второй волны инвазии цитотрофобласта. Для этой формы характерны некроз и деструкция микроворсинок синцитиотрофобласта с последующей активацией тромбообразования в межворсинчатом пространстве, формированием ишемических инфарктов и афункциональных зон.
Слабая выраженность приспособительных процессов и их несостоятельность вследствие развивающихся стазов свидетельствует о декомпенсированной форме плацентарной недостаточности и приводит к задержке внутриутробного развития плодов, о чем свидетельствует достоверное (р<0,001) уменьшение их массы (2,94±0,07 г) на 22,4 % и длины тела (38,70±0,48 мм) на 9,7 %. Постимплантационная гибель эмбрионов при плацентарной недостаточности у крыс достигает 14,4±1,7 %, что в два раза превышает подобную при неосложненном течении беременности.
Полученные в эксперименте результаты позволяют отнести к патоморфолигическим критериям хронической плацентарной недостаточности, вызванной лигированием 1/3 пучка преплацентарных артерий у крыс на 15-й день беременности, определенные параметры. Прежде всего, это уменьшение массы последов и плодов крыс на 10 % и 22 %, соответственно. В плацентарном ложе матки основным диагностическим признаком развивающихся нарушений маточного и плацентарного кровообращения, по нашему мнению, является незавершенная гестационная перестройка в 52 % артерий, сопровождающаяся уменьшением их площади сечения в 2 раза и удельного объема на 35 %. Для краевых отделов плаценты характерно формирование обтурирующего тромбоза материнских сосудов в базальной части органа и зон субхориальной ишемии в лабиринте, в результате чего площадь материнских лакун уменьшается на 37 %. К диагностически значимым нарушениям кровообращения в центральных отделах плаценты следует отнести застойное полнокровие в дилятированных материнских лакун (на 30 % по сравнению с контролем) с формированием в них неразрешенного стаза эритроцитов. На нарушение кровотока в плодовом звене указывает уменьшение площади капилляров на 20 %. Удельный объем отложений фибриноида в последе при плацентарной недостаточности у крыс составляет 13%, а патологических очагов в виде тромбоза синусоидов, ишемии лабиринта, деструкции трехслойного трофобласта и базофильных клеток 5,5 %.
3. Структурные перестройки в последах и плацентарном ложе
при профилактике и коррекции нарушенного в эксперименте маточного и
плацентарного кровообращения природными гуминовыми соединениями
С целью изучения влияния гуминовых соединений, экстрагированных из торфов Верхневолжского региона, на маточный и плацентарный кровоток и соматическое развитие плодов в условиях плацентарной недостаточности крысы 3-й группы на протяжении всей беременности получали per os вышеуказанные соединения. Суточная доза составила 10 мг/кг. Выбор суточной дозы не случаен и основывается на исследовании Сарыевой О.П. (2006), доказавшей при пролонгированном изучении на трех последующих поколениях потомства крыс отсутствие эмбриотоксического и тератогенного влияния гуминовых веществ в указанной дозировке. По данным эксперимента Obminska-Domoradzka B. et al. (1993) и Сарыевой О.П. (2006) суточная доза гуминовых соединений, равная 10 мг/кг, вызывает сбалансированный иммуномодулирующий эффект.
Применение гуминовых соединений у животных исследуемой группы сопровождалось достоверным увеличением массы последов (510,85±6,42 мг) по сравнению со 2-й группой (р<0,001). Изменение массы плаценты обусловлено увеличением объема органа (0,82±0,01 см3) за счет повышенного кровенаполнения, которое на тканевом уровне проявляется дилятацией до 5764,2±232,4 мкм2 в центре и 6130,5±297,8 мкм2 на периферии органа и гиперемией материнских синусоидов базального отдела, а также увеличением площади лакун и плодовых капилляров лабиринта (рис. 1). Удельный объем указанных структур достоверно увеличивается по сравнению со 2-й группой (табл. 2). Кроме измения площади синусоидов базального отдела плаценты и артерий плацентарного ложа достоверно увеличивается количество указанных сосудов на единицу площади по сравнению с предшествующими группами (рис. 3), что, вероятно, связано с ангиогенной активностью гуминовых соединений, которая доказана на модели инфаркта миокарда у крыс (Krzeminski T.F., 2005).
Рис. 3 Количество материнских синусов базльного отдела плаценты и артерий плацентарного ложа в 1 мм2
На фоне повышения васкуляризации маточно-плацентарной области под влиянием гуминовых веществ в последах крыс исследуемой группы в 2 раза снижается удельный объем фибриноида и патологических очагов в виде деструкции трофобластических клеток, нарушений кровообращения в виде тромбозов и стазов (табл. 2). Ультраструктурные изменения в трехслойном трофобласте в центре лабиринтного отдела плацент крыс, получавших гуминовые соединения, характеризуются сформированной щеточной каймой на поверхности клеток первого слоя, обращенной в просвет материнских лакун. Перестройки на клеточном уровне в трехслойном трофобласте характеризуются гиперплазией митохондрий и гранулярного эндоплазматического ретикулума, которая косвенно свидетельствуют о компенсаторной активации плацентарного метаболизма под влиянием гуминовых веществ. На периферии лабиринта в клетках первого трофобластического слоя наряду с гипоплазией микроворсинок сохраняется деструкция крист митохондрий и просветление их матрикса.
Подтверждением активации метаболизма в последе является достоверное увеличение количества ДНК, РНК и гликогена в трофобласте и амниотическом эпителии по сравнению со 2-й группой. В лабиринте и базальной части плацент 3-й группы увеличивается удельный объем гликогеновых клеток. Данные об активации синтеза ДНК и РНК гуминовыми веществами согласуются с результатами исследований Maslinski C. et al. (1995). Согласно теории В.В. Демина (2004) гуминовые соединения поглощаются клетками путем эндоцитоза и подвергаются впоследующем ферментативному гидролизу, в результате которого образуются аминокислоты, моносахара и нуклеотиды, активно включающиеся в метаболизм.
Таким образом, в последах и плацентарном ложе матки под влиянием природных гуминовых соединений развивается ряд адаптивных реакций, приводящих к повышению васкуляризации органа и увеличению удельного объема сосудов в материнском и плодовом русле. Гиперваскуляризация плацент приводит к улучшению трофики тканей и сопровождается уменьшением количества клеток с деструкцией ультраструктур, активацией синтеза нуклеиновых кислот и гликогена в последе. Вышеперечисленные структурные перестройки, происходящие под действием гуминовых соединений в последах и плацентарном ложе матки крыс 3-й группы, позволяют отнести изучаемые вещества к корригирующим плацентарную недостаточность в эксперименте. Морфологическим подтверждением корригирующего действия является преобладание в плацентах крыс процессов адаптации над альтерацией и нарушениями маточного и плацентарного кровотока.
Внутриутробное развитие плодов 3-й группы соответствует сроку гестации. Масса плодов крыс (3,96±0,06 г) в группе с коррекцией плацентарной недостаточности гуминовыми соединениями увеличивается на 35 % по сравнению со 2-й группой, а длина тела (44,79±0,35 мм) – на 15 % (р<0,001). Применение гуминовых веществ с первого дня беременности снижает в 2,5 раза (р<0,05) доимплантационную эмбриональную гибель (4,8±1,6 %) по сравнению с обеими сравниваемыми группами. Коррекция плацентарной недостаточности у животных 3-й группы приводит также к снижению постимплантационной гибели (6,0±1,7 %). Следовательно, гуминовые соединения, экстрагированные из торфа, в условиях экспериментальной плацентарной недостаточности профилактируют гибель плода и задержку внутриутробного развития. Использование гуминовых соединений с целью повышения плодовитости, стимулиции роста плодов и повышения общей резистентности потомства нашло свое место в ветеринарии (Жорина Л.В., 1991; Бокова Т.И., 2000).
Результаты эксперимента показывают, что гуминовые соединения обладают биологической активностью, способной благоприятно влиять на маточный и плацентарный кровоток и внутриутробное развитие плода при плацентарной недостаточности. Однако для дальнейшего изучения механизмов биологического действия данных соединений в ближайшей перспективе необходимо определить их биодоступность и фармакокинетические характеристики. Одновременно необходимо разработать способ биологической стандартизации веществ, полученных из природного сырья. Только при соблюдении указанных условий возможно проведение дальнейших испытаний гуминовых соединений на доклиническом и клиническом этапах.
ВЫВОДЫ
- В патогенезе декомпенсированной плацентарной недостаточности у крыс, созданной в эксперименте путем лигирования преплацентарных сосудов, основную роль играют нарушения материнского и плодового кровообращения, альтерация трофобластических клеток, несостоятельность адаптивных процессов и гестационной трансформации сосудов.
- Патоморфологическим субстратом развивающейся в эксперименте плацентарной недостаточности являются незавершенное гестационное ремоделирование артерий плацентарного ложа, тромбозы материнских синусоидов базальной части плаценты, ишемия лабиринта в краевых отделах, дилятация и неразрешенные стазы эритроцитов в материнских лакунах.
- Плацентарная недостаточность у крыс сопровождается увеличением экспрессии фактора Виллебранда в трехслойном трофобласте лабиринта плаценты на 20 % и периваскулярных базофильных клетках базальной части органа на 25%, что свидетельствует о формировании феномена эндотелиальной дисфункции. Альтерация трофобластических, базофильных и децидуальных клеток приводит к снижению уровня экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста на 10 % в плаценте и на 13 % в плацентарном ложе по сравнению с подобными показателями в последах при неосложненном течении беременности.
- Следствием плацентарной недостаточности у крыс является увеличение постимплантационной гибели до 14,4 % и задержка внутриутробного развития плодов с уменьшением массы плодов на 22 % и длины тела на 10 % по сравнению с параметрами при неосложненном течении беременности.
- Основными морфологическими диагностическими критериями плацентарной недостаточности у крыс при лигировании 1/3 пучка преплацентарных артерий, являются уменьшение массы последов на 10 %, незавершенная гестационная перестройка в 52 % артерий плацентарного ложа с уменьшением их площади сечения в 2 раза и удельного объема на 35 %. Для плацентарной недостаточности характерно уменьшение площади краевых материнских синусоидов в базальной части органа на 36 %, площади периферических материнских лакун лабиринта на 37 %, площади плодовых капилляров на 20 %, дилятация материнских лакун центральных отделов плаценты на 30 % с развитием в них неразрешенного стаза эритроцитов, увеличение удельного объема отложений фибриноида до 13% и патологических очагов, представленных тромбозом синусоидов, ишемией лабиринта, деструкцией трехслойного трофобласта и базофильных клеток до 5,5 %.
- Структурные перестройки в плацентах крыс, получавших на протяжении всей беременности гуминовые соединения в дозе 10 мг/кг на фоне перевязки преплацентарных артерий, связаны с увеличением васкуляризации маточно-плацентарной области в результате дилятации, гиперемии и гиперплазии синусоидов базальной части плаценты и артерий плацентарного ложа. Гуминовые соединения, экстрагированные из торфа, в условиях экспериментальной плацентарной недостаточности предотвращают гибель эмбрионов и задержку внутриутробного развития плода.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
- Кузнецов Р.А., Курицына О.П., Баринова О.М., Перетятко Л.П. Влияние природных гуминовых соединений на маточно-плацентарное кровообращение у крыс в эксперименте //Нижегородский медицинский журнал. – 2005. – № 3. - С. 61-64.
- Сарыева О.П., Кузнецов Р.А., Перетятко Л.П., Вашурина И.Ю., Калинников Ю.А., Погорелова А.С. Влияние гуминовых соединений различного происхождения на иммунные органы экспериментальных животных // Тезисы V Всеросс. научн. семинара «Химия и медицина». – Уфа, 2005. – С. 204-207.
- Погорелова А.С., Кузнецов Р.А., Сарыева О.П., Вашурина И.Ю., Калинников Ю.А., Перетятко Л.П. Препарат из торфа для акушерства, гинекологии и перинатологии //Тезисы V Всеросс. научн. семинара «Химия и медицина». – Уфа, 2005. – С. 198-201.
- Кузнецов Р.А. Влияние природных гуминовых кислот на плацентарное кровообращение у крыс в эксперименте. // Тез. докладов научн. конференции «Молодая наука – развитию Ивановской области». – Иваново, 2005. - С. 183-185.
- Сарыева О.П., Кузнецов Р.А., Перетятко Л.П. Механизмы влияния природных гуминовых соединений на иммунные органы экспериментальных животных // В сб. научн. тр. «Современные проблемы материнства и детства». – Иваново, 2005. – С.100-105.
- Кузнецов Р.А., Сарыева О.П., Перетятко Л.П. Эффекты влияния гуминовых соединений на маточно-плацентарное кровообращение в эксперименте //В сб. тез. республик. научно-практ. конф. «Кардиологические проблемы в акушерстве, гинекологии и перинатологии». – Иваново, 2006. – С. 113-114.
- Кузнецов Р.А. Роль сосудисто-эндотелиального фактора роста и фактора Виллебранда в коррекции экспериментальной плацентарной недостаточности гуминовыми соединениями. // В сб. тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – С.-Петербург, 2007. – С. 72-74.
- Кузнецов Р.А, Сарыева О.П. Экспрессия сосудисто-эндотелиального фактора роста и фактора Виллебранда в условиях коррекции плацентарной недостаточности гуминовыми соединениями в эксперименте. // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2007». – Иваново, 2007. – С. 18.
- Кузнецов Р.А., Перетятко Л.П. Основные механизмы профилактики и коррекции плацентарной недостаточности гуминовыми соединениями в эксперименте. // Вестник новых медицинских технологий. – 2007. – № 3. – С. 19-23.
- Перетятко Л.П., Проценко Е.В., Кузнецов Р.А., Кудряшова А.В. Плацентарные механизмы и экспериментальная терапия синдрома задержки внутриутробного развития плода. // Материалы IX Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – Москва, 2007. – С. 189-190.
- Кузнецов Р.А., Перетятко Л.П. Морфологическая характеристика плацентарной недостаточности при применении гуминовых соединений в условиях эксперимента // Морфологические ведомости. – 2007. – № 3-4. – С. 36-39.
Соискатель Кузнецов Р.А.
