Всасывание продуктов гидролиза белков и углеводов: механизмы и регуляция
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И.П. ПАВЛОВА
На правах рукописи
ГРОМОВА
ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА
ВСАСЫВАНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА БЕЛКОВ И УГЛЕВОДОВ:
МЕХАНИЗМЫ И РЕГУЛЯЦИЯ
03.00.13 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург
2008
Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург.
НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ доктор биологических наук,
Андрей Андреевич Груздков
(Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН,
Санкт-Петербург)
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор медицинских наук, профессор
Владимир Иванович Овсянников (НИИ
экспериментальной медицины РАМН,
Санкт-Петербург)
доктор биологических наук, профессор
Марина Николаевна Маслова (Институт эволюционной физиологии им.И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург).
доктор биологических наук,
Сергей Тимофеевич Метельский (ГУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва)
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Санкт-Петербургский государственный университет
Защита диссертации состоится « » ________________ 2008 года
в ____ часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских
и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии
им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии
им. И.П. Павлова РАН.
Автореферат разослан « » ______________2008 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук Н.Э. Ордян
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование всасывания, т.е. переноса низкомолекулярных веществ, содержащихся в пище или образующихся в результате полостного и мембранного гидролиза пищевых биополимеров, из желудочно-кишечного тракта во внутреннюю среду организма, является одним из актуальных направлений физиологии пищеварения и питания.
Современные представления о функционировании пищеварительного аппарата (в том числе – в отношении всасывания пищевых веществ) сформировались во многом под влиянием открытия А.М. Уголевым в конце 50-х годов мембранного пищеварения. Локализация мембранного гидролиза пищевых веществ и всасывания образующихся продуктов на одной и той же поверхности – апикальной мембране энтероцитов – является одним из факторов, обеспечивающих тесную интеграцию этих процессов и высокую эффективность работы пищеварительно-транспортного конвейера.
В значительном прогрессе, достигнутом в исследовании механизмов всасывания пищевых веществ и его адаптации, важную роль сыграли различные аналитические (редуцированные) модели: от эвертированных препаратов тонкой кишки (обзоры: Уголев, 1972; 1985; Kimmich, 1981; Karasov, Diamond, 1987; Foulkes, 1996; Barthe et al., 1999; Тимофеева и др., 2000; Метельский, 2007) до везикул изолированных мембран щеточной каймы энтероцитов и клонированных мембранных транспортеров (Уголев, 1985; Уголев, Иезуитова, 1991; Hopfer, 1987; Cheeseman, Tsang, 1996; Kushak, Winter, 2005; Drozdowki, Thomson, 2006a; Wright et al, 2007).
На основе опытов с эвертированными препаратами тонкой кишки была разработана основная модель переноса глюкозы через энтероцит, предполагающая вход глюкозы через апикальную мембрану в клетки с участием натрий-зависимого вторичного активного транспорта и выход глюкозы из них через базолатеральную мембрану с участием облегченной диффузии (Crane et al., 1961), которая в дальнейшем получила развитие в отношении всасывания аминокислот и дипептидов (обзоры: Hopfer, 1987; Тимофеева и др., 2000; Kushak, Winter, 2005). Позднее были получены новые данные в пользу указанной модели благодаря выделению и клонированию апикального натрий-зависимого транспортера глюкозы SGLT1 и базолатерального транспортера облегченной диффузии глюкозы GLUT2 (обзоры: Hopfer, 1986; Тимофеева и др., 2000; Ferraris, 2001; Kushak, Winter, 2005; Wright et al, 2007).
Вместе с тем в последние годы были предприняты попытки ревизии общепринятого представления о вторичном активном транспорте как основном механизме переноса глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов в тонкой кишке млекопитающих. Выдвинуты две новые гипотезы: о преимущественно парацеллюлярном переносе глюкозы на потоке всасывающейся воды (Pappenheimer 1987, 2001) и об облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2, который включается в апикальную мембрану энтероцитов при высоких углеводных нагрузках (Kellett, Helliwell, 2000; Kellett, 2001).
Обе гипотезы основаны главным образом на результатах опытов in vitro или острых опытов in vivo на анестезированных животных. Вместе с тем при использовании разработанной А.М.Уголевым и Б.З. Зариповым (1979) методики хронических опытов было показано, что в отсутствие наркоза и операционной травмы гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке протекают с более высокой скоростью, а степень их сопряжения значительно выше, чем в случае широко применявшихся методов in vivo и in vitro. Существенные различия между острыми и хроническими опытами in vivo обнаружены в отношении реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на некоторые экспериментальные воздействия (введение уабаина и/или удаление ионов натрия) (Уголев и др., 1984; 1986; 1987), а также в отношении проницаемости преэпителиального («неперемешиваемого») слоя тонкой кишки, значительно более высокой в хронических опытах (Груздков, Громова, 1995; Levitt et al., 1996). Все это диктовало необходимость проверки указанных новых гипотез в условиях хронического опыта как наиболее близких к физиологическим.
Остается дискуссионным вопрос о соотношении транспорта продуктов расщепления белков через апикальную мембрану энтероцита в виде аминокислот, образующихся при мембранном гидролизе пептидов, и в виде малых пептидов (ди- и трипептиды), подвергающихся затем внутриклеточному гидролизу (обзоры: Grimble, Silk, 1989; Уголев и др., 1990; Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 2000; Adibi, 2003; Thwaites, Anderson, 2007). Следует отметить, что кинетические параметры транспорта аминокислот и олигопептидов до настоящего времени практически не исследовались в опытах in vivo в отсутствие наркоза и операционной травмы. Вместе с тем указанные факторы могут существенно изменять относительный вклад «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывание продуктов гидролиза белков.
В последние десятилетия установлены основные факторы, влияющие на протекание гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке (пищевые субстраты, желчь, панкреатический секрет, гормоны), среди которых ведущая роль отводится субстратному регулированию (Karasov, Diamond, 1987; Уголев и др., 1991; Levin, 1994; Ferraris, Diamond, 1997; Ferraris, 2001; Drozdowski, Thomson, 2006b; Wright et al, 2007). Но до настоящего времени нет ясности в отношении роли желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов (обзоры: Karasov, Diamond, 1983; 1987; Уголев и др., 1991б). В литературе имеются сведения, главным образом, о совместном действии желчи и панкреатического секрета. Представлялось важным выявить влияние каждого из них в отдельности на всасывательную способность тонкой кишки, в частности, в отношении всасывания продуктов гидролиза углеводов.
До сих пор при исследовании субстратной регуляции всасывания нутриентов в тонкой кишке практически не использовалась методика хронических экспериментов. Вместе с тем ее применение для этой цели имеет ряд важных преимуществ перед существующими методами, а именно: 1) проведение многократных опытов на одной и той же группе животных; 2) контроль уровня и специфичности локальной субстратной нагрузки на тонкую кишку и возможность выявления реакции на эту нагрузку со стороны соответствующих мембранных гидролитических и транспортных систем; 3) возможность исследования роли эндогенных (в основном, гормональных) факторов, сопутствующих изменению функционального состояния организма, на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки.
Представлялось целесообразным использовать указанные преимущества хронических опытов для выявления особенностей регуляции всасывания нутриентов в изолированном участке тонкой кишки под влиянием регулярной субстратной нагрузки различной специфичности, а также системных факторов, сопутствующих полному голоданию, белковой депривации и наркозу.
Все вышеизложенное определило постановку цели и задач исследования.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследование механизмов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке и его адаптивной регуляции при действии различных люминальных и эндогенных факторов.
Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. Выявить относительную роль различных механизмов транспорта (парацеллюлярный перенос, облегченная диффузия с участием GLUT2, вторичный активный транспорт с участием SGLT1) во всасывании глюкозы в тонкой кишке.
2. Разработать математический подход и использовать его для оценки по данным, полученным в хронических опытах, «истинных» (с учетом влияния преэпителиального слоя тонкой кишки) кинетических параметров мембранного гидролиза мальтозы и дипептидов, а также всасывания глюкозы, аминокислот и дипептидов.
3. Определить соотношение «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании дипептидов.
4. Оценить влияние различных по специфичности субстратных нагрузок на структурные и функциональные характеристики тонкой кишки.
5. Оценить роль желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы и крахмала.
6. Изучить влияние наркоза на гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке.
7. Исследовать влияние полного голодания и белковой депривации на гидролитические и транспортные функции тонкой кишки.
НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые показано, что высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке крыс в диапазоне больших концентраций мальтозы имеют место в отсутствие всасывания воды (в случае гипоосмотических инфузатов) и даже на фоне секреции воды (в случае гиперосмотических инфузатов); эти результаты свидетельствуют о том, что парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.
Впервые показано, что флоретин (ингибитор GLUT2), введенный с мукозной стороны кишки, в условиях хронического опыта не только ингибирует всасывание глюкозы (или галактозы), но и способен неспецифически тормозить всасывание глицина. В опытах in vitro обнаружено, что он снижает выход глюкозы из энтероцитов в эвертированных мешках тонкой кишки и ингибирует активность пищеварительных ферментов в гомогенатах слизистой оболочки. Эти результаты позволяют заключить, что используемый рядом зарубежных исследователей подход, предусматривающий применение флоретина с мукозной стороны in vivo, дает завышенную оценку вклада облегченной диффузии и заниженную оценку вклада вторичного активного транспорта с участием транспортера SGLT1 во всасывание глюкозы.
С применением разработанного математического подхода впервые по данным о кинетике гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке в хронических опытах получена оценка проницаемости преэпителиального слоя и, с ее учетом, определены значения «истинных» кинетических констант гидролиза мальтозы и активного транспорта глюкозы. Это позволило впервые установить, что значительно бльшие скорости всасывания глюкозы в хронических опытах, по сравнению с острыми опытами in vivo, обусловлены не только лучшей проницаемостью преэпителиального барьера тонкой кишки, но и более высоким значением константы максимальной скорости активного транспорта глюкозы.
Впервые с применением разработанного математического подхода определены в условиях хронического опыта значения «истинных» кинетических констант мембранного гидролиза и всасывания дипептидов (глицилглицин и глицил-L-лейцин) и составляющих их аминокислот (глицин и лейцин), что позволило количественно оценить относительную роль «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании каждого из этих дипептидов в широком диапазоне их концентраций.
В опытах с перевязкой желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов впервые показано повышение активного транспорта свободной глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов. После перевязки панкреатического протока у кроликов отсутствовали заметные изменения в активном транспорте глюкозы, образующейся при мембранном гидролизе крахмала. Повышение активного транспорта глюкозы в указанных отделах тонкой кишки обеспечивает сохранение высокой эффективности работы пищеварительно-всасывательного конвейера в отношении углеводных полимеров при снижении темпов полостного пищеварения вследствие недостаточности панкреатических ферментов.
Впервые исследована динамика развития адаптивных изменений гидролиза и всасывания различных субстратов в изолированном участке тонкой кишки крыс в хронических опытах при белковой депривации животных в течение двух недель. Обнаружены разнонаправленные изменения всасывания глюкозы, глицина и глицилглицина на разных сроках безбелкового рациона. Несмотря на то, что в некоторые сроки эти показатели снижаются, их уровень остается довольно высоким, что играет жизненно важную роль при возобновлении кормления.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.
Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие современных представлений о механизмах транспорта глюкозы, аминокислот и дипептидов в тонкой кишке млекопитающих в физиологических условиях. Полученные результаты показывают, что парацеллюлярный перенос на потоке воды, рассматривавшийся некоторыми исследователями как основной механизм всасывания глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках, в этих условиях не играет заметной роли. Наши данные свидетельствуют о том, что основным механизмом всасывания глюкозы является ее активный транспорт, опосредованный SGLT1, тогда как роль облегченной диффузии с участием GLUT2 становится существенной лишь при высоких углеводных нагрузках. Согласно результатам нашей работы, относительный вклад «пептидной» и «аминокислотной» составляющих во всасывание дипептидов в физиологических условиях определяется соотношением кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида.
Представленные результаты способствуют более глубокому пониманию путей и механизмов адаптивной регуляции всасывания нутриентов при действии различных люминальных и эндогенных факторов. Раскрыты особенности влияния наркоза и операционной травмы, присущих острым опытам in vivo, на всасывание нутриентов. Показано, что наркоз влияет на проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и на величину максимальной скорости активного транспорта глюкозы. Данные о реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на полное голодание и безбелковое питание предполагают участие эндогенных факторов, сопутствующих этим состояниям, в регуляции процессов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов. Показано сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ в условиях полного голодания или содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе, что, по-видимому, играет важную роль в обеспечении эффективного всасывания эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасывания основных компонентов пищи при возобновлении питания. Проанализированы особенности изменения активного транспорта глюкозы в тонкой кишке после перевязки желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов. Полученные данные позволяют полагать, что повышение активного транспорта глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов направлено на сохранение эффективного всасывания глюкозы, образующейся при гидролизе углеводных полимеров, в условиях снижения темпов полостного пищеварения вследствие исключения желчи и панкреатического секрета.
Результаты экспериментального исследования различных механизмов всасывания глюкозы, а также механизмов гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот, могут иметь значение для совершенствования методов энтерального и парентерального питания, а также для оценки механизмов действия лекарственных веществ олигопептидной природы.
Результаты исследования субстратной регуляции всасывания в изолированном участке тонкой кишки крыс в условиях хронического опыта способствуют пониманию механизмов адаптивных перестроек тонкой кишки после хирургических вмешательств и могут быть полезны при разработке диетического питания в постоперационном периоде.
Данные о реакции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе углеводов различной степени полимерности, на исключение желчи или панкреатического секрета расширяют представления о механизмах адаптивных перестроек тонкой кишки при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической -амилазы) и могут быть полезны для разработки лечебных диет при указанной патологии.
Исследование изменений функциональных характеристик изолированного участка тонкой кишки в хронических опытах, а также изменений функциональных характеристик препаратов тонкой кишки в опытах in vitro на фоне полного голодания или безбелкового питания, имеет практическое значение для разработки лечебных диет, обеспечивающих оптимальный рефидинг – переход от состояния голодания (лечебного или вынужденного) к нормальному питанию.
Математические подходы, позволяющие оценить проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и, с ее учетом, «истинные» кинетические константы мембранного гидролиза и всасывания субстратов, могут найти применение при анализе результатов перфузионных исследований in vivo на животных и на человеке.
Данные, полученные в работе, могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и биохимии.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.
2. Транспорт глюкозы, опосредованный котранспортером натрия и глюкозы SGLT1, является основным механизмом всасывания этого моносахарида в тонкой кишке, тогда как облегченная диффузии с участием GLUT2 играет заметную роль лишь при высоких углеводных нагрузках.
3. Высокие скорости всасывания глюкозы в тонкой кишке в физиологических условиях обеспечиваются главным образом благодаря большой мощности системы вторичного активного транспорта глюкозы и высокой проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки.
4. Сохранение высокой эффективности функционироваания пищеварительно-всасывательного конвейера тонкой кишки в отношении углеводов при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической -амилазы) обеспечивается за счет повышения способности кишечного эпителия к активному транспорту глюкозы.
5. Сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ (глюкоза, аминокислоты, дипептиды) в условиях полного голодания или безбелкового питания может обеспечиваться действием эндогенных (гормональных) факторов и способствовать эффективному всасыванию этих субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасыванию основных компонентов пищи при возобновлении питания.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА. Материалы работы доложены на II международной конференции «Средства математического моделирования» (Санкт-Петербург, 1999); I–V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999, 2001, 2003, 2005, 2007 гг.); IV, VI, VIII Международных конгрессах «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2000, 2002, 2004 гг.); ХIХ Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); XXXV Международном конгрессе физиологических наук (San Diego, USA); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы пищеварения и питания» (Санкт-Петербург, 2006); Международном симпозиуме «XXI Meeting European Intestinal Transport Group. March 3-6, 2007. Oberwiesenthal, Germany).
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликованы 52 работы, включая 27 статей в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 283 страницах, содержит 35 рисунков и 8 таблиц.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал исследования. Эксперименты in vitro выполнены на 82 взрослых крысах (Вистар, самцы, масса тела 150200 г) и на 18 взрослых кроликах (масса тела 23 кг). В хронических опытах in vivo использовано 65 крыс (Вистар, самцы, масса тела 150200 г), на каждой из которых проведено около 15 опытов.
Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Методы исследования
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ
Методы in vitro. При исследовании всасывания пищевых субстратов использовалась методика эвертированных мешков или отрезков тонкой кишки в нашей модификации (Громова, и др., 1992; Тимофеева и др., 1994). Инкубация препаратов проводилась при 37°С в растворах глюкозы, мальтозы, глицина и глицилглицина в течение 20 – 60 мин в присутствии кислорода (оксигенация) или азота (аноксия). После инкубации в случае эвертированных отрезков определяли концентрацию субстрата в ткани препарата, а в случае эвертированных мешков – концентрацию субстрата в ткани и в серозной жидкости препарата. Определяли также объем серозной жидкости и вес препарата (без серозной жидкости). Аккумуляцию глюкозы в ткани и в серозной жидкости эвертированных мешков оценивали по количеству глюкозы в этих объектах в расчете на длину препарата и на 1 г влажного веса ткани препарата кишки. Об уровне активного транспорта субстрата судили по разнице в аккумуляции субстрата в условиях оксигенации и аноксии.
Активности мальтазы (НФ 3.2.1.20), -амилазы (НФ 3.2.1.1), щелочной фосфатазы (НФ 3.1.3.1), аминопептидазы М (НФ 3.4.11.2) и глицил-L-лейциндипептидазы (НФ 3.4.13.2) в гомогенатах слизистой оболочки определялись по описанным ранее методикам (Тимофеева и др., 1986; Егорова и др., 1986).
Экспериментально-хирургические подходы. При исследовании роли желчи и панкреатического секрета во всасывании углеводов проводили (под наркозом) перевязку желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов, а через 7 и 14 дней в опытах in vitro в препаратах тонкой кишки определяли активный транспорт свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы и крахмала.
Методика хронического эксперимента. Техника хирургической операции и условия проведения экспериментов в основном были такими же, как в оригинальной методике А.М. Уголева и Б.З. Зарипова (Уголев, Зарипов, 1979; Уголев и др., 1986). У крыс после анестезии изолировали участок тощей кишки длиной около 20 см, в оба конца которого вставляли металлические фистулы, выводимые на боковую поверхность живота. Проходимость пищеварительного канала восстанавливали анастомозом «конец в конец».
Хронические опыты начинали через 7 – 8 дней после операции и продолжали в течение 6 – 7 недель. Во время эксперимента животное помещали в специальную клетку, имитирующую норку и обеспечивающую щадящую фиксацию положения животного в течение 2 – 3 часов. В ходе опыта полость изолированной петли перфузировали со скоростью около 0.5 мл/мин (в ряде случаев около 0.3 мл/мин) растворами исследуемых субстратов, подогретыми до 38oС. Кроме специально оговоренных случаев, все инфузаты были изоосмолярными. Растворы субстратов готовили на растворе Рингера с пониженной концентрацией NaCl (100 или 120 мМ). При наивысшей из использованных концентраций субстрата осмолярность инфузата была около 300-320 мОсм, т.е. близкой к осмолярности стандартного раствора Рингера. При низких концентрациях субстратов для поддержания изоосмолярности инфузатов в них добавлялось соответствующее количество маннита. Для оценки вклада активного компонента транспорта глюкозы в ее суммарное всасывание в ряде опытов изолированный участок перфузировали растворами глюкозы (75 или 100 мМ) в присутствии флоридзина (1 мМ) конкурентного ингибитора транспортера SGLT1.
После предварительной 15-минутной перфузии раствором исследуемого субстрата данной концентрации последовательно отбирали 2 – 3 пробы (с интервалом 5 или 10 мин) для биохимического анализа. При этом измеряли объем проб. Как правило, каждый из опытов повторялся 1 – 2 раза на тех же экспериментальных животных. В дни, когда опыт не проводился, изолированной участок кишки перфузировали раствором глюкозы (25 или 50 мМ) с целью сохранения на достаточно высоком уровне его основных функциональных характеристик.
Скорости гидролиза дисахаридов, JH, (мкмоль/мин), всасывания свободной глюкозы, JАсг, и глюкозы, образующейся при гидролизе дисахаридов, JАд, (мкмоль/мин), а также скорости всасывания воды, Jw, (мкл/мин), в изолированной петле тонкой кишки вычисляли по следующим формулам:
JH = Cд,вх vвх – (Cд+гл,вых – Cгл,вых) vвых,
JАсг = Cгл,вх vвх – Cгл,вых vвых,
JАд = Cд,вх vвх – Cд+гл,вых vвых,
Jw = vвх – vвых,
где Cд,вх и Cгл,вх – концентрации дисахаридов и глюкозы, соответственно, в инфузате (мМ глюкозы); Cгл,вых – концентрация глюкозы в оттекающем перфузате, определенная глюкозооксидазным методом (мМ); Cд+гл,вых – суммарная концентрация сахаров в оттекающем перфузате, определенная антроновым методом (мМ глюкозы); vвх – скорость инфузии (мл/мин); vвых – скорость оттекания перфузата (мл/мин).
Аналогичные формулы использовали при расчете скоростей гидролиза и всасывания дипептидов и всасывания аминокислот. Кроме того, определяли коэффициент сопряжения гидролитических и транспортных процессов как отношение скорости всасывания глюкозы в изолированной кишечной петле к скорости ее образования при гидролизе мальтозы (Уголев и др., 1984; 1986).
По окончании хронических опытов производили декапитацию животного, извлекали кишку и измеряли массу, длину изолированного участка и площадь его серозной поверхности. Определяли также массу и площадь серозной поверхности функционирующего участка кишки аналогичной длины, расположенного ниже анастомоза. Эти данные использовали при расчетах скоростей гидролиза и всасывания исследуемых субстратов на единицу массы изолированного участка и площади его серозной поверхности.
Методы определения концентрации субстратов. Во всех опытах концентрацию глюкозы и 2-дезокси-D-глюкозы определяли глюкозооксидазным методом (Dahlqvist, 1964), концентрацию галактозы и сумму концентраций глюкозы и мальтозы (в мМ глюкозы) антроновым методом (Scott, Melvin, 1953), концентрацию глицина методом, разработанным в Лаборатории физиологии питания (Уголев, Тимофеева, 1969), концентрацию лейцина – методом оксидазы L-аминокислот (Caspary, 1974); сумму концентраций глицина и глицилглицина, а также сумму концентраций глицина, лейцина и глицил-L-лейцина (в мМ аминогрупп) методом с TNBS (Field, 1972).
Статистическая достоверность результатов оценивалась по парному или непарному t-критерию Стьюдента, а в некоторых случаях с применением непараметрических критериев.
МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
Методика оценки «истинных» кинетических констант гидролиза мальтозы и активного транспорта глюкозы в тонкой кишке in vivo. Математический подход разработан на основе модели, в которой изолированная кишечная петля была аппроксимирована в виде однородной по длине трубки, в полости которой происходит интенсивное перемешивание содержимого, а функционирующая поверхность отделена от полости диффузионным барьером – преэпителиальным слоем («неперемешиваемым слоем») (Westergaard et al., 1986; Груздков, 1993; Pappenheimer, 2001; Метельский, 2007). Как и большинство других исследователей (Levitt et al., 1996; Pappenheimer, 2001), мы принимали, что гидролиз мальтозы на апикальной мембране энтероцитов может быть описан классическим уравнением Михаэлиса-Ментен (уравнение 1), а всасывание глюкозы аналогичным уравнением плюс ненасыщаемый (диффузионный) компонент (уравнение 2):
Vmax . Sm Jmax . Cm
JH = ; (1) JA = + kd . Cm, (2)
Km + Sm Kt + Cm
где JH и JA скорости гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, соответственно; Sm и Cm концентрации мальтозы и глюкозы, соответственно, на пищеварительно-всасывательной поверхности; Vmax максимальная скорость гидролиза мальтозы; Jmax максимальная скорость активного транспорта глюкозы; Km и Kt константы Михаэлиса для гидролиза и активного транспорта соответственно; kd константа скорости диффузии глюкозы через кишечный эпителий.
При определении «истинных» (скорректированных с учетом влияния преэпителиального слоя тонкой кишки) значений кинетических констант гидролиза мальтозы последовательно выполняли ряд вычислительных операций.
Сначала определяли начальную (оценочную) величину диффузионного сопротивления преэпителиального слоя (RPL0) в расчете на 1 см длины кишки (мин/см2) по формуле:
L
RPL0 =, (3)
v . ln (Sвх / Sвых )
где Sвх и Sвых концентрации мальтозы на входе и на выходе изолированной петли тонкой кишки соответственно (мМ); L длина изолированной петли; v объемная скорость перфузии (мл/мин).
С учетом полученного значения RPL0 вычисляли начальные (оценочные) значения концентрации мальтозы на всасывательной поверхности (Sm0) по формуле:
Sm0 = S – Jh . RPL, (4)
где S средняя логарифмическая концентрация субстрата в полости кишки. Затем, используя формулу (1), вычисляли значения кинетических констант гидролиза мальтозы (Km0 и Vmax0) методом двойных обратных величин с применением прямой линейной регрессии. В дальнейшем путем пошагового изменения значений RPL0 и вычисления новых значений Kmi и Vmaxi методом двойных обратных величин с использованием прямой линейной регрессии определяли конечные значения диффузионного сопротивления преэпителиального слоя (RPLn) и кинетических констант Kmn и Vmaxn, при которых сумма квадратов отклонений расчетных (теоретических) значений скоростей гидролиза мальтозы от соответствующих значений, полученных в эксперименте, была минимальной.
При оценке «истинных» кинетических констант активного транспорта глюкозы в условиях хронического опыта использовался сходный математический подход. Отличие состояло в том, что сначала по данным опытов с перфузией изолированной петли тонкой кишки в присутствии флоридзина вычисляли по формуле (5) значение константы скорости пассивной диффузии, kd, (см2/мин, в расчете на 1 см длины кишки). (При ингибировании активного транспорта глюкозы ее всасывание зависит в основном от пассивного компонента, а концентрация глюкозы на всасывательной поверхности (Cm) незначительно отличается от ее концентрации в полости кишки, СL).
Ja100
kd =, (5)
СL . L
где Ja100 – скорость всасывания глюкозы (мкмоль/мин) в изолированной петле кишки при исходной концентрации 100 мМ в присутствии флоридзина; CL – концентрация глюкозы в полости кишки (~100 мМ); L – длина изолированной петли (см).
Далее, применяя формулу (3) в отношении данных по всасыванию глюкозы, определяли начальную (оценочную) величину диффузионного сопротивления преэпителиального слоя (RPL0) в расчете на 1 см длины кишки (мин/см2) и с её учетом по формуле, аналогичной формуле (4), вычисляли начальные (оценочные) значения концентрации глюкозы на всасывательной поверхности (Cm0). Затем, используя формулу (2) и полученное выше значение величины kd, вычисляли кинетические константы активного транспорта глюкозы (Kt0 и Jmax0) методом двойных обратных величин с использованием прямой линейной регрессии. Далее с использованием метода итераций получали уточненные значения этих кинетических констант.
Для количественного выражения проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки мы, как и другие авторы, использовали такой параметр, как толщина неперемешиваемого водного слоя (d), который определяли по формуле (6) (Levitt et al.,1992; Груздков, Громова,1995; Pappenheimer, 2001):
d = R . D, (6)
где R – диффузионное сопротивление преэпителиального слоя в расчете на 1 см2 серозной поверхности кишки (мин/см); D – коэффициент диффузии в воде для глюкозы (5.3 . 10-3 см2/мин) и мальтозы (3.8 . 10-3 см2/мин) (Pappenheimer, 2001).
Методика оценки «истинных» кинетических констант гидролиза и всасывания дипептидов, а также всасывания аминокислот в тонкой кишке in vivo. При оценке «истинных» кинетических констант гидролиза и всасывания глицилглицина, а также всасывания глицина, использовался в основном аналогичный математический подход. Отличие состояло в допущении, что толщина преэпителиального слоя в этих опытах равна таковой, полученной в опытах с глюкозой, а диффузионная проницаемость слоя для этих субстратов обратно пропорциональна квадратному корню из их молекулярной массы (Pappenheimer, 2001). Кроме того, использовалась итерация по kd (коэффициенту пассивного переноса субстрата через апикальную мембрану энтероцита) для вычисления методом линейной регрессии конечных значений Kt, Jmax и kd, при которых становилась минимальной сумма квадратов отклонений вычисляемых теоретических значений скоростей всасывания исследуемого субстрата от экспериментальных значений.
В случае глицилглицина сначала выделяли так называемые «аминокислотную» и «пептидную» составляющие его всасывания. «Аминокислотная» составляющая рассчитывалась с использованием приведенного выше уравнения (2) при значениях Kt, Jmax и kd, предварительно определенных нами по результатам опытов с всасыванием свободного глицина. При этом входящая в уравнение (2) величина Cm (концентрация свободного глицина на апикальной мембране энтероцита) вычислялась по формуле (7):
Cm = Jвых . RPL – C, (7)
где Jвых = vвых . Cвых скорость выхода из изолированной кишечной петли глицина, образующегося при гидролизе дипептида; vвых объемная скорость оттекающего перфузата, Cвых концентрация глицина в оттекающем перфузате; RPL сопротивление преэпителиального слоя; C = 0.63 . Cвых средняя логарифмическая концентрация глицина в полости изолированной петли.
«Пептидную» составляющую скорости всасывания глицилглицина находили путем вычитания «аминокислотной» составляющей из суммарной скорости всасывания дипептида, определенной в эксперименте. Скорость мембранного гидролиза дипептида рассчитывали как сумму скорости его всасывания в форме глицина и скорости выхода из изолированной петли невсосавшегося глицина.
В случае глицил-L-лейцина использовался, в основном, аналогичный подход. Отличие состояло в том, что «аминокислотная» и, соответственно, «пептидная» составляющие рассчитывались двумя способами: по глицину и по лейцину. «Пептидную» составляющую скорости всасывания глицил-L-лейцина для глицина или лейцина находили путем вычитания соответствующей аминокислотной составляющей из определенной в эксперименте суммарной скорости всасывания дипептида (в виде дипептида и в виде каждой из аминокислот). При этом принималось, что значения кинетических констант транспорта аминокислот, образующихся при гидролизе дипептида, аналогичны значениям соответствующих констант транспорта свободных глицина и лейцина. С использованием метода итераций определялось такое значение транспорта дипептида, которое соответствовало скоростям всасывания каждой из составляющих его аминокислот. Скорость мембранного гидролиза дипептида также рассчитывалась двумя способами (по глицину и лейцину) и уточнялась с использованием итерационного метода. В каждом случае она определялась как сумма скорости всасывания дипептида в виде глицина (лейцина) и скорости выхода из изолированной петли невсосавшегося глицина (лейцина).
В ряде случаев экспериментальные данные сопоставлялись с результатами математического моделирования, выполненного совместно с А.А.Груздковым.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Относительная роль различных механизмов всасывания нутриентов
Оценка вклада парацеллюлярного механизма во всасывание глюкозы в тонкой кишке. В конце 80-х годов Дж. Паппенгеймер выдвинул гипотезу о парацеллюлярном переносе глюкозы на потоке всасывающейся воды как основном механизме ее всасывания в тонкой кишке in vivo при высокой концентрации глюкозы (Pappenheimer, Reiss, 1987; Pappenheimer, 1993, 2001). Он считал, что этот механизм особенно эффективен при высоких концентрациях глюкозы, которые, по его мнению, возникают в зоне щеточной каймы энтероцитов при мембранном гидролизе олигосахаридов (Pappenheimer, 1993). Для проверки этой гипотезы в условиях хронического опыта мы исследовали гидролиз мальтозы и всасывание образующейся глюкозы, а также всасывание воды, в изолированной петле тонкой кишки крыс в широком диапазоне концентраций субстрата при различной осмолярности перфузионных растворов (рис. 1). Обнаружено, что скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы не достигают насыщения даже при чрезвычайно высоких концентрациях мальтозы в исходном перфузате (150–200 мМ), более чем в 50 раз превышающих значения констант Михаэлиса для гидролиза мальтозы (3–4 мМ) (Levitt et al., 1996; Pappenheimer, 2001) и для активного транспорта глюкозы (1–5 мМ) (обзоры: Тимофеева и др., 2000; Ferraris, 2001; Pappenheimer, 2001). При этом в случае перфузии изолированной петли гипоосмолярными растворами субстрата (кривые 1а и 2а) скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы во всем диапазоне концентраций были несколько выше (статистически недостоверно), чем в случае гиперосмолярных растворов (кривые 1б и 2б).
При увеличении концентрации мальтозы в исходном перфузате в диапазоне с 6.25
Рис.1. Гидролиз мальтозы (1) и всасывание образующейся глюкозы (2) в изолированной петле тонкой кишки крыс при ее перфузии в хроническом опыте гипоосмолярными (а) и гиперосмолярными (б) растворами мальтозы в диапазоне ее супервысоких концентраций.
По оси абсцисс – концентрация мальтозы в исходном перфузате, мМ глюкозы; по оси ординат – скорости гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, мкмоль/мин.
до 37.5 мМ скорость всасывания воды возрастала с 21.0±5.4 до 43.9±5.1 мкл/мин, (P<0.05) и тесно коррелировала (r=0.97) со скоростью всасывания образующейся глюкозы. В диапазоне высоких концентраций мальтозы при перфузии изолированной петли гиперосмолярными растворами наблюдалась секреция воды со скоростью 15.0–25.0 мкл/мин, а в случае гипоосмолярных растворов скорость трансэпителиального потока воды варьировала от -11.7 (секреция) до +3.8 (всасывание) мкл/мин. При этом отсутствовала корреляции между всасыванием глюкозы и воды.
Таким образом, согласно нашим данным, парацеллюлярный перенос на потоке всасывающейся воды не является преимущественным механизмом всасывания глюкозы, поскольку в диапазоне высоких концентраций мальтозы (150 – 200 мМ) отсутствует результирующее всасывание воды, то есть не выполняется необходимое условие для осуществления конвективного парацеллюлярного переноса субстрата.
Роль облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2 в переносе глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов. Недавно группой английских исследователей (обзор: Kellett, 2001) была предложена гипотеза, согласно которой перенос глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов происходит не только путем активного транспорта с участием SGLT1, но и путем облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2, который при высоких углеводных нагрузках может встраиваться в апикальную мембрану. Одним из аргументов в пользу этой гипотезы является то, что в опытах in vivo на анестезированных животных флоретин (ингибитор GLUT2), введенный в полость кишки, вызывает торможение всасывания глюкозы.
Для проверки указанной гипотезы в условиях хронического опыта на крысах мы исследовали влияние флоретина и флоридзина – ингибитора транспортера SGLT1 – на всасывание глюкозы и галактозы, транспортируемых с участием SGLT1 и GLUT2, в изолированной кишечной петле. Обнаружено, что в присутствии флоретина (1 мМ) скорость всасывания глюкозы снижается по сравнению с контролем на 67, 62 и 50% при исходных концентрациях глюкозы 12.5, 25.0 и 50 мМ соответственно (P<0.01), а в присутствии флоридзина (1 мМ) она снижается на 78 % (P<0.01) при исходной концентрации глюкозы 50 мМ (рис. 2). Сходное действие этих ингибиторов наблюдалось в отношении всасывания галактозы.
 |
Рис. 2. Влияние флоридзина (1 мМ) и флоретина (1 мМ) на всасывание глюкозы в изолированной петле тонкой кишки крыс в хроническом опыте.
По вертикали – скорость всасывания в мкмоль/мин. К –– контроль; +Флд –– в присутствии флоридзина; +Флт –– в присутствии флоретина. 50 мМ (слева) –– концентрация глюкозы в исходном перфузате в опытах с флоридзином;12.5 мМ, 25.0 мМ и 50.0 мМ (справа) –– концентрация глюкозы в исходном перфузате в опытах с флоретином.
Эти результаты согласуются с данными других исследователей (Kellett, 2001; Au et al., 2003; Shepherd et al., 2004) и подтверждают возможность участия GLUT2 в транспорте глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов. Они подкрепляются также данными о наличии транспортера GLUT2 в апикальной мембране энтероцитов после нагрузки тонкой кишки раствором с высокой концентрацией глюкозы, полученными другими авторами, а также нами в совместной работе с группой Я.Ю. Комиссарчика (Институт цитологии РАН) (Грефнер и др., 2006).
Однако, вопреки нашим ожиданиям, после нагрузки изолированной петли в течение 40 мин раствором глюкозы (75 мМ) скорость всасывания 2-дезокси-D-глюкозы (5 мМ) – специфического субстрата для GLUT2 – возрастала незначительно (на 18%, P>0.05) по сравнению с исходным уровнем (до нагрузки), а присутствие в инфузате 2-дезокси-D-глюкозы (50 мM) не вызывало конкурентного снижения всасывания галактозы (50 мМ). Это означает, что наличие GLUT2 в апикальной мембране энтероцитов само по себе не является показателем преимущественной роли облегченной диффузии во всасывании моносахаридов. Тем более, что отмеченное выше торможение флоретином всасывания глюкозы in vivo могло быть связано с его способностью ингибировать транспортер GLUT2, локализованный в базолатеральной мембране, и тем самым тормозить выход глюкозы из энтероцитов через эту мембрану, что, в свою очередь, должно выражаться в снижении общего всасывания глюкозы.
Это предположение подтвердилось в опытах in vitro на эвертированных мешках тонкой кишки крыс. Было обнаружено, что в присутствии флоретина (100 мкМ) с мукозной стороны вывернутых мешков аккумуляция глюкозы в ткани препарата в условиях оксигенации менялась незначительно по сравнению с контролем (в отсутствие ингибитора), тогда как в серозной жидкости она снижалась на 43% (P<0.01). А в присутствии флоридзина (10 мкМ) с мукозной стороны аккумуляция глюкозы в условиях оксигенации почти в равной степени (на 50%, P<0.05) снижалась как в ткани препаратов, так и в серозной жидкости.
Кроме того, нами показано неспецифическое снижение (на 34%, P<0.05) скорости всасывания глицина в изолированной петле тонкой кишки крыс в присутствии флоретина (1 мМ), а также ингибирование флоретином (1 мМ), добавленным в гомогенаты слизистой оболочки тонкой кишки, активности щелочной фосфатазы (на 24%, P<0.05) и аминопептидазы М (на 15%, P<0.05)
Таким образом, флоретин, введенный с мукозной стороны, не только ингибирует GLUT2-зависимую облегченную диффузию глюкозы через апикальную мембрану энтероцита, но и способен опосредованно снижать общее всасывание глюкозы, реализуемое ее транспортом с участием SGLT1. Использование некоторыми авторами такого подхода в острых опытах in vivo (Kellett, Helliwell, 2000; Shepherd et al., 2004) сопряжено с завышением вклада облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2 и занижением вклада активного транспорта, опосредованного SGLT1, во всасывание глюкозы в физиологических условиях. Это не позволяет считать адекватным применение данного подхода для оценки реального соотношения двух указанных механизмов транспорта глюкозы через апикальную мембрану энтероцита.
В целом, наши данные подтверждают факт участия механизма облегченной диффузии, опосредованной GLUT2, в переносе глюкозы через апикальную мембрану энтероцита, однако при физиологических концентрациях глюкозы в кишке (<50 мМ) основным является, по-видимому, ее активный транспорт с участием SGLT1, тогда как облегченная диффузия с участием GLUT2 начинает играть заметную роль лишь при повышенных углеводных нагрузках.
Роль пептидной транспортной системы во всасывании дипептидов в тонкой кишке. В хронических опытах на крысах мы исследовали кинетику гидролиза и всасывания глицилглицина и глицил-L-лейцина (дипептидов, в разной степени подверженных мембранному гидролизу), а также кинетику всасывания свободных глицина и лейцина в изолированной петле тонкой кишки. Предварительно, по данным исследования на тех же животных кинетики всасывания глюкозы, была определена диффузионная проницаемость преэпителиального слоя. С ее учетом, используя разработанные нами математические подходы, мы определили значения «истинных» кинетических констант гидролиза и транспорта дипептидов и всасывания аминокислот, что позволило затем, используя математическое моделирование (выполнялось совместно с А.А.Груздковым), оценить в широком диапазоне концентраций субстратов относительную роль «пептидного» компонента во всасывании указанных дипептидов.
Полученное нами значение проницаемости преэпителиального слоя соответствовало диффузионной проницаемости неперемешиваемого водного слоя толщиной 48.5±8.0 мкм, что согласуется с оценками, полученными нами ранее в аналогичных экспериментальных условиях (Груздков, Громова, 1995; Громова и др., 2002; Громова, Груздков, 2003), а также с данными других авторов, полученными в опытах на неанестезированных животных (Strocchi, Levitt, 1991; Uhing, Kimura, 1995).
В отношении всасывания глицина и лейцина в изолированной петле тонкой кишки крыс были получены следующие значения «истинных» кинетических констант: Kt =46.7±4.0 и 2.15±0.59 мМ и Jmax =0.74±0.15 и 0.16±0.03 мкмоль мин-1· см-1 (для глицина и лейцина, соответственно). В отношении Kt (константа Михаэлиса для транспорта) эти значения хорошо согласуются с данными, полученными нами ранее в сходных экспериментальных условиях (Громова, Груздков, 2003), а также с оценками других авторов, полученными в опытах на эвертированных препаратах тонкой кишки крыс и на везикулах щеточной каймы энтероцитов крыс (Munck, 1981; Pascual et al., 2000; Castilla-Cortazar et al., 2004).
В отношении гидролиза и всасывания дипептидов нами получены следующие значения кинетических констант. Для «пептидной» составляющей всасывания глицилглицина: Kt=4.4±0.6 мМ дипептида и Jmax=0.24±0.02 мкмоль дипептида мин-1· см-1. Для «пептидной» составляющей всасывания глицил-L-лейцина: Kt=4.8±0.9 мМ дипептида и Jmax=0.23±0.02 мкмоль дипептида мин-1· см-1. Для мембранного гидролиза дипептидов (глицилглицин и глицил-L-лейцин) значения «истинных» кинетических констант были равны: Km=5.4±1.0 и 38.2±4.4 мМ дипептидов (соответственно) и Vmax=0.09±0.02 и 0.24±0.07 мкмоль дипептидов мин-1· см-1 (соответственно).
Согласно нашим расчетам, в случае глицилглицина доля «пептидного» компонента в его суммарном всасывании относительно постоянна (7780%) во всем диапазоне исходных концентраций этого дипептида (2.540 мМ). При этом около 70% дипептида расщепляется внутриклеточно и 30% – в результате мембранного гидролиза. В случае глицил-L-лейцина при увеличении исходной концентрации дипептида с 5 до 40 мМ доля «пептидного» компонента в результирующем всасывании глицина снижается с 89.4 до 83.7%, а лейцина – с 86.0 до 71.2%. При этом доля внутриклеточного гидролиза глицил-L-лейцина снижается с 83.1 до 62.9%. Соответственно, до 37.% возрастает доля мембранного гидролиза этого дипептида.
Анализ полученных результатов показывает, что доля «пептидной» составляющей во всасывании конкретного дипептида определяется соотношением кинетических параметров его мембранного гидролиза и мембранного транспорта. Например, в случае глицил-L-лейцина заметная зависимость доли «пептидной» составляющей его всасывания от исходной концентрации дипептида обусловлена высоким значением Km для мембранного гидролиза глицил-L-лейцина (38.2 мМ) по сравнению с низким значением Kt для его мембранного транспорта в интактном виде (4.8 мМ).
Таким образом, в условиях хронического опыта при относительно невысоких концентрациях исследованных дипептидов (<40 мМ) во всасывании исследованных дипептидов преобладает «пептидная» составляющая. Теоретический анализ показывает, что в диапазоне высоких концентраций субстрата (>>40 мМ) «пептидный» транспорт может достигать насыщения, а его доля существенно снижаться и становиться сопоставимой с всасыванием свободных аминокислот, образующихся в результате мембранного гидролиза дипептидов.
Участие люминальных факторов в регуляции гидролиза и всасывания нутриентов в тонкой кишке
Функциональные характеристики изолированного участка тонкой кишки в хронических опытах при различных субстратных нагрузках. Прямое субстратное регулирование является одним из основных механизмов адаптации систем мембранного гидролиза и транспорта тонкой кишки к количеству и качественному составу потребляемой пищи (Karasov, Diamond, 1987; Адаптационно-компенсаторные процессы…, 1991; Wright et al., 1997; Ferraris, 2001; Drozdovski, Thomson, 2006b; Loo et al., 2006). Однако концепция субстратного регулирования базируется в основном на экспериментах, в которых об изменении концентрации субстратов можно судить весьма приблизительно. Методика хронических экспериментов открывает широкие возможности для изучения прямого влияния тех или иных субстратов на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки. Исследование субстратной регуляции в хронических опытах позволяет также оценить эффективность различных регулярных субстратных нагрузок в отношении замедления атрофии слизистой оболочки изолированного участка и сохранения на достаточно высоком уровне его основных функциональных показателей, что особенно важно для успешного применения данной методики.
На двух группах крыс мы использовали два типа регулярных (почти ежедневная перфузия в течение 1 – 1.5 ч) субстратных нагрузок на изолированный участок тонкой кишки: 1) глюкозой (25 или 50 мМ) – в соответствии с оригинальной методикой (Уголев и др., 1986) и 2) глютаминовой кислотой (25 мМ) или глютамином (50 мМ). Сопоставлялось влияние этих нагрузок на массу слизистой оболочки изолированного участка, а также всасывание в нем глюкозы, глицина, глютаминовой кислоты, гидролиз и всасывание глицилглицина.
Через 7 недель нагрузок глютаминовой кислотой отношение массы слизистой оболочки в изолированном участке кишки к таковой в прилегающем функционирующем участке было в среднем на 20% выше, чем при нагрузках глюкозой (25.0 мМ). В случае нагрузок глютамином в течение двух недель масса слизистой оболочки изолированного участка кишки была на 30 % больше (P<0.05), чем при нагрузках глюкозой (50 мМ).
У крыс обеих групп в диапазоне высоких исходных концентраций глюкозы скорость ее всасывания резко снижалась в период со второй до четвертой недели после операции, а в последующие 4 недели сохранялась примерно на одном уровне. В интервале со второй по восьмую недели после операции значения константы Михаэлиса для активного транспорта глюкозы (Kt) существенно не изменялись у крыс обеих групп. Значение максимальной скорости активного транспорта (Jmax) снизилось на 30% у крыс первой группы (с нагрузкой глюкозой), и на 20% у крыс второй группы (с нагрузкой глютаминовой кислотой), что связано, по-видимому, с частичной атрофией слизистой оболочки изолированной петли. Однако в расчете на 1 см длины кишки, а также на г влажного веса кишки, значение Jmax для активного транспорта глюкозы в конце экспериментального периода было несколько выше (статистически недостоверно) у крыс, получавших нагрузку глюкозой.
Значения кинетических констант транспорта глицина у крыс первой группы составили: Kt=36.3±3.7 мМ и Jmax = 0.42±0.10 мкмоль · мин-1 · см-1, а у крыс второй группы: Kt=34.0±3.7 мМ и Jmax=0.56±0.04 мкмоль · мин-1 · см-1. При этом в расчете на 1 см2 серозной поверхности кишки значение Jmax для всасывания глицина было вдвое выше во второй группе крыс по сравнению с первой (P<0.05).
Максимальная скорость всасывания глицилглицина при расчете на 1 см2 серозной поверхности была существенно выше у крыс второй группы по сравнению с первой (0.64±0.13 против 0.39±0.06 мкмоль · мин-1 · см-1), однако различия не были статистически достоверными из-за большой вариабельности данных.
Таким образом, регулярная нагрузка изолированной кишечной петли глютаминовой кислотой и глютамином эффективнее нагрузки глюкозой в отношении замедления атрофии слизистой оболочки в изолированном участке кишки. Кроме того, нагрузка глютаминовой кислотой способствует сохранению на более высоком уровне гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот. Но для сохранения на высоком уровне всасывания глюкозы, по-видимому, более эффективна нагрузка глюкозой.
В целом, полученные в хронических опытах результаты свидетельствуют об изменении транспортных характеристик изолированного участка тонкой кишки в соответствии с локальной субстратной нагрузкой и служат прямым подтверждением концепции субстратного регулирования.
Влияние желчи и панкреатического секрета на функциональные характеристики тонкой кишки. Результаты экспериментальных исследований свидетельствует об участии пищеварительных секретов в изменении численности популяции энтероцитов и их гидролитических и транспортных активностей (Уголев, 1978; Karasov, Diamond, 1987; Адаптационно-компенсаторные процессы…, 1991; Ferraris, 2001, Drozdowski, Thomson, 2006b). Ранее в основном исследовалось одновременное действие желчи и панкреатического сока, тогда как особенности влияния каждого из этих секретов на гидролитические и транспортные системы тонкой кишки остаются неясными
В нашей работе в опытах in vitro исследовались гидролиз и всасывание углеводов в тонкой кишке крыс после перевязки общего желчного протока, а также в тонкой кишке кроликов после перевязки панкреатического протока в начальные сроки после операции. Выбор кроликов в качестве объекта исследования обусловлен тем, что у этих животных (в отличие от крыс) удобна перевязка панкреатического протока. Мы определяли общую амилазную и мальтазную активности в гомогенатах слизистой оболочки различных отделов тонкой кишки, а также активный транспорт свободной глюкозы (С-глюкоза), глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы (М-глюкоза) и крахмала (К-глюкоза), в эвертированных отрезках кишки, взятых из тех же отделов.
Через 7 дней после перевязки общего желчного протока у крыс происходило расширение в дистальном направлении, по сравнению с интактными животными (контроль), зоны наиболее интенсивного активного транспорта С-глюкозы (рис. 3). Сходные результаты были получены в отношении транспорта М-глюкозы. Активный транспорт К-глюкозы был относительно низким у интактных животных и практически не обнаруживался после перевязки у крыс общего желчного протока. По-видимому, это связано, со снижением адсорбции панкреатической -амилазы на поверхности слизистой оболочки кишки в отсутствие желчи, поскольку она, как было показано ранее (Уголев и др., 1974), способна повышать прочность адсорбции этого фермента на поверхности кишки, и с относительно небольшим вкладом у крыс собственно кишечной -амилазы в общую амилазную активность слизистой оболочки тонкой кишки.
В совокупности эти факты позволяют думать, что из-за пониженной адсорбции панкреатической -амилазы на поверхности тонкой кишки (вследствие отсутствия желчи) даже на фоне возможного увеличения в данных условиях секреции в полость кишки панкреатической -амилазы (Ohlsson et al., 1997) реальный уровень -амилазной активности и темпы расщепления углеводов в полости тонкой кишки, по-видимому, существенно ниже по сравнению с таковыми у интактных животных. В результате, в проксимальных отделах тонкой кишки происходит снижение, а в дистальных отделах – некоторое увеличение локальной концентрации промежуточных и конечных продуктов гидролиза крахмала: олигосахаридов, мальтозы и глюкозы. В этих условиях индукция мембранных транспортеров в так называемой «резервной зоне», к которой обычно относят дистальные отделы тонкой кишки, обеспечивает сохранение эффективного всасывания глюкозы.
Перевязка панкреатического протока у кроликов через 7 дней после операции приводила к резкому снижению общей амилазной активности в слизистой оболочке тонкой кишки, особенно в ее проксимальных отделах (P<0.05). На фоне отсутствия панкреатической -амилазы, общий уровень амилазной активности определяется активностью собственно кишечной -амилазы. Важно отметить, что уровень мальтазной активности в слизистой оболочке тонкой кишки не менялся через 7 дней после операции.
Активный транспорт свободной глюкозы через 7 дней после исключения панкреатической секреции увеличился, особенно в передних отделах тонкой кишки (P<0.05), где он обычно невелик (рис. 4). Сходная закономерность, но выраженная в меньшей степени, наблюдалась в отношении активного транспорта М-глюкозы. Поразительно, что активный транспорт К-глюкозы через 7 дней после операции достоверно не отличался от такового у контрольных животных, сохраняясь на довольно
 |  |
| Рис. 3. Аккумуляция С-, М- и К-глюкозы в эвертированных отрезках тонкой кишки крыс после лапаротомии (К) и через 7 дней после перевязки общего желчного протока (n=45) По вертикали – аккумуляция глюкозы в ткани (мМ) I – IV – участки тонкой кишки | Рис. 4. Аккумуляция С-, М- и К-глюкозы в эвертированных отрезках тонкой кишки кроликов в контроле (К) и через 7 дней после перевязки панкреатического прото-ка (n=6) По вертикали – аккумуляция глюкозы в ткани (мМ) I – IV – участки тонкой кишки |
высоком уровне во всех отделах тонкой кишки, несмотря на весьма значительное снижение общей амилазной активности слизистой оболочки кишки.
На основании полученных данных можно предположить, что повышение активного транспорта глюкозы в проксимальных отделах тонкой кишки кроликов при недостаточности полостного пищеварения носит адаптивный характер и направлено на сохранение высокой эффективности функционирования пищеварительно-всасывательного конвейера тонкой кишки в отношении углеводов.
Таким образом, исключение желчи и панкреатического секрета оказывает опосредованное влияние на всасывание продуктов гидролиза углеводов, снижая темпы полостного пищеварения и, как следствие, снижая концентрацию глюкозы. При недостаточности панкреатической -амилазы кишечная -амилаза не восполняет её функции. Сохранение эффективного всасывания глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала, в данных условиях достигается за счет повышения мощности активного транспорта этого моносахарида через апикальную мембрану энтероцитов.
Изменение гидролиза и всасывания нутриентов в тонкой кишке при действии эндогенных факторов
Функциональные характеристики тонкой кишки в условиях хронического опыта. Уже в первых работах А.М.Уголева и Б.З.Зарипова (1979) с использованием разработанной ими методики хронического опыта были обнаружены значительно более высокие скорости гидролиза и всасывания нутриентов в тонкой кишке по сравнению таковыми в острых опытах in vivo на анестезированных животных. Предполагалось, что это связано, по крайне мере частично, с более высокой проницаемостью преэпителиального слоя тонкой кишки благодаря отсутствию влияния наркоза и операционной травмы (Груздков, Громова, 1995; Levitt et al., 1996). Вместе с тем это может быть также связано с большей активностью гидролитических и транспортных систем тонкой кишки. Для проверки данного предположения мы определили с использованием разработанного математического подхода «истинные» кинетические константы всасывания глюкозы в изолированном участке тонкой кишки в условиях хронического опыта.
Значения проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки, определенные в хронических опытах по данным о кинетике гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, были эквивалентны диффузионной проницаемости неперемешиваемого водного слоя толщиной 20–50 мкм. Они согласуются с результатами других наших работ и с оценками других авторов (Levitt et al., 1992; Pappenheimer, 2001), но почти на порядок отличаются от значений, определенных ранее в острых опытах in vivo на анестезированных животных (300–800 мкм) (обзоры: Груздков, 1993; Pappenheimer, 2001). Величина константы Михаэлиса для активного транспорта глюкозы (Kt), определенная по данным хронических опытов (3.18±0.60 мМ), укладывается в диапазон значений, рассчитанных другими авторами по данным острых опытов in vivo с учетом влияния преэпителиального слоя (0.8–5.0 мМ; Westergaard et al, 1986; Pappenheimer, 2001) и мало отличается от наших прежних оценок (4.3 мМ ) (Громова, Груздков, 1999).
Иная картина наблюдается в отношении максимальной скорости активного транспорта глюкозы (Jmax ). С одной стороны, ее величина в расчете на см длины кишки (0.73±0.09 мкмоль мин-1 см-1) близка к значению, определенному нами ранее по данным хронических опытов (0.70 мкмольмин-1см-1 (Громова, Груздков, 1999), и хорошо согласуется с данными других исследователей, полученными в хронических опытах на неанестезированных крысах (Uhing, Kimura, 1995). С другой стороны, эти значения примерно в 3 раза выше тех, которые были получены многими авторами в острых опытах in vivo на анестезированных крысах (0.24 мкмоль мин-1 см-1), согласно сводке в обзоре (Pappenheimer, 1990). Эти данные косвенно свидетельствуют о том, что наркоз и операционная травма, присущие острым опытам in vivo, приводят не только к снижению проницаемости преэпителиального слоя, но и оказывают ингибирующее влияние на активный транспорт глюкозы. В пользу такого предположения говорит и тот факт, что коэффициент сопряжения (отношение скорости всасывания глюкозы к скорости ее образования при гидролизе мальтозы) существенно выше в хронических опытах (в отсутствие наркоза) по сравнению с острыми (Уголев и др., 1986). Этот факт нашел подтверждение в проведенной нами специальной серии хронических опытов, в которой наблюдалось значительное снижение при наркозе (нембутал, в/б в дозе 3.5 мг на 100 г массы тела) коэффициента сопряжения: с 0.734 до 0.579 и с 0.507 до 0.399 при исходных концентрациях субстрата 18.75 мМ и 50.0 мМ соответственно.
Прямые доказательства в пользу указанного предположения были получены при исследовании в хронических опытах временной динамики всасывания глюкозы в изолированной петле тонкой кишки крыс, находившихся под наркозом. Оказалось, что скорость всасывания глюкозы при ее исходной концентрации 75 мМ, когда активный транспорт близок к максимальному значению, снижалась на 20 % через 15 мин и на 50% (P<0.05) через 35 мин после введения нембутала (в/б в дозе 3.5 мг на 100 г массы тела) (Рис. 5). При низкой исходной концентрации глюкозы (25 мМ), когда скорость ее всасывания примерно пропорциональна проницаемости преэпителиального слоя, она в меньшей степени снижалась под влиянием наркоза (на 20%, P<0.05).
Рис.5. Влияние наркоза (нембутал) на всасывание глюкозы (25 и 75 мМ) в изолированной петле тонкой кишки крыс в хроническом опыте.
По оси абсцисс – время от начала опыта, мин; по оси ординат – скорость всасывания глюкозы, мкмоль/мин.
1 – перфузия раствором глюкозы 25 мМ; 2 – перфузия раствором глюкозы 75 мМ.
Стрелкой показан момент введения нембутала.
Согласно нашим данным, наркоз значительно тормозит не только всасывание глюкозы, но и всасывание глицина и глицилглицина, которое осуществляется с участием специфических систем активного транспорта. Частично действие наркоза на всасывание нутриентов проявляется также в неспецифическом снижении проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки. В отношении активного транспорта его влияние, возможно, обусловлено снижением уровня энергетического обмена в кишечных клетках. Предполагалось (Uhing, Kimura, 1995), что оно связано с изменением общего кровотока в тонкой кишке или с изменением кровотока в микрососудах. Известно, например, что анестезия и операционная травма снижают общий кровоток в тонкой кишке и изменяют его распределение между слизистой оболочкой, подслизистой основой и мышечным слоем (Gumbleton et al., 1990; Colombato et al., 1991). В связи с этим можно думать, что наличие взаимодействия между всасыванием субстратов и кровотоком в слизистой оболочке тонкой кишки является одним из важных факторов, обеспечивающих высокие скорости всасывания низкомолекулярных пищевых веществ в тонкой кишке в физиологических условиях.
Всасывание нутриентов в тонкой кишке при голодании. При полном голодании или безбелковом рационе изменение функциональных параметров тонкой кишки происходит как в связи с изменением локальной пищевой нагрузки, так и под действием эндогенных (главным образом, гормональных) факторов, сопутствующих голоданию. Данные литературы о влиянии голодания на всасывание моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке (Karasov et al., 1987; Адаптационно-компенсаторные процессы, 1991; Тимофеева и др., 1994; Ihara et al., 2000a; Громова, 2003; Habold et al., 2004, 2005) весьма противоречивы. Отчасти это можно объяснить тем, что в работах разных авторов применялись различные экспериментальные подходы, способы расчета и сроки голодания, а также использовались животные разных возрастных групп и исследовались разные виды голодания (полное, частичное или белковая депривация).
В нашей работе исследовалось влияние полного голодания, а также безбелкового высокоуглеводного рациона, на гидролиз и всасывание ряда пищевых субстратов с использованием двух методических подходов: опытов in vitro и хронических опытов in vivo на неанестезированных животных. Применение хронических опытов давало уникальную возможность проследить динамику развития адаптационного процесса, а также изучить влияние преимущественно эндогенных факторов, сопутствующих голоданию, поскольку люминальная нагрузка на изолированный участок тонкой кишки не менялась при переходе к голоданию.
У неоперированных крыс после полного голодания в течение трех и пяти дней масса слизистой оболочки тонкой кишки снижалась на 24 и 47% (P<0.05) соответственно, а после 7- и 14-дневного содержания животных на безбелковом рационе она снижалась примерно на 30 % (P<0.05). Однако в условиях хронического опыта после двухнедельного содержания животных на высокоуглеводном безбелковом рационе масса слизистой оболочки изолированного участка не изменялась, тогда как масса слизистой оболочки функционирующего (ниже анастомоза) участка кишки была снижена на 32% (P<0.05). Ранее наблюдалась аналогичная закономерность в отношении массы слизистой и высоты ворсинок изолированного участка тонкой кишки при полном голодании (Волошенович и др., 1981).
После полного голодания крыс в течение трёх и пяти дней активный транспорт галактозы в эвертированных мешках тонкой кишки не менялся, а активный транспорт свободного глицина и глицина, образующегося при гидролизе глицилглицина, повышался, особенно через 5 дней (в расчете на длину препарата) (P<0.05). После содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе в течение 7 и 14 дней активный транспорт глюкозы в эвертированных мешках тонкой кишки возрастал (P<0.05), а активный транспорт глицина не менялся (в расчете на длину препарата).
Более сложная картина адаптации наблюдалась при исследовании динамики всасывания указанных выше субстратов в хронических опытах после перевода крыс на высокоуглеводный безбелковый рацион (рис. 6).
Рис. 6. Времення динамика гидролиза и всасывания нутриентов в изолированной петле тонкой кишки крыс в хроническом опыте до и после их перевода на высокоуглеводный безбелковый рацион.
По оси абсцисс – время от начала опыта, дни; по оси ординат – скорости гидролиза и всасывания субстратов, мкмоль/мин. А – всасывание глюкозы; Б – всасывание глицина; В – гидролиз мальтозы (1) и всасывание глюкозы (2); Г – гидролиз глицилглицина (1) и всасывание глицина (2).
Стрелками обозначено время перехода на безбелковый рацион.
* P<0.05; ** P<0.02; *** P<0.01 (по отношению к среднему исходному уровню.
Всасывание каждого из активно транспортируемых субстратов (глюкоза, глицин, глицилглицин) менялось разнонаправлено на разных сроках безбелкового питания. При этом снижение всасывания глицина в некоторые сроки происходило только до исходного уровня, а всасывания глюкозы и глицилглицина – на 30% и на 40% от исходного уровня, соответственно. Однако к концу двухнедельного периода всасывание глицина повышалось, а всасывание глюкозы и глицилглицина возвращалось к исходному уровню. Эти данные указывают на то, что процессы всасывания весьма чувствительны к действию эндогенных факторов, сопутствующих безбелковому питанию.
В целом, полученные результаты свидетельствуют о способности тонкой кишки поддерживать на достаточно высоком уровне всасывание глюкозы, аминокислот и пептидов в условиях полного голодания или безбелкового питания. Это может обеспечиваться эндогенными (гормональными) факторами и играть важную роль в поддержании эффективного всасывания эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также при возобновлении питания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования (в особенности, с использованием хронических опытов) позволили получить новые данные, касающихся относительной роли различных механизмов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке и его адаптивной регуляции под действием люминальных и эндогенных факторов.
В хронических опытах на крысах показано, что в диапазоне высоких концентраций мальтозы образующаяся глюкоза всасывается в тонкой кишке с высокой скоростью в отсутствие всасывания воды. Эти данные свидетельствуют о том, что парацеллюлярный перенос глюкозы на потоке всасывающейся воды весьма незначителен по сравнению с ее активным транспортом не только в диапазоне низких концентраций субстрата, что было показано нами ранее (Груздков, Громова, 1993), но и в диапазоне его высоких и супервысоких концентраций.
С использованием различных методических подходов нами проведена проверка другой гипотезы (Kellett, 2001), согласно которой при высоких углеводных нагрузках доминирующую роль во всасывании глюкозы в тонкой кишке играет механизм облегченной диффузии через апикальную мембрану энтероцитов с участием транспортера GLUT2. При этом мы получили противоречивые результаты. С одной стороны, в хронических опытах на крысах наблюдалось значительное снижение всасывания в изолированной петле тонкой кишки глюкозы и галактозы, использующих общие мембранные транспортеры SGLT1 и GLUT2, в присутствии флоретина – ингибитора транспортера GLUT2. Это свидетельствовало о возможном включении GLUT2 в апикальную мембрану энтероцитов и его участии во всасывании глюкозы и галактозы. Однако с другой стороны, всасывание 2-дезокси-D-глюкозы (5 мМ) – специфического субстрата для GLUT2 – лишь незначительно повышалось после нагрузки изолированной кишечной петли в течение 40 мин глюкозой (75 мМ) и не отмечалось торможения всасывания галактозы (50 мМ) в присутствии в инфузате 2-дезокси-D-глюкозы (50 мM). Кроме того, наблюдалось неспецифическое торможение флоретином всасывания глицина в изолированной кишечной петле и активности ряда пищеварительных ферментов в гомогенате слизистой оболочки тонкой кишки. В специальной серии опытов in vitro показана способность флоретина тормозить выход глюкозы из энтероцитов через базолатеральную мембрану, происходящий, как известно, с участием транспортера GLUT2.
Полученные нами результаты в совокупности подтверждают факт участия механизма облегченной диффузии, опосредованной GLUT2, в переносе глюкозы через апикальную мембрану энтероцита in vivo. Вместе с тем они показывают, что подход, предусматривающий применение флоретина в опытах in vivo, по-видимому, дает завышенную оценку вклада механизма облегченной диффузии во всасывание глюкозы и заниженную оценку активного компонента ее всасывания. Поэтому вряд ли можно признать достаточно обоснованным мнение авторов гипотезы о том, что в условиях нормального пищеварения облегченная диффузия с участием GLUT2 является основным механизмом всасывания глюкозы.
Сочетание хронических опытов с математическими подходами позволило внести определенную ясность в дискуссионный до настоящего времени вопрос о соотношении «аминокислотного» и «пептидного» компонентов во всасывании дипептидов. Впервые в хронических опытах были определены «истинные» (скорректированные с учетом влияния преэпителиальнольного слоя) кинетические константы мембранного гидролиза и всасывания в интактном виде глицилглицина и глицил-L-лейцина, а также всасывания свободных глицина и лейцина в изолированной петле тонкой кишки крыс. В результате проведенного анализа было установлено, что в этих условиях при невысоких концентрациях дипептидов (<40 мМ) преобладает «пептидный» компонент их всасывания. При этом относительная роль «пептидного» компонента зависит от величины и соотношения кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида в интактном виде. Теоретический анализ показал, что в диапазоне высоких концентраций субстрата «пептидный» транспорт может достигать насыщения, а его доля существенно снижаться и становиться сопоставимой с всасыванием свободных аминокислот, образующихся в результате мембранного гидролиза дипептидов.
Впервые исследованы особенности субстратной регуляции гидролитических и транспортных систем в изолированном участке тонкой кишки в условиях хронического опыта. Показано, что регулярная нагрузка изолированной кишечной петли глютаминовой кислотой или глютамином эффективнее нагрузки глюкозой в отношении замедления атрофии в изолированном участке тонкой кишки. Нагрузка глютаминовой кислотой способствует также сохранению на более высоком уровне гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот. Однако для поддержания на высоком уровне всасывания глюкозы более эффективна нагрузка глюкозой. Эти результаты являются прямым подтверждением концепции субстратного регулирования систем мембранного транспорта в тонкой кишке.
Исследование всасывания в тонкой кишке углеводов с различной степенью полимерности при исключении желчи у крыс и панкреатического секрета у кроликов показало, что эти секреты оказывают не прямое, а опосредованное влияние на всасывание глюкозы. При снижении темпов полостного и мембранного пищеварения углеводных полимеров в результате снижения активности -амилазы после исключения из тонкой кишки желчи и, в особенности, после исключения ферментов панкреатического сока, происходит, по-видимому, уменьшение концентрации продуктов их гидролиза, в частности глюкозы, в тонкой кишке. В этих условиях расширение зоны интенсивного активного транспорта глюкозы в тонкой кишке крыс в дистальном направлении (в случае исключения желчи) и повышение активного транспорта глюкозы в проксимальных отделах тонкой кишки кроликов (после выключения панкреатической секреции) можно рассматривать как адаптивную реакцию, обеспечивающую эффективное всасывание этого важного в энергетическом плане моносахарида.
Принципиально важным является вопрос о механизмах действия наркоза на функциональные характеристики тонкой кишки. Полученные результаты свидетельствуют о том, что отрицательное влияние наркоза на всасывание пищевых субстратов (глюкоза, глицин, глицилглицин) связано не только со снижением проницаемости преэпителиального слоя, но и с торможением их транспорта через апикальную мембрану энтероцитов. Можно предположить, что это торможение связано со снижением энергетического обмена в кишечных клетках, которое, в свою очередь, происходит при наркозе вследствие ухудшения снабжения их кислородом из-за снижения общего кровотока в тонкой кишке или изменения кровотока в микрососудах (Uhing, Kimura, 1995). Вероятно существование связи между всасыванием пищевых веществ и кровотоком в слизистой оболочке является одним из важных факторов, обеспечивающих высокие скорости всасывания низкомолекулярных пищевых веществ в тонкой кишке в нормальных условиях.
Результаты исследования активного транспорта глюкозы, глицина и глицилглицина в опытах in vitro при полном голодании и безбелковом питании, а также в хронических опытах при безбелковом питании, позволили заключить, что при повышенной углеводной нагрузке на тонкую кишку активный транспорт глюкозы регулируется уровнем этой нагрузки. Однако даже в ее отсутствие (при полном голодании) активный транспорт глюкозы сохраняется на достаточно высоком уровне, что, по-видимому, обусловлено существованием эндогенного контроля этого процесса. При этом активный транспорт аминокислот и дипептидов не меняется или даже возрастает, что связано, вероятно, с тем, что в отсутствие экзогенного белка эти субстраты, продолжающие поступать в полость тонкой кишки в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, начинают более эффективно использоваться для питания организма.
Исследование временной динамики гидролиза и всасывания различных пищевых субстратов в условиях хронического опыта показало, что всасывание глюкозы, глицина и глицилглицина разнонаправлено меняется на разных сроках безбелкового питания. Эти результаты свидетельствуют о высокой чувствительности процессов всасывания к действию эндогенных факторов, сопутствующих голоданию.
ВЫВОДЫ
1. Высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке крыс в диапазоне высоких концентраций субстрата (50 – 200 мМ) наблюдаются при секреции воды в кишке в случае гиперосмолярных инфузатов и в отсутствие ее всасывания в случае гипоосмолярных инфузатов, что свидетельствует о незначительной роли парацеллюлярного механизма транспорта глюкозы в тонкой кишке млекопитающих при высоких углеводных нагрузках.
2. Флоретин, введенный со стороны слизистой оболочки тонкой кишки в хронических опытах in vivo, тормозит всасывание не только глюкозы и галактозы, но и глицина, а в опытах in vitro не влияет на аккумуляцию глюкозы в ткани эвертированных мешков тонкой кишки, но снижает ее аккумуляцию в серозной жидкости. Подход, предусматривающий применение флоретина с мукозной стороны in vivo, завышает относительную роль GLUT2-зависимого транспорта глюкозы через апикальную мембрану энтероцита. Основным механизмом всасывания глюкозы является ее транспорт, опосредованный SGLT1, тогда как облегченная диффузии с участием GLUT2 имеет существенное значение при высоких углеводных нагрузках.
3. Роль «пептидной» и «аминокислотной» составляющих во всасывании дипептидов определяется соотношением кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида. При относительно низких концентрациях (менее 40 мМ) глицилглицин и глицил-L-лейцин всасываются в тонкой кишке преимущественно в нерасщепленном виде. Однако при увеличении концентрации субстрата доля пептидного компонента снижается и может стать сопоставимой с долей всасывания свободных аминокислот, образующихся в результате мембранного гидролиза дипептидов.
4. В условиях хронического опыта (в отсутствие наркоза и операционной травмы) проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки, а также значение максимальной скорости активного транспорта глюкозы, многократно превышают значения этих параметров, определяемые в острых опытах in vivo на анестезированных животных.
5. После исключения из пищеварения желчи у крыс обнаружено расширение в дистальном направлении зоны интенсивного активного транспорта свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы. После исключения из пищеварения панкреатических ферментов у кроликов повышается активный транспорт свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы, в проксимальных отделах тонкой кишки и сохраняется на исходном уровне по всей длине тонкой кишки активный транспорт глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала.
Повышение активного транспорта глюкозы в ответ на исключение желчи или панкреатического секрета, можно рассматривать как компенсаторную реакцию, обеспечивающую сохранение высокой эффективности функционироваания пищеварительно-всасывательного конвейера тонкой кишки в отношении углеводов при недостаточности полостного пищеварения (в частности, недостаточности панкреатической -амилазы).
6. Нагрузка изолированной петли тонкой кишки крыс растворами глютаминовой кислоты или глютамина более эффективна, по сравнению с нагрузкой глюкозой, в отношении замедления атрофии ее слизистой оболочки и сохранения на более высоком уровне гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот. Нагрузка раствором глюкозы в большей степени способствует поддержанию способности изолированной петли к всасыванию глюкозы. Эти результаты служат прямым подтверждением концепции локального субстратного регулирования всасывательной способности тонкой кишки.
7. Показано, что после полного голодания животных (3 и 5 дней) или после их содержания на высокоуглеводном безбелковом рационе (7 и 14 дней) на фоне снижения массы слизистой оболочки тонкой кишки крыс, сохраняется или даже повышается способность кишки к всасыванию глюкозы, галактозы и глицина, что способствует эффективному всасыванию эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также основных компонентов пищи при возобновлении питания.
8. На разных сроках содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе происходят разнонаправленные изменения скоростей всасывания глюкозы, глицина и глицилглицина в изолированной петле тонкой кишки в хроническом опыте. Эти данные свидетельствуют о чувствительности процессов всасывания, к действию эндогенных (гормональных) факторов, сопутствующих белковому голоданию.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.
Публикации в рецензируемых научных журналах согласно перечню ВАК России
1. Громова Л.В., Гусев С.А., Егорова В.В., Иезуитова Н.Н., Никитина А.А., Тимофеева Н.М., Цветкова В.А., Уголев А.М. Ферментативно-транспортные системы эпителиальных клеток, стромы и мышечносерозного слоя тонкой кишки крыс // Докл.АН СССР. 1991. Т.317, № 5. С. 1254-1257.
2. Громова Л.В., Гусев С.А., Егорова В.В., Иезуитова Н.Н., Никитина А.А., Тимофеева Н.М., Цветкова В.А., Уголев А.М. Гидролазы мукозного, субмукозного и мышечно-серозного слоев тонкой кишки и их функции // Физиол. журн. СССР им. И.М.Сеченова. 1991. Т. 77. №11. С. 82-93.
3. Громова Л.В., Такесуе Е., Уголев А.М. Влияние галактозы на всасывание в тонкой кишке свободной глюкозы и глюкозы, освобождающейся при гидролизе мальтозы и трегалозы // Докл. АН СССР, 1992, Т.322, № 3, С. 607-609.
4. Громова Л.В., Уголев А.М. Транспортная система, откачивающая моносахариды из энтероцитов через базолатеральную мембрану // Физиол. журн. им.И.М.Сеченова. 1992. Т. 78. № 8. С. 45-55.
5. Громова Л.В., Гусев С.А., Иоффе М.Л., Уголев А.М. Некоторые особенности всасывания в тонкой кишке двух гидролизатов казеина и эквивалентной смеси аминокислот // Физиол. журн. им.И.М.Сеченова. 1992. Т. 78, № 8. С.56-64.
6. Уголев А.М., Егорова В.В., Иезуитова Н.Н., Тимофеева Н.М., Громова Л.В., Зарипов Б.З. Ферментативно-транспортные характеристики тонкой кишки крыс при старении // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1992. Т. 78, № 8. С. 29-37.
7. Громова Л.В., Груздков А.А. Относительная роль различных механизмов всасывания глюкозы в тонкой кишке при физиологических условиях // Физиол.журн. им. И.М. Сеченова, 1993, Т. 79, № 6, С. 65-72.
8. Громова Л.В., Иоффе М.Л. Влияние пептидов, входящих в состав гидролизатов казеина, на всасывание глюкозы и воды в тонкой кишке крыс // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1993. Т. 79, № 6. С. 73-79.
9. Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Брудная М.С., Громова Л.В., Груздков А.А., Уголев А.М. Анализ структурных характеристик плотного контакта энтероцитов тонкой кишки крыс в процессе всасывания нутриентов (иммуноэлектронно-микроскопическое исследование) // Физиол.ж. им. И.М.Сеченова, 1993, Т. 79. № 6. С. 57-64.
10. Тимофеева Н.М., Иезуитова Н.Н., Егорова В.В., Никитина А.А., Громова Л.В., Гордова Л.А. Белковое голодание и трофически-барьерные функции ферментных и транспортных систем пищеварительных и непищеварительных органов взрослых и растущих крыс // Физиол. журнал им.И.М.Сеченова, 1994. Т. 80. № 11. С. 91-103.
11. Ugolev A.M., Komissarchik Ya.Yu., Gromova L.V., Gruzdkov A.A., Snigirevskaya E.S., Brudnaya M.S. Structural and functional analysis of glucose absorption mechanisms in the rat small intestine in vivo // General. Physiol. and Biophys. 1995. V. 14. No 5. P. 405-417.
12. Груздков А.А., Громова Л.В. Сопряжение гидролиза дисахаридов со всасыванием образующейся глюкозы в тонкой кишке in vivo // ДАН. 1995. Т. 342. № 6. С.830-832.
13. Груздков А.А., Громова Л.В. Оценка проницаемости преэпителиального слоя в тонкой кишке крыс in vivo // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1995. Т.81. №5. С.58-69.
14. Громова Л.В., Егорова В.В., Иезуитова Н.Н., Иоффе И.Л., Никитина А.А., Тимофеева Н.М. Исследование ферментных и транспортных систем тонкой кишки крыс после кратковременных субстратных нагрузок. // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1996. Т. 82. № 3. С. 19-26.
15. Громова Л.В., Егорова В.В., Иезуитова Н.Н., Иоффе И.Л., Никитина А.А., Тимофеева Н.М. Исследование ферментных и транспортных систем тонкой кишки крыс после кратковременных субстратных нагрузок. // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1996. Т. 82. № 3. С. 19-26.
16. Gromova L.V., Gruzdkov A.A. Hydrolysis-Dependent Absorption of Disaccharides in the Rat Small Intestine (Chronic Experiments and Mathematical Modeling) // Gen. Physiol. Biophys.. 1999. Vol. 18. No 2, P. 209-224.
17. Тимофеева Н.М., Иезуитова Н.Н., Громова Л.В. Современные представления о всасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих // Успехи физиол. наук. 2000. Т.31. № 4. С. 24-37.
18. Груздков А.А., Громова Л.В. Механизмы всасывания глюкозы в тонкой кишке крыс in vivo при высокой концентрации углеводов // Российский физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2001. Т.87. №7. С. 973-981.
19. Громова Л.В. Всасывание углеводов в тонкой кишке крыс после перевязки желчного протока // Росс. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2001. Т.87. №2. С. 271-278.
20. Громова Л.В., Груздков Ал.А., Груздков А.А. Кинетические параметры гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы в тонкой кишке крыс в хронических опытах // Российский физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2002. Т.88. № 4. С.510-518.
21. Громова Л.В., Груздков А.А.. Кинетический анализ всасывания глицина и глицилглицина в тонкой кишке крыс в условиях хронического опыта // Росс. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2003. Т. 89. № 2. С. 173-183.
22. Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Кевер Л.В., Груздков А.А., Громова Л.В. Структурно-функциональный анализ механизмов всасывания глюкозы при высоких концентрациях мальтозы в тонкой кишке крыс in vivo // Цитология. 2003. Т. 45. № 5. С. 456-465.
23. Груздков А.А., Громова Л.В. Исследование потребления крысами концентрированных растворов глюкозы и моделирование ее распределения вдоль кишки // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 10. С. 1270-1280.
24. Громова Л.В., Грефнер Н.М., Груздков А.А., Комиссарчик Я.Ю. Оценка роли облегченной диффузии в транспорте глюкозы через апикальную мембрану энтероцита // Росс. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2006. Т 92. № 3. С. 362-373.
25. Громова Л.В. Влияние флоретина и флоридзина на пищеварительно-всасывательные характеристики тонкой кишки // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2006. Т. 42. № 4. С. 365-370.
26. Громова Л.В. Влияние белкового голодания на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки крыс в условиях хронического опыта // Росс. физиол.. журн. им. И.М. Сеченова. 2006. Т. 92. № 10. С. 1239-1249.
27. Грефнер Н.М., Громова Л.В., Груздков А.А., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. Структурный анализ роли облегченной диффузии в процессе всасывания глюкозы энтероцитами тонкой кишки крысы // Цитология. 2006. Т. 48. № 4. С. 355-363.
Публикации в материалах конференций и сборниках научных трудов
28. Громова Л.В., Груздков А.А. Быстрые адаптации активного транспорта глюкозы в тонкой кишке in vivo // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1996. Т.6. № 4. С.106-107.
29. Громова Л.В., Груздков А.А. Математический подход к оценке кинетических констант гидролиза пищевых веществ в тонкой кишке по данным перфузионных исследований // Тез. докл. Второй междунар. конф. «Средства математич. моделирования», 14-19 июня 1999 г., С.-Петербург, С. 169-170.
30. Громова Л.В., Груздков А.А.. Кинетические параметры гидролиза мальтозы в тонкой кишке крыс in vivo // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2000. Т. Х. № 5. Приложение №11. Материалы Шестой Российской гастроэнтерологической недели. 23-27 октября 2000, г. Москва. С. 113.
31. Громова Л.В., Груздков А.А.. Гидролиз мальтозы и всасывание глюкозы и воды при высоких концентрациях дисахарида в полости кишки // IV Международный конгресс «Парентеральное и энтеральное питание». Москва. 2000 г. С. 18.
32. Громова Л.В.. Транспорт углеводов в тонкой кишке кроликов при ее гипо- и гиперфункционировании // Всероссийская конференция с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященная 75-летию со дня рождения А.М. Уголева. Санкт-Петербург. 2001. С.93-94.
33. Громова Л.В., Груздков А.А.. Влияние энтеральной нагрузки глутаминовой кислотой на структурно-функциональные характеристики изолированной петли тонкой кишки крыс // V Международный конгресс «Энтеральное и парентеральное питание». Москва. 2001. С.36.
34. Громова Л.В. Влияние голодания на всасывание пищевых веществ в тонкой кишке // «Организм и окружающая среда», М.: ГНЦ РФ – Ин-т медико-биологич. проблем РАН. 2003. С. 113-114.
35. Gruzdkov A.A, Gromova L.V. Experimental and mathematical analysis of relationships between gastric emptying and glucose absorption in the small intestine // Pavlov Centenary symposium: Integrative Physiology & Behaviour, С.- Петербург, 19-22 июня 2004 г. 2004. P. 42.
36. Груздков А.А., Громова Л.В., Иезуитова Н.Н.. Хронический опыт как метод исследования мембранного гидролиза и всасывания нутриентов в условиях, близких к физиологическим // Материалы ХIХ Съезда физиологич. общества. Екатеринбург. 2004. Рос. физиол. журн. Т. 90. № 8. С. 10.
37. Gruzdkov A.A., Gromova L.V. Short-term adaptation of the gut to high glucose loads // Experimental Biology and XXXV International Congress of Physiological Sciences. Abstracts./ The FASEB Journal. 2005. Vol..19. Abstract #406.10.
38. Громова Л.В., Груздков А.А. Действие наркоза на гидролиз и всасывание пищевых веществ в тонкой кишке // Материалы IV Всерос. конференции. «Механизмы функционирования висцеральных систем». С-Петербург, 2005. С.75.
39. Груздков А.А., Громова Л.В. Ингибирование флоридзином и флоретином транспорта глюкозы в тонкой кишке крыс // Сборник научных трудов, посвящ. акад Ф.И. Фурдую в связи с 70-летием со дня рождения. «Современные проблемы физиологии и санокреатологии». Кишинев. 2005. С. 87-92
40. Громова Л.В. Изменение функциональных характеристик тонкой кишки под действием наркоза // Научные труды I Съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 2005, Т. 1. С. 99.
41. Груздков А.А., Громова Л.В. Функциональное состояние слизистой оболочки тонкой кишки при белковом голодании // Гастроэнтерология С.-Петербурга. Гастроэнтерология. Гепатология. Колопроктология. Фармакотерапия. Питание. Научно-практический журнал. Матер. 8-го Межд. Славяно-Балтийского научн.форума «Санкт-Петербург – Гастро-2006». 2006. № 1-2. С. М37.
42. Громова Л.В. Роль панкреатического секрета во всасывании углеводов в тонкой кишке кроликов / Матер. третьей Всерос. научно-практ. конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Новосибирск. 7-9 ноября 2007 г. // Сибирский медико-фармацевтический журнал. 2007. Т. 62. № 7. С.179-180.
43. Gromova L.V. Functional analysis of the role of facilitative diffusion in glucose absorption from the small intestine in vivo.// J. Physiol. Biochem. 2007. V. 63 No 1. P. 45. (21-th Meeting European Intestinal Transport Group. March 3-6, 2007. Oberwiesenthal, Germany).
44. Громова Л.В. Груздков А.А. Роль люминальных и системных факторов в регуляции гидролиза и всасывания пищевых веществ в тонкой кишке млекопитающих // Материалы ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 4-8 июня 2007 г. С. 31-32 (С075).
