WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Разработка и стандартизация противовоспалительного лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта.

На правах рукописи

Доброхотов Денис Анатольевич

Разработка и стандартизация противовоспалительного лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

14.04.02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Москва 2011

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Нестерова Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Сокольская Татьяна Александровна

Доктор фармацевтических наук,

профессор Зайчикова Светлана Геннадьевна

Ведущая организация

ФБГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения"

Защита состоится "___"___________ 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 119019, г.Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первый МГМУ им.И.М. Сеченова по адресу: 117998, г.Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан "___"____________________2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук,

профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в практическом здравоохранении, составляет более 40%. Одним из путей увеличения количества препаратов растительного происхождения является широкое изучение действия уже известных фармакопейных лекарственных растений, часто используемых по ограниченному числу показаний, а также составление рациональных многокомпонентных растительных композиций (сборов), которые являются наиболее популярными, доступными для населения и содержат биологически активные вещества с разносторонним фармакологическим действием для коррекции многих связанных между собою биохимических процессов организма. Перспективность и развития исследований в области разработки новых прописей многокомпонентных сборов для лечения разнообразных патологий обеспечивается достаточной сырьевой базой по большинству видов лекарственных растений. Вместе с тем ассортимент сборов, получивших разрешение к медицинскому применению в Российской Федерации, не велик (порядка 40 наименований). Следует отметить, что в стоматологической практике сборы на основе лекарственного растительного сырья не находят, на сегодняшний день, достойного применения. Расширение исследований по изысканию источников для получения новых эффективных и безопасных лекарственных растительных средств, обеспечивающих комплексное фармакологическое воздействие на все звенья патогенеза в стоматологической практике, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки и стандартизации сбора для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. Разработать методологический подход к созданию многокомпонентных растительных сборов для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта; с учетом патогенеза заболеваний пародонта теоретически и экспериментально обосновать выбор оптимального состава сбора;
  2. Изучить ассортимент лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырья, спрос, потребности и обосновать необходимость создания лекарственного растительного средства, применяемого для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта;
  3. Изучить химический состав сбора для профилактики лечения заболеваний пародонта, а также провести оценку его антимикробного действия;
  4. Провести комплексные фармакогностические исследования многокомпонентного растительного сбора, определить критерии подлинности и показатели качества сбора, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания.
  5. Провести поиск веществ-маркеров, позволяющих идентифицировать все заявленные компоненты в анализируемом сырье.
  6. Изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из сборов.
  7. Разработать нормативную документацию на предлагаемый сбор: проект фармакопейной статьи на сбор.
  8. На основе предложенного сбора разработать удобную форму –фильтр-пакет.

Научная новизна работы. Сформулирован подход формирования состава сбора для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта с учетом многофакторного воздействия каждого компонента.

В ходе исследования специализированной литературы и патентной документации, обоснован состав нового отечественного сбора для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта, с оригинальным набором компонентов, позволяющий осуществлять фармакологическое воздействие на многофакторные звенья развития патологического процесса в тканях пародонта.



Новизна проведенных исследований подтверждена патентом № 2319499 "Лекарственный сбор для лечения и профилактики заболеваний пародонта, осложненного аллергическим состоянием" от 20 марта 2008 года.

Выявлены вещества-маркеры, позволяющие доказать заявленные компоненты в сборе, и с учетом проведенных исследований предложены методы идентификации всех заявленных компонентов в анализируемом сборе.

В ходе фармакогностических исследований определены морфологические признаки растительных компонентов сбора, выявлены диагностически значимые признаки лекарственного растительного сырья в сборе. С использованием комплекса методов (тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия) в анализируемом сборе установлено содержание основных групп биологически активных веществ флавоноидной природы, фенолкарбоновых кислот, сапонинов, полисахаридов, эфирных масел, органических кислот, аминокислот.

С учетом значимости отдельных групп биологически активных веществ в обеспечении лечебных эффектов разработаны методики их количественной оценки и предложены показатели качества, необходимые для стандартизации. На основании проведенных исследований обоснована необходимость комплексного подхода к стандартизации сбора, включающей идентификацию всех заявленных компонентов.

С целью определения доброкачественности сбора, предложены методики количественного определения - содержания суммы флавоноидов, дубильных веществ, полисахаридов, глицерризиновой кислоты, включенные в проект нормативной документации на анализируемый сбор.

Изучено влияние размера частиц и условий экстракции на выход биологически активных веществ, на основании чего сформулированы рекомендации по оптимальному режиму настаивания. Осуществлено определения ряда маркерных веществ, обеспечивающих надежную идентификацию компонентов сбора при стандартизации.

С учетом разработанных методов анализа определены оптимальные сроки хранения созданного лекарственного сбора.

Практическая значимость результатов исследования. Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать новый растительный сбор в качестве эффективного средства для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта, что расширяет арсенал отечественных средств растительного происхождения, применяемых в стоматологической практике.

На основании проведенных исследований разработан проект ФС на сбор для лечения и профилактики заболеваний пародонта. Результаты исследований по выявлению веществ-маркеров в ЛРС, входящем в состав сбора, внедрены в обучающий модуль «Особенности сквозной стандартизации лекарственного растительного сырья» в спец. курсе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Российского Университета Дружбы Народов, а также использованы в проекте методического руководства по контролю качества сборов из лекарственного растительного сырья, используемых в качестве средств для лечения и профилактики стоматологических заболеваний в лаборатории контроля качества медицинской техники и оборудования Главного управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники в Республике Узбекистан.

Связь задач исследований с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы кафедры общей химии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по теме: "Оценка качества и сертификация лекарственных препаратов лекарственного растительного сырья и продуктов его переработки" (Номер государственной регистрации 01970007164).

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 2009); XVII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 2010); научно-практической конференции "Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации" (Ташкент 2009); научно-практической конференции "Интеграция образования, науки и производства в фармации" (Ташкент 2010); IV Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва 2007); Учебно-методической конференции сотрудников Академии, посвященной 250-летию ММА им. И.М. Сеченова (Москва 2007); Учебно-методической конференции сотрудников Академии, посвященной 250-летию ММА им. И.М. Сеченова (Москва 2008); Научно-практической конференции, посвященной 5-ти летию студенческого научного общества стоматологического факультета (Москва 2009); Научно-практической конференции, посвященной 105-летию со дня рождения доктора фармацевтических наук, профессора Ивана Алексеевича Муравьева (Пятигорск 2009); Республиканской научно-практической конференции "Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья" (Ташкент 2006); Межкафедральной конференции кафедр общей химии и ботаники ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова.

Личный вклад автора. Автору принадлежит роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрение в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – "Фармацевтическая химия, фармакогнозия". Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4, 6 и 7 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, и 1 патент РФ на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту:

- анализ литературных и экспериментальных исследований по обоснованию необходимости разработки состава сбора, рекомендуемого для профилактики и лечения заболеваний пародонта.

- результаты исследования химического состава в изучаемых объектах основных групп биологически активных веществ методами спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ.

- результаты анализов по установлению характеристик подлинности и определению показателей качества разработанного сбора.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 184 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (главы 2,3) собственных исследований (главы 4,5,6), заключения, выводов, списка литературы, который включает в себя 243 источника, из них 22 на иностранных языках, и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 27 рисунками.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе, на основании анализа отечественной и зарубежной литературы, изучены основные тенденции развития воспалительных заболеваний пародонта, а также современных препаратов, используемых для лечения и профилактики указанных патологий. Дана краткая характеристика российского рынка лекарственных препаратов растительного происхождения, используемых для воздействия на различные звенья патологической цепи, обуславливающей развитие воспалительное заболевание пародонта. Обсуждены возможности применения фитокомпозиции с лечебной и профилактической целью при указанных заболеваниях. Рассмотрены вопросы, связанные с особенностями стандартизации многокомпонентных лекарственных растительных средств, в первую очередь касающиеся поиска специфических веществ, позволяющих идентифицировать все заявленные компоненты в многокомпонентной композиции.

Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, а также данные методического характера.

Третья глава посвящается разработке теоретических и методических подходов к созданию многокомпонентного сбора, обеспечивающего комплексное фармакологическое воздействие при воспалительных заболевания пародонта, а также изучение ассортимента лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырь, спроса и потребностей и обосновывается необходимость создания лекарственного растительного средства, применяемого для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта.

Глава четвертая посвящена фармакогностическим исследованиям и стандартизации разработанного растительного сбора. В ней отражены данные по оценке его качества и изучению химического состава, позволившие в дальнейшем осуществлять стандартизацию разработанного многокомпонентного лекарственного растительного сбора. Подобраны оптимальные условия экстракции биологически активных веществ из сбора и даны практические рекомендации по использованию с целью лечения и профилактики заболевания пародонта.

В пятой главе приведенные данные по изучению комплекса биологически активных веществ терпеноидной природы и фенолкарбоновых кислот, на основании которых выявлены специфические для каждого вида вещества, которые могут быть использованы в качестве веществ – маркеров, обеспечивающих надежную идентификацию всех заявленных компонентов в составе анализируемого сбора.

В шестой главе приведены результаты исследований выделения БАВ из фильтр-пакетов и обосновывается возможность их использования в комплексной терапии заболеваний пародонта.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служило лекарственное растительного сырье различных морфологических групп, отвечающее требованиям нормативной документации: Radix Glycyrrhizae ( ГФ X, ст.573), Flores Calendulae officinalis (ГФ XI, ст. 5), Rhizomata Tormentillae (ФСП 42-0273201101), Herba Bidentis tripartitae (ГФ XI, ст. 45), Herba Achilleaea Millefolii (ГФ XI, ст. 53), Herba Origani vulgaris (ГФ XI), Rhizomata et radices Sanguisorbae (ФС 42-1082-76).

На основе указанного сырья создан сбор, обладающий выраженным антимикробным действием в отношении большинства возбудителей, который может быть рекомендован для профилактики и лечения воспалительного заболевания пародонта.

Все анализируемое сырье приобреталось на ОАО «Красногорсклексредства».

Отбор проб проводился в соответствии ГФ XI издания, вып. 1, стр 273.

В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с указаниями статьи «Сборы» (ГФ XI изд., вып.1, стр.266.).

Микроскопическое исследование сборов осуществляли согласно методике, описанной в ГФ ХI изд., вып.1, стр. 277. («Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья»).

Идентификацию биологически активных веществ (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, тритерпеновых сапонинов и др.) проводили с помощью качественных реакций и методами бумажной хроматографии на бумаге Санкт-Петербургской фабрики № 2 марки «С» «Filtrak №11» и с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) «Silufol UV-254», «Kieselgel», «Merck» в системах стандартных, обычно применяемых для анализа биологически активных веществ указанных групп.

ВЭЖХ анализ фенольных соединений, глицирризиновой и органических кислот проводился на хроматографе фирмы GILSON, Франция, инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мульти Хром для Windows версия 1,47а (ЗАО «Амперсенд», Москва, Россия). В качестве неподвижной фазы использовали колонки PLATINUM EPS 100A размером 4,6х250 мм, ALTECH OA-1000 Organic Acids размером 6,5х300 мм.

Поиск специфических веществ маркеров осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6850 Series II. Детектор масс-селективный Agilent Technologies 5973 Network. Колонка HP-5MS (30m х 0,25mm). Условия хроматографирования: температура колонки: начальный изотермический участок 35°С – 5 мин, 35-100°С, со скоростью подъема температуры 2°С/мин, 100-200°С, со скоростью подъема температуры 5°С/мин, 200-250°С, со скоростью подъема температуры 10°С/мин и конечным изотермическим участком 15 мин. Температура испарителя 200°С. Температура инжектора 30°С. Скорость газа-носителя (гелия) – 1 мл/мин.

Содержание свободных и связанных аминокислот определяли методом ВЭЖХ на приборе «KLA-3B» «Хитачи». Условия анализа стандартные, обычно применяемые для анализа белковых гидрализатов, с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром» для «Windows».

Качество сбора контролировали по следующим числовым показателям: влажность (по методике ГФ XI, вып. 1, стр 285), зола общая (по методике ГФ XI, вып. 2 стр. 24), зола, не растворимая в 10% растворе соляной кислоты (по методике ГФ XI, вып. 2 стр 25), примеси, количество измельченных частиц (по методике ГФ XI, вып. 1, стр. 275-276).

Изучение антимикробной активности сбора проводилось в службе контроля качества ОАО «Петровакс-фарма».

Статистическая обработка экспериментальных результатов исследований нами проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.1 стр. 199-221, с использованием критерия Стьюдента.

Разработка подходов к составлению рецептур сбора для профилактики и лечения заболеваний пародонта.

Обоснование состава многокомпонентного растительного сбора

На основании анализа современной патентной документации, а также литературных данных о химическом составе и фармакологической активности отдельных видов лекарственного растительного сырья составлен сбор из лекарственного растительного сырья, рекомендуемый для профилактики и лечения заболеваний пародонта, обладающий выраженным антимикробным, противовоспалительным, эпителизирующим и имунномодулирующим действием. В его состав включены: корни солодки Radix Glycyrrhizae (20%), цветки календулы Flores Calendulae officinalis (10%), корневища лапчатки Rhizomata Tormentillae (10%), трава череды Herba Bidentis tripartitae (10%), трава тысячелистника Herba Achilleaea Millefolii (10%), трава душицы Herba origani vulgaris (20%), корневища и корни кровохлебки Rhizomata et radices sanguisorbae (20%). Заявленные компоненты измельчались до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.

Поскольку определяющим фактором в развитии воспалительных заболеваний пародонта большинство авторов считают микробную контаминацию поверхности эмали и слизистой, нами было проведено изучение антимикробной активности водного извлечения из полученного сбора. Она определялась в разведениях (1:10, 1:100, 1:1000) суспензированных образцов в стерильном физиологическом растворе с рН=7.

В эксперименте использовали следующие системы тест-культур:

Bacillus cereus AТСС 10702

Candida abicans АТСС 885-653

Esherichia coli АТСС 25922

Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р

Pseudomоnas aeruginosa АТСС 9027

Результаты анализа представлены в таблице 1

Таблица 1

Результаты определения антимикробной активности извлечения из сбора.

Анализируемый объект Bacillus cereus Candida abicans Esherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomоnas aeruginosa
Разведение 1:10 +++ +++ +++ +++ ++-
1:100 +++ +++ +++ +++ ++-
1:1000 ++- ++- ++- +++ +--




+++ сильно выраженное угнетение роста штамма

++- заметное угнетение тест-штамма по сравнению с контрольным высевом

+-- незначительное угнетение роста, слабый бактериостатический эффект

Приведенные данные свидетельствуют о наличии выраженного антимикробного действия анализируемого сбора, сохраняющего свою антимикробную активность даже при разведении 1:1000 в отношении большинства тест-культур, традиционно используемых для выявления бактериостатического эффекта. Следует особо отметить угнетение роста штаммов Candida abicans, Staphylococcus aureus, Pseudomоnas aeruginosa, которые оказывают заметное влияние на развитие воспаления тканей пародонта.

Обобщенные данные по подбору компонентов сбора, обладающих различной фармакологической активностью и позволяющих оказывать комплексное воздействие на все звенья развития воспалительных заболеваний пародонта, использовались нами при составлении методических рекомендаций по дальнейшей разработке рациональных прописей (схема 1).

Схема 1. Алгоритм действий по разработке рецептур сборов.

Разработка и стандартизация лекарственного сбора для леченяи и профилактики заболеваний пародонта.

Для внедрения в медицинскую практику новых лекарственных средств, в том числе сборов, необходимо проведение исследований по разработке пoказателей качества сбора, гарантирующих эффективность, безопасность, воспроизводимость действия, и, на основе полученных результатов, создание проекта ФС. Сложный состав биологически активных веществ предлагаемого сбора, включающего 7 растительных компонентов, делает целесообразным постановку вопроса об их стандартизации по комплексу биологически активных соединений, доминирующих в сборе и преимущественно обусловливающих фармакологический эффект. Также необходимо провести их фармакогностическое изучение для установления качественного состава, количественного содержания основных групп биологически активных веществ и разработки метода стандартизации.

Разработка технологической схемы получения сбора.

Схема получения сбора (Схема 2) была разработана на основании общепринятых технологических операций для изготовления данной лекарственной формы в соответствии с требованиями стандарта ОСТ 42-510-98 и «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств».

 Схема 2. Основные стадии технологического процесса. Характеристика-2

Схема 2. Основные стадии технологического процесса.

Характеристика доброкачественности и подлинности сбора.

Для установления критериев подлинности сбора, содержащего растительное лекарственное сырье, относящееся к различным морфологическим группам, проводили изучение его внешних и анатомо-диагностических признаков с помощью макро- и микроскопического методов анализа. Установлены наиболее значимые диагностические признаки, которые использовались при разработке нормативной документации (проект ФС).

Результаты определения товароведческих характеристик сбора представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели качества сборов

Показатели качества анализируемого сбора Обнаружено при анализе Рекомендуемая норма
I 2005 II 2006 III 2007
Влажность, % 8,85% 9,25% 9,55% не > 14%
Зола общая, % 8,26% 8,32% 8,34% не> 13%
Зола, нерастворимая в 10% растворе НСl, % 2,57% 2,59% 2,57% не > 5%
Количество частиц, не проходящих сквозь сито с d=5 мм, % 5,9% 6,4% 6,9% не>10%
Примеси органические, % 0,19% 0,18% 0,18% не > 2%
Примеси минеральные, % 0,029% 0,030% 0,030% не> 1%

Учитывая, что в состав сбора входят компоненты, содержащие эфирные масла, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды и сапонины, наше внимание при проведении анализа было уделено в первую очередь указанным группам.

С помощью качественных реакций в водном извлечении из сбора было установлено наличие флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, гликозидов, аскорбиновой кислоты, аминокислот и полисахаридов.

Методом бумажной хроматографии в присутствие свидетелей РСО и хроматографически чистых образцов подтверждено наличие: на уровне РСО ликуразида (Rf~0,11); на уровне ГСО лютеолин-7-гликозида (Rf~0,53); на уровне РСО танина (Rf~0,61).

При длине волны 254 нм видны 11 флуоресцирующих пятен: на уровне РСО ликуразида (Rf~0,11); на уровне РСО лютеолин-7-гликозида (Rf~0,53); на уровне РСО танина – пятно коричневатого цвета (Rf~0,61); на уровне РСО галловой кислоты – пятно сине-фиолетового цвета (Rf~0,93).

Полученные данные подтверждены методом ВЭЖХ. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты исследования фенольных соединений сбора методом ВЭЖХ.

Номер пика Идентифицировано % Содержание в выделенной смеси (метод внутренней нормализации)
1 Галловая кислота 11,58
2 Катехин 5,88
3 Хлорогеновая кислота 6,22
4 Кофейная кислота 28,03
5 Лютеолин-7-гликозид 13,70
6 Ликуразид 1,79
7 Кверцетин 15,31
8 Дигидрокверцетин 2,43
9 Апигенин 2,06

Общий вид хроматографического профиля фенольных соединений представлен на рисунке 1.

 Идентификация фенольных соединений в сборе методом ВЭЖХ 1 - галловая-3

Рис. 1. Идентификация фенольных соединений в сборе методом ВЭЖХ

1 - галловая кислота; 2 - катехин; 3 - хлорогеновая кислота; 4 - кофейная кислота; 5 - лютеолин-7-гликозид; 6 - ликуразид; 7 - кверцетин; 8 - дигидрокверцетин; 9 - апигенин

Методом ВЭЖХ осуществлено определение содержания органических кислот, в ходе которого в составе сбора идентифицированы: щавелевая, винная, маликовая, янтарная, бензойная, салициловая кислоты.

Результаты идентификации органических кислот в анализируемом сборе представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты идентификации органических кислот в сборе методом ВЭЖХ.

Номер пика Идентифицировано Времена удерживания, мин Содержание в выделенной смеси, % (метод внутренней нормализации)
1 Щавелевая кислота 4,99 59,01
2 Винная кислота 5,89 11,27
3 Маликовая кислота 6,63 24,63
4 Янтарная кислота 10,23 0,31
5 Бензойная кислота 14,93 0,21
6 Салициловая кислота 15,84 4,57

Общий вид хроматографического профиля органических кислот представлен на рисунке 2.

 Идентификация органических кислот в сборе методом ВЭЖХ 1 - щавелевая-4

Рис.2. Идентификация органических кислот в сборе методом ВЭЖХ

1 - щавелевая кислота; 2 - винная кислота; 3 - маликовая кислота; 4 - янтарная кислота; 5 - бензойная кислота; 6 - салициловая кислота.

Поскольку в разработанном сборе содержится трава душицы и тысячелистника, основным компонентом которых является эфирное масло, нами был изучен состав эфирного масла выделяемый из анализируемого сбора.

Анализ проводили в стандартных условиях с использованием РСО гераниола, L-пинена, -пинена, борнилацетата и тимола. Детектирование проводили с использованием анисового альдегида. В данных условиях в испытуемом образце было обнаружено 11 пятен. Из них идентифицировано 5 пятен на уровне пятен РСО, 6 пятен не идентифицировано.

Результаты идентификации эфирного масла в анализируемом сборе представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты идентификации компонентов эфирного масла методом ТСХ.

Rf Rf РСО Идентифицировано
Гераниол Тимол L-пинен -пинен борнилацетат
0,05 0,11 0,16 0,20 0,25 0,33 0,45 0,67 0,73 0,75 0,98 0,25 0,75 0,45 0,33 0,73 Гераниол -пинен L-пинен Борнилацетат Тимол

Для определения содержания эфирных масел в сборах использовали метод перегонки с водяным паром с подбором оптимальных условий количественного определения. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние условий перегонки на выход эфирного масла из сборов.

Навеска сырья, г Выход эфирного масла, %
Степень измельченности и время перегонки и время перегонки
1 мм 2 мм 3 мм
Зч Зч 1 ч Зч
Сбор
10,0 0,10± 0,003% 0,15± 0,005% 0,15± 0,005% 0,08± 0,002% 0,12± 0,004% 0,12± 0,004% 0,09± 0,003% 0,11± 0,004% 0,12± 0,004%

С помощью метода ВЭЖХ установлен качественный и количественный состав аминокислот. В результате идентифицировано наличие 16 аминокислот: лизин (5,3%), метионин (0,08%), гистидин (2,8%), аргинин (8,5%), треонин (4,9%), серин (6,6%) пролин (6,2%), глицин (10,5%) валин (6,6%), изолейцин (3,2%), лейцин (8,0%), тирозин (2,8%), фенилаланин (2,9%) аланин (10,0%) глутаминовая кислота (12,0%), аспарагиновая кислота (8,7%).

Учитывая литературные данные, подтверждающие широкий спектр фармакологического действия фенольных соединений, а также принимая во внимание результаты предыдущих исследований, подтвердившие присутствие фенольной фракции в анализируемом сборе, мы сочли целесообразным привести количественную оценку суммы флавоноидов в пересчете на рутин и фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту.

Для разработки методики количественной оценки суммы действующих веществ нами были подобраны оптимальные условия проведения анализа: выбор экстрагента, его соотношение с сырьем, размер частиц сырья и время экстракций. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Выбор оптимальных условий экстракции флавоноидов

Изучаемый параметр Содержание флавоноидов, %
Концентрация этилового спирта
Н2О 0,086 ± 0,004
25% 0,124 ± 0,005
50% 0,284 ± 0,011
70% 0,455 ± 0,018
96% 0,138 ± 0,005

Продолжение таблицы 7

Измельченность сырья
1 мм 0,464 ± 0,018
2 мм 0,471 ± 0,018
3 мм 0,394 ± 0,015
5 мм 0,159 ± 0,006
Соотношение сырье — экстрагент
1:50 0,439 ± 0,017
1,5:50 0,421 ± 0,016
2:50 0,417 ± 0,016
Время экстракции при температуре кипения
15 мин 0,315 ± 0,013
30 мин 0,395 ± 0,016
45 мин 0,471 ± 0,019
60 мин 0,475 ± 0,019

Было установлено, что максимальный выход суммы флавоноидов (%) наблюдается при использовании в качестве экстрагента 70% этилового спирта; измельченность сырья 2 мм; оптимальное соотношение сырья и экстрагента составило 1:50 и время нагревания на кипящей водяной бане -45 минут.

Количественное определение суммы фенолкарбоновых кислот проводили спектрофотометрическим методом в пересчете на хлорогеновую кислоту, результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в сборе

Дата контроля Содержание фенолкарбоновых кислот, %
Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5
15.05.10 1,82 1,84 1,86 1,82 1,83

Метрологические характеристики анализа приведены в таблице 9

Таблица 9

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенолкарбоновых кислот

n f P% t(P,f) _ X% S2 S Sx _ X _ E%
5 4 95 2,78 1,834 0,00028 0,0167 0,0074 0,0208 1,13

Учитывая присутствие в сборе корней солодки, в состав которой входит фракция сапонинов, содержащая глицирризиновую кислоту - вещество, которое может быть рассмотрено в качестве приоритетного маркера, мы сочли целесообразным провести количественную оценку сбора по показателю содержания суммы сапонинов.

Анализ содержания суммы тритерпеновых сапонинов проводили после кислотного гидролиза спектрофотометрическим методом в пересчете на олеаноловую кислоту при длине волны 490 нм. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10

Содержание сапонинов в сборах

Дата контроля Содержание сапонинов в сборах, %
Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 4 Проба 5
06.05.09 0,68 0,72 0,73 0,67 0,72
14.05.10 0,66 0,71 0,71 0,66 0,68

Подтверждена сохранность биологически активных веществ- сапонинов при хранении.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы сапонинов представлены в таблице 11

Таблица 11

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы сапонинов

n f P% t(P,f) _ X% S2 S Sx _ X _ E%
5 4 95 2,78 0,704 0,00073 0,027 0,0121 0,0335 4,77
5 4 95 2,78 0,684 0,00063 0,025 0,012 0,0312 4,56

Анализ глицирризиновой кислоты осуществляли методом ВЭЖХ на приборе «Watera» (США) со спектрофотометрическим детектором Lambda-Max модель 481 в стандартных условиях, которые используются для определения веществ сапониновой природы.

Расчет количественного содержания глицирризиновой кислоты проводили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы Мульти Хром для «Windows». Полученные результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12

Содержание глицирризиновой кислоты в сборе

Дата контроля Содержание глицирризиновой кислоты, %
В сборе В корнях солодки
4.03.08 0,54 ± 0,008 6,52 ± 0,097
9.03.09 0,52 ± 0,008 6,48 ± 0,097
8.03.10 0,49 ± 0,007 6,34 ± 0,095

Полученные показатели качества и нормы содержания действующих веществ включены в проект нормативной документации.

Изучение возможности выявления специфических веществ, используемых при стандартизации в качестве маркеров.

В работе проводилось изучение компонентного состава растений, входящих в состав растительного лекарственного сбора с целью нахождения специфических веществ-маркеров, обеспечивающих надежность идентификации всех заявленных компонентов сбора.

Пробоподготовка включала в себя следующее: устанавливали флакон с полученным экстрактом в ультразвуковую ванну-мешалку «Сапфир» без нагрева на 10 минут. Затем осуществляли отбор 10 мл экстракта в пластиковую колбу для центрифугирования и центрифугировали на центрифуге Ohaus Split 16000 rpm при 16000 об/мин 2 минуты. По окончанию центрифугирования осуществляли отбор микродозатором 1 мл экстракта с поверхности для предотвращения попадания частиц сырья. Помещали в барабан инжектора хромато-масс-спектрометра.

Компонентный состав летучих фракций экстрактов компонентов представлен в таблице 13

Таблица 13.

Компонентный состав летучих фракций экстратов растительного лекарственного сырья, входящего в состав сбора для лечения и профилактики воспалительного заболевания пародонта.

Анализируемое сырье Соединение Время удерживания, мин Степень совпадения с библиотечным масс-спектром, %
Цветки календулы Трипропиламин 15,947 83
Уксусная кислота 21,063 90
-Кубебен 21, 529 96
Копфен 21,529 91
D-Гермакрен 23, 287 92
-Кубебен 23, 291 92
-Селинен 24, 706 91
-Аморфен 25,281 92
(+)-Эпи-бициклосесквифелландрен 26, 062 97
-Кадинен 26, 391 99
Виридифлорен 26, 539 99
-Элемен 26, 836 98
-Аморфен 27,067 99
Нонадекан 30, 197 95
Корневища и корни кровохлебки о-Ксилен 17, 073 83
Уксусная кислота 21, 075 86
З-Фуральдегид 21, 494 87
Карвон 27, 169 92
Корни солодки Туйен 15,534 93
2,3-Бутандиол 23, 796 91
1,3-Циклогексадиен, 5-(1,5-диметил-4-гексенил) -2-метил-, 26, 934 93
-Аморфен 27,751 98
Циклогексен, 3-(1,5-диметил-4-гексенил)-6-метилен-, 27, 880 95
Анетол 28, 881 98

Продолжение таблицы 13

Трава череды Лимонен 15,377 95
-Цимен 17, 108 93
Уксусная кислота 21,017 91
Диметил сульфоксид 23, 772 90
Карвон 27, 172 92
Трава тысячелистника -Фелландрен 13,176 91
-Мирцен 14, 064 93
Лимонен 14,931 91
Эвкалиптол 15,486 98
Транс-оцимен 15,955 89
о-Цимен 16, 925 97
Уксусная кислота 21, 025 91
Камфора 22,748 98
Борнеол 24, 093 91
Изоборнил ацетат 24,163 87
Кариофиллен 24, 507 99
Изоборнеол 26, 499 91
(+)-Эпи-бициклосесквифелландрен 26, 715 93
Октагидро-7-метил-1Н-циклопента(1.3)циклопропа(1,2) бензол 26,797 93
2,4-Третбутилфенол 27, 661 93
Декагидро-8 -этил-1,1,4,6-тетраметилнафталин 32, 671 95
Корневища лапчатки Лимонен 15,455 91
Туйен 15,674 94
Транс-оцимен 16,710 95
Уксусная кислота 21, 009 91
З-Фуральдегид 21,490 91
Фурфурол 21,590 91
Трава душицы обыкновенной -Пинен 13,157 95
Бицикло(2.2.1)гексан, 4-метилен-1 -(1 -метилэтил)- 13,450 91
-Фелландрен 13,450 91
Терпинолен 14, 880 91
Лимонен 15,346 94
Эвкалиптол 15,592 99
-Терпинен 16, 526 97
-Оцимен 16, 670 96
Цис--терпинеол 21,536 97
Циклобутан( 1,2,3,4)дициклопентен, декагидро-3 -метил-6-метилен- 22,897 96
Кариофиллен 24,550 99
П-мент-1 -ен-8-ол 26, 371 91

Наиболее специфичными веществами в качестве маркеров могут быть использованы 1,3-циклогексадиен, -аморфен, анетол,2,3-бутандиол, подтверждающие наличие в сырье корней солодки; борнеол, кариофелен, бициклосесквифелелландрен наличие травы тысячелистника; -пинен, цис--терпинеол присутствие травы душицы; производное пропилбензола -цимен присутствие травы череды; о-ксилен и карвон – наличие корневищ и корней кровохлебки; -кубебен, -кубебен, D-гермакрен, копфен, присутствие цветков календулы; фурфурол и 3-фуральдегид, наличие корневища лапчатки.

Таким образом установлено, что все заявленные в сборе виды лекарственного растительного сырья содержат биохимические маркеры, по присутствию которых возможна идентификация соответствующего вида сырья в составе анализируемого сбора.

Выводы

  1. Разработан научно-методологический подход к созданию многокомпонентных растительных сборов для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта; обоснован выбор оптимального состава сбора с учетом патогенеза заболеваний пародонта теоретически и экспериментально;
  2. Изучен ассортимент лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырья, проведена оценка спроса, потребности и обоснована необходимость создания лекарственного растительного средства, применяемого для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта.
  3. Изучен химический состав сбора для профилактики и лечения заболеваний пародонта, а также проведена оценка его антимикробного действия;
  4. Проведены комплексные фармакогностические исследования многокомпонентного растительного сбора, определены критерии подлинности и показатели качества сбора,
  5. Предложены методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания.
  6. Проведен поиск веществ - маркеров, позволяющих идентифицировать все заявленные компоненты в анализируемом сырье. Солодка (-аморфен, анетол,2,3-бутандиол), тысячелистник (борнеол, кариофелен, бициклосесквифелелландрен), душица (-пинен, цис--терпинеол), череда (производное пропилбензола -цимен), кровохлебка (о-ксилен и карвон), календула (-кубебен, -кубебен, D-гермакрен, копфен), лапчатка (фурфурол и 3-фуральдегид).
  7. Изучено влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из сборов.
  8. Разработана нормативная документация на предлагаемый сбор: проект фармакопейной статьи на сбор.
  9. Изучены и отобраны качественные характеристики и числовые показатели, которые следует использовать в анализе водных извлечений сбора, выпускаемого в фильтр-пакетах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В. Совершенствование стандартизации противовоспалительного средства для лечения и профилактики заболевания пародонта, осложненного аллергическим состоянием пациента // Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья: Материалы Республиканской научно-практической конференции. -Ташкент. – 2006. –С.90-91.
  2. Доброхотов Д.А., Кузьменко А.Н., Нестерова О.В., Разживин Р.В., Решетняк В.Ю., Попков В.А. Сравнительное изучение компонентного состава вытяжек из лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта на основе различных растворителей методом газо-жидкостной хроматографии. // Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов: Материалы VI российской научно-практической конференции. - М.: РАЕН, 2007.-С.103.
  3. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В., Разживин Р.В., Кузьменко А.Н. Разработка показателей подлинности сбора для комплексного лечения заболевания пародонта, осложненного аллергическим состоянием. // Фармацевтический вестник Узбекистана. –Ташкент, 2007,- № 2. –С.19-22.
  4. Адмакин О.И., Доброхотов Д.А., Нестерова О.В., Маркарян А.А., Мамедов А.А., Пинеев С.А., Разживин Р.В., Таланова С.А. Патентное изобретение № 2319499 РФ. Лекарственный сбор для лечения и профилактики заболевания пародонта, осложненного аллергическим состоянием. // "Бюллетень Федерального Института промышленной собственности. Изобретения. Полезные модели" – Москва, 2008. – №8 (IIч.) – С. 487.
  5. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В. Теоретическое обоснование разработки нового сбора для профилактики и комплексного лечения воспалительного заболевания пародонта, осложненного аллергическим состоянием. // Стоматология ХХI века. Эстафета поколений. -Сборник трудов научно-практической конференции, посвященный 5-летию студенческого научного общества стоматологического факультета. –М., 2009. -С.53-54.
  6. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В. Изучение хромато-масс-спектрометрических профилей компонентов сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта с целью разработки показателей подлинности. // Стоматология ХХI века. Эстафета поколений. -Сборник трудов научно-практической конференции, посвященный 5-летию студенческого научного общества стоматологического факультета. – М., 2009. -С.54-55.
  7. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В. Определение веществ- маркеров при исследовании сборов лекарственного растительного сырья (обзор). // Стоматология ХХI века. Эстафета поколений. -Сборник трудов научно-практической конференции, посвященный 5-летию студенческого научного общества стоматологического факультета. – М., 2009. -С.55-57.
  8. Доброхотов Д.А., Чередник И.В., Парамазова З.Х. Разработка метода определения суммарного содержания флавоноидов в корнях солодки и сборе для лечения и профилактики заболеваний пародонта. // Стоматология ХХI века. Эстафета поколений. -Сборник трудов научно-практической конференции, посвященный 5-летию студенческого научного общества стоматологического материаловедения. – М., 2009. -С.57-58.
  9. Доброхотов Д.А. Разработка числовых показателей противовоспалительного лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта. // Фармацевтический вестник Узбекистана. –Ташкент 2009 № 2. -С.25-28.
  10. Доброхотов Д.А. Качественный анализ фенолкарбоновых кислот в сборе для лечения и профилактики заболеваний полости рта. // Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации: Материалы Республиканской научно-практической конференции. –Ташкент, -2009, -С.167-168.
  11. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В., Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю. Определение компонентного состава летучей фракции экстракта календулы с целью выделения веществ маркеров. // Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации: Материалы Республиканской научно-практической конференции. –Ташкент, -2009, -С.168-169.
  12. Доброхотов Д.А., Нестерова О.В. Определение полисахаридного комплекса в сборе для лечения и профилактики заболеваний полости рта. // Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации: Материалы Республиканской научно-практической конференции. –Ташкент, -2009, -С.169-170.
  13. Головина Н.В., Доброхотов Д.А. Нестерова О.В. Бабаскин В.С., Ольшанская О.В. Оптимизация хроматографических условий определения низших карбоновых кислот в растительном сборе для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта. // Тез. доклада XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". М.2010,-С.596
  14. Доброхотов Д.А., Головина Н.В., Нестерова О.В., Бабаскин В.С., Гарнова Н.Ю. Нахождение специфических маркеров при анализе состава растительного лекарственного сбора для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта, осложненных аллергическим состоянием// Тез. доклада XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". М.2010, - С.605
  15. Попков В.А., Нестерова О.В., Доброхотов Д.А. Основные принципы составления и стандартизации сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта.// Интеграция образования, науки и производства в фармации: Материалы научно-практической конференции. – Ташкент, -2010, -С.151
  16. Нестерова О.В., Доброхотов Д.А. Определение содержания аминокислотного состава сбора для лечения воспалительного заболевания пародонта // Интеграция образования, науки и производства в фармации: Материалы научно-практической конференции.– Ташкент,-2010, -С.152
  17. Доброхотов Д.А. Фитохимическое изучение цветков календулы с целью разработки критериев подлинности при определении сырья в многокомпонентном сборе // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб. науч. тр./ под ред. М.В. Гаврилина. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010.-.Вып. 65. -С.36-37
  18. Доброхотов Д.А., Кузьменко А.Н., Нестерова О.В. Изучение компонентного состава экстракта лапчатки корневища с целью выявления специфических веществ, позволяющих идентифицировать данное сырье в многокомпонентном сборе. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб. науч. Тр./ под ред. М.В. Гаврилина. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010.-.Вып. 65. -С.312-313.
  19. Кузьменко А.Н., Доброхотов Д.А., Разживин Р.В., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю., Попков В.А. Изучение компонентного состава летучей фракции экстрактов растений, входящих в состав сбора для лечения заболеваний пародонта, методом газовой хромато-масс-спектрометрии. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии, 2010, - №10 –С.3-9


 





<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.