Арина александровна особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы

На правах рукописи

Паюхина Марина Александровна

ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА КЛЕТОК ГРАНУЛЕЗЫ

ФОЛЛИКУЛОВ В ЯИЧНИКАХ СВИНЕЙ И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ

С ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

ГИПОФИЗАРНО-ОВАРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Белгород – 2009

Работа выполнена на кафедре терапии и акушерства ФГОУ ВПО «Курская

государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

Научный руководитель: заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор биологических наук, профессор

Сеин Олег Борисович

Официальные оппоненты: заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор биологических наук, профессор

Безбородов Николай Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Козлов Владимир Егорович

Ведущая организация – Орловский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится _____ 2009 года в «____» часов на заседании диссертационного совета Д 220.004.01 при ФГОУ ВПО «Белгородская госу-дарственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 308503, Белгородская область, пос. Майский, ул. Вавилова, д.1. Тел/факс 8(4722) 39-22-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО Бел ГСХА

Автореферат разослан «____» 2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доцент Ю.Н. Литвинов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярной биологии клетки, позволил по-иному оценить многие процессы, протекающие в ней. Более детально изучены механизмы контроля клеточного деления, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигналов от рецепторов в ядро. Одним из таких механизмов, участвующих в поддержании гомеостаза на тканевом и системном уровнях, является апоптоз – особый вид гибели клеток, который наблюдается как в условиях нормальной, так и патологической жизнедеятельности животных.

Исследование молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток стало в настоящее время одной из самых актуальных проблем биологических наук, поскольку сбои в реализации программы апоптоза в клетках лежат в основе патогенеза и прогрессии ряда заболеваний. Нарушение генетически запрограммированных процессов клеточной гибели, а именно ингибиции апоптоза может привести к неуправляемой со стороны гормональной системы организма клеточной пролиферации и развитию новообразований, возникновению аутоиммунных заболеваний.

Апоптоз стал неотъемлемым инструментом для осуществления наследственного и приобретенного, гуморального и клеточного ответа иммунной системы. Изучение процесса апоптоза открывает новые перспективы в клеточной биологии и иммунологии.

В последние годы у исследователей повысился интерес к процессам апоптоза, протекающего в репродуктивных органах самок, в частности тканях матки и яичников. Ученых интересует роль апоптоза в развитии фолликулов и их атрезии, какова его интенсивность в течение полового цикла, и какое влияние оказывают на него гонадотропные и половые гормоны. Осуществляются попытки регуляции апоптоза в фолликулах яичников с использованием различных ингибиторов (С.В. Стрижикова, 2000; L. Zhong-Hua et al., 2002; L. Chang-Kyn, 2002). Однако имеющиеся в источниках литературы сведения не многочисленны, выполнены на разных видах животных и нередко носят противоречивый характер.

Цель и задачи исследований. Принимая во внимание актуальность и научно-практическую значимость указанной проблемы, целью настоящей работы являлось изучение особенностей процесса апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы. Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологическое проявление апоптоза клеток гранулезы фолликулов и гормональную активность аденогипофиза и яичников у свиней до полового созревания.

2. Установить особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов и гормональной активности аденогипофиза и яичников у свиней в возрастном аспекте.

3. Выяснить роль апоптоза клеток гранулезы в процессе атрезии фолликулов в яичниках свиней.

4. Изучить влияние экзогенных гонадотропных препаратов на активность процесса апоптоза в клетках гранулезы в фолликулах яичников свиней.

5. Получить иммуногистохимическую характеристику апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения люлиберина.

Научная новизна. На основании результатов морфологических и иммуногистохимических исследований выяснено, что клетки гранулезы подвергаются апоптозу на разных стадиях развития фолликулов в яичниках свиней. Показано, что атрезия клеток гранулезы фолликулов тесным образом связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников и зависит от содержания в крови гонадотропных и половых гормонов. Впервые выявлены особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней, находящихся на разных стадиях атрезии. Получены новые данные о влиянии на апоптоз клеток гранулезы экзогенных гонадотропных препаратов и люлиберина.

Отличие результатов исследований от результатов, полученных другими авторами, заключается в том, что исследования были выполнены не на модулируемых системах и лабораторных животных, а на свиньях разного возраста и физиологического состояния. При этом использовались комплекс методов: гистологические, иммуногистохимические, гормональные. Это позволило изучить особенности апоптоза клеток гранулезы и гормонального статуса у неполовозрелых и половозрелых свинок, выяснить роль апоптоза в процессе атрезии фолликулов и изучить влияние экзогенных гонадотропинов и люлиберина на процесс апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований особенностей апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней существенно дополняют представления о механизме атрезии фолликулов и интерьерных перестройках, происходящих в репродуктивной системе самок в возрастном аспекте.

Полученные данные можно использовать при разработке новых средств биологической стимуляции овуляции у свиноматок, а также в учебном процессе при изучении курсов физиологии и ветеринарного акушерства.

Реализация результатов исследований. Основные научные положения и предложения производству вошли в рекомендации «Физиологические особенности формирования половой функции у свиней» (Курск, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Результаты качественных и количественных показателей проявления апоптоза клеток гранулезы на разных стадиях развития фолликулов в яичниках свиней.

• Особенности процесса апоптоза клеток гранулезы у свиней в возрастном аспекте и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы.

• Взаимосвязь процессов апоптоза клеток гранулезы и атрезии фолликулов в яичниках свиней.

• Иммуногистохимическая характеристика процесса апоптоза клеток гранулезы в фолликулах свиней после введения экзогенных гонадотропинов и люлиберина.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях «Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2006), «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта развития агропромышленного комплекса» (Троицк, 2007), «Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение» (Санкт-Петербург, 2007), «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2007), «Проблемы и перспективы развития аграрного производства» (Смоленск, 2007), «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2007), «Трансферт инновационных технологий в животноводстве» (Орел, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008); всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ в номинации «Ветеринарные науки» (Белгород, 2008), научных конференциях профессорско-преподавательского состава Курской ГСХА имени И.И. Иванова (Курск, 2005 – 2008);

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы. Список литературы включает 238 источников, в том числе 167 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 26 рисунками. По результатам исследований опубликовано 10 научных статей, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2005 по 2008 гг. на базе межкафедральной научно-исследовательской лаборатории факультета ветеринарной медицины и учебно-опытного хозяйства «Знаменское» Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова; лаборатории Курского областного бюро патологической анатомии.

Объектом исследований являлись ремонтные свинки крупной белой породы. Животных подбирали по принципу аналогов с учетом происхождения, массы тела, возраста и развития. Материалом для исследований служили яичники, которые получали от свинок после убоя или овариоэктомии в условиях хозяйства или мясокомбината.

Экспериментальная часть работы состояла из трех серий опытов.

В первой серии опытов изучали особенности апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней в возрастном аспекте. С этой целью проводили отбор яичников у неполовозрелых и половозрелых свинок 5-месячного возраста, а также у 7-, 9-, 12- и 24-месячного возраста. У неполовозрелых свиней яичники получали во время стадии уравновешивания полового цикла.

У всех подопытных животных брали кровь, в которой определяли общие гематологические показатели (СОЭ, гематокрит, содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина), содержание эстрадиола-17 и прогестерона.

Вторая серия опытов была посвящена изучению процессов апоптоза и атрезии фолликулов в яичниках свиней. Данные процессы исследовали у свинок 5-месячного возраста.

В третьей серии опытов изучали влияние экзогенных гонадотропинов и люлиберина на течение апоптоза в клетках гранулеза фолликулов в яичниках свиней.

В качестве гонадотропинов был выбран препарат «Фоллимаг». Опыты проводили на свинках 9-месячного возраста, из которых было сформировано 5 групп. В первую группу входили контрольные животные; во 2 группу входили свинки, у которых отбор яичников проводили на первые сутки после введения препарата; в 3 группу - на третьи сутки; в 4 группу – на пятые сутки; в 5 группу – на седьмые сутки после введения препарата. Препарат вводили внутримышечно в дозе 1000 ИЕ/гол.

В качестве люлиберина был выбран препарата «Сурфагон». Для выяснения его влияния на течение апоптоза в клетках гранулезы было сформировано четыре группы свинок 6-месячного возраста. Свинки 1, 2 и 3 группы являлись опытными, им вводили внутримышечно и однократно сурфагон в дозе 50 мкг/гол. Свинки 4 группы являлись контрольными, им вводили стерильный физиологический раствор. У свинок 1 опытной группы яичники отбирали через 6 часов после введения препарата, у свинок 2 и 3 группы – соответственно через 24 и 48 часов. У контрольных животных овариэктомию проводили через 24 часа после введения физиологического раствора.

В ходе выполнения диссертационной работы использовали комплекс методов.

Масса, линейные и объемные параметры. Массу устанавливали с использованием электронных весов. Диаметр яичников и фолликулов измеряли штангенциркулем. Объем определяли путем погружения в мерный сосуд с водой.

Гистологические исследования. Изготовление гистологических препаратов осуществляли по общепринятой схеме: фиксация материала, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле, заливка в парафин, приготовление парафиновых срезов на санном микротоме (Д.С. Саркисов, 1996). Окрашивали гистопрепараты гематоксилин-эозином. Для морфометрических измерений использовали винтовой окуляр-микрометр.

Иммуногистохимические исследования. Проводили стрептавидин–биотиновым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах ткани яичников с использованием моноклональных мышиных антител к PCNA – Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone bcl-2 (1:300, Dako); Clone Ki-67 (1:25, Dako); p53, DO-7 (1:25, Dako). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (рН=6,0) в бытовой СВЧ-печи «SAMSUNG –M1774R». Для приготовления препаратов использовали стекла, покрытые силаном (DAKO S 2024).

Количественные исследования проводили путем определения индекса апоптоза (ИА) в 10 случайно выбранных полях зрения (100 клеток) как долю (в %) положительно окрашенных ядер клеток гранулезы фолликулов яичников с соответствующими морфологическими признаками.

Аналогичным образом, что и индекс апоптоза, определяли в клетках гранулезы фолликулов яичников индекс пролиферации (ядерная метка Ki-67) и экспрессию р53, bcl-2.

Для оценки морфологических изменений зернистого слоя фолликулов использовали специальную визуально-аналоговую шкалу для полуколичественного определения выраженности активности процесса апоптоза (Аруин Л.И., 1997).

Гормональные методы. Определение в плазме крови гонадотропных препаратов (ФСГ, ЛГ) проводили методом биологического тестирования (A.Parlow, 1961) после их предварительного концентрирования в плазме крови путем насыщения сернокислым аммонием (М.И. Прокофьев, Ю.А. Селиверстов, 1977). Содержание эстрадиола-17 и прогестерона в крови животных определяли иммуноферментным методом с использованием наборов «Vismarа».

Биометрические исследования. Полученные в ходе проведенных исследований данные подвергали биометрической обработке (П.Ф. Рокицкий, 1973) с использованием ПВЭМ «IBM PC/AT».

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность

гипофизарно-овариальной системы у свиней в период

полового созревания

Анализ гистологических препаратов фолликулов в яичниках у 5-месячных неполовозрелых и половозрелых свинок показал, что клетки гранулезы, подверженные апоптозу, отличаются от жизнеспособных клеток. Это связано с тем, что у апоптотических клеток уплотняется цитоплазма, вследствие чего она окрашивается более интенсивно по сравнению с окружающими клетками, а также происходит фрагментация и конденсация хроматина в ядре. При этом существенных различий в течении апоптоза в клетках гранулезы у половозрелых и неполовозрелых свиней выявлено не было. Как у первых, так и у вторых процесс апоптоза осуществлялся по одному «сценарию» и сопровождался характерными признаками: уменьшение клетки, подверженной апоптозу, в размере, отграничение ее от окружающей ткани светлым ободком и образование апоптозных телец. Апоптозные тельца в гистологических препаратах выглядели преимущественно в виде округлых образований, четко отграниченных от окружающих тканей участками просветления.

Применение большого увеличения позволило выявить в апоптозных клетках изменения в ядре и цитоплазме. Было установлено, что ядерный хроматин в этих клетках конденсируется в виде отдельных крупных глыбок, которые локализуются преимущественно около ядерной мембраны. Конденсированный хроматин в одних случаях занимал всю поверхность среза такого фрагмента, в других располагался в виде «полулуния».

Несмотря на однотипность изменений в гранулезе и в общем «механизме» апоптоза у неполовозрелых и половозрелых свиней, нам удалось выявить, что интенсивность процесса апоптоза у первых была более высокой, чем у вторых. О чем свидетельствуют результаты определения индекса апоптоза: у неполовозрелых свинок (1,88±0,3 – 2,10±0,44) он был выше по сравнению с половозрелыми (1,65±0,5 - 1,78±0,88).

Рис.1 - Индекс апоптоза клеток гранулезы и содержание ФСГ

и ЛГ в крови свинок 5-месячного возраста

Рис.2 - Индекс апоптоза клеток гранулезы и содержание эстрадиола-17

и прогестерона в крови свинок 5-месячного возраста

В свою очередь было установлено, что интенсивность апоптоза в клетках гранулезы фолликулов свиней тесным образом связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников. Как следует из рисунков 1, 2 у свинок с относительно низким содержанием в крови гонадотропных гормонов и эстрадиола-17 индекс апоптоза был выше, чем у животных с более высоким содержанием этих гормонов.

3.2. Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность

гипофизарно-овариальной системы у свиней в возрастном аспекте

Исследование процесса апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней в 5, 7, 9, 12 и 24 месяцев показало, что он был практически однотипным и не имел существенных различий в возрастном аспекте. В большинстве случаев в гистопрепаратах встречались одиночные клетки с признаками апоптоза и редко обнаруживались группы апоптозных клеток. При этом в погибающих клетках гранулезы наблюдалась конденсация хроматина в виде крупных глыбок.

На ранних стадиях апоптотической смерти клеток гранулезы наблюдались округления контуров и уменьшение размеров клеток, потеря ими межклеточных контактов. Гибнущие клетки обнаруживались во всех фолликулах независимо от того, подвержены они атрезии или нет.

Расчет индекса апоптоза показал, что с увеличением возраста животных интенсивность апоптоза в клетках гранулезы снижается. Однако и в этом случае наблюдалась зависимость течения апоптотического процесса от функционального состояния аденогипофиза и яичников. У свинок с более высоким содержанием в крови гонадотропных гормонов и эстрадиола-17 индекс апоптоза был меньше, чем у животных с более низким содержанием этих гормонов (табл.1).

Таблица 1 - Индекс апоптоза и содержание гонадотропных и половых

гормонов в крови свиней в возрастном аспекте

Показатели	Возраст, мес.
	5	7	8	9	12	24
Апоптозный индекс	1,85±0,3	1,75±0,8*	1,65±0,4*	1,65±0,5*	1,60±0,7*	1,66±0,6*
ФСГ мкг/100мл	114,5±8,5	124,0±9,9	131,5±10,2	130,8±9,0	141,0±10,7	150,5±11,*5
ЛГ мкг/100мл	2,5±0,2	3,3±0,4	3,5±0,3	3,6±0,2*	3,8±0,1*	3,7±0,3*
Эстрадиол-17, пмоль/л	66,8±5,7	70,5±6,6	71,2±8,3	75,4±6,0	81,3±7,7*	78,8±7,0*
Прогестерон, нмоль/л	20,5±3,5	23,7±2,8	34,0±3,7*	27,2±4,2	33,5±3,6*	39,6±4,5*

Примечание: * - при р<0,05, по сравнению с соответствующими показателями, полученными у животных 5-месячного возраста

3.3. Особенности атрезии фолликулов в яичниках свиней

в возрастном аспекте

Экспериментальная часть работы по изучению процесса атрезии фолликулов у свиней состояла из двух серий опытов. В первой серии изучали процесс атрезии фолликулов в яичниках свинок с 3- до 10- месячного возраста. Вторая серия опытов была посвящена исследованию атрезии фолликулов в яичниках свинок после введения гонадотропного препарата ПГ-600 (Голландия).

Учитывая то, что процесс атрезии фолликулов в яичниках свиней, независимо от возраста животных, имеет однотипный характер, мы обобщили результаты гистологических исследований и провели анализ. Это позволило получить, прежде всего, общее представление о «механизме» атрезии фолликулов в яичниках у свиней крупной белой породы.

Результаты исследований показали, что процесс атрезии фолликулов регистрировался как у неполовозрелых свинок, так и у половозрелых животных. Было установлено, что атрезии подвергались фолликулы на всех стадиях развития. Процесс атрезии примордиальных фолликулов протекал с плохо выраженными изменениями, поэтому о завершении атрезии этих фолликулов можно судить только по разрушению структур овоцита.

Атрезия вторичных фолликулов протекала с более характерными признаками. Прежде всего, здесь можно было заметить изменения со стороны фолликулярного эпителия, подвергавшегося дегенерации. Его клетки становились более округлыми, ядра принимали неправильную форму, овоцит находился в свободном состоянии внутри фолликула.

Атрезия третичных фолликулов, в отличие от вторичных, протекала с более выраженными признаками и сопровождалась дегенерацией не только фолликулярного эпителия, но и клеток внутренней теки. Отмечено, что и в этом случае в овоците заметных изменений не обнаруживалось.

Наши наблюдения показали, что при световой микроскопии первые признаки атрезии в фолликулах свиней регистрируются в фолликулярном эпителии и текальных клетках, а затем проявляются в овоците. Однако не исключено, что «запуск» атретического процесса в фолликуле начинается именно с овоцита, а затем он передаётся на окружающие структуры - фолликулярный эпителий и теку. В данном случае световая микроскопия не позволяет выявить трудноуловимые изменения в структуре овоцита.

Динамика количества антральных фолликулов в яичниках свиней представлена на рисунке 3, из которого видно, что наиболее интенсивно атрезия фолликулов происходит в период полового созревания и становления половой функции.

Учитывая роль аденогипофиза в регуляции фолликулогенеза, нами был проведён эксперимент по изучению влияния гонадотропинов на ход атретического процесса в яичниках свиней. С этой целью ремонтным свинкам 8-месячного возраста вводили гонадотропный препарат ПГ-600 в дозе 600 ИЕ/гол (1 опытная группа) и 1000 ИЕ/гол (2 опытная группа), контролем являлись животные, которым вводили физиологический раствор. Через 72 часа у опытных и контрольных свинок проводили лапаротомию и извлекали яичники.

Рис.3 - Динамика образования атретических фолликулов в

яичниках ремонтных свинок в возрастном аспекте

Результаты гистологических исследований показали, что введение гонадотропного препарата ПГ-600 оказывает определённое влияние на процесс атрезии в яичниках свинок. При этом было установлено, что введение более высокой дозы (1000 ИЕ/гол) препарата сопровождается активизацией атретического процесса и кистозным перерождением фолликулов. После введения препарата в рекомендуемых дозах (600 ИЕ/гол) в яичниках свинок находилось много примордиальных, а также полноценных вторичных и третичных фолликулов и значительно меньше фолликулов, подвергавшихся атрезии.

3.4. Роль апоптоза в процессе атрезии фолликулов в яичниках свиней

При изучении взаимосвязи апоптотических и атретических процессов, нами было установлено, что в фолликулах, не имеющих признаков атрезии, единичные клетки обнаруживались в основном в тех частях зернистого слоя, которые удалены от яйценосного бугорка. В фолликулах, подвергшихся атрезии (первая стадия), апоптотические клетки обнаруживались в основной своей массе по периферии. Наоборот, в фолликулах во время второй стадии атрезии более интенсивно процесс апоптоза протекал в яйценосном бугорке, постепенно затрагивая другие клетки зернистого слоя. При этом поздние стадии апоптотического процесса преобладали по периферии, а ранние - в яйценосном бугорке.

Третья стадия атретического процесса характеризовалась тем, что в яйценосном бугорке большинство клеток гранулезы вступали в позднюю стадию апоптоза и выявлялись лишь единичные клетки, не имеющие признаков гибели. Тогда как по периферии апоптотические процессы «затухали» и количество клеток без признаков апоптоза было больше, чем в яйценосном бугорке.

Четвертая стадия атретического процесса характеризовалась резким включением в процесс гибели всех частей зернистого слоя. При микроскопии основную массу составляли апоптотические тельца.

Рис.4 - Динамика индекса апоптоза клеток гранулезы фолликулов

в яичниках свиней 5-месячного возраста

Для получения более полной картины, происходящей в гранулезе, был произведен подсчет индекса апоптоза в зрелых фолликулах, не имеющих видимых признаков атрезии, а также в фолликулах, находящихся на первой, второй и третьей стадии атретического процесса. В этом опыте был использован иммуногистохимический метод исследования с использованием антител к гену р53. Результаты исследований представлены на рисунке 4, из которого следует, что в зрелых фолликулах, не имеющих видимых признаков атрезии, индекс апоптоза был минимальным, а в фолликулах подвергшихся атрезии он возрастал в зависимости от стадии атретического процесса.

Таким образом, увеличение индекса апоптоза указывает на наличие атретического процесса и данный показатель можно использовать в качестве «маркера» начала атретического процесса в фолликулах.

3.5. Влияние экзогенных гонадотропинов на течение апоптоза в

клетках гранулезы яичников свиней

Результаты иммуногистохимического анализа апоптотической активности в клетках гранулезы зрелых фолликулов в яичниках свиней после введения препарата «Фоллимаг» показали, что у животных контрольной группы морфологическая картина исследования характеризовалась слабо выраженным bcl-2 - окрашиванием гранулезы и лишь небольшие группы клеток имели яркую коричневую окраску. Иммуногистохимическое окрашивание на ген р53 выявило наличие позитивно реагирующих клеток зернистого слоя со степенью градации два балла (11-13%). В основном такие клетки обнаруживались по периферии. Активность коричневой окраски для ядерного антигена пролиферирующих клеток Ki-67 характеризовалась равномерностью со слабой степенью выраженности, клетки имели не однородную окраску и в основной массе окрашивались в светло-коричневый цвет.

На первые сутки после введения препарата было отмечено усиление сродства клеток гранулезы к красителю. В этот период наблюдений возрастало число клеток гранулезы, имевших bcl-2-позитивное окрашивание. При этом количество клеток, имеющих положительную окраску к гену р53, снижалось, составляя 9-10%. Реакция с антителами к Ki-67 не имела существенных отличий от контрольной группы.

Через трое суток с момента введения препарата было выявлено усиление иммуногистохимического окрашивания на антиапоптотический белок bcl-2, которое наиболее выражено проявлялось в области яйценосного бугорка. Реакция на ген р53 имела слабую выраженность признака. При морфологическом исследовании препаратов на Ki-67-позитивных клеток отмечалось увеличение сродства к красителю, наблюдалась более интенсивная коричневая окраска и увеличение числа окрашенных клеток.

На пятые сутки после введения препарата интенсивность окрашивания клеток гранулезы возросла. При этом выраженное bcl-2-позитивное окрашивание выявлялось не только в зернистом слое, но и затрагивало соединительно-тканный слой. Процент клеток иммуногистохимически позитивных к белку р53 имел незначительную степень выраженности признака и составлял менее 5%. Интенсивность коричневой окраски на Ki-67 была ярко выраженной и имела равномерность в распределении по зернистому слою.

На седьмые сутки с момента введения препарата общая интенсивность экспрессии bcl-2-протеинов уменьшилась. В это время отмечалась выраженная мозаичность иммуногистохимического окрашивания разных частей фолликула: участки окрашенных на bcl-2 клеток гранулезы чередовались с зонами, в которых было выражено сродство красителя к клеткам. Окраска на белок р53 показала, что процент клеток положительно реагирующих вновь увеличился. При этом концентрация р53 – позитивных клеток была сосредоточена по периферии зернистого слоя. Это связано, по-видимому, с повышением интенсивности апоптотических процессов вследствие снижения защитных свойств клетки, обусловленных понижением активности белка bcl-2. При исследовании срезов, окрашенных на маркер пролиферации Ki-67, наблюдалось неравномерное окрашивание клеток.

Анализ результатов полуколичественной оценки апоптотических процессов, протекающих в клетках гранулезы яичников свиней после введения гонадотропного препарата, позволяет сделать предположение, что усиление экспрессии bcl-2-белка на пятые сутки эксперимента связано со стимуляцией механизмов блокирующих апоптоз и осуществляющих антиоксидантную защиту клеток.

В это же время мы наблюдали уменьшение процента клеток положительно реагирующих при окраске на белок р53, что также указывает на снижение апоптотических процессов в клетках.

Сравнительное изучение выраженности апоптоза в клетках гранулезы до и после введения препарата позволило выявить значительные колебания количественных показателей индекса апоптоза, пролиферативного индекса и экспрессии белка bcl-2. Было установлено, что пролиферативный индекс, полученный с использованием иммуногистохимического определения ядерного антигена пролиферирующих клеток Ki-67, имел тенденцию к увеличению после ведения препарата, в отличие от контроля. Так, у животных контрольной группы он составлял 47,3±1,5%, а у свинок второй и третьей опытной группы, что соответствовало 3 и 5 суткам после введения гонадотропного препарата, пролиферативный индекс был выше и достигал соответственно 49,2±3,2% и 52,5±2,0%. Однако, у свинок, у которых исследовали материал на 7 сутки после введения препарата, пролиферативный индекс снижался (50,7±3,6%).

Экспрессия белка bcl-2 в период исследований изменялась параллельно динамике пролиферативного индекса. В клетках гранулезы фолликулов у свинок на 3 сутки после введения препарата экспрессия bcl-2 составляла 87,3±4,8%, на 5 сутки – 90,7±5,2%, что соответственно на 1,6 и 5,1% было больше по сравнению с контролем. В то же время на 7 сутки после введения гонадотропного препарата экспрессия белка bcl-2 вновь понизилась и составляла 87,7±4,9%.

Что касается индекса апоптоза, то его динамика была противоположной динамике пролиферативного индекса и экспрессии белка bcl-2. Так, у контрольных свинок индекс апоптоза в клетках гранулезы фолликулов составлял 3,1±0,3%. У свинок опытных групп на 3 и 5 сутки после введения гонадотропного препарата он понизился и соответственно достигал 2,5±0,2 и 2,0±0,2%. Однако, на 7 сутки после введения препарата он вновь увеличился (2,7±0,3%).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что гонадотропины оказывают блокирующее действие на процесс апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней.

3.6. Иммуногистохимическая характеристика апоптоза клеток

гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения люлиберина

Исследование процесса апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения препарата «Сурфагон» позволило выявить определенное сродство клеток к маркеру р53. При этом количество апоптоз-положительных клеток составляло в среднем 1,5%, и в основном они обнаруживались по периферии фолликула, а в яйценосном бугорке такие клетки не выявлялись. Результаты изучения маркера пролиферации Ki-67 в исследуемой группе подтвердили снижение пролиферативной активности клеток и неравномерность в их окраске.

У подопытных свинок через 24 час после введения препарата количество клеток зернистого слоя, имеющих ярко-коричневую равномерную окраску к маркеру bcl-2 уменьшилось, а количество клеток, имеющих сродство к р53, наоборот, имело тенденцию к увеличению. Однако такие клетки, как и в предыдущем случае, в основном выявлялись по периферии фолликула. Что касается маркера пролиферации Ki-67, то в ходе исследований наблюдалось снижение сродства к нему, которое характеризовалось слабо выраженной коричневой окраской клеток.

При этом в атретических фолликулах сродство к маркеру р53 было отчетливо выраженным и характеризовалось яркой окраской и отсутствием мозаичности, тогда как к маркеру bcl-2 сродство клеток практически не проявлялось.

Через 48 час после введения препарата в зернистом слое третичных и вторичных фолликулов наблюдали картину, схожую с таковой у контрольной группы животных. Полуколичественная оценка результатов показала лишь отличия при исследовании окраски к маркеру пролиферации, которая характеризовалась слабой выраженностью, лишь отдельные клетки имели ярко-коричневую окраску.

Количественная оценка пролиферативной активности имела тенденцию к снижению по сравнению с таковой в контрольной группе животных. Так, через 6 час после введения препарата пролиферативный индекс составлял 43,6±3,9%. Через 24 часа он повысился до 45,2±4,1%, что свидетельствует о снижении способности клеток к пролиферации. Однако у свинок, у которых исследовали фолликулы через 48 час после введения препарата, пролиферативный индекс имел тенденцию к увеличению (46,7±3,5%).

Анализ состояния экспрессии р53 показал, что через 6 час после введения препарата количество р53–положительно реагирующих клеток было не высоким и в среднем составляло 1,5±0,3%, тогда как в контроле данное значение достигало 2,6±0,6%. Через 24 часа процент апоптозных клеток увеличился до 3,9±0,7%, а через 48 час вновь отмечалась тенденция к снижению показателя (3,1±0,7%).

Проведенная оценка изменений экспрессии белка bcl-2 показала, что данный показатель через 6 час после введения препарата составлял 88,1±4,5%, через 24 час достигал 87,2±5,2%, а через 48 час – 86,9±5,3%. В контрольной группе животных показатель экспрессии белка bcl-2 составлял 85,6±5,4%. Расчет индекса апоптоза показал, что в контрольной группе свинок в клетках гранулезы фолликулов он составлял 3,3±0,3%. Через 6 часов, после введения люлиберина, индекс резко понизился и достигал 2,5±0,2 %. Однако, во второй опытной группе он вновь увеличился до 2,8±0,5%.

Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что после введения сурфагона у свинок апоптотические процессы снижаются и активизируется процесс роста фолликулов. Об этом свидетельствует тот факт, что у свинок третьей группы масса яичников (6,3±0,21г), их объем (5,3±0,35см3), количество фолликулов, размеры которых превышали 0,5см (19,8±0,44), было больше, чем у свинок других групп. При этом по сравнению с контрольными животными (5,10±0,20г; 4,4±0,27 см3; 16,4±0,35) эти различия являлись статистически достоверными (р<0,05).

В свою очередь иммуноферментный анализ половых гормонов показал, что у свинок третьей группы содержание в крови эстрадиола-17 (84,6±4,2пмоль/л) было достоверно больше (р<0,05) по сравнению с контрольными животными (68,0±6,0 пмоль/л). Что касается прогестерона, то существенных различий (р>0,05) в его содержании в крови свинок опытных и контрольных групп нами выявлено не было.

Что касается прогестерона, то существенных различий (р>0,05) в его содержании в крови опытных и контрольных групп нами выявлено не было.

Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что после введения сурфагона у свинок апоптотические процессы снижаются и активизируются процесс роста фолликулов. Об этом сивдетельствует тот факт, что у свинок третьей группы, масса яичников (6,3±0,21г), их объем (5,3±0,35см3), количество фолликулов размеры которых превышали 0,5см (19,8±0,44), было больше чем у свинок других групп. При этом по сравнению с контрольными животными (5,10±0,20г; 4,4±0,27 см3; 16,4±0,35) эти различия являлись статистически достоверными (р<0,05).

4. ВЫВОДЫ

1. Процесс апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках неполовозрелых и половозрелых ремонтных свинок происходит непрерывно и имеет однотипный характер. При этом его интенсивность у первых была более высокой, чем у вторых, на это указывает индекс апоптоза: у неполовозрелых свинок он находился в пределах 1,85±0,3 – 2,10±0,44, а у половозрелых - 1,65±0,5 – 1,78±0,85.
2. С увеличением возраста свиней интенсивность апоптоза в клетках гранулезы снижается. Наиболее высокий индекс апоптоза был у животных 5-7 – месячного возраста (1,75±0,24-1,85±0,19), а наиболее низкий у 12-24-месячных (1,60±0,11 – 1,70±0,34).
3. Интенсивность апоптоза в клетках гранулезы свиней связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников. У свинок с относительно высоким содержанием в крови гонадотропных гормонов и эстрадиола-17 индекс апоптоза был меньше (1,60±0,7 – 1,65±0,5), чем у животных с низким содержанием гормонов (1,85±0,3 – 2,0±0,7).
4. Апоптоз клеток гранулезы является характерным признаком атрезии фолликулов:

- в фолликулах, находящихся на первой стадии атрезии, апоптотических клеток мало и они обнаруживаются преимущественно по периферии гранулезы;

- на второй стадии атрезии процесс апоптоза более интенсивно протекает в клетках яйценосного бугорка, постепенно затрагивая другие клетки зернистого слоя;

- на третьей стадии атрезии большинство клеток яйценосного бугорка подвержены апоптозу и выявляются лишь единичные клетки, не имеющие признаков гибели;

- на четвертой стадии атрезии фолликулов все клетки гранулезы подвержены апоптозу с образованием апоптозных телец.

5. Маркеры апоптоза в клетках гранулезы bcl-2 и р53 являются показателями дальнейшего развития фолликула. При увеличении экспрессии белка bcl-2 процессы апоптоза блокируются и фолликул достигает преовуляторного состояния, при увеличении экспрессии р53 дальнейшее развитие фолликула идет по атретическому пути.
6. Экзогенные гонадотропины изменяют интенсивность процесса апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней:

- введение препарата «Фоллимаг» сопровождается относительно высоким уровнем экспрессии белка bcl-2 и снижением продукции гена р53, что ведет к уменьшению количества гибнущих клеток в гранулезе.

- пролиферативный индекс на 3 и 5 сутки после введения препарата «Фоллимаг соответственно составил 49,2±3,2% и 52,5±2,0%, что было больше, чем в контроле (47,3±1,5%), а индекс апоптоза, наоборот, в это время уменьшился соответственно до 2,5±0,2% и 2,0±0,2% по сравнению с контролем (3,1±0,3%).

7. Синтетический люлиберин изменяет интенсивность апоптотических процессов в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней. Через 6 часов после введения препарата «Сурфагон» экспрессия белка bcl-2 повысилась на 2,5% и уменьшился индекс апоптоза на 1,0% по сравнению с контролем.

5. Практические предложения

• Полученные интерьерные показатели у ремонтных свинок крупной белой породы как физиологические нормативы могут быть использованы при разработке новых способов и средств биологической стимуляции репродуктивной функции свиноматок, а также в клинической практике и в учебных целях при подготовке специалистов зооветеринарного профиля.
• Выявленные свойства люлиберина и гонадотропных гормонов оказывать влияние на течение апоптоза в клетках гранулезы, можно использовать при изыскании эффективных путей регуляции программированной гибели клеток, контроля их роста и дифференцировки, с целью предотвращения возникновения различных патологических состояний.

6. Список опубликованных работ

1. Сеин О.Б. Особенности апоптоза в клетках тканей яичников кроликов / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы ХІ международной научно-практической конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». – Белгород, 2007. – С.220.
2. Паюхина М.А. Апоптозный индекс и экспрессия маркеров апоптоза в клетках гранулезы фолликулов свиней / М.А. Паюхина, О.Б. Сеин // Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития аграрного производства». – Смоленск, 2007. – С.391-392.
3. Паюхина М.А. Изучение апоптоза гранулезы фолликулов яичников, находящихся на разных этапах развития у свиней / М.А. Паюхина // Материалы ІІ Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение». – Санкт-Петербург, 2007. – С.55-56.
4. Паюхина М.А. Интенсивность апоптоза и показатель пролиферативной активности при исследовании клеток гранулезы фолликулов свиней / М.А. Паюхина, О.Б. Сеин // Материалы ХІ международной научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта развития агропромышленного комплекса». – Троицк, 2007. – С.130-131.
5. Сеин О.Б. Оценка апоптотических процессов в клетках гранулезы зрелых и атретических фолликулов свиней / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы международной научно-практической конференции «Трансферт инновационных технологий в животноводстве». – Орел, 2008. – С.177-179.
6. Паюхина М.А. Апоптоз клеток гранулезы в зрелых фолликулах яичников свиней / М.А. Паюхина // Межвузовский сборник научных трудов Современный мир, природа и человек. Естествознание и гуманизм. – Томск, 2007. - Т.4. - №4. - С.38.
7. Сеин О.Б. Морфологические особенности апоптоза клеток гранулезы в фолликулах свиней / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса». – Курск, 2008. – Т.3. – С.132-133.
8. Сеин О.Б. Пути ингибирования апоптоза в клетках гранулезы фолликулов яичников у свиней / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы научно-практической конференции, посвященной 125-летию образования ветеринарной службы Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». – Курск, 2008. – С.357-359.
9. Сеин О.Б. Процесс атрезии фолликулов в яичниках свиней в период становления половой функции / О.Б. Сеин, Д.О. Сеин, М.А. Паюхина // Вестник Курской государственной с.-х. академии им. Профессора И.И. Иванова. - Курск, 2009. - №5. - С.66-70.

10. Сеин О.Б. Апоптоз клеток гранулезы в фолликулах яичников свиней и его коррекция гонадотропными препаратом / М.А. Паюхина, О.Б. Сеин // Аграрная наука. – 2008. - №5. – С.35-36.