Пути оптимизации ранней диагностики и прогноза рака мочевого пузыря
На правах рукописи
АЛЬ-ШУКРИ
Адель Сальманович
Пути оптимизации ранней диагностики
и прогноза рака мочевого пузыря
14.01.23 – урология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург
2010
Работа выполнена на кафедре урологии и в отделе молекулярно-генетических технологий Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в клинике урологии медицинского университета «Шарите» (Берлин, Германия).
Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ
доктор медицинских наук,
профессор Ткачук Владимир Николаевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,
профессор Петров Сергей Борисович,
доктор медицинских наук,
профессор Коган Михаил Иосифович,
доктор медицинских наук,
профессор Александров Валерий Павлович
Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Санкт-Петербургская педиатрическая
медицинская академия» министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Защита диссертации состоится « ___ » _____________ 2011 года
в _______ часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.090.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого 6/8.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова».
Автореферат разослан « ___ » _____________ 2010 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, доцент Мясникова Марина Олеговна
- 27 -
Список сокращений
РМП – рак мочевого пузыря
ТУР – трансуретральная резекция
5-АЛА – аминолевулиновая кислота
ММП – матрикс-металлопротеаза
ОКТ – оптическая когерентная томография
УЗИ – ультразвуковое исследование
ВТА – (bladder tumor antigen) – антигены опухоли мочевого пузыря
CIS – карцинома in situ
ФДД – фотодинамическая диагностика
КИФ – коэффициент интенсивности флюоресценции
n – количество
min – минимальное значение
max – максимальное значение
ФЦС – флюоресцентная цистоскопия
ХПН – хроническая почечная недостаточность.
- 26 -
Зассеев Р.Д.).// Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии: Материалы конференции. – СПб., 2007, - с.61-62.
- Новые возможности прогнозирования прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря при помощи компьютерной кариометрии (соавт. – Аль-Шукри С.Х., Рыбакова М.Г., Корнеев И.А.).// XI съезд урологов России: Материалы. – М., 2007, - с.376-377.
- Прогностическая ценность исследования аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи у больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря (соавт. – Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А., Агеев М.Н.).// IX Российский онкологический конгресс: Материалы. – М., 2005, - с.204-205.
- Обработка изображения в оптической когерентной томографии для исследования биотканей (Tomo-View 1,0) (соавт. – Таратин М.А., Аль-Шукри С.Х., Данильченко Д.И.).// Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007614173 от 01 октября 2007г., выд. Федеральной службой по интеллектуальной собственности и патентам.
- Возможности компьютерной кариометрии в прогнозировании клинического течения поверхностных переходно-клеточных карцином мочевого пузыря (соавт. –Аль-Шукри С.Х., Рыбакова М.Г., Корнеев И.А., Ягмуров О.Д.).// 1-ый съезд Белорусской ассоциации урологов: Материалы. – Минск, 2008 – с.243.
- Комплексный подход к прогнозированию клинического течения переходно-клеточного рака мочевого пузыря (соавт. –Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А., Завьялова Е.С., Ягмуров О.Д., Козлов В.В.).// Современные технологии в диагностике и лечении урологических заболеваний: Материалы конференции. – СПб., 2009 – с.5-6.
- 3 -
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Рак мочевого пузыря является одним из наиболее часто встречающихся новообразований мочевыводящих путей (Аль-Шукри С.Х. и Ткачук В.Н., 2000; Аполихин О.И. и соавт., 2008; Jemal A. и соавт., 2007). По данным Всемирной Организации Здравоохранения рак мочевого пузыря составляет 70% от всех опухолей мочевой системы (Давыдов М.И. и Аксель Е.М., 2006). В России в 1995-2005 гг. заболеваемость раком мочевого пузыря увеличилась на 58,6% - с 5,76 до 9,14 на 100000 населения (Аполихин О.И. и соавт., 2008). Заболеваемость раком мочевого пузыря ежегодно увеличивается во всех странах мира (Plesko I. и соавт., 2004), а в России прирост заболеваемости ежегодно составляет около 3% (Чиссов В.И. и соавт., 2005).
До сих пор высока летальность от рака мочевого пузыря. В России уже на первом году после установления диагноза от рака мочевого пузыря умирают 32,2% больных (Чепуров Д.А., 2005). Это связывают с поздним выявлением заболевания, ибо первую и вторую стадии рака мочевого пузыря диагностируют лишь у 42,2% больных (Матвеев Б.П. и соавт., 2003). Более низкая выявляемость поверхностных опухолей мочевого пузыря в России связана с недостаточным внедрением новых методов распознавания этой болезни.
В последние годы способы диагностики рака мочевого пузыря подразделяют на стандартные методы исследования и новые методы исследования (Soloway M., 2003; Loebell P. и соавт., 2006; Setty B. и соавт., 2007), однако новые методики остаются до сих пор недостаточно изученными, а поэтому они и слабо внедрены в медицинскую практику (Александров В.П. и соавт., 2002). Несмотря на разработки новых методов ранней диагностики рака мочевого пузыря и усовершенствование хирургической тактики лечения остаются весьма высокими как частота рецидивирования опухоли после оперативных методов лечения (40-83%), так и прогрессирование (34-79%) этой болезни (Комяков Б.К. и соавт., 2004; Корнеев И.А., 2006; Агеев М.Н., 2008; Ramos D. и соавт., 2004; Langbein S. и соавт., 2006; Raab S. и соавт., 2007; Schmitz-Dragen B. и соавт., 2008; Pasin E. и соавт., 2008). Показатели пятилетней выживаемости у больных раком мочевого пузыря остаются низкими и в зависимости от стадии болезни варьируют от 14 до 93% (Матвеев Б.П., 2003; Bassi Р. и соавт., 1999).
Рак мочевого пузыря наносит обществу значительный социально-экономический ущерб (Лопаткин Н.А. и соавт., 2004), поэтому своевременное распознавание и правильно выбранное лечение этой болезни с обязательным учётом определения её прогноза являются актуальной
- 4 -
проблемой современной медицины. Такими методами, позволяющими распознать рак мочевого пузыря в начальной стадии болезни и определить прогноз заболевания, с учётом стандартных методов исследования, являются фотодинамическая диагностика (флюоресцентная цистоскопия с использованием 5-аминолевулиновой кислоты), определение матрикс-металлопротеаз в моче, выполнение оптико-когерентной томографии, исследование аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи, изучение прогностической ценности клеток-эффекторов стромы опухоли, изучение ангиогенеза опухоли и применение компьютерной кариометрии, а также изучение информативности прогностических молекулярно-генетических маркеров.
Целью исследования явилась оценка комплексного использования новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря в начальных стадиях болезни и выявление способов прогнозирования клинического течения поверхностного переходноклеточного рака мочевого пузыря.
Задачи исследования:
- Оценить диагностическую и прогностическую ценность клинических факторов у больных раком мочевого пузыря.
- Определить значение флюоресцентной цистоскопии для ранней диагностики рака мочевого пузыря и определения прогноза заболевания.
- Изучить диагностическую и прогностическую ценность определения матрикс-металлопротеаз в моче у больных раком мочевого пузыря.
- Уточнить место оптико-когерентной томографии для диагностики и определения прогноза рака мочевого пузыря.
- Обосновать диагностическую и прогностическую ценность исследования аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи у больных раком мочевого пузыря.
- Дать комплексную оценку морфологических признаков (клеток-эффекторов стромы опухоли, ангиогенеза опухоли и компьютерной кариометрии) для ранней диагностики и оценки прогноза у больных раком мочевого пузыря.
- Изучить информативность молекулярно-генетических факторов для ранней диагностики и оценки прогноза у больных раком мочевого пузыря.
Научная новизна исследования. Впервые изучены молекулярно-генетические маркеры рака мочевого пузыря и доказана их роль в диагностике ранних стадий опухоли и определении прогноза заболевания. Установлено, что информативность прогностических молекулярно-генетических маркеров у больных раком мочевого пузыря может быть
- 25 -
- Место оптико-когерентной томографии в диагностике рака мочевого пузыря (соавт.- Данильченко Д.И., Ткачук В.Н.).// Урология, 2009 - № 2 – с.42-44 (из списка ВАК РФ).
- Прогностические молекулярно-генетические маркеры рака мочевого пузыря (соавт.- Ткачук В.Н., Волков Н.М., Дубина М.В.).// Онкоурология, 2009 – № 2 – с.78-82 (из списка ВАК РФ).
- Комплексный подход к прогнозированию клинического течения переходно-клеточного рака мочевого пузыря (соавт.- Завьялова Е.С., Корнеев И.А., Ягмуров О.Д., Козлов В.В.).// Учёные записки СПб ГМУ им. акад. И.П.Павлова, 2009 – том XVI, № 1 – с.59-64 (из списка ВАК РФ).
- Диагностическая и прогностическая ценность определения матрикс-металлопротеаз в моче у больных раком мочевого пузыря (соавт. – Данильченко Д.И.).// Нефрология, 2009 – том 13, № 1 – с.87-89 (из списка ВАК РФ).
- Роль антигенов Ki-67, p-53 и bci-2 в прогнозировании клинического течения рака мочевого пузыря (соавт. – Завьялова Е.С., Корнеев И.А., Ягмуров О.Д.).// Нефрология, 2009 – том 13, № 1 – с.90-95 (из списка ВАК РФ).
- Возможности молекулярно-генетических исследований для прогнозирования рака мочевого пузыря (соавт. – Ткачук В.Н., Дубина М.В.).// Нефрология, 2010 – том 14, № 2 – с.67-71 (из списка ВАК РФ).
- Значение классических морфологических признаков для прогнозирования течения переходно-клеточного рака мочевого пузыря (соавт. –Завьялова Е.С., Корнеев И.А., Ягмуров О.Д.).// Нефрология, 2010 – том 14, № 1 – с.81-85 (из списка ВАК РФ).
- Диагностика поверхностного рака мочевого пузыря при помощи серебрения ядрышковых протеинов клеток осадка мочи (соавт. – Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А., Агеев М.Н и др.).// Актуальные вопросы урологии: сборник научных работ, посвящённый 100-летию СПб общества урологов (под ред.-В.Н.Ткачука), СПб., 2007, - с.23-28.
- Общие принципы лечения больных раком мочевого пузыря. Значение клинических, гистологических и биологических факторов прогноза для выбора методов лечения (соавт. – Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А.).// Практическая онкоурология: избранные лекции (под ред. А.В.Воробьёва), - СПб., 2008, - с.115-132.
- Новые возможности компьютерного морфометрического анализа для прогнозирования течения переходно-клеточного рака мочевого пузыря (соавт. – Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А., Завьялова Е.С., Козлов В.В.,
- 24 -
- Информативность прогностических молекулярно-генетических маркеров у больных раком мочевого пузыря может быть повышена путём комбинированного анализа нескольких молекулярных факторов.
- Оптико-когерентную томографию следует применять не только для диагностики рака мочевого пузыря, но и при выполнении трансуретральной резекции опухоли для более точного контроля радикальности оперативного вмешательства, что позволяет улучшить прогноз заболевания.
- Для интерпретации ОКТ-изображений следует применять ЭВМ-программу «Tomo View – 1.0», которая позволяет повысить эффективность этого метода исследования.
- Концентрацию металлопротеаз-2 и металлопротеаз-9 в моче следует определять у всех больных раком мочевого пузыря для уточнения глубины инвазии и степени дифференцировки опухоли.
- Для выявления рака мочевого пузыря и определения прогноза заболевания у всех больных следует изучить характер распределения аргентофильных нуклеопротеидов в клетках осадка мочи.
- Компьютерную кариометрию следует применять для уточнения прогноза рака мочевого пузыря, так как этот метод исследования позволяет получить представление о пролиферативной активности опухоли и предсказать её биологическое поведение.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Изучение прогностической ценности клеток-эффекторов стромы переходноклеточных карцином мочевого пузыря (соавт.- Корнеев И.А.., Аль-Шукри С.Х.).// Онкоурология, 2007 - № 4 – с.26-30 (из списка ВАК РФ).
- Прогностическая ценность флюоресцентной цистоскопии с использованием 5-аминолевулиновой кислоты у больных раком мочевого пузыря (соавт.- Аль-Шукри С.Х., Данильченко Д.И., Корнеев И.А.).// Нефрология, 2005 – том 9, № 4 – с. 80-84 (из списка ВАК РФ).
- Распределение аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи и прогноз у больных поверхностным раком мочевого пузыря (соавт.- Аль-Шукри С.Х., Корнеев И.А., Агеев М.Н.).// Нефрология, 2006 – том 10, № 3 – с.98-101 (из списка ВАК РФ).
- Прогностическая роль ангиогенеза опухоли в течении переходно-клеточного рака мочевого пузыря (соавт.- Корнеев И.А., Ягмуров О.Д., Завьялова Е.С.).// Нефрология, 2008 – том 12, № 4 – с.77-80 (из списка ВАК РФ).
- 5 -
повышена путем комбинированного анализа нескольких молекулярных факторов. Доказано, что выполнение флюоресцентной цистоскопии у больных раком мочевого пузыря позволяет не только улучшить раннюю диагностику заболевания, но и уменьшить риск рецидивирования опухоли после ее трансуретральной резекции, что является положительным прогностическим фактором. Обосновано положение о том, что оценка пролиферативной активности опухоли путём определения уровня металлопротеаз в моче является эффективным методом определения стадии рака мочевого пузыря. Доказано, что оптико-когерентная томография позволяет значительно улучшить диагностику рака мочевого пузыря в ранних стадиях болезни. Для повышения эффективности оптико-когерентной томографии разработана новая оригинальная компьютерная программа «Tomo View – 1,0». Впервые установлено, что изучение характера распределения аргентофильных нуклеопротеидов в клетках осадка мочи улучшает диагностику поверхностного рака мочевого пузыря. Выявлены возможности новых морфологических признаков (маркеров ангиогенеза опухоли, клеток-эффекторов стромы опухоли и маркеров клеточного скелета стромы опухоли), которые позволяют не только уточнить диагноз рака мочевого пузыря, но и более точно прогнозировать клиническое течение болезни. Впервые обосновано положение о том, что для ранней диагностики и определения прогноза рака мочевого пузыря следует проводить комплексное обследование больных, заключающееся не только в выполнении стандартных методов диагностики, но и в исследовании аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи, выполнении флюоресцентной цистоскопии, оптико-когерентной томографии, изучении прогностической ценности клеток-эффекторов стромы опухоли, ангиогенеза стромы опухоли, ангиогенеза опухоли и компьютерной кариометрии, а также изучение прогностичности молекулярно-генетических маркеров.
Практическая значимость работы. Использование комплекса новых онкомаркеров при диагностике рака мочевого пузыря позволяет более точно осуществлять диагностику этой болезни, особенно в ранних стадиях заболевания, а также определять прогноз заболевания. Эти данные позволяют уточнить показания к различным методам лечения больных, страдающих раком мочевого пузыря. В клиническую практику внедрен усовершенствованный метод обработки данных изображений, получаемых при оптико-когерентной томографии, что позволяет повысить эффективность этого метода исследования.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Перспективным направлением в диагностике ранних стадий рака мочевого пузыря и определении прогноза заболевания является выявление
- 6 -
молекулярно-генетических маркеров, которые позволяют правильно классифицировать опухоль по степени инвазии и адекватно оценивать прогноз заболевания.
- Оценка пролиферативной активности опухоли мочевого пузыря путём определения уровня металлопротеаз в моче является простым и эффективным методом выявления новообразования и помогает определить прогноз заболевания.
- Оптико-когерентная томография позволяет значительно улучшить диагностику рака мочевого пузыря в ранних стадиях.
- Морфологические признаки (маркеры ангиогенеза опухоли, характеристика клеток-эффекторов стромы опухоли, маркеры клеточного скелета стромы опухоли) позволяют не только уточнить диагноз, но и более точно прогнозировать клиническое течение рака мочевого пузыря.
- Для ранней диагностики и определения прогноза рака мочевого пузыря следует проводить комплексное обследование больных, заключающееся не только в выполнении стандартных методов диагностики, но и применении новых малоинванзивных методик (изучении ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи, выполнении флюоресцентной цистоскопии и оптико-когерентной томографии, определении новых морфологических признаков опухоли и выявлении молекулярно-генетических маркеров опухоли).
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы урологической клиники СПб ГМУ им. акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 17), урологического отделения Мариинской больницы гор. Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, Литейный пр., 57), урологического отделения Ленинградской областной клинической больницы (Санкт-Петербург, пр. Луначарского, 45), урологического отделения Мурманской областной клинической больницы (Мурманск, ул. Клиническая, 6), а также используются в программе обучения студентов и при постдипломном обучении врачей-урологов на кафедре урологии СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 17).
Связь с планом научных исследований. Диссертация выполнена по плану НИР Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова по проблеме «Разработка новых и усовершенствование существующих методов профилактики, диагностики и лечения урологических заболеваний», утвержденной Министерством Здравоохранения и социального развития РФ, номер государственной регистрации 01200212891.
- 23 -
оперативного лечения, являются инфильтративный характер роста клеток, множественность поражения и большие размеры опухоли.
- Выполнение флюоресцентной цистоскопии у больных раком мочевого пузыря позволяет не только улучшить раннюю диагностику заболевания, но и уменьшить риск рецидивирования опухоли после её трансуретральной резекции, что является положительным прогностическим фактором.
- Оценка пролиферативной активности опухоли путём определения уровня металлопротеаз в моче является простым и эффективным методом выявления рака мочевого пузыря и помогает определить прогноз заболевания. Концентрация металлопротеаз в моче зависит от глубины инвазии и степени дифференцировки опухоли.
- Оптико-когерентная томография позволяет значительно улучшить диагностику рака мочевого пузыря в ранних стадиях за счёт более точного выявления плоских внутриэпителиальных и неинвазивных опухолей. Разработанная нами для повышения информативности и улучшения качества изображения различных слоёв мочевого пузыря компьютерная программа «Tomo View – 1.0» с получением цветных томограмм позволяет повысить эффективность этого метода исследования.
- Исследование характера распределения аргентофильных нуклеопротеинов в клетках осадка мочи позволяет улучшить диагностику поверхностного рака мочевого пузыря и уточнить принадлежность больных к группе высокого риска рецидивирования и прогрессирования опухоли.
- Для определения прогноза рака мочевого пузыря целесообразно определять мутации генов FGFR3 и р53. Мутации экзона 7 гена FGFR3 характеризуют благоприятное течение заболевания, а мутации в экзонах 5, 6 и 7 гена р53 наблюдаются при неблагоприятном течении рака мочевого пузыря.
Практические рекомендации
- Для ранней диагностики и определения прогноза рака мочевого пузыря следует проводить комплексное обследование больных, заключающееся не только в выполнении стандартных методов диагностики, но и в исследовании аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи, выполнении флюоресцентной цистоскопии с использованием 5-аминолевулиновой кислоты и оптико-когерентной томографии, изучении прогностической ценности клеток-эффекторов стромы опухоли, ангиогенеза опухоли и компьютерной кариометрии, а также изучение прогностичности молекулярно-генетических маркеров.
- 22 -
6 была выявлена замена аденина (А) на гуанин (G) в кодоне 13419 с соответствующей заменой аминокислоты тирозина (Tyr) на цистин (Cys) в 220 позиции белка. Данная мутация была ассоциирована с переходноклеточным раком в стадии Т2, характеризующимся низкой степенью дифференцировки и прорастанием всех слоёв стенки мочевого пузыря. В экзоне была выявлена замена гуанина (G) на аденин (А) в кодоне 14070 соответствующей заменой аминокислоты аргинина (Arg) на глютамин (Gln) в 248 позиции белка. Данная мутация была ассоциирована с образцами переходноклеточного рака в стадии Т3 (2 случая) низкой степени дифференцировки, прорастанием опухоли в мышечный слой и Т3b (1 случай) – недифференцированная опухоль с прорастанием в предстательную железу, мышечную оболочку, стенку, инвазией по сосудам. Взятые вместе мутации гена р53 наблюдались в 62,5% злокачественных опухолей в двух группах, характеризующих рак низкой степени дифференцировки, недифференцированные опухоли и аденокарциномы (5/8).
Таким образом, в результате проведённого молекулярно-генетического исследования генов FGFR3 и р53 у пациентов с гистологически верифицированным диагнозом «рак мочевого пузыря» был установлен факт преобладания мутаций различных генов, характеризующих разные стадии прогрессии, что может служить важным фактором прогноза заболевания. Согласно нашим данным, мутации, выявленные в наиболее часто мутируемом экзоне 7 гена FGFR3, характеризовали относительно благоприятное течение заболевание у больных с опухолью мочевого пузыря на стадии Т1 – Т2, с высокой степенью клеточной дифференцировки, а мутации в экзонах 5, 6 и 7 и гена р53 наблюдались при неблагоприятном течение заболевания.
Результаты исследования показали возможности молекулярно-генетических исследований для прогнозирования рака мочевого пузыря.
Выводы
- Перспективным направлением в диагностике ранних стадий рака мочевого пузыря и определении прогноза заболевания является выявление молекулярно-генетических маркеров, которые позволяют правильно классифицировать опухоль по степени инвазии и адекватно оценивать прогноз заболевания.
- Прогностически неблагоприятными признаками, которые соответствуют низкой послеоперационной выживаемости больных раком мочевого пузыря и высокому риску рецидивирования опухоли после
- 7 -
Личный вклад автора. Материал, представленный в настоящей работе, был получен автором диссертации при первичном и контрольном обследовании большинства больных раком мочевого пузыря в урологической клинике СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова. Была создана база данных, включавшая результаты обследования больных. Полученный материал был проанализирован лично автором диссертации и им же выполнена статистическая обработка данных.
Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по нефрологии и урологии Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2007, 2008, 2009), на 892-ом заседании Санкт-Петербургского научного общества урологов имени С.П.Федорова (Санкт-Петербург, 2007), на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005), на Всероссийской научной конференции «Современные технологии в диагностике и лечении заболеваний мочеполовой системы» (Новосибирск, 2005), на Всероссийской научной конференции «Методы диагностики и лечения онкоурологических заболеваний» (Санкт-Петербург, 2005), на Международном франко-российском симпозиуме по онкоурологии (Санкт-Петербург, 2005), на 59 конгрессе немецкого общества урологов (Берлин, 2007), на Международной конференции «Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии» (Санкт-Петербург, 2007), на XI съезде урологов России (Москва, 2007), на 1-ом съезде Белорусской ассоциации урологов (Минск, 2008), на 5-ом конгрессе Ливанской ассоциации урологов (Бейрут, 2008), на Международной конференции «Современные технологии в диагностике и лечении урологических заболеваний» (Санкт-Петербург, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 11 – в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Опубликована глава в монографии. Получен патент на изобретение (№ 2007614173 от 1 октября 2007 г.).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, девяти глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, в котором приведено 340 источников, в том числе 57 работ на русском языке и 283 работы на иностранных языках. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 35 рисунками.
Содержание работы
Материалы и методы исследования. В основу настоящего исследования положены материалы анализа клинических, лабораторных, эндоскопических, ультразвуковых, гистологических и молекулярно-
- 8 -
генетических данных, полученных у 702 больных раком мочевого пузыря, которые были госпитализированы в урологическую клинику Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И.П. Павлова и урологическую клинику медицинского университета «Шарите» г. Берлин, Германия в 1995-2008 гг.
Кроме того, нами было обследовано 65 больных с другими заболеваниями мочевого пузыря, составивших группу сравнения. Среди больных этой группы 57 чел. страдали хроническим циститом, а 8 – плоскоклеточной метаплазией или гиперплазией слизистой оболочки мочевого пузыря. Контрольную группу составили 45 человек, у которых не были диагностированы болезни мочевого пузыря, а они лечились в клинике по поводу варикоцеле, водянки оболочек яичка, фимоза, нефролитиаза, но без наличия обструкции или инфекции мочевыводящих путей. Всего под нашим наблюдением находилось 812 пациентов.
Из 702 больных раком мочевого пузыря 586 (83,5%) человек поступили в клинику в плановом порядке, остальные 116 (16,5%) пациентов были госпитализированы по экстренным показаниям, в том числе 85 (12,1%) – в связи с макрогематурией, 12 (1,7%) – с активной фазой хронического пиелонефрита, 10 (1,4%) – с острой задержкой мочеиспускания и 9 (1,3%) больных – с выраженным болевым синдромом.
Среди обследованных нами больных раком мочевого пузыря мужчин было 568 (80,9%) человек, а женщин – 134 (19,1%). Соотношение мужчин и женщин составило 4,2:1. Возраст наблюдаемых нами больных варьировал от 22 до 92 лет и в среднем составил 66,1±12,5 лет.
У наблюдаемых нами больных раком мочевого пузыря преобладали поверхностные опухоли: Tcis – (карцинома in situ «плоская опухоль») – у 8 (1,1%) больных, Та (неинвазивная папиллярная карцинома) – у 312 (44,4%) больных, Т-1 (опухоль распространяется на субэпителиальную соединительную ткань) – у 274 (39,1%) больных, т.е. поверхностные опухоли были диагностированы у 84,6% больных. Инвазивный рак мочевого пузыря был выявлен у 15,4% больных, в том числе Т-2 (опухоль инфильтрует мышцы мочевого пузыря) – у 76 (10,8%) больных, Т-3 (опухоль инфильтрует перивезикальные ткани) – у 20 (2,8%) больных и Т-4 (опухоль инфильтрует окололежащие органы и ткани) – у 12 (1,7%) больных. Опухоли с высокой степенью дифференцировки раковых клеток (G-1), были выявлены у 365 (52,0%) больных, опухоли со средней степенью дифференцировки раковых клеток (G-2) – у 177 (25,2%) больных, а опухоли с низкой степенью дифференцировки раковых клеток (G-3) – у 160 (22,8%) больных раком мочевого пузыря.
- 21 -
минимального значения средней величины хорды ядра (r=0,73; p=0,004), а нарастанию анаплазии – увеличение степени эллипсовидности ядер (t=3,31; p=0,011). Для рецидивирующего течения рака мочевого пузыря были характерными большие значения средней хорды ядра (r=0,52; p=0,006), ширины ядра (r=0,46; p=0,015), диаметра ядра (r=0,46; p=0,016) и габаритов ядер (r=0,61; p=0,004), а ядра имели более округлую форму (r=0,49; p=0,08). Следовательно, компьютерная кариометрия опухолей мочевого пузыря представляет интерес как метод, позволяющий получить дополнительные объективные характеристики морфологических особенностей новообразования и предсказать её биологическое поведение.
Одной из задач настоящего исследования явилось изучение мутации гена FGFR3 и экспрессии гена р53 для определения прогноза у больных раком мочевого пузыря. Для решения этой задачи мы обследовали 25 больных, страдающих раком мочевого пузыря. Материалом для молекулярно-генетических исследований у этих больных послужил операционный материал (у 7 – цистэктомия, у 18 – ТУР опухоли). По данным гистологического исследования удалённых опухолей мочевого пузыря у 23 (92%) больных был выявлен переходно-клеточный рак с различной степенью дифференцировки, а у 2 (8%) – аденокарцинома с умеренной и низкой степенью дифференцировки.
В результате прямого секвенирования экзона 7 гена FGFR3 у 9 из 25 больных, что составило 36% была обнаружена нуклеотидная замена цитозина (С) на гуанин (G) в кодоне 746 с соответствующей заменой аминокислоты серина (Ser) на цистин (Cys) в 249 позиции белка. Исходя из гистологической классификации, обнаруженные мутационные изменения гена FGFR3 соответствовали определённой форме и стадии злокачественного процесса, а именно: все образцы опухолей мочевого пузыря, в которых была обнаружена данная мутация, характеризовались высокой степенью дифференцировки и составляли 69,2% от всех опухолей этой группы. Кроме того, данные опухоли были локализованы в поверхностном слое мочевого пузыря и были обнаружены у пациентов на стадии Т1 и Т2а рака мочевого пузыря.
В результате прямого секвенирования экзонов 5, 6 и 7 гена р53 при исследовании опухолей мочевого пузыря были обнаружены три вида мутаций. При секвенировании экзона 5 в одном случае была выявлена делеция (выпадение) цитозина в кодоне 13085 нуклеотидной последовательности, которая приводила к остановке считывания белка в соответствующей позиции. Данная мутация была ассоциирована с переходноклеточным раком мочевого пузыря в стадии Т2, который характеризовался низкой степенью дифференцировки и инвазией в слизистую оболочку. В экзоне
- 20 -
При анализе различий между подгруппами пациентов с разными степенями дифференцировки ткани опухоли оказалось, что различий в васкуляризации между опухолями G1 и G2 не обнаружено. Однако образцы опухолевой ткани с умеренной и низкой степенью дифференцировки достоверно отличались по плотности микрососудов (t=2,94; p=0,019). Сравнительное изучение опухолевой ткани со степенями дифференцировки G1 и G3 показало, что они отличались по числу микрососудов в поле зрения в наибольшей степени (t=4,34; p=0,002; U=0,00; p=0,011). Следовательно, ангиогенез тесно связан со степенью злокачественности опухоли. С понижением степени дифференцировки плотность микрососудов опухолевой ткани возрастала. Это позволяет заключить, что определение ангиогенной активности опухоли мочевого пузыря может быть полезным для определения прогноза течения заболевания.
При изучении опухолей мочевого пузыря при помощи компьютерной морфометрии у 28 больных и сопоставлении полученных данных с клиническими данными, глубиной инвазии и степенью дифференцировки рака оказалось, что этот метод позволяет получить представление о пролиферативной активности опухоли мочевого пузыря. Работа выполнена совместно с кафедрой патологической анатомии (зав. – проф. М.Г. Рыбакова) СПбГМУ имени акад. И. П. Павлова и аспирантом кафедры урологии Е.С. Завьяловой.
При анализе полученных данных были выявлены закономерности строения ядер опухолевых клеток, соответствующие значениям клинических и морфологических признаков. У пациентов более молодого возраста (r=0,43; p=0,018), с мультифокальным поражением мочевого пузыря (p=0,013) и большими размерами (p=0,009) опухоли были выявлены более крупные ядра опухолевых клеток. У пациентов старшего возраста ядра имели более округлую форму (r=0,71; p=0,004), меньшую длину (r=0,58; p=0,029) и периметр (r=0,56; p=0,038), а также размеры максимальной оси эллипса (r=0,55; p=0,041) и габариты (r=0,54; p=0,045). Были выявлены различия размеров и формы ядер в зависимости от клинических характеристик опухоли мочевого пузыря. Так, для опухолей больших размеров были характерными большая площадь ядра (r=0,67; p=0,024), минимальный диаметр Фере (r=0,68; p=0,0022), минимальная средняя ось эллипса (r=0,73; p=0,01), ширина ядра (r=0,74; p=0,009), средняя хорда (r=0,67; p=0,023), эквивалентный диаметр (r=0,68; p=0,017), фактор эллипса (r=0,65; p=0,032) и габариты ядра (r=0,61; p=0,046).
Обнаружены различия строения ядер опухолевой ткани мочевого пузыря с различной глубиной инвазии и степенью дифференцировки опухоли. Врастанию в стенку мочевого пузыря соответствовало увеличение
- 9 -
В соответствии с задачами настоящего исследования наблюдаемые нами больные раком мочевого пузыря в зависимости от применяемых специальных методов обследования были разделены на несколько подгрупп. В подгруппу больных по изучению прогностической ценности исследования аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи вошли 65 больных раком мочевого пузыря. Прогностическая ценность клеток-эффекторов стромы карцином была изучена у 305 больных раком мочевого пузыря. Прогностическая роль ангиогенеза опухоли была изучена у 29 больных раком мочевого пузыря. Роль антигенов Ki-67, p53 и bci-2 была изучена у 26 больных раком мочевого пузыря. Оптико-когерентная томография для диагностики и определения прогноза заболевания была выполнена у 100 больных раком мочевого пузыря. Диагностическая и прогностическая ценность определения матрикс-металлопротеаз в моче была изучена у 71 больного раком мочевого пузыря и у 59 больных группы сравнения. Молекулярно-генетические маркеры были изучены у 25 больных раком мочевого пузыря. Компьютерная кариометрия выполнена у 28 больных раком мочевого пузыря. Прогностическая ценность флюоресцентной цистоскопии с использованием 5-аминолевулиновой кислоты была определена у 104 больных раком мочевого пузыря. Диагностическая и прогностическая ценность клинических факторов была изучена у всех 702 наблюдаемых нами больных раком мочевого пузыря. Стандартное цитологическое исследование мочи выполнено у 360 больных.
Все наблюдаемые нами больные были обследованы в динамике: при госпитализации больных в клинику, перед выпиской после выполненного оперативного вмешательства, через 3, 6 и 9 мес. после выписки и в дальнейшем – ежегодно. Три раза были обследованы только 3 (0,5%) пациента из 702, четыре и пять раз – 119 (16,9%) больных, а остальные 580 (82,6%) больных – шесть и более раз. В ходе каждого обследования пациентам проводили клинико-лабораторные, ультразвуковые, эндоскопические и рентгенологические исследования, а операционный материал был подвергнут морфологическому, а у 25 больных - молекулярно-генетическому исследованию. Цитологическое исследование мочи было выполнено в лаборатории цитологических исследований центра лабораторной диагностики ГОУ СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова (зав. – проф. В. Л. Эмануэль). Для цитологического исследования использовали дневную порцию самопроизвольно выпущенной мочи, которую центрифугировали при 1000 об. в течение 4 мин. Клеточный состав и цитологические признаки малигнизации оценивали в световом бинокулярном микроскопе типа МИКМЕД-2 (ЛОМО) при увеличении 100х и 1000х соответственно. Цитологический
- 10 -
диагноз новообразования и степень дифференцировки опухоли устанавливали в соответствии с цитологическими критериями по классификации L.G.Koss (1996). Исследование аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи выполняли по методике W.Howell and D.Black (1980). В препаратах подсчитывали при увеличении 420х количество клеточных ядер, а при увеличении 2000х – число ядрышек в ядрах и аргентофильных гранул в ядрышках клеток уротелия. Кроме того, в каждом препарате рассчитывали среднее число ядрышек, приходящееся на одно ядро и среднее количество аргентофильных гранул, приходящееся на каждое ядрышко.
Рентгенологическое обследование включало компьютерную томографию или обзорную и экскреторную урографию в сочетании с нисходящей цистографией.
Всем больным с целью уточнения состояния мочевых путей, определения степени распространения опухоли и выявления сопутствующих заболеваний и осложнений со стороны органов мочевой и мужской половой системы проводили ультразвуковое исследование почек, забрюшинного пространства, мочевого пузыря и предстательной железы, а также органов брюшной полости. При этом использовали ультразвуковые линейные томографические сканеры фирмы «Kontron» (Франция) и «Aloka-4000» (Япония) с секторальным и ректальным датчиками частотой 3,5-5 МГц. Всем больным была произведена уретроцистоскопия.
Операционный материал был подвергнут морфологическому и иммуногистохимическому исследованиям на кафедре патологической анатомии (зав. – проф. М.Г. Рыбакова) СПб ГМУ им. акад. И. П. Павлова. Кусочки ткани опухоли, полученные в ходе оперативного лечения, были подвергнуты обзорному морфологическому анализу, при котором стадию рака определяли в соответствии с классификацией TNM, а степень дифференцировки опухолевых клеток оценивали в соответствии с рекомендациями F.Mostofi et al. (1973).
Для изучения экспрессии антигенов Ki-67, p-53 и bcl-2 выполняли гистохимическую методику и расчёт индекса мечения. Срезы опухоли толщиной 5 мкм инкубировали с моноклональными антителами MIB-1 (1:100; Immunotech. Inc., Westbrook, USA) в течение 12 часов при температуре 4оС. Затем производили обработку конским IgG в течение 30 минут и инкубацию стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой, в течение 60 минут. Визуализацию обеспечивали за счёт инкубации ткани в растворе 3-амино-9-этилкарбазола (АЕС, Sigma, Pool, UK) в течение 5 минут, после которой положительная гистохимическая реакция на антигены проявлялась в виде интенсивного жёлто-коричневого окрашивания ядра раковой клетки в случае Ki-67 и p-53, и коричневого окрашивания цитоплазмы и/или ядерной оболочки в случае bcl-2.
- 19 -
КНШ – коэффициент насыщения ядрышек аргентофильными гранулами;
КНЯ – коэффициент насыщения ядер аргентофильными гранулами;
П – пол (мужчина – 1, женщина – 2).
При анализе полученных результатов было установлено, что при значении DF>3,28 возникновение карциномы возможно, а при величинах DF3,28 вероятность наличия рака минимальна. Чувствительность предложенного метода составила 95%, специфичность – 89%, точность – 92%.
Известно, что прогноз течения заболевания зависит от опухолевой прогрессии и вероятности появления метастазов. Кровоснабжение опухоли является одним из ключевых факторов дальнейшего прогрессирования опухоли, ибо от него зависит доставка кислорода и питательных веществ, а также и возможность метастазирования опухоли. Активация ангиогенеза опухоли является одним из ключевых этапов инвазии и метастазирования злокачественных новообразований.
У 16 больных раком мочевого пузыря данные гистологического и иммуногистохимического исследования были сопоставлены с результатами диспансерного наблюдения за больными в течение 5 лет. В результате исследования было установлено, что образцы опухолевой ткани отличались друг от друга по плотности микрососудов. При анализе распределения было выявлено, что для плотности микрососудов были характерны правосторонняя асимметрия и островершинное распределение. Была обнаружена зависимость числа микрососудов в поле зрения от степени дифференцировки опухолевой ткани (рис. 2).
Рис.2 Зависимость плотности микрососудов от степени дифференцировки опухолевой ткани.
С понижением дифференцировки опухолевой ткани число микрососудов в поле зрения возрастало: при G1 составив 3,5, при G2 – 3,8, а при G3 – 7,0 (r= 0,68; p=0,04; rs= 0,56; p=0,023; H=6,55; p=0,038; F=9,41; p=0,003).
- 18 -
Контрольная группа состояла из 20 человек, у которых на момент обследования заболеваний мочевого пузыря не было. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2
Показатели распределения аргентофильных гранул в ядрышках, ядрышек в ядрах и ядер в клетках осадка мочи у больных раком мочевого пузыря
| Исследуемый признак в препарате | Показатели распределения | |||
| M. | SD | Min. | Max. | |
| Число ядер | 6,5 | 1,7 | 2 | 8 |
| Число ядрышек в ядрах | 17,5 | 6,7 | 4 | 26 |
| Число аргентофильных гранул в ядрышках | 21,4 | 10,1 | 3 | 39 |
| Насыщенность ядер ядрышками | 2,7 | 0,7 | 0,9 | 4,3 |
| Насыщенность ядрышек гранулами | 1,2 | 0,4 | 0,6 | 2,1 |
Примечание: М – среднее значение; SD – стандартное отклонение;
Min – минимальное значение; Max – максимальное значение.
В ходе статистической обработки материалов обследования рассчитывали коэффициенты насыщения ядер и ядрышек аргентофильными гранулами (АГ). Было выполнено сравнение полученных результатов в обеих группах, а также проанализировано соотношение между параметрами распределения аргентофильных нуклеопротеинов и изменением степени гистопатологической градации опухолевой ткани, а также выживаемостью больных и рецидивированием рака. При сравнении распределения аргентофильных нуклеопротеинов в клетках осадка мочи у пациентов основной и контрольной групп было установлено, что у больных раком мочевого пузыря определялось большее, по сравнению с пациентами контрольной группы, количество аргентофильных гранул (SD=21,36±10,14 и SD=7,25±4,89 соответственно), ядрышек (SD=17,56±6,72 и SD=11,6±2,9 соответственно). У больных раком мочевого пузыря было выявлено достоверно большее количество ядрышек (t=,365 p<0,001; U=103 p<0,004) и гранул (t=5,65 p<0,001; U=50,5 p<0001) а значение коэффициента насыщения ядрышек и ядер аргентофильными гранулами было значительно выше (t=5,58 p<0,001; U=39 p<0,001 и t=6,84 p<0,001; U=34 p<0,001).
При совокупной оценке была создана математическая модель, позволяющая оценить вероятность наличия рака мочевого пузыря:
ДФ = 0,954 КЯД + 1,795 КНШ + 0,077 КНЯ – 0,651 П, где:
ДФ – соответствующее значение дискриминантной функции;
КЯД – количество ядрышек в ядре;
- 11 -
Для компьютерного кариометрического анализа изображение десяти полей зрения опухолевой ткани через видеокамеру трансформировали в цифровой формат, а затем подвергали компьютерной обработке при помощи программы «Видео Тест Морфо 4,0». При этом обязательно контрастировали границы клеточных ядер и для каждого из них рассчитывали 18 параметров (площадь, периметр, длина, ширина, средняя хорда, округлость, удлинённость, проекция ядра на оси X и Y-мерной шкалы поля зрения, средний габарит, фактор круга, фактор эллипса, эквивалентный диаметр, максимальная и минимальная оси эллипса, а также минимальный, средний и максимальный диаметры Фере.
Для изучения прогностической роли ангиогенеза опухоли у больных раком мочевого пузыря из кусочка опухоли, взятого во время операции, готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Затем выполняли при увеличении х600 обзорные гистологическое исследование изучаемых структур с выявлением глубины инвазии и степени дифференцировки. Количественным отражением интенсивности ангиогенеза являлась плотность микрососудов опухоли, которую подсчитывали после окраски сосудов иммунохимическими методами, используя антитела к фактору СД-34. Иммуногистохимические реакции проводили с антителами к СД-34 фирмы «Дако» (Дания).
Концентрацию металло-протеаз в моче (ММП-2 и ММП-9) определяли по стандартной методике, описанной в работах S.Zucker и соавт. (1995). Эта методика базируется на электрофорезе в полиакриламидном геле с одним из полимеризированных протеиновых субстратов: желатином, казеином или фибрином – Со. При этом разгоняемые в геле протеины пропитываются отрицательно заряженным додецилсульфатом натрия.
Для выполнения флюоресцентной цистоскопии в мочевой пузырь за 3 часа до исследования вводили свежеприготовленный раствор АЛК. Пациенты после введения раствора АЛК до исследования не опорожняли мочевой пузырь. Для проведения флюоресцентной диагностики использовали источник света с повышенной интенсивностью и специальным синим спектром с длиной волны 400-410 nm.
Для определения места оптико-когерентной томографии (ОКТ) в диагностике рака мочевого пузыря нами была усовершенствована методика проведения этого исследования (свидетельство № 2007614173, выданное 1 октября 2007 г.). Для выполнения ОКТ мочевого пузыря использовали эндоскопическое устройство, состоящее из эндоскопа, ОКТ-системы и видеосистемы.
- 12 -
Для изучения прогностического значения молекулярно-генетических маркеров рака мочевого пузыря в отделе молекулярно-генетических технологий ГОУ СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова (зав. – член-корр. РАН доктор медицинских наук профессор М. В. Дубина) у 25 больных, страдающих раком мочевого пузыря, мы изучали мутацию гена рецептора роста фибробластов-3 (FGFR3) и экспрессию гена p53. Генетический анализ ДНК опухолей проводили на наличие мутационных повреждений в генах FGFR3 и р53. Для поиска возможных мутаций генов в опухолях мочевого пузыря использовали метод секвенирования нуклеотидных последовательностей по Сэнгеру с использованием фермента ДНК-полимеразы Taq, описанного P.M. Green и соавт. в 1994 году. Данный метод состоит из следующих основных этапов: амплификация избранных участков ДНК методом ПЦР, денатурация, медленная ренатурация и последующее электрофоретическое разделение амплифицированных генов в полиакриламидном геле. Идентификацию продуктов ПЦР проводили в каждом из 2-ходнонитевых фрагментов ДНК. Затем с помощью генетического банка нуклеотидных последовательностей (GeneBank), приведённого в сети Интернет на странице Национального центра биотехнологической информации и Национальных институтов здоровья США определяли нуклеотидные последовательности кодирующих регионов экзона 7 гена FGFR3 и экзонов 5, 6 и 7 гена р53. Поиск и тестирование праймеров на совместимость проводили с использованием специальных программ, доступных в сети Интернет.
Полученные при выполнении настоящего исследования данные были обработаны на ЭВМ с помощью стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа. Для всех исследуемых признаков были определены минимальные и максимальные значения, средние величины, стандартная ошибка средней величины, среднее квадратичное отклонение.
Выявление зависимости между признаками проведено при помощи 2 - критерия Пирсона, t-критерия Стьюдента и точного метода Фишера, а для анализа различий между средними величинами в группах использованы t-критерии Стьюдента, парный td-тест и непараметрический U-тест Манна-Уитни. При сравнении величин размаха значений признаков применялся F- критерий Фишера и Q-критерий Бартлетта.
Результаты исследования
Диагностическая и прогностическая ценность клинических факторов (пол и возраст, клинические проявления заболевания, сопутствующие заболевания, характер госпитализации, наличие хронического пиелонефрита
- 17 -
При применении эндоскопической оптико-когерентной томографии по сравнению со стандартной цистоскопий на 16% повышается чувствительность диагностики опухолей мочевого пузыря, особенно за счёт более точного распознавания плоских внутриэпителиальных и неинвазивных опухолей. Предложенная нами для повышения информативности и улучшения качества ОКТ-изображения различных слоёв мочевого пузыря компьютерная программа «Tomo View-1.0» с получением цветных оптико-когерентных томограмм позволяет улучшить распознавание различных заболеваний этого органа, в том числе и опухолей. Оптико-когерентная томография позволяет получить высокоразрешающее изображение внутреннего строения поверхностных слоёв мочевого пузыря и различать уротелий, подслизистый слой, капилляры и поверхностную мышечную пластинку слизистой оболочки мочевого пузыря. Для определения края опухоли и глубины инвазии опухоли мочевого пузыря оптико-когерентную томографию необходимо использовать не только при диагностике болезни, но и при выполнении ТУР опухоли, что позволит более точно контролировать радикальность оперативного вмешательства, и тем самым также улучшить прогноз заболевания.
Цитологическое исследование осадка мочи является стандартным и давно применяемым методом диагностики рака мочевого пузыря. Стандартное цитологическое исследование мочи было выполнено у 360 больных с подозрением на рак мочевого пузыря. Оказалось, что чувствительность стандартного цитологического исследования мочи в выявлении рака мочевого пузыря у наблюдаемых нами больных при глубине инвазии Tcis (carcinoma in situ) была равной 50%, При Та – 51%, при Т1 – 73%, при Т2 – 92%, при Т3 – 96%, а общая чувствительность составила 79,5%. Таким образом, цитологическое исследование осадка мочи хотя и является стандартным методом диагностики рака мочевого пузыря, однако его диагностические и прогностические возможности ограничены. В связи с этим в последние годы некоторые авторы (Корнеев И.А., 2006; Karakok M. и соавт., 2002) предложили использовать анализ пролиферативной активности клеток осадка мочи при помощи методики серебрения, которая позволяет оценивать количество и структуру ответственных за активность рибосомных цистроков ядрышковых организаторов. Одной из задач нашего исследования была оценка диагностической и прогностической ценности исследования аргентофильных ядрышковых протеинов в клетках осадка мочи у больных раком мочевого пузыря. Были изучены материалы обследования 42 человек, разделённых на 2 группы. В основную группу вошло 22 больных поверхностным переходноклеточным раком мочевого пузыря.
- 16 -
Для усовершенствования обработки изображения при выполнении оптической когерентной томографии нами совместно с Санкт-Петербургским государственным университетом информационных технологий, механики и оптики была создана компьютерная программа «Tomo View – 1.0), состоящая из нескольких режимов для настройки и цветного отображения ОКТ-томографии (свидетельство № 2007614173, выданное 1 октября 2007 г. Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации). Всего у 100 пациентов было выполнено 1187 ОКТ-измерений и 543 гистологических исследований удалённых кусочков ткани мочевого пузыря. У всех больных были исследованы здоровые участки слизистой оболочки мочевого пузыря, а также участки с различными патологическими изменениями (таблица 12). ОКТ-изображение рассматривали параллельно с гистологической картиной удалённого из этого места кусочка ткани.
Расчёт полученных результатов, изображённых на рисунке 1, показал, что ОКТ-эндоскопия с большой достоверностью коррелирует с раковыми изменениями слизистой мочевого пузыря. Чувствительность ОКТ-цистоскопии составила 90%, а стандартной цистоскопии – только 74% (р<0,05). Специфичность ОКТ-цистоскопии была равной 86%, а для стандартной цистоскопии – лишь 67% (р<0,01).
Рис. 1. Чувствительность и специфичность стандартной и ОКТ-цистоскопии.
- 13 -
и доброкачественной гиперплазии предстательной железы у мужчин, клинико-лабораторные показатели, группа крови) была изучена у всех 702 больных раком мочевого пузыря. Оказалось, что после ТУР рецидивирующее течение болезни имело место у 376 (66,2%) из 568 мужчин, но только у 49 (36,6%) из 134 женщин, что в 1,8 раза реже (t=1,66; p<0,001). Возможно, это в некоторой степени было обусловлено преобладанием у женщин высокодифференцированных (t=2,04, p=0,041) опухолей.
Сочетание ДГПЖ и рака мочевого пузыря мы наблюдали у 492 (86,6%) мужчин старше 60 лет. Было установлено, что наличие ДГПЖ соответствовало меньшей выживаемости больных в послеоперационном периоде, при этом смерть пациентов чаще (2=8,47; р=0,004) наступала в результате прогрессирования рака на фоне атаки пиелонефрита.
Множественный характер новообразований (t=2,67; р=0,009), большие размеры опухоли (t=2,32; р=0,015) и инфильтративный характер роста (t=2,43; р=0,003) были характерными для больных с низкой послеоперационной выживаемостью.
Известно, что стандартная цистоскопия не всегда помогает заподозрить, а поэтому после выполнения биопсии подозрительного участка и распознать рак мочевого пузыря, особенно в ранних стадиях заболевания. Мы определили значение флюоресцентной цистоcкопии для ранней диагностики рака мочевого пузыря и определения прогноза заболевания. Диагностическая и прогностическая ценность флюоресцентной цистоскопии с использованием 5-аминолевулиновой кислоты была изучена у 104 больных, которым было выполнено 343 биопсии участков, подозрительных на наличие малигнизации, которые были удалены во время трансуретральной резекции в пределах неизменённых тканей. Количество зон резекции у пациентов составило от 1 до 9, в среднем – 3,3±0,7. Оказалось, что АЛК-индуцированная флюоресценция с большой достоверностью коррелирует с раковыми изменениями слизистой мочевого пузыря. В диагностике опухолей мочевого пузыря чувствительность флюоресцентной цистоскопии составила 96%, а стандартной цистоскопии – 78% (р<0,05). Специфичность флюоресцентной цистоскопии была равной 52%, а стандартной цистоскопии – 31% (р<0,01). Для повышения специфичности флюоресцентной цистоскопии мы усовершенствовали данный метод и для избежания тангенциальной флюоресценции боковые и переднюю стенку мочевого пузыря рекомендуем обследовать оптикой с углом 70о, а заднюю стенку и верхушку – прямой оптикой (0о–30о). Это позволило увеличить специфичность до 61%.
- 14 -
При диспансерном наблюдении за больными после выполнения трансуретральной резекции опухоли мочевого пузыря оказалось, что рецидивы опухоли после оперативного вмешательства, выполненного в сочетании с флюоресцентной цистоскопией, встречаются реже (табл. 1).
Таблица 1
Частота рецидивов опухоли мочевого пузыря
после трансуретральной резекции новообразования
| Сроки контрольного обследования после ТУР | Рецидив после ТУР с фотодинамическим контролем | Рецидив после стандартной ТУР |
| 2 мес. | 12 (13,6%) | 38 (40,0%) |
| 6 мес. | 20 (22,7%) | 45 (47,4%) |
| 12 мес. | 31 (35,2%) | 55 (57,9%) |
| 24 мес. | 40 (45,4%) | 61 (64,2%) |
| 36 мес. | 52 (59,1%) | 67 (70,5%) |
| 60 мес. | 52 (59,1%) | 72 (75,8%) |
| Всего больных | 88 | 95 |
Необходимо отметить, что больные первой группы (88 чел.), которым была выполнена ТУР опухоли мочевого пузыря под фотодинамическим контролем, и больные второй группы (95 чел.), которым была выполнена ТУР опухоли мочевого пузыря под стандартной цистоскопией белым светом, были абсолютно идентичны по размерам опухоли, глубине инвазии и степени дифференцировки новообразования.
Для разработки новых высокоэффективных методов распознавания рака мочевого пузыря и определения прогноза этого заболевания необходимо более детальное и глубокое изучение биологических особенностей этого вида опухоли. Одним из новых методов оценки агрессивности опухолей в настоящее время является определение эндогенных ферментов протеолиза. В последние годы доказано, что в процессе инвазии злокачественных новообразований происходит протеолитическое разрушение базальной мембраны слизистой оболочки мочевого пузыря опухолевыми клетками (Stetler-Stivenson W.G. и соавт., 1996). К экзогенным ферментам, участвующим в этом процессе, относят матрикс-металлопротеазы (ММП). Уровень ММП-2 и 9 в моче был изучен у 130 пациентов, которые были разделены на 3 группы. У 71 больного был диагностирован рак мочевого пузыря. В группу сравнения были включены 14 больных с другим заболеванием мочевого пузыря – хроническим циститом в стадии обострения. Контрольную группу из 45 человек (4 женщины и 41 мужчина) составили
- 15 -
пациенты, у которых не были диагностированы болезни мочевого пузыря, а они лечились в клинике урологии по поводу варикоцеле, водянки оболочек яичка, фимоза, мочекаменной болезни, но без наличия обструкции или инфекции мочевыводящих путей. У больных раком мочевого пузыря концентрация ММП-2 и ММП-9 в моче была значительно выше, чем у больных, страдающих хроническим циститом и у лиц контрольной группы. Так, у больных раком мочевого пузыря концентрация ММП-2 в моче составила 278,7+29,6 µg/g креатинина, тогда как у пациентов, страдающих хроническим циститом в стадии обострения – 101,5+18,8 µg/g креатинина (p<0,01), а у лиц контрольной группы – 83,5+5,6 µg/g креатинина (p<0,001). Содержание ММП-9 в моче у больных раком мочевого пузыря составило 405,4+32,7 µg/g креатинина, тогда как у пациентов с хроническим циститом – 130,0+50,7 µg/g креатинина (p<0,01), а у лиц контрольной группы – 92,1+7,7 µg/g креатинина (p<0,001). Концентрация ММП-2 и ММП-9 в моче в подгруппе больных с инвазивным раком мочевого пузыря (Т2) была выше (887,4+41,1 µg/g креатинина и 1050,8+34,8 µg/g креатинина соответственно), чем у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря (Та и Т1), у которых она составила 153,2+32,1 µg/g креатинина и 229,8+24,5 µg/g креатинина (p<0,001). При анализе уровня ММП-2 и ММП-9 в моче у больных РМП в зависимости от степени дифференцировки опухолевых клеток оказалось, что с повышением степени злокачественности опухолевого процесса возрастает уровень исследуемых протеаз. При G-1 концентрация ММП-2 в моче составила 112,4+8,8 µg/g креатинина, при G-2 – 198,6+12,0 µg/g креатинина (р<0,05), а при G-3 – 493,1+18,4 µg/g креатинина (р<0,001). Концентрация ММП-9 у больных РМП с дифференцировкой клеток G-1 составила 232,8+12,8 µg/g креатинина, при G-2 – 272,7+31,3 µg/g креатинина (р<0,05), а при G-3 – 554,3+28,6 µg/g креатинина (р<0,001).
В последние годы для получения изображения структуры биологических тканей стали использовать оптическую когерентную томографию (ОКТ). Этот метод исследования позволяет на клеточном уровне получить изображение тканей, приблизив качество изображения к гистологическому (Гладкова Н.Д. и соавт., 2002; Hnang D. и соавт., 1991; Fercher A. и соавт., 1993). Мы у 100 больных определили место оптико-когерентной томографии для диагностики рака мочевого пузыря, особенно в ранних стадиях. Для этого была усовершенствована методика проведения оптико-когерентной томографии мочевого пузыря и проведено сравнение получаемых при этом методе исследования изображений у больных раком мочевого пузыря, других заболеваниях этого органа и у здоровых людей.
