На правах рукописи
ПОДАГОВА
Екатерина Владимировна
ПСЕВДОГИПЕРТРОФИЧЕСКИЕ ПРОГРЕССИРУЮЩИЕ МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ У ДЕТЕЙ: АЛГОРИТМЫ ДИАГНОСТИКИ И МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ
14. 00. 13 – нервные болезни
03. 00. 15 – генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2007
Работа выполнена в ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава.
Научные руководители: доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор | Мальмберг С. А. Дадали Е. Л. |
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент | Зыков В.П. Ситников В.Ф. |
Ведущая организация: ГУ НИИ Неврологии РАМН
Защита диссертации состоится “29” мая 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.01 в ГОУ ВПО Российском Государственном медицинском университете Росздрава по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д.1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Автореферат разослан «14» марта 2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета,
Кандидат медицинских наук, профессор Л.В. Губский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа генетически гетерогенных заболеваний с изолированным или преимущественным поражением мышц плечевого и тазового поясов конечностей [Anastasi G et al. 2004, Arahata K. 2000, Kumagai T et al. 2001, Nigro V. 2003]. Показано, что наиболее злокачественное течение характерно для, так называемых, псевдогипертрофических вариантов ПКМД, которые делятся на дистрофинопатии и саркогликанопатии [Fischer D et al. 2005, Gulati S et al. 2003, Sunada Y. 2004]. В группу дистрофинопатий включены ПМД Дюшенна и Беккера, которые представляют собой аллельные варианты, обусловленные различными мутациями в гене белка дистрофина [Дадали Е.Л. 1999, Иллариошкин С.Н. и соавт. 1998, Nonaka I. 2004]. Группа саркогликанопатий представлена 4 вариантами ПКМД - 2С, 2D, 2E, 2F типов, наследующихся по аутосомно-рецессивному типу и обусловленных мутациями в генах четырех трансмембранных белков - альфа, бета, гамма и дельта саркогликанов [Beckmann J.S. et al. 1996, Dincer P et al. 2000, Emery A.E. 2002]. Имеющиеся в литературе немногочисленные работы, посвященные проведению клинико-генетических корреляций, показали отсутствие выраженных различий клинических и нейрофизиологических проявлений ПМД Дюшенна и саркогликанопатий, что можно объяснить сходством патогенетических механизмов и морфологического дефекта, возникающего при этих группах заболеваний [Dua T 2001, Zats M. et al. 1989, Мальмберг С.А., 2000]. Известно, что дистрофин и саркогликаны входят в состав дистрофин-гликопротеинового комплекса, посредством которого осуществляется связь цитоскелета миофибрилл с внеклеточным матриксом [Баранов А.Н. 2000, Гринио Л.П. и соавт. 1997, Ananda A et al. 1999]. Нарушение одного из компонентов этого комплекса приводит к его деградации и некрозу мышечных волокон, с последующим замещением их соединительной тканью [Бадалян Л.О. и соавт. 1988, Темин П.А. и соавт. 1997, Шишкин С.С. 1997]. Сходство клинических проявлений этих генетически гетерогенных заболеваний осложняет проведение их дифференциальной диагностики и планирование профилактических мероприятий в отягощенных семьях в процессе проведения медико-генетического консультирования [Hausmanova-Petrusewicz I et al. 2000, Ozawa E. 1999]. Это определяет необходимость создания четких алгоритмов диагностики отдельных генетических вариантов псевдогипертрофических форм ПМД, использование которых позволит избежать ошибок при расчетах риска и заключениях о состоянии здоровья будущего ребенка во время проведении дородовой диагностики. Однако разработка таких алгоритмов невозможна без проведения тщательного клинического, биохимического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического обследования больных и членов их семей. Основное внимание при проведении комплексного анализа должно быть направлено на изучение частот встречаемости и особенностей фенотипических проявлений различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД у больных мужского пола, а также характера клинических симптомов у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина и больных женского пола с аутосомно-рецессивными вариантами псевдогипертрофических форм ПМД. Результаты исследований позволят не только оптимизировать процесс диагностики и дифференциальной диагностики различных вариантов псевдогипертрофических форм ПМД, но и повысить результативность при проведении медико-генетического консультирования отягощенных семей.
Цель исследования: создание алгоритмов диагностики и медико-генетического консультирования семей отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПКМД на основе проведения комплексного обследования больных и членов их семей.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- Оценить частоту встречаемости ПМД Дюшенна и аутосомно-рецессивных вариантов псевдогипертрофических ПКМД в выборке больных из популяции РФ.
- Провести сравнительный анализ частот встречаемости основных клинических признаков и уровня активности КФК в группах больных с аллельными вариантами ПМД Дюшенна.
- Оценить особенности клинических проявлений у больных женского пола с аутосомно-рецессивными вариантами псевдогипертрофических ПКМД и у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина.
- Разработать алгоритмы дифференциальной диагностики псевдогипертрофических ПМД у больных мужского и женского пола.
- Унифицировать протокол проведения медико-генетического консультирования семей, отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПМД.
Научная новизна
Впервые на основе проведения комплексного клинического, молекулярно-генетического, биохимического и иммуногистохимического методов обследования больных с фенотипическими проявлениями псевдогипертрофических ПМД проведена оценка частот встречаемости ПМД Дюшенна и псевдогипертрофических вариантов ПМД с аутосомно-рецессивным типом наследования. Выявлены особенности клинических проявлений и биохимических параметров у носительниц мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. Выявлены ранее не описанные в литературе особенности поражения мозга у гетерозиготной носительницы в гене дистрофина. Усовершенствованы алгоритмы диагностики, дифференциальной диагностики и медико-генетического консультирования семей с различными генетическими вариантами псевдогипертрофических форм ПКМД у лиц мужского и женского пола на основе современных иммунногистохимических и молекулярно-генетических данных.
Практическая значимость
Разработаны четкие протоколы диагностики и дифференциальной диагностики псевдогипертрофических вариантов ПМД у больных мужского и женского пола, необходимые в практической деятельности врача-невролога и генетика. Использование этих протоколов в клинической практике позволит избежать ошибок при проведении профилактических мероприятий в ходе медико-генетического консультирования отягощенных семей.
Положения, выносимые на защиту:
1. В выборке больных мужского пола с псевдогипертрофическими вариантами ПМД из центральных регионов России подавляющее большинство случаев (96,7%) представлено ПМДД, тогда как на долю аутосомно-рецессивных вариантов саркогликанопатий приходится лишь 3,3% случаев. В противоположность этому в группе больных женского пола доля саркогликанопатий составляет 77,8 %, а в 22,2 % случаев заболевание возникает у гетерозиготных носительниц мутаций в гене дистрофина.
2. Существуют различия в частоте встречаемости аллельных вариантов ПМДД, обусловленных делециями, дупликациями и точковыми мутациями в гене дистрофина. В 60,5 % заболевание возникает в результате делеции, в 7,6 % - дупликации и 31,9 % - точковых мутаций в гене дистрофина. Показано отсутствие статистически значимых различий в возрасте начала, частотах встречаемости клинических проявлений и уровне активности креатинфосфокиназы в плазме крови при аллельных вариантах ПМДД.
3. Миопатический симптомокомплекс в проксимальных группах мышц конечностей и/или признаки кардиомиопатии выявляются при тщательном клинико-неврологическом обследовании у 41,8 % облигатных носительниц, что требует назначения профилактического лечения, препятствующего манифестации клинических симптомов. Выявлены ранее неописанные особенности клинических проявлений у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина, характеризующиеся симптомами поражения ЦНС.
4. Усовершенствованы алгоритмы диагностики псевдогипертрофических ПМД у лиц мужского и женского пола. У 10,6 % больных мужского пола и 78,6 % больных женского пола для дифференциальной диагностики ПМДД и аутосомно-рецессивных саркогликанопатий необходимо использовать иммуногистохимический метод, направленный на обнаружение дистрофиновых волокон в мышечном биоптате.
5. Модифицированы расчеты повторного риска рождения больного ребенка с ПМДД и характер проведения профилактических мероприятий в отягощенных семьях. На основе различий частоты возникновения мутаций в гене дистрофина в женских и мужских гаметах установлено, что при аллельном варианте ПМДД, обусловленном точковыми мутациями вероятность гетерозиготного носительства его матери составляет 97,6 %, что значительно увеличивает эффективность и точность результатов проведения дородовой диагностики в семьях отягощенных ПМДД с использованием косвенных методов ДНК анализа.
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанные диагностические протоколы и алгоритмы проведения медико-генетического консультирования семей, отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПМД, успешно используются в практической работе отделения психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями ФГУЗ ДКБ № 38 - ЦЭП ФМБА России, которое является клинической базой кафедры нервных болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, а также в научно-консультативном отделе ГУ Медико-генетического научного центра РАМН. Данные проведенного исследования применяются в лечебной и педагогической работе на кафедре нервных болезней педиатрического факультета, а также включены в лекционные курсы по медицинской генетике на кафедре общей и медицинской генетики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на юбилейной конференции «15-лет ФГУЗ ДКБ № 38-ЦЭП ФМБА» (2005 г), совместном заседании кафедры нервных болезней педиатрического факультета и кафедры генетики МБФ РГМУ (2007 г).
Публикации
По теме диссертационного исследования опубликовано 5 научных работ (4 статьи и 1 тезис).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и включает введение и главы, посвященные обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению и обсуждению полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 9 рисунками, 5 диаграммами, 17 оригинальными фотографиями, краткими выписками из историй болезни. Библиографический указатель включает 252 (65 отечественных и 187 зарубежных) источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследованная выборка больных включала 142 пациента с псевдогипертрофическими формами ПМД: 123 больных мужского пола в возрасте от 2,5 до 18 лет и 19 - женского в возрасте от 2 лет 8 мес до 40 лет, находящихся под наблюдением в научно-консультативном отделе МГНЦ РАМН (директор – академик РАМН, профессор Е.К. Гинтер) и в отделении психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями (зав. – д.м.н. Мальмберг С.А.) ФГУЗ ДКБ №38 – ЦЭП ФМБА России (главный врач - к.м.н. Голоденко В.И.) в период с 2002 по 2005. Клиническое обследование больных включало неврологический осмотр по общепринятой в клинической нейромиологии методике, сбор анамнестических данных и генеалогический анализ. В соматической сфере был сделан акцент на тщательном контроле сердечной и дыхательной деятельности. Оценка уровня зрелости и специфики развития интеллекта исследовалась с помощью шкалы Векслера. Электромиографическое исследование проводилось с использованием 4-х канального электронейромиографа «Нейро-МВП» фирмы Нейрософт (Иваново, Россия). С целью обнаружения поражения сердечной мышцы проводилось эхокардиографическое исследование, регистрация ЭКГ и суточное холтеровское кардиомониторирование на аппарате “Oxford Medilog Prima” в трех отведениях с определением среднесуточной частоты сердечных сокращений, циркадного индекса, стандартных параметров ЭКГ, аритмий, вариабельности ритма сердца с применением временного анализа. Определение уровня активности креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), мышечных изоформ аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартатаминотрансферазы (АсАт) проводилось по стандартной методике на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalab Flexor PC и полуавтоматическом биохимическом анализаторе Eclipse фирмы Merck. ДНК-диагностика у больных мужского пола осуществлялась методом мультиплексной амплификации с анализом 20 экзонов и промоторной области в лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН (зав. – д.б.н., проф. Поляков А.В.). Больным женского пола с клиническими признаками псевдогипертрофической ПМД проводилось исследование кариотипа с использованием дифференцированной G окраски по стандартным методикам. При выявлении несбалансированной лайонизации одной из Х хромосом учитывали данные о том, что основным фактором инактивации Х-хромосомы у девочек является дифференцированное метилирование в различных ее участках. Использование рестриктаз, чувствительных к метилированию, то есть расщепляющих ДНК только тогда, когда в сайте их рестрикции метилирование отсутствует, дает основание судить об уровне метилирования генов Х хромосомы. При наличии несбалансированной лайонизации Х хромосомы после обработки ДНК эндонуклеазой, будет преимущественно амплифицироваться один из двух аллелей, которые наблюдались в равном соотношении после проведения реакции амплификации на ДНК, не подвергнутой обработке рестриктазой. Имунно-гистохимический анализ, направленный на определение дичстрофиновых волокон в биоптате четырехглавых мышц проводился при помощи антител, специфичных к С-домену, Rod - домену и N-концу белка дистрофина. Мышечный биоптат обрабатывался согласно стандартному иммунно-цитохимическому протоколу. Для выявления эпитопов дистрофина использовали антитела DYS-1, DYS-2 и DYS-3 "Novocastra" (Великобритания).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Анализ частот встречаемости ПМДД в группе больных мужского пола с псевдогипертрофическими вариантами ПМД.
Точная диагностика ПМДД у больных мужского пола с псевдогипертрофическим вариантами ПМД осуществлялась в случаях: наличия X –сцепленного рецессивного наследования заболевания, обнаружения делеции в гене дистрофина и установления гетерозиготного носительства матерью пробанда в изолированных случаях на основе повышения уровня креатинфосфокиназы в плазме крови. Х-сцепленная сегрегация заболевания обнаружена в 26 семьях (21,2 % от общего количества семей), в двух обследованных семьях (1,6 %) наличие сходного заболевания выявлено у сестер пробандов, что дало основании диагностировать аутосомно-рецессивный вариант ПКМД, в остальных 95 семьях (77,2 %) пробанд был единственным больным в семье. При проведении ДНК анализа, направленного на выявление делеций и дупликаций в гене дистрофина, в группу больных с ПМДД отнесен еще 71 больной больных (при этом у 62 больных идентифицирована делеция, а у 9 больных дупликация в гене дистрофина).
В оставшихся семьях с наличием единственного больного всем матерям пробандов проведено исследование уровня КФК в плазме крови. В качестве порогового значения для установления носительства был принят показатель в 150 ед/л. Результатами этого исследования явилось установление гетерозиготного носительства мутации у 11 матерей больных мальчиков. Таким образом, в результате проведения такого комплексного исследования диагноз ПМДД установлен у 108 больных, что составило 87,8 % случаев в обследованной нами выборке больных мужского пола и в двух случаях идентифицирован аутосомно-рецессивный вариант псевдогипертофической ПКМД.
У 13 больных мальчиков, у матерей которых значения активности КФК были в границах нормы, а сами пациенты были единственными больными в семьях, проведение дифференциального диагноза между ПМДД/Б и псевдогипертофическими вариантами ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования требовало осуществления иммуногистохимического анализа биоптатов скелетных мышц с целью обнаружения дистрофин-позитивных волокон. Отсутствие дистрофин-позитивных волокон обнаружено у 11 из 13 обследованных, что позволило установить диагноз ПМДД/Б. В 2 случаях с выявленными дистрофин-позитивными волокнами у больных диагностирован аутосомно-рецессивный вариант ПКМД. Таким образом, на основании данных генеалогического и иммуногистохимического анализа количество случаев с аутосомно-рецессивными псевдогипертрофическими вариантами ПКМД увеличилось до четырех (см. таблицу 1).
Таблица 1. Распределение больных с изолированными случаями псевдогипертрофических ПМД, диагностируемых с помощью различных методов.
Метод диагностики | ДНК-анализ | Биохимический (повышение уровня КФК у матери больного) | Иммуногистохимический | Всего |
Количество семей (в %) | 71 (74,7 %) | 11 (11,6 %) | 13 (13,7 %) | 95 (100 %) |
Таким образом, в обследованной нами выборке больных из России подавляющее количество случаев псевдогипертрофических вариантов ПМД у больных мужского пола представлено ПМДД, на долю которых приходится 96,7 % всех случаев заболеваний этой групп. Лишь в 3,3 % диагностировано наличие одного из аутосомно-рецессивных вариантов ПКМД.
Результаты проведенного исследования соответствуют таковыми, полученным в большинстве европейских популяций с низким уровнем инбридинга и позволяют сделать заключение о необходимости первоочередного использования методов диагностики ПМДД у больных мальчиков с клиническими проявлениями псевдогипертрофических вариантов ПМД.
2. Особенности клинических характеристик аллельных вариантов ПМДД у больных мужского пола.
С целью выявления особенностей клинических и электромиографических характеристик вариантов ПМДД, обусловленных делециями в проксимальной и дистальной части гене дистрофина нами проведен сравнительный анализ частот встречаемости 18 наиболее типичных симптомов заболевания, а также возраста его манифестации. Сравнение этих показателей проведено в трех группах больных – с наличием делеции в проксимальной части гена, в дистальной части гена, а также с отсутствием делеции. Учитывая возраст-зависимую экспрессивность заболевания, характеризующуюся возможностью появления ряда клинических признаков по мере прогрессирования заболевания, нами проведен анализ тяжести течения заболевания у больных, включенных в каждую группу, на основании определения стадии миодистрофического процесса.
Анализ полученных результатов показал, что все три анализируемые группы больных были близки по численности, а также сопоставимы по количеству больных с 1, 2 и 3 стадиями заболевания, что дало возможность проведения корреляционного анализа в трех анализируемых группах больных без введения специальных поправок на различия в численности анализируемых групп.
В таблице 2 представлены результаты определения частот встречаемости основных клинических симптомов у больных трех проанализированных групп.
Таблица 2. Частоты встречаемости клинических признаков у больных с делеционными и неделеционными вариантами ПМДД
Наименование симптома | Частота встречаемости признака в % | ||
Группа 1 (n=31) | Группа 2 (n=33) | Группа 3 (n=44) | |
отсутствие коленного рефлекса | 80,65 | 78,79 | 68,18 |
гиперлордоз поясничного отдела позвоночника | 61,29 | 78,79 | 70,45 |
отсутствие карпо-радиального рефлекса | 54,84 | 36,36 | 40,91 |
отсутствие рефлекса с двуглавой мышцы | 41,94 | 36,36 | 38,64 |
отсутствие ахиллова рефлекса | 41,94 | 54,55 | 45,45 |
кардиопатия | 29,03 | 42,42 | 47,73 |
снижение интеллекта | 25,81 | 30,30 | 40,91 |
деформация грудной клетки | 19,35 | 45,45 | 20,45 |
контрактуры голеностопных суставов | 16,13 | 39,39 | 29,55 |
гипомимия, слабость лицевой мускулатуры | 12,90 | 15,15 | 15,91 |
деформация стоп | 9,68 | 27,27 | 11,36 |
контрактуры коленных суставов | 6,45 | 21,21 | 9,09 |
контрактуры лучезапястных суставов | 0 | 6,06 | 0 |
контрактуры локтевых суставов | 0 | 18,18 | 6,82 |
контрактуры плечевых суставов | 0 | 6,06 | 0 |
гипотрофия мышц лица | 0 | 21,21 | 2,27 |
ожирение | 0 | 3,03 | 2,27 |
фасцикуляции мышц | 0 | 0 | 2,27 |
Полученные результаты не выявили значимых различий в спектре и частоте встречаемости основных фенотипических проявлений ПМДД в трех обследованных группах.
3. Клинические характеристики различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД у лиц женского пола.
Под нашим наблюдением находилось 19 больных женского пола (из 18 семей) в возрасте от 2 лет 8 мес до 40 лет с выраженными клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПМД. Известно, что наличие признаков заболевания у женщин может быть обусловлено, как манифестацией аутосомно-рецессивных вариантов псевдогипертрофических ПМД, так и возникновением заболевания у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина в результате количественных или структурных перестроек Х-хромосомы. Всем больным женского пола проводилось исследование кариотипа с использованием дифференциальной G –окраски, молекулярно-генетический анализ, направленный на идентификацию несбалансированной лайонизации Х-хромосомы в клетках крови, а также генеалогический анализ. Двенадцати больным, у которых используемые диагностические методы не позволяли уточнить генетический вариант, проведен иммуногистохимический анализ, направленный на идентификацию дистрофиновых волокон. В итоге - используемый комплекс диагностических методов позволил идентифицировать генетические варианты в рамках заданных критериев у всех больных женского пола.
Показано, что у 5 из 19 обследованных больных женского пола (26,3 %) возникновение выраженных клинических проявлений ПМД было обусловлено наличием мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. У одной пациентки клинические симптомы ПМД были обусловлены мозаичным вариантом синдрома Шерешевского-Тернера, а у 4 больных (21%) наблюдалась несбалансированная лайонизация Х-хромосомы, которая привела к преимущественной инактивации хромосомы, не несущей патологической мутации в гене дистрофина (Таблица 3).
Таблица 3. Распределение различных генетических вариантов в анализируемой группе псевдогипертрофических форм ПМД у больных женского пола.
Генетический вариант | Клинические проявления у гетерозиготных носительниц | Аутосомно-рецессивный вариант ПМД | ||
Моносомия Х | Несбалансированная лайонизация Х-хромосомы | Наличие дистрофина в мышечных волокнах | Генеалогический анализ | |
Количество больных | 1 | 4 | 12 | 2 |
Учитывая полученные результаты, свидетельствующие о возможности возникновения выраженных клинических проявлений ПМДД у гетерозиготных носительниц, нами проведено клиническое, биохимическое и электромиографическое обследование 43 облигатных носительниц из 40 семей в возрасте от 28 до 50 лет, не предъявлявших жалоб на момент осмотра.
Факт гетерозиготного носительства устанавливался на основании проведения генеалогического анализа, свидетельствующего об Х-сцепленной рецессивной сегрегации заболевания и/или обнаружения повышения уровня КФК в плазме крови. В результате проведения обследования клинические проявления обнаружены у 18 из 43 носительниц (см. рисунок 3).
Рисунок 3. Частота встречаемости отдельных клинических признаков у гетерозиготных носительниц.
У 11 из 18 носительниц (61,1 %) выявлялись только миопатический симптомокомплекс наряду с умеренно выраженными псевдогипертрофиями икроножных мышц, у 6 больных (33,3 %) наблюдалось сочетание миопатического симптомов и кардиомиопатии. Лишь у 1 носительницы (5,5 %) были выявлены изолированные признаки кардиомиопатии.
4. Медико-генетическое консультирование при псевдогипертрофических вариантах ПМД.
Медико-генетическое консультирование (МГК) отягощенных семей является необходимым этапом при проведении обследования пробандов с псевдогипертрофическими вариантами ПКМД. МГК традиционно включает три основных этапа. Наиболее важным из них является первый, диагностический этап, от успешности проведения которого зависит эффективность консультирования в целом. На основании результатов собственных исследований и анализа литературных данных нами усовершенствована методика проведения двух основных этапов МГК, направленных на диагностику и дифференциальную диагностику различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД и модифицированы таблицы расчетов риска рождения больного ребенка в семьях с аллельными вариантами ПМДД. Алгоритм диагностики у лиц мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПКМД представлен на рисунке 4. В абсолютном большинстве случаев псевдогипертрофических ПМД диагностический поиск будет ограничиваться предложенным алгоритмом.
Однако в части случаев (в нашей выборке количество таких больных не превышает 3 %) возникает необходимость продолжения диагностического поиска оставшихся четырех генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД. С этой целью нами предложен следующий алгоритм диагностики псевдогипертрофических ПМД с аутосомно-рецессивным типом наследования, который представлен на рисунке 5. Учитывая результаты собственных исследований, а также литературные данные, свидетельствующие об отсутствие значимых клинических, биохимических, электромиографических признаков, позволяющих уверенно дифференцировать ПМДД и псевдогипертрофические варианты ПМД, основой для предложенного диагностического алгоритма этой группы заболеваний явились литературные данные о частотах встречаемости отдельных генетических вариантов.
Нами показано, что 27,8 % обследованных больных женского пола возникновение выраженных клинических проявлений псевдогипертрофических вариантов ПМД было обусловлено наличием мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. В связи с этим дифференциальная диагностика у пациенток женского пола должна быть направлена в первую очередь на исключение гетерозиготного носительства патологической мутации в гене дистрофина (см. рисунок 6.)
Рисунок 4. Алгоритм диагностики у лиц мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПКМД.
Рисунок 5. Алгоритм диагностики псевдогипертрофических вариантов ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.
Рисунок 6. Алгоритм дифференциальной диагностики различных вариантов псевдогипертрофических ПКМД у лиц женского пола.
4.3. Принципы расчетов риска возникновения ПМДД у потомков родственниц пробандов с различными аллельными вариантами заболевания.
При четком установлении генотипа матери пробанда и ее родственниц расчеты риска не представляют сложностей и проводят на основании типов образующихся гамет. Известно, что женщины-гетерозиготные носительницы мутаций имеют 50 % вероятность рождения больного сына или дочери-носительницы. Наибольшие сложности возникают при наличии единственного больного в семье, а генотип его матери установить не удалось, так уровень креатинфосфокиназы у нее был в пределах нормы. Традиционно, при расчетах вероятности носительства мутации в гетерозиготном состоянии у родственниц пробандов с Х-сцепленными-рецессивными заболеваниями используют теорему Байеса (расчеты риска с различной вероятностью возникновения 2-х независимых событий). В качестве априорной вероятности носительства женщиной патологической мутации в одном из генов Х-хромосом обычно принимают показатель в 4 (где - частота мутирования на гамету на поколение). Этот показатель складывается из частот мутирования в женских гаметах 2 и мужских 2. При равной частоте мутирования в женских ( )и мужских половых клетках () и фертильности больных f=0 (известно, что больные ПМДД не оставляют потомства) этот показатель принимается равным 4. Используя этот показатель в качестве априорной вероятности при наличии единственного больного в семье и отсутствия родственников мужского пола по материнской линии, вероятность гетерозиготного носительства у матери пробанда оказывается равной 2/3 (66 %,) и риск рождения больного ребенка составляет 33 % (таблица 4).
Таблица 4. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда в спорадических случаях.
Вероятность | Носительница | Не носительница |
Априорная | 4 | 1-41 |
Условная | 1/2 | |
Совместная | 2 | |
Апостериорная | 2/3 | 1/3 |
Однако в настоящее время стало ясно, что эти цифры должны быть уточнены, так как исследования ряда авторов показали, что для ряда генов, приводящих к Х-сцепленным рецессивным заболеваниям частота возникновения мутации в женских и мужских гаметах существенно различается. Показано, что возникновение точковых мутаций в гене дистрофина de novo в гаметах дедушек пробандов возникает в 40 раз чаще, чем бабушек по материнской линии. Принимая во внимание это обстоятельство, риск гетерозиготного носительства мутации в гене дистрофина у матерей пробандов с точно установленным диагнозом ПМДД и не имеющих делеции в гене дистрофина, значительно выше, чем считалось ранее. Продемонстрируем это заключение на примере родословной, представленной на рисунке 4.
Рисунок 4. Родословная
Таблица 5. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда с наличием точковой мутации при четко установленном диагнозе ПМДД.
Вероятность | II2 носительница | II2 не носительница |
Априорная | 82 | 1-82 1 |
Условная | ||
Совместная | 41 | |
Апостериорная | 41/42 (97,6%) | (2,4%) |
Таким образом, вероятность гетерозиготного носительства мутации в гене дистрофина при наличии больного сына и отсутствия здоровых сыновей и братьев составляет не 66 % как можно было бы предполагать при равенстве частот мутации в женских и мужских гаметах а 97,6 %. Следовательно, повторный риск рождения у нее больного сына составляет 48,8 %. С другой стороны показано, что возникновение других частых мутаций - делеций и дупликаций - в гене дистрофина приблизительно в 3,3 раза чаще возникает в женских гаметах по сравнению с мужскими. Таким образом, в этих случаях равно 0,3 и тогда априорная вероятность для II2 носительства мутации в гене дистрофина составляет 2,6 [2+ 2 (0,3)]. Используя аналогичные расчеты, основанные на теореме Байеса получаем, что при отсутствии родственников пробанда мужского пола по материнской линии риск носительства для матери пробанда с ПМДД, обусловленного делецией или дупликацией в гене дистрофина составляет 56 %, а риск рождения больного сына составляет 28 % (Таблица 6.).
Таблица 6. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда с ПМДД, обусловленного делецией или дупликацией в гене дистрофина.
Вероятность | Носительница | Не носительница |
Априорная | 2,6 | 1-2,6 1 |
Условная | 0,5 | |
Совместная | 1,3 | |
Апостериорная | 0,56 (56%) | 0,44 (44%) |
Таким образом, проведенные нами расчеты позволяют сделать вывод о том, что идентификация различных аллельных вариантов ПМДД с помощью методов ДНК анализа позволяет упростить процедуру идентификации генетического статуса родственниц пробанда по материнской линии и оптимизировать процесс проведения пренатальной диагностики в отягощенных семьях.
Таким образом, разработанный диагностический протокол, регламентирующий и определяющий последовательность использования диагностических методов для дифференциальной диагностики ПМДД и саркогликанопатий, а также модификация расчетов риска носительства мутации в гене дистрофина позволят существенно повысить точность и эффективность проведения профилактических мероприятий в отягощенных семьях.
ВЫВОДЫ
1. На основании комплексного обследования выборки из 123 больных мужского пола из популяции центральных регионов России подсчитаны частоты встречаемости ПМДД и аутосомно-рецессивных саркогликанопатий. Показано, что 96,7 % случаев этой группы заболеваний приходится на долю ПМДД и лишь 3,3 % случаев представлено аутосомно-рецессивными саркогликанопатиями.
2. Установлено отсутствие статистически значимых различий в возрасте начала, частотах встречаемости клинических проявлений и уровне активности креатинфосфокиназы в плазме крови у больных мужского пола с ПМДД, обусловленной наличием делеций, локализованных в дистальных и проксимальных участках гена дистрофина, а также у больных ПМДД с отсутствием делеции в гене дистрофина.
3. Показано, что в группе больных женского пола с псевдогипертрофическими вариантами поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий саркогликанопатии составляют 77,8 %, а в 22,2 % случаев заболевание возникает у гетерозиготных носительниц мутаций в гене дистрофина, имеющих несбалансированную лайонизацию Х-хромосомы, не несущую патологический ген в клетках-мишенях.
4. Показано, что при проведении тщательного неврологического обследования миопатический симптомокомплекс с заинтересованностью проксимальных мышц конечностей и/или признаки кардиомиопатии выявляется у 41,8 % облигатных носительниц, что требует назначения профилактического лечения, препятствующего манифестации клинических симптомов. Установлено отсутствие корреляциии между наличием и степенью выраженности клинических проявлений у облигатных носительниц мутации в гене дистрофина и уровнем активности креатинфосфокиназы в плазме крови.
5. Предложены алгоритмы дифференциальной диагностики различных генетических вариантов псевдогипертрофических вариантов поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий. Установлено, что у 10,6 % (при идентификации только делеций) и у 4,2 % (при установлении делеций и дупликаций) больных мужского пола, а также у 78,6 % больных женского пола для уточнения диагноза необходимо использовать иммуногистохимический метод для обнаружения дистрофина в мышечных волокнах.
6. Модифицированы расчеты повторного риска возникновения ПМДД в отягощенных семьях в зависимости от типа мутации в гене дистрофина. Показано, что при наличии у больного с ПМДД делеции или дупликации в гене дистрофина в семьях с единственным пораженным риск рождения больного сына у матерей пробандов 28 %, а в случае наличия у пробанда точковой мутации - 48,5%.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Разработанные алгоритмы диагностики и дифференциальной диагностики и медико-генетического консультирования семей, отягощенных ПМДД и псевдогипертрофическими вариантами ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования у больных мужского пола, позволят существенно повысить эффективность работы практических врачей, занимающимися проблемами наследственных болезней нервной системы.
- Выявленные особенности и спектр клинических симптомов у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина позволят спланировать характер и объем диагностических методов, необходимых для их профилактики раннего выявления у родственниц больных.
- Предложенная модель изучения группы генетически гетерогенных заболеваний, имеющих значительное сходство клинических проявлений, может быть использована для широкого круга наследственной патологии.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Мальмберг С.А., Подагова Е.В. Молекулярные основы врожденных миопатий // Неврологический журнал. – 2005. - №. 1 – с. 50-55.
- Подагова Е.В., Дадали Е.Л., Мальмберг С.А., Кузнецов А.Б., Шаркова И.В. Особенности диагностики псевдогипертрофических вариантов поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий // Неврологический журнал. – 2007. - № 1. – с.24-28.
- Дадали Е. Л., Мальмберг С. А., Подагова Е.В., Кузнецов А. Б., Максин Д.А. Псевдогипертрофические поясно-конечностные мышечные дистрофии у детей: алгоритм диагностики // Российский медицинский журнал.- 2007. - №3. – с..
- Дадали Е.Л., Мальмберг С.А., Подагова Е.В., Поляков А.В., Петрухин А.С. Особенности клинических проявлений прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина // Неврологический журнал. – 2007. - № 3. – с..
- Подагова Е.В., Мальмберг С.А., Дадали Е.Л. Псевдогипертрофические прогрессирующие мышечные дистрофии: алгоритмы диагностики // XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». – Тезисы. – М. – 2007.