О ценка цитопротекторного эффекта препаратов, имеющих антиоксидантный механизм действия при экспериментальном остром панкре а тите

На правах рукописи

УДК-616.37-002-085.245

БЕРЁЗКИН

Иван Михайлович

ОЦЕНКА ЦИТОПРОТЕКТОРНОГО ЭФФЕКТА ПРЕПАРАТОВ,

ИМЕЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПРИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ

14.00.25 – «Фармакология, клиническая фармакология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Александр Георгиевич Муляр

Официальные оппоненты: Член-корр. РАМН, Заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Юрий Борисович Белоусов

доктор медицинских наук,

профессор Александр Сергеевич Кинзирский

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская

академия им. И.М. Сеченова Росздрава»

Защита состоится «___»____________ 2008 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.01 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» (127473, г. Москва, ул. Делегатская, 20/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» (127006, г. Москва, ул. Вучетича, 10а).

Автореферат разослан "__ " марта 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Р.И. Стрюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Неуклонный рост заболеваемости острым панкреатитом, низкая эффективность фармакотерапии, высокий уровень послеоперационной летальности при деструктивных формах панкреатита, обуславливают важность разработки новых методов и схем лечения данной патологии (Полуэктов Л.П. и др., 1996; Сажин В.П. и др., 1996; Федоров В.Д. и др., 1999; Гринберг А.А., 2000; Губергриц Н.Б., Христич Т.П., 2000; Beger H.J., Rau B.A., 1995). Актуален и социальный аспект проблемы, поскольку большинство больных, страдающих этим заболеванием - лица трудоспособного возраста.

Неотъемлемой составляющей поиска новых методов и схем лечения является детальное изучение этиологических механизмов и патогенетических аспектов развития заболевания (Сергиенко В.И. и др., 1999).

В патогенезе острого воспаления поджелудочной железы особое место отводится стойкому изменению процессов липидного обмена (Мещишен И.Ф. и др., 1992; Сологуб Т.В. и др., 2002; Genu B., 1992), при котором особую значимость приобретает интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ), повышение фосфолипазной активности и снижение антиоксидантной защиты организма, являющиеся основными факторами дестабилизации мембран железистого аппарата железы (Белявский А.Д. и др., 1998; Петросян Э.А. и др., 1998; Власов А.П. и др., 2000; Cuzzocrea S. et al., 1999; Fukuhara K. et al., 1999; Tokyay R. et al., 1999).

В последнее время все большее внимание уделяется изучению морфофункционального состояния эритроцитов при различных патологических состояниях (Кумерова А.О. и др., 1996; Доровских В.А. и др., 1998; Азизова О.А. и др., 2002; Прокопьева В.Д. и др., 2002; Рязанцева Н.В. и др., 2002; Hou H.J. et al., 1992), оценка которого, с одной стороны, позволяет косвенно судить о выраженности мембранодеструктивных процессов в клеточных структурах различных органов. С другой стороны, нарушение функциональной активности эритроцитов может выступать одним из звеньев в патогенезе основного заболевания.

Принимая во внимание, что в патогенезе острого панкреатита ведущее место отводится нарушению липидного обмена и изменению морфофункционального состояния фосфолипидного бислоя мембран клеточных структур поджелудочной железы, становится очевидной целесообразность оценки в экспериментальных условиях терапевтической эффективности антиоксидантов. Из числа препаратов, обладающих антиоксидантным действием, для исследований были отобраны антиоксиданты – альфа-токоферола ацетат, димефосфон и винпоцетин. И хотя последний препарат относится к фармакологической группе «Корректор мозгового кровообращения», известно, что он обладает значительными антиоксидантными свойствами.

Цель работы

Оценить цитопротекторный эффект препаратов, имеющих антиоксидантный механизм действия на модели острого билиарного панкреатита.

Задачи исследования

1. Изучить липидный состав, интенсивность процессов ПОЛ, активность фосфолипазы А2 тканевых структур поджелудочной железы и эритроцитов на модели экспериментального панкреатита.

2. Оценить терапевтическую эффективность лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантным действием - альфа-токоферола ацетата, димефосфона и винпоцетина на течение острого панкреатита и функциональную активность эритроцитов при данном виде патологии.

3. Выявить возможность фармакологической коррекции липидного метаболизма в тканевых структурах поджелудочной железы и эритроцитах при применении альфа-токоферола ацетата, димефосфона, винпоцетина.

4. Исследовать влияние препаратов на течение процессов ПОЛ, антиоксидантную и фосфолипазную активность в тканевых структурах поджелудочной железы.

5. Установить взаимосвязь показателей терапевтической эффективности изученных лекарственных препаратов с их способностью корригировать липидный обмен.

Научная новизна

Показано, что при остром панкреатите на фоне повреждения антиоксидантной системы, развития синдрома липидной пероксидации и активизации фосфолипазы А2 в тканевых структурах поджелудочной железы и эритроцитах, отмечаются значительные модификации липидного состава их мембран, сопряженные с выраженностью воспалительного процесса в поджелудочной железе и нарушением функциональной активности эритроцитов.

Продемонстрировано, что включение альфа-токоферола ацетата, димефосфона и винпоцетина в схему терапии острого билиарного панкреатита способствует снижению выраженности воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы и более быстрому восстановлению функциональной активности эритроцитов у экспериментальных животных.

При экспериментальном остром панкреатите установлены высокие показатели цитопротекторного эффекта антиоксидантов, проявляющиеся не только на органном, но и на организменном уровнях в виде быстрого восстановления липидного состава биомембран тканевых структур поджелудочной железы и эритроцитов.

Выявлено, что липидстабилизирующий эффект альфа-токоферола ацетата, димефосфона, винпоцетина реализуется за счет способности данных препаратов снижать интенсивность процессов ПОЛ и фосфолипазную активность, восстанавливая антиоксидантный потенциал исследованных тканевых структур поврежденного органа.

Показано, что высокая цитопротекторная активность исследованных препаратов обусловлена их способностью корригировать липидный обмен в организме.

Установлено, что терапевтическая эффективность димефосфона и, особенно, винпоцетина существенно выше, чем у препарата сравнения – альфа-токоферола ацетата.

Практическая значимость работы

Определено направление в совершенствовании терапии данного вида патологии, которое заключается в использовании в общей схеме консервативного лечения препаратов, обладающих антиоксидантным эффектом.

Результаты исследований могут стать основой для включения отдельных показателей липидного метаболизма в перечень диагностических тестов, оценивающих степень выраженности патологического процесса и эффективность проводимой терапии.

Личный вклад автора

Автором была проведена серия экспериментов на 50 беспородных разнополых собаках, использованы современные методики исследования: фотометрия, тонкослойная хроматография, денситометрия, определение сорбционной способности эритроцитов, определение жесткости эритроцитарных мембран, макро- и микроскопия. С применением лабораторных методов исследования, произведена оценка фармакологического воздействия (антиоксидантного эффекта) лекарственных препаратов при экспериментально смоделированном остром панкреатите.

Основные положения выносимые на защиту

1. При моделировании острого панкреатита, на фоне депрессии собственной антиоксидантной защиты, развивается синдром липидной пероксидации, сопровождающийся активизацией фосфолипазы А2 в тканевых структурах поджелудочной железы и эритроцитах.

Наблюдаемые явления сопряжены с выраженностью воспалительного процесса в поджелудочной железе и нарушением функциональной активности эритроцитов.

2. Применение при экспериментально смоделированном остром панкреатите препаратов, имеющих антиоксидантный механизм действия (альфа-токоферола ацетат, димефосфон и винпоцетин) приводит к положительной динамике клинических морфологических и лабораторных показателей.

3.Терапевтическая эффективность исследованных лекарственных средств связана с их цитопротекторными свойствами. Наибольший положительный липидрегулирующий эффект выявлен при использовании винпоцетина, наименьший при использовании альфа-токоферола ацетата.

4. Применение указанных препаратов в терапии острого панкреатита способствует быстрому восстановлению липидного состава биологических мембран тканевых структур поджелудочной железы и эритроцитов за счет снижения интенсивности процессов ПОЛ, фосфолипазной активности и восстановления антиоксидантного потенциала исследованных тканевых структур.

Внедрение в практику

Положения, разработанные в диссертации, включены в программу обучения студентов на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (М., 2006); на межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования» (Пенза, 2007); на I Конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Ульяновск, 2007); на Огаревских чтениях – научно-практической конференции Мордовского государственного университета (Саранск, 2007).

Апробация диссертации проведена на совместном заседании сотрудников кафедр фармакологии и клинической фармакологии ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава», протокол № 2 от 25 февраля 2008г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть работ, одна из которых в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 148 страницах машинописного текста. Состоит из шести глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 186 отечественных и 67 иностранных источников. Работа содержит 18 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Животные

Работа выполнена на 50 разнополых беспород­ных половозрелых собаках массой от 6,6 до 10,4 кг.

Препараты

В исследованиях использованы следующие лекарственные средства: Винпоцетин – 000182/02-2003 от 24.04.2003. ФГУП «Мосхимфармпрепараты» им Н.А. Семашко; димефосфон – раствор 15% - 83 / 654 / 13. ОАО «Татхимфармпрепараты»; альфа-токоферола ацетат – 71/945/35 73941/12 от 11.02.1967 ООО «ФармДон».

Модель острого панкреатита

У всех животных за 48 часов до начала эксперимента производился забор периферической крови с последующим лабораторным изучением показателей перекисного окисления липидов и функционального состояния эритроцитов. Эти показатели были приняты за норму (исход) и отображены в автореферате на графических рисунках, как 100%.

Все экспериментальные исследования, касающиеся хирургического пособия, проводились под внутривенным наркозом, с использованием тиопентала-натрия из расчета 0,04 г/кг массы животного. Панкреатит моделировали по методу В.М. Буянова с соавт. (1989). Собакам выполняли срединную лапаротомию, пунктировали желчный пузырь, забирали желчь с последующим лигированием места пункции. Затем желчь вводили в паренхиму вертикальной части поджелудочной железы по 0,6 мл в 5 точек.

В послеоперационном периоде всем животным проводили инфузионную терапию (внутривенные введения 5% раствора глюкозы и 0,89% раствора хлорида натрия из расчета 50 мл/кг массы животного). У всех животных в контрольные сроки (на первые, третьи и пятые сутки) осуществляли забор крови для изучения отдельных показателей функционального состоя­ния эритроцитов, качественного и количественного состава липидов, интенсивности процессов ПОЛ, активности фосфолипазы А2, каталазы и супероксиддисмутазы тканей поджелудочной железы и эритроцитов. Выборочно производился забор биоптата. Схема исследований представлена в таблице №1. Препараты антиоксидантного действия вводились в терапевтической дозе, рекомендуемой в справочной литературе и на основании собственных исследований при отработке модели острого панкреатита.

Таблица 1. Схема постановки и проведения исследований

№	Группы	Число животных	Режимы введения препаратов
I	Контрольная	15	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию.
II	Альфа-токоферола ацетатат	10	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию и вводили альфа-токоферол ацетат 5-ти кратно, в дозе 5 мг/кг/сутки, внутримышечно.
III	Димефосфон	10	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию и вводили димефосфон 5-ти кратно, в дозе 50 мг/кг/сутки, внутривенно.
IV	Винпоцетин	15	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию и вводили винпоцетин 5-ти кратно, в дозе 1 мг/кг/сутки, внутривенно.

Методы исследования:

1. Определение липидов: Липиды из гомогената ткани поджелудочной железы и эритроцитов периферической крови экстрагировали хлороформметаноловой смесью, фракционировали методом тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинах. Полярные фосфолипиды разделяли на пластинах фирмы Merk (США) на стеклянной основе, нейтральные липиды фракционировали на силикагелевых пластинах для обращенно-фазной тонкослойной хроматографии (Россия) (Хиггинс Дж. А., 1990; Vaskovsky V.E. et al., 1975). Количественное определение липидов проводилось на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware).

2. Определение диеновых и триеновых конъюгатов проводилось по методу Ганстон Ф.Д. ( Ганстон Ф.Д.,1986).

3.Содержание малонового диальдегида оценивалось в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу Егоров Д.Ю. (Егоров Д.Ю., Козлов А.В., 1987). Для определения антиокислительной активности липидов предварительно проводилась индукция липопереокисления раствором сульфата железа в концентрации 5 мкмоль в течение часа.

4. Активность супероксиддисмутазы оценивалась в реакции с нитросиним тетразолием (Гуревич В. С. и др., 1990).

5. Активность каталазы определялась фотометрическим методом по методу Королюк М.А. (Королюк М.А., 1988). Активность каталазы выражалась в мг Н2О2/мин/г белка.

6. Активность альфа-амилазы определялась методом ферментативного гидролиза крахмала, данные регистрировались на ФЭКе при длине волны 630–690 нм (красный светофильтр) (Досон Р. и др., 1991).

7. Определение активности фосфолипазы А2 проводилось по методу В.А Трофимова (Трофимов В.А., 1999). Активность фосфолипазы А2 оценивалась в среде, содержащей 10 ммоль трис-HCL-буфер (pH 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль CaCl2 и субстрат (1,2 ммоль). В качестве субстрата использовались фосфатидилхолины яичного желтка. Регистрация каталитической деятельности фермента проводилась титрометрическим методом по мере образования свободных жирных кислот. Расчет осуществлялся по калибровочной кривой, построенной по пальмитиновой кислоте, и выражался в мкмоль/с/г белка.

8. Выделение эритроцитов. Кровь для исследования липидного состава мембран эритроцитов забиралась в пластиковую стерильную пробирку. Немедленно после забора крови эритроциты отделялись от плазмы путем центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин. Плазма отбиралась, кольцо белых клеток отбрасывалось, а эритроциты промывались 5-ю объемами 0,05 М Трис HCl (рН= 7,2 буфера) содержащего 150 ммоль хлорида натрия.

9. Определение деформабельности эритроцитов проводилось по методу Федоровой З.Д., 1986. Определялось время, необходимое для полного растекания капли -Т1 и времени растекания эритроцитарной суспензии -Т2. Расчет индекса деформабельности эритроцитов производился как отношение Т1 к Т2.

10. Определение сорбционной способности эритроцитов проводилось по методу Тогайбаева А.А. и др.,1988. Эритроциты отделялись путем центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин. Плазма удалялась, 1мл эритроцитарной массы переносился в пробирку, содержащую 3 мл 0,025% раствора метиленового синего, приготовленного на 0,9% растворе NaCl. Оптическая плотность надосадочной жидкости определялась на длине волны 630 нм. Количество поглощенного красителя (в процентах) вычислялось по формуле:

Еа=100-(С*100/ВF),

где А – количество поглощенного красителя, В – оптическая плотность исходного раствора.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с использованием критерия t Стьюдента. Вычисления проводились на CPU 1600 MHz “Intel Pentium-IV” с помощью пакета программ Microsoft Office XP. Использовался текстовый процессор Microsoft Word 2003. Динамика показателей отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных таблиц Microsoft Excel 2003.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования показали, что выбранная экспериментальная модель острого панкреатита оказалась адекватной для решения поставленной задачи. На следующие сутки после введения желчи в паренхиму поджелудочной железы у животных развивались клинические, морфологические, лабораторные признаки заболевания. Макроскопическая оценка состояния поджелудочной железы при остром панкреатите выявила наличие выраженных признаков воспалительного процесса в ткани пораженного органа в виде отека, гиперемии, кровоизлияний, а в ряде случаев – участков некроза паренхимы органа. Установлено, что при формировании отечной формы острого панкреатита максимальной выраженности воспалительные явления достигали к третьим суткам эксперимента, а на пятые уже отмечалась положительная динамика восстановления макроскопической картины органа. Развитие деструктивной формы наблюдалось в 6 случаях, и сопровождалось прогрессивным нарастанием всех признаков воспалительного процесса в органе, что в итоге приводило к тотальному некрозу паренхимы поджелудочной железы (панкреонекрозу), обуславливая летальность животных.

При изучении активности -амилазы крови выявлено, что она существенно возрастала уже на первые сутки динамического наблюдения и превышала исходный уровень на 144,58%. На третьи сутки эксперимента активность энзима продолжала расти, достоверно превышая норму на 295,81%. На пятые сутки исследования активность -амилазы начинала уменьшаться, но оставалась выше исходного уровня на 160,91%.

Известно, что сохранность структурно-функциональной архитектоники клетки, а, следовательно, и ткани в целом во многом зависит от сбалансированности процессов перекисного окисления липидов (Власов А.П. и др., 2000). Изучение интенсивности процессов липопереокисления и ферментативной активности в тканях поджелудочной железы при остром панкреатите на фоне применения стандартной инфузионной терапии показало, что при данном заболевании отмечается существенная интенсификация процессов перекисного окисления липидов. Так, при остром панкреатите, содержание первичных и вторичных продуктов в ткани пораженного органа возрастало на 86,96 – 160,00% и 109,20 – 318,69% соответственно. Установлено, что при остром панкреатите отмечается значительная интенсификация активности фосфолипазы А2 на 520,88 – 770,33%. Указанные изменения в ткани поджелудочной железы отмечались на фоне угнетения собственного антиоксидантного ферментного потенциала органа, что было зафиксировано в виде снижения активности супероксиддисмутазы (СОД) на 19,92 - 50,04%. Выявлено, что максимальной выраженности указанные изменения достигали к третьим суткам эксперимента (рис. 1).

Рис. 1. Изменения активности супероксиддисмутазы в ткани поджелудочной железы на фоне инфузионной терапии острого панкреатита

Примечание: - достоверность изменений показателей р<0,05, относительно нормы.(контрольная группа)

Изучение состава липидов железистого аппарата структур поджелудочной железы при остром панкреатите на фоне применения инфузионной терапии показало, что развитие патологического процесса в органе тесно связано с липидными дестабилизациями биомембран его тканевых структур. Отмечался устойчивый рост уровней лизофосфолипидов – на 519,13 – 1119,13 %. Выявлены существенные модификации количественного и качественного состава липидов в виде снижения уровней суммарных фосфолипидов на 18,85 – 36,95%, холестерола (ХЛ) – на 37,93%, увеличения содержания моноацилглицеролов (МАГ), диацилглицеролов (ДАГ) и триацилглицеролов (ТАГ) на 61,50 – 196,26; 187,91 – 468,13 и 58,14% соответственно, а также роста уровней свободных жирных кислот (СЖК) – на 37,33 – 95,80% (рис. 2).

Рис. 2. Динамика показателей липидов в ткани поджелудочной железы при остром панкреатите на фоне инфузионной терапии

Примечание: – достоверность изменений р<0,05, относительно нормы.

Известно, что фракции свободных жирных кислот и лизофосфолипидов обладают выраженным детергентным действием, являясь одним из существенных мембранодестабилизирующих факторов, обусловливающим совместно с интенсификацией ПОЛ и активизацией фосфолипазы А2 прогрессирование патологического процесса в органе (Власов А.П. и др., 2004). Следует отметить, что наибольшей выраженности липидные модификации в ткани поджелудочной железы достигали к третьим суткам течения острого панкреатита отечной формы, когда, как описано выше, выраженность воспалительного процесса в органе достигала своего апогея.

Известно, что эритроциты способны опосредованно отражать общий статус клеток всего организма, а по их структурным изменениям косвенно можно судить о нарушениях токсического характера. Это является одной из причин повышенного интереса исследователей к морфофункциональному состоянию красных клеток крови при различных патологических состояниях (Кумерова А.О. и др., 1996; Доровских В.А. и др., 1998; Азизова О.А. и др., 2002; Прокопьева В.Д. и др., 2002; Рязанцева Н.В. и др., 2002; Hou H.J. et al., 1992). Исследование функциональной активности эритроцитов на фоне стандартной инфузионной терапии острого панкреатита показало существенное изменение морфофункционального статуса красных клеток крови в виде уменьшение эластичности, увеличения жесткости и неспецифической проницаемости их мембран, зафиксированное в виде снижения индекса деформабельности (ИДЭ) на 15,38 – 20,77% (р<0,05), повышения жесткости мембран эритроцитов (ЖМЭ) на 18,31 – 31,20% (р<0,05) и сорбционной способности биомембран (ССЭ) красных клеток крови на 16,02 – 30,02% (р<0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Динамика показателей морфофункционального состояния эритроцитов при остром панкреатите

Примечание: - достоверность отличия p<0,05, по отношению к исходному уровню.

Подобные изменения функционального статуса эритроцитов, согласно имеющимся данным, увеличивают вероятность сладж-феномена, вызывают нарушения процессов микроциркуляции, а также снабжение органов и тканей кислородом (Прокопьева В.Д. и др., 2002; Шурхина Е.С. и др., 2003; Бессмельцев С.С. и др., 2004; Преснякова М.В. и др., 2005; Терехина Н.А и др., 2005). Следует отметить, что нарушение функциональной активности эритроцитов коррелировало с выраженностью воспалительного процесса в поджелудочной железе, достигнув максимальных проявлений на третьи сутки эксперимента.

Изучение выраженности процессов перекисного окисления липидов, активности фосфолипазы А2, антиоксидантных ферментов эритроцитов показало, что в динамике острого панкреатита нарушение функциональной активности эритроцитов тесно связано с интенсификацией процессов перекисного окисления липидов и активизацией фосфолипазы А2 при снижении антиоксидантной защиты красных клеток крови. Так, количество первичных и вторичных продуктов ПОЛ в эритроцитах существенно возрастало относительно нормы на всех этапах эксперимента. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) превышало норму на 17,28 – 20,99% и 97,44 – 136,26% соответственно. Активность фосфолипазы А2 (ФЛ А2)в красных клетках крови возрастая превышала исходный уровень на 316,28– 453,49 % (рис. 4). Каталазная активность также увеличивалась и была выше нормы на 40,13 – 61,84%. Установлено достоверное снижение активности супероксиддисмутазы на 20,92 – 48,37% (р<0,05) относительно первоначального уровня.

Рис. 4. Показатели продуктов перекисного окисления липидов и активности фосфолипазы А2 эритроцитов на фоне острого панкреатита

Примечание: – достоверность р<0,05, по отношению к исходному уровню.

Структурно-функциональные особенности мембран зрелых клеток красной крови в некоторой степени отражают процессы, происходящие в мембранах клеток других тканей организма (Степовая Е.А. и др., 2003; Кузнецов В.И. и др., 2004; Спиридонов В.Н. и др., 2004; Субботина Т.Н. и др., 2004). Выявлено, что при остром панкреатите липидный состав биологических мембран эритроцитов подвергался значительным модификациям. Отмечалось увеличение содержания свободных жирных кислот (СЖК) на 48 – 76,71%, триацилглицеролов (ТАГ) на 31,15 – 43,93% и эфиров холестерола (ЭХЛ) 12,39 – 34,42 % на фоне снижения уровня холестерола (ХЛ) и суммарных фосфолипидов (СФЛ) на 15,29 – 16,26% и 8,54– 11,25 % соответственно при значительном процентном увеличении лизоформ (на 112,82 – 220,51%) в их составе (рис. 5).

Известно, что указанные липидные изменения способствуют повышению проницаемости мембран эритроцитов, что отмечалось и в данной серии экспериментов в виде роста сорбционной способности эритроцитов. Увеличение количества насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот и снижение содержания полиненасыщенных жирных кислот приводит к увеличению “жесткости” мембран и уменьшению деформабельности эритроцитов (Соболева М.К., Шарапов В.И., 1994), это нашло подтверждение в снижении индекса деформабельности, выявленном у животных I группы. Липидные модификации биомембран красных клеток крови достигли наибольшей выраженности на третьи сутки течения острого панкреатита и были сопряжены с интенсификацией свободнорадикальных процессов, ферментативной активности фосфолипазы А2 и каталазы в эритроцитах.

Рис 5. Показатели состава липидов мембран эритроцитов при остром панкреатите

Примечание: – достоверность изменений (р<0,05) относительно нормы.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют важнейшую роль системных нарушений липидного обмена в патогенезе острого панкреатита, что подтверждается выявленной сопряженностью выраженности системных дислипидных явлений и динамики воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы.

В экспериментальных группах исследовали эффективность препаратов альфа-токоферола ацетата, димефосфона и винпоцетина в терапии острого панкреатита. Исследования показали, что при добавлении винпоцетина (IV группа) в схему инфузионной терапии острого панкреатита, и клинически и лабораторно отмечалось существенное улучшение состояния животных. На фоне применения данного препарата ни в одном из 15 случаев не было зафиксировано развитие панкреонекроза, и отмечалась 100% выживаемость животных. Макроскопическая оценка состояния поджелудочной железы при релапаротомии показала, что применение винпоцетина способствовало снижению выраженности воспалительного процесса в паренхиме органа и окружающих тканях, предотвращая прогрессирование патологического процесса с трансформацией отечной формы острого панкреатита в деструктивную. Существенный положительный эффект винпоцетина отмечался уже с первых суток применения.

Цитопротекторный эффект был зарегистрирован и при использовании димефосфона: только в одном случае из десяти, несмотря на использование апробируемого антиоксиданта, отмечалась трансформация отечной формы острого панкреатита в деструктивную, что привело к гибели животного на пятые сутки эксперимента.

Применение альфа-токоферола ацетата незначительно изменяло течение воспалительного процесса при остром панкреатите. На всех контрольных сроках изменения состояния поджелудочной железы были аналогичны таковым в контроле, но несколько менее выражены.

Экспериментально установлено, что способность препаратов снижать выраженность воспалительного процесса в ткани пораженного органа коррелировала с восстановлением функциональной активности эритроцитов. Так, на фоне применения винпоцетина уже с первых суток лечения сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) снижались относительно контрольных данных на 13,43%, достоверно не отличаясь от исходных значений. На данном этапе терапии индекс деформабельности (ИДЭ) красных клеток крови по сравнению с нормой изменялся, превосходя контроль лишь на 28,79% (рис. 6).

Рис. 6. Показатели функциональной активности эритроцитов при остром панкреатите на фоне применения винпоцетина

Примечание: - достоверность отличия показателей p<0,05, по отношению к контролю; к – данные контрольной группы; о – данные IV группы.

Применение димефосфона уже на третьи сутки способствовало коррекции нарушений функционального статуса красных клеток крови. Терапевтический эффект от применения альфа-токоферола ацетата проявлялся лишь к концу эксперимента.

Выявлено, что восстановление функциональной активности эритроцитов на фоне применения антиоксидантов реализуется за счет способности препаратов снижать интенсивность процессов ПОЛ, активность фосфолипазы А2, потенцируя восстановление ферментов антиоксидантной системы. Так, включение димефосфона (III группа) в терапию острого билиарного панкреатита показало, что на третьи сутки применения апробируемого препарата содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) снижалось относительно контроля на 12,63% и 18,29% (р<0,05) соответственно. Уровень активности фосфолипазы А2 (ФЛ А2) продолжал уменьшаться по сравнению с контрольным на 49,58% (p<0,05). Супероксиддисмутазная активность на фоне применения димефосфона в терапии острого панкреатита превосходила контроль на 58,23% (p<0,05), достоверно от нормы не отличаясь. Использование винпоцетина показало более высокий антиоксидантный эффект препарата по сравнению с димефосфоном (рис. 7).

Рис. 7. Показатели перекисного окисления липидов и активности фосфолипазы А2 эритроцитов на фоне терапии винпоцетином при остром

панкреатите

Примечание: – значения показателя p<0,05, по сравнению с контролем (I гр.); к – контрольная группа; о – IV группа)

Положительный эффект альфа-токоферола ацетата отмечался лишь с пятых суток его применения. Применение данного препарата в лечении острого панкреатита способствовало некоторому снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов, активности фосфолипазы А2 и восстановлению собственного антиоксидантного потенциала красных клеток крови.

Снижение содержания основных мембранодеструктивных факторов на фоне применения исследуемых препаратов не могло не отразиться на липидном спектре биомембран эритроцитов. Так, на пятые сутки эксперимента на фоне применения альфа-токоферола уровни эфиров холестерола, триацилглицеролов и свободных жирных кислот снижались относительно контроля на 19,92, 19,18 и 15,14% (р<0,05) соответственно, показатели эфиров холестерола, триацилглицеролов достигали исходного значения. Показатель суммарных фосфолипидов был выше исходного уровня на 12,31% (р<0,05) но статистически значимо от нормы не отличался.

Исследование состава фосфолипидов (ФЛ). Данные хроматографии показали, что удельный вес лизофосфолипидов (ЛФЛ) на конечном этапе эксперимента снижался относительно контроля на 25,84% (р<0,05), продолжая превышать норму на 69,23% (р<0,05). Содержание фосфатидилсерина (ФС) было ниже контрольных данных на 14,46% (р<0,05). Уровень фосфатидилэтаноламина возрастал относительно контроля на 20,39%, но достоверно от нормы не отличаясь. Применение димефосфона и, особенно, винпоцетина показало значительно более выраженный липидрегулирующий эффект, когда восстановление и даже в некоторых случаях нормализация состава основных мембранных липидов отмечалась уже с первых дней терапии (рис. 8).

Рис. 8. Динамика уровня фосфолипидов эритроцитов на фоне терапии

винпоцетином при остром панкреатите

Примечание: – значения показателя p<0,05, по сравнению с контролем; к – контрольная группа; о- IV – группа).

Таким образом, результаты экспериментальных исследований показывают, что применение антиоксидантов в терапии острого панкреатита способствует коррекции мембранодестабилизирующих процессов в повреждённом органе, обусловленной высоким липидрегулирующим эффектом данных препаратов.

Выявлено, что наибольшей липидрегулирующей способностью и цитопротекторной активностью обладает винпоцетин, положительный эффект которого начинает проявляться уже с первых суток терапии, предупреждая прогрессирование патологического процесса.

Было изучено состояние липидного метаболизма в ткани пораженного органа на фоне применения винпоцетина. Исследования показали, что включение винпоцетина в схему стандартной инфузионной терапии острого панкреатита способствует снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов и активности фосфолипазы А2 на фоне восстановления собственного антиоксидантного ферментного потенциала поджелудочной железы. Положительный эффект винпоцетина отмечается уже с первых суток его использования, когда содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) на данном этапе терапии было достоверно ниже контрольных цифр на 13,95 и 24,54% (р<0,05) соответственно. Активность фосфолипазы А2 превосходила норму, но при сравнении с результатами контрольной группы была ниже на 46,13% (р<0,05) (рис. 9).

Рис. 9. Показатели перекисного окисления липидов и активности фосфолипазы А2 ткани поджелудочной железы на фоне применения винпоцетина в терапии острого панкреатита

Примечание: к – данные контрольной I группы ; о – данные IV группы ; - изменения показателей достоверности р<0,05, по отношению к контрольному уровню.

Определение активности супероксиддисмутазы показало увеличение данного показателя относительно контроля на 26,26% (р<0,05).

Изучение липидного состава ткани поджелудочной железы при остром панкреатите на фоне применения винпоцетина показало, что включение препарата в терапию приводит к восстановлению липидного состава биомембран панкреацитов уже после первых суток применения, когда в ткани поджелудочной железы отмечался некоторый рост содержания моноацилглицеролов (МАГ) и свободных жирных кислот (СЖК) относительно нормы. Хотя данные показатели были достоверно ниже контрольных цифр на 32,69 и 19,92% (p<0,05) соответственно (рис. 10).

Рис. 10. Состав липидов ткани поджелудочной железы при остром панкреатите на фоне применения винпоцетина

Примечание: к – данные контрольной группы; о – данные IV группы; - изменения показателей достоверные р<0,05, по отношению к контрольному уровню.

В первые сутки применения винпоцетина уровень суммарных фосфолипидов вырос на 22,32% (p<0,05) относительно контроля, но снизился относительно нормы. Применение винпоцетина в терапии острого панкреатита уже с первых суток оказывало благотворное влияние на качественный состав липидов ткани поджелудочной железы. Содержание лизофосфолипидов и при достоверном росте относительно нормы существенно снижалось по сравнению с контролем на 38,34% (p<0,05). Уровень фосфатидилэтаноламина (ФЭ) возрос относительно контроля на 22,43% (p<0,05), достоверно от нормы не отличаясь. Выявленные изменения липидного спектра биомембран панкреатоцитов свидетельствуют о способности винпоцетина купировать мембранодеструктивные явления в поджелудочной железе, что обусловливает высокую цитопротекторную эффективность препарата. Отметим, что позитивное действие препарата сопровождалось существенным снижением активности -амилазы в плазме крови на 18,7 – 28,9%.

Следует заметить, что применение альфа-токоферола ацетата в терапии острого панкреатита незначительно снижает выраженность воспалительных изменений в поджелудочной железе, улучшая состояние животных и уменьшая летальность.

В сравнительном аспекте установлено, что эффективность димефосфона и, особенно, винпоцетина в терапии острого билиарного панкреатита была существенно выше, чем у препарата сравнения -альфа-токоферола ацетатата. Положительный фармакотерапевтический эффект винпоцетина и димефосфона отмечался с первых-третьих суток терапии, а альфа-токоферола ацетатата – только с пятых.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментально смоделированном остром панкреатите, на фоне угнетения антиоксидантной системы, развития синдрома липидной пероксидации и активизации фосфолипазы А2 в тканевых структурах поджелудочной железы и эритроцитах, отмечаются значительные изменения (модификации) липидного состава мембран, сопряженные с выраженностью воспалительного процесса в поджелудочной железе и нарушением функциональной активности эритроцитов.

2. Применение при экспериментальном панкреатите препаратов, обладающих антиоксидантным действием (альфа-токоферола ацетата, димефосфона, винпоцетина), способствует уменьшению воспалительного процесса в поджелудочной железе и восстановлению функциональной активности эритроцитов.

3. Использование исследованных препаратов в терапии острого панкреатита показало высокий цитопротекторный эффект, который заключался в быстром восстановлении липидного состава биомембран клеточных структур поджелудочной железы и эритроцитов (уменьшение уровня свободных жирных кислот на 19,92 – 54,13%, лизоформ фосфолипидов на 32,93 – 63,98%, повышение содержания суммарных фосфолипидов на 13,61 – 34,21%).

4. Цитопротекторный эффект альфа-токоферола ацетата, димефосфона, винпоцетина реализуется за счет способности препаратов снижать интенсивность процессов ПОЛ (уровень молекулярных продуктов липопероксидации уменьшается на 12,6 – 38,1%, фосфолипазная активность – на 15,6 – 73,1%), и восстанавливать антиоксидантный потенциал исследованных клеточных структур (повышается активность СОД на 23,1 – 70,5%).

5. Установлена взаимосвязь высокой терапевтической эффективности исследованных препаратов с их способностью корригировать липидный обмен в организме. Эффективность липидрегулирующего действия винпоцетина существенно выше, чем у димефосфона и препарата альфа-токоферола ацетата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Показатели липидного обмена форменных элементов крови (эритроцитов), а также интенсивности перекисного окисления липидов и фосфолипазной активности являются значимыми лабораторными критериями выраженности воспалительного процесса в поджелудочной железе при остром панкреатите, и эффективности проводимой терапии.

2. В комплексную терапию больных острым панкреатитом для предупреждения прогрессирования воспалительного процесса в органе и коррекции нарушений функциональной активности форменных элементов крови рекомендуется включение мембранопротекторов. Из исследованных лекарственных препаратов предпочтение следует отдать винпоцетину. Препарат следует применять сразу после диагностики заболевания и вводить ежедневно, это позволит быстрее купировать явления панкреатита и восстановить морфофункциональное состояние эритроцитов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Расстройства гомеостаза при синдроме эндогенной интоксикации // Актуальные проблемы медицинской науки и образования: труды межрегиональной научной конференции. Пенза: Информационный издательский центр ПГУ, 2007. С. 46–47. Власов А.П., Крылов В.Г., Берёзкин И.М., Александров П.В., Пузанов С.Ю., Арсентьев И.Н.
2. Коррекция функционального статуса форменных элементов крови при эндотоксикозе // Материалы I Конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов: сб.тр. Ульяновск: УлГУ. С. 134–135. Дроздова Г.А., Власова В.П., Берёзкин И.М., Пузанов С.Ю., Александров П.В., Марочкина Н.В.
3. Мембранопротекторы в коррекции морфофункциональных нарушений форменных элементов крови // Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте: Материалы XI науч. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов мед.фак. Мордов.гос. ун-та. Вып. 7. Саранск: Изд-во Мордов. ун–та, 2007. С. 27–30. С.Ю. Пузанов, И.М. Берёзкин, А.И. Москаева, Н.В. Марочкина
4. Мембранопротекторы в коррекции расстройств гомеостаза при панкреатите // Вестник интенсивной терапии. 2007. № 5. С. 78–81. А.П. Власов, В.Г. Крылов, И.М. Берёзкин, А.Г. Келейников, И.В. Атаманкин, И.В. Мишарина, В.М. Кукош
5. Панкреатопротекторное действие препаратов антиоксидантного типа // Современные аспекты хирургической эндокринологии: материалы XVI Российского симпозиума по хирургической эндокринологии. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2007. С. 53–54. А.П. Власов, В.Г. Крылов, И.М. Берёзкин, С.Б. Келейников, Е.В. Салямкина
6. Мембранопротекторы в коррекции печеночной недостаточности при эндотоксикозе // Анналы хирургической гепатологии. 2007. Т. 12. № 3. С. 194–195. Каргаев В.Н., Меркушкина И.В., Захаркин А.Г., Тюрина Е.П., Циликина О.В., Берёзкин И.М., Александров П.В.