УДК 541.145+ 543.38+542.67+548.53

Влияние концентрации на структуру макромолекул гуминовых кислот в водных растворах

Н. Л. Лаврик, Н. У. Муллоев

Институт химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук, ул. Институтская, 3, Новосибирск 630090 (Россия)

Е -mail: lavrik

(Поступила 10.12.05; после доработки 11.04.06)

Аннотация

Впервые корректно изучена концентрационная зависимость первых моментов М1 спектров флуоресценции разных по молекулярному весу фракций гуминовых кислот (ГК) в водных растворах в диапазоне концентраций 0.5–50 мг/л. Для всех изученных фракций ГК до концентраций ~5 мг/л обнаружен значительный рост величины М1. Установлено, что величина М1 претерпевает меньшие изменения с увеличением молекулярного веса фракции ГК. Интерпретация концентрационных зависимостей М1 проводится с помощью гипотезы ассоциатов. В рамках этой гипотезы наблюдаемые батохромные сдвиги спектров флуоресценции фракций ГК при увеличении концентрации объясняются изменением конформации флуорофора и изменением полярности микроокружения.

Введение

Актуальность изучения свойств макроструктуры гуминовых кислот ГК в водных растворах обусловлена тем, что только гуминовые вещества обладают всем комплексом свойств, которые создают в водных бассейнах Земли специфические экологические условия, имеющих общепланетарное значение. Кроме того, изучение структурного состояния макромолекул ГК в водной среде является актуальным, поскольку именно ГК способствуют деградации растворённых поллютантов (амины, фенолы, гетероциклические соединения, тяжёлые металлы и т.д.) благодаря связыванию их в природных водах в различные комплексы [1].

Структура макромолекул ГК изучается приблизительно 200 лет, но до сих пор является предметом дискуссий. До середины 90-х годов XX века наиболее распространённая точка зрения (общепринятая парадигма) на структуру макромолекулы ГК представлялась следующей: имеется ядро (ароматический углеродный скелет) и периферия (полисахаридно-полипептидные цепи) [1]. Молекулярные фрагменты ядра и периферии одной макромолекулы ГК связаны химическими связями. Носителями специфических свойств гуминовых кислот являются конденсированные ароматические ядра, соединённые друг с другом ковалентными связями. Периферические нерегулярные структурные элементы (периферические цепи) являются переменными компонентами и, следовательно, ГК представляет собой заряженный полимер (полианион) с молекулярным весом до 300 000 кД, который может варьироваться. Таким образом макромолекулы гуминовых кислот характеризуются широким набором различных структур, т.е обладают свойством полидисперсности.

О макроструктуре ГК в водных растворах до работы [2] в литературе имелись различные гипотезы: так в работах [3–5] авторы считали, что ГК представляют собой сфероколлоиды или глобулоподобные образования, в то время как авторы [6–8] полагали, что макроструктура ГК представляет гибкий цепной полимер, который имеет полиэлектролитную природу. Были попытки «примирить» противоположные гипотезы, полагая, что макроструктура ГК представляет собой смесь сфероколлоидов и линейных полимеров [9, 10]. Однако эта гипотеза не получила признания. В работе [2] авторы попытались создать «унифицированную концепцию», которая позволила бы внести ясность в понимание структуры ГК. С этой целью они систематически исследовали концентрационные зависимости коэффициентов вязкости и поверхностного натяжения водных растворов ГК при различных величинах ионной силы раствора и рН. В результате авторы [2] пришли к выводу, что в щелочных средах макроструктура ГК при низких концентрациях представляет собой гибкий линейный полимер, а при высоких концентрациях - жесткий сфероколлоид. Однако механизм образования жёсткого сфероколлоида (например, благодаря ассоциации или благодаря «скручиванию» исходной мономерной молекулы) в [2] не был описан.

В связи с вопросом о конформации ГК в водных растворах следует указать на свойство амфифильности этих молекул, которое имеет место благодаря наличию полярных и неполярных фрагментов в её структуре. Это свойство делает возможным формирование супрамолекулярных агрегатов типа мицелл за счёт самоассоциации. Наличие таких процессов установлено, например, для биологических мембран [11] и более простых молекул [12]. Именно свойство амфифильности ГК положено в основу предложенной в 1996 г. альтернативной гипотезы о структуре ГК в водных растворах [13]. Её суть заключается в том, что макромолекула ГК представляет собой не полимер с ковалентными связями между всеми атомами в молекуле, а является супрамолекулярным мицелло-подобным агрегатом, состоящим из относительно малых гетерогенных молекул с молекулярным весом до 1000 Д, способных к самоассоциации благодаря слабым дисперсионным силам (ван-дер-ваальсовские взаимодействия, СН, комплексы) и Н-связям [13,14]. Здесь следует заметить, что работе [13] предшествовала работа [15], в которой впервые было указано на слабые гидрофобные взаимодействия, как на фактор, который формирует структуру макромолекулы ГК в растворе. Таким образом в «супрамолекулярной» модели принципиальным является отсутствие ковалентных связей между относительно малыми молекулами.

В последнее время одним из простых и общепризнанных методов мониторинга структурных свойствах ГК стал метод флуоресценции [16–29]. Этот метод позволяет получать обширную информацию об изменении структуры флуорофоров в молекулах в зависимости как от изменения собственной конформации молекулы ГК [16, 18, 21, 29], так и в зависимости от изменения полярности её микроокружения [16–20]. Спектры флуоресценции ГК неоднородны, поскольку представляют собой суперпозицию спектров флуоресценции разных флуорофоров, принадлежащих благодаря свойству полидисперсности разным макромолекулам ГК [17, 22]. В качестве количественных параметров наблюдения за спектрами флуоресценции используют величины интегральных интенсивностей, первых моментов М1 («центр тяжести спектра») [16, 17], коэффициентов формы спектра флуоресценции (отношение интенсивности коротковолновой и длинноволновой компоненты спектра флуоресценции) [17, 21, 22, 24] и т.д.

Систематических исследований макроструктурных свойств ГК в водных растворах в зависимости от концентрации с помощью метода флуоресценции не проводилось. Имеются лишь отдельные работы, целью которых не являлось специальное изучение макроструктуры ГК в зависимости от концентрации (см., например, [23, 30, 31]). Из полученных результатов, имеющих отношение к задаче изучения макроструктуры ГК в зависимости от концентрации, можно указать только данные работы [30], в которой авторы наблюдали батохромный сдвиг спектра флуоресценции ГК при возрастании её концентрации. Этот сдвиг авторы связывали с возможностью образования агрегированного состояния из макромолекул ГК.

Однако многие работы (и не только указанные выше), в которых изучались спектры флуоресценции ГК, содержат ряд погрешностей, которые делают получение надёжной информации о макроструктуре ГК затруднительной. Эти погрешности заключаются в отсутствии поправок спектров флуоресценции ГК на эффект внутреннего фильтра (ЭВФ) [32, 33]. ЭВФ заключается в том, что на длинах волн наблюдения флуоресценции величина оптической плотности отлична от нуля и зависит от концентрации. Другой погрешностью является отсутствие учёта флуоресценции растворителя, которая всегда имеет место в водных растворах [21]. Таким образом, достоверная информация об изменениях спектров флуоресценции молекул ГК (а следовательно, и об изменении их структуры или окружения) в зависимости от концентрации в настоящее время отсутствует. Между тем актуальность и принципиальность получения такой информации об изменении (или постоянстве) структуры макромолекулы ГК в зависимости от концентрации в водных растворах представляет дополнительный интерес в связи с определением констант связывания ГК с различными молекулами-поллютантами. Такое определение проводится с помощью анализа результатов, полученных из экспериментов по наблюдению зависимости интенсивности флуоресценции молекул поллютанта от концентрации ГК (нахождение констант Штерна–Фольмера) [34-36]. При этом принимается, что структурные свойства ГК не зависят от концентрации, что априори неочевидно.

Сведения о влиянии веса фракции ГК на концентрационные зависимости спектров флуоресценции отсутствуют вообще, хотя результаты таких экспериментов являются весьма важными для решения задач, связанных как с изучением взаимодействия макромолекул ГК в водных растворах, так и с изучением молекулярной структуры и функциональных свойств самой ГК.

Целью настоящей работы было изучение макроструктуры различающихся по весу фракций, выделенных из ГК одного генезиса, в зависимости от концентрации с помощью метода флуоресценции, который как указывалось выше, является чувствительным методом контроля за изменением структурных параметров ГК [16–31, 34–36]. Спектральным параметром наблюдения изменения спектров флуоресценции фракций ГК была величина первого момента М1. Возможность использования этого параметра для получения информации об изменении структуры в макромолекулах ГК было успешно продемонстрирована ранее [18, 19].

Экспериментальная часть

В качестве образцов фракций ГК были взяты фракции ГК, выделенные из одной почвы (Курский чернозём). Выделение ГК и получение фракций с условным обозначением С + D, B + С, B и А подробно описаны ранее [37–39]. Молекулярные веса, определённые с помощью метода ультрафильтрации, для этих фракций составляли 5–30, 30–60, 60–100 и 100–300 кД соответственно [38]. Щелочные растворы из сухих препаратов ГК готовились на деионизованной воде (R = 6 Мом); рН растворов составляла 12.3 (NaOH квалификации

«ч. д. а.»). При изменении концентрации ГК величина рН растворов не менялась.

Спектры флуоресценции снимались через сутки после приготовления раствора. За время хранения растворов между съёмками (максимум 3 суток) изменений в спектрах поглощения и флуоресценции не происходило. Спектры флуоресценции были получены на N2 - лазерном строб-флуориметре (возб = 337 нм) [40]. Луч лазера проходил через кювету из кварца (1 0.5 1 см) сверху параллельно входной щели флуориметра. Центр возбуждающего луча лазера диаметром 3мм находился на расстоянии 2 мм от переднего края кюветы. Кювета заполнялась раствором таким образом, чтобы мениск отсутствовал. Эксперименты проводились с образцами, из которых воздух не удалялся. Спектры поглощения растворов ГК были получены на спектрометре Hewlett Packard.

Величина первого момента М1 спектров флуоресценции фракций ГК определялась как

М1 = / (1)

где Ii – интенсивность люминесценции на длине волны i. Величина Ii вычислялась по формуле

= Iiэкс. ГК *10ОDi - Iiэкс. щ (2)

В уравнении (2) Iiэкс. ГК и Iiэкс. щ – экспериментально наблюдаемые интенсивности флуоресценции на длине волны i раствора ГК и щелочи соответственно. Сомножитель 10ОDi – поправка на поглощение флуоресценции раствором ГК на длине волны i. ОDi– оптическая плотность исследуемого образца на длине волны i при длине оптического пути 2 мм. Поправка, учитывающая поглощение на длине волны возбуждения 337 нм (множитель

(1–10–ОD337)–1 к обоим членам правой части выражения (2)), не вводилась, поскольку её учёт, как следует из (1), не влияет на величину М1. Разложение контуров спектров флуоресценции ГК на составляющие проводилось с помощью стандартной программы Origin 6.

Результаты и обсуждение

Спектры поглощения

На рис. 1 показаны спектры поглощения фракции B + С в зависимости от концентрации ГК. Аналогичные зависимости наблюдались и для других фракций. Из представленных данных видно, что изменение концентрации не меняет формы спектра поглощения. На врезке рис. 1 представлены концентрационные зависимости величин OD для нескольких длин волн фракции B + C. Видно, что закон Бугера–Ламберта–Бэра (БЛБ) хорошо выполняется. Для других фракций при разных длинах волн также наблюдались линейные зависимости величины ОD от концентрации. Полученные зависимости согласуются с данными литературы [1]. Выполнение закона БЛБ в исследованном диапазоне концентраций означает, что свойства ансамбля хромофоров, которые формируют спектры поглощения макромолекул ГК, не претерпевают изменений при изменении концентрации раствора.

Спектры флуоресценции

Влияние эффектов внутреннего фильтра и растворённого кислорода на спектры флуоресценции. Ранее в [41] было показано, что для точного учета ЭВФ в испускании, начиная с величины ОD ~ 0.8, необходимо учитывать конечную геометрическую ширину возбуждающего лазерного луча. Это связано с тем, что поправкой 10ОDi (наиболее широко рекомендуемая коррекция на ЭВФ с использованием закона БЛБ) корректно можно пользоваться только в случае бесконечно узкого возбуждающего луча. В наших экспериментах в диапазоне концентраций ГК 0.5–50 мг/л величина ОD не превышала величин 0.4 и поэтому различием в величинах поправок на эффект внутреннего фильтра, вычисленных с помощью закона БЛБ и точного расчёта, можно было пренебречь. Действительно, например, величины М1 для СГК = 55 мг/л фракции B, вычисленные с помощью поправки по БЛБ и с помощью точного расчёта составили 466.5 и 466.6 нм соответственно. Это различие приблизительно на порядок меньше случайной экспериментальной погрешности определения величины М1. Следует также заметить, что в интервале концентраций ГК 0.5–5 мг/л, в котором изменения величин М1 наиболее значительны (см. далее рис. 4), поправками на поглощение вообще можно пренебречь, поскольку при этих концентрациях внесение поправки на ЭВФ не превышает 3 % для величины абсолютной интегральной интенсивности и 0.2 нм для величины М1.

Результаты анализа экспериментов по сравнению спектров флуоресценции ГК при наличии и отсутствии воздуха (барботирование аргоном) показали совпадение параметров спектров флуоресценции ГК (интегральная интенсивность, форма контура). Отсутствия влияния растворённого кислорода можно было ожидать, поскольку типичные времена флуоресценции ГК составляют не более нескольких наносекунд [23, 42] и поэтому наличие О2, концентрация которого в воде при Т = 293 K составляет ~ 2.9*10–4 М [43], не может оказывать заметного влияния на спектральные параметры флуоресценции ГК в водных растворах.

Зависимость спектров флуоресценции фракций ГК от концентрации. На рис.2, а показаны экспериментально наблюдаемые спектры флуоресценции фракции C+D для нескольких концентраций; на рис.2б - спектры флуоресценции для тех же концентраций, корректированные по формуле (2), и на рис.2, в - нормированные спектры флуоресценции, показанные на рис.2, б. Из представленных спектров видно, что для данной фракции при возрастании концентрации ГК заметно растёт «плечо» на ~ 490 нм. Аналогичные трансформации спектра – возрастание вклада красной части спектра при росте концентрации ГК - наблюдались и для других фракций.

Разложение представленных на рис. 2, б контуров на две составляющие (рис. 3) показывает, что с ростом концентрации возрастает интенсивность длинноволновой компоненты. Кроме того, с увеличением концентрации наблюдается длинноволновый сдвиг всех компонент (см. врезку на рис. 3). Рост интенсивности длинноволновой компоненты и длинноволновой сдвиг обеих компонент с увеличением концентрации должен приводить к росту величины М1 общего спектра флуоресценции, что и наблюдается в эксперименте (рис. 4). Наблюдаемый рост величины М1 может быть обусловлен двумя причинами: увеличением вклада в общую интенсивность длинноволновой составляющей и длинноволновым сдвигом обеих компонент. Здесь следует заметить, что рост величины М1 может быть обусловлен и только возрастанием вклада интенсивности длинноволновой компоненты при независимости от концентрации положения максимумов спектров флуоресценции всех составляющих компонент.

Из представленных данных на рис. 4 видно, что концентрационные зависимости М1 могут быть двух типов: с плато (фракции С + D, В, А) и без плато (фракции В + С, не фракционированная ГК). Кроме того видно, что для всех фракций характерно неравномерное возрастание М1 с увеличением концентрации ГК: наиболее значительные изменения величина первого момента претерпевает до концентраций ~ 5 мг/л.

Возрастание величины М1 с увеличением концентрации наблюдалось и в водных растворах ГК при pH 6.5 (СNaOH = 0, не фракционированный образец). Этот факт является аргументом в пользу того, что наблюдаемые сдвиги не являются следствием взаимодействия молекул ГК с примесями, которые могут быть в щелочи. Таким образом, окончательно заключаем, что именно рост концентрации ГК сопровождается длинноволновым (батохромным) сдвигом спектра флуоресценции.

При С ~ 50 мг/л (рис. 4) абсолютные величины М1 для разных фракций различаются. Это различие можно понять, если принять, что спектры флуоресценции разных фракций ГК обусловлены флуорофорами разной химической природы. Действительно в [37] было показано, что с ростом веса фракции возрастает доля высокомолекулярных гомологов жирных кислот, а в [38] было установлено, что фракция С + D имеет наименьшее содержание аминокислот. Наконец авторы [44], анализируя данные изучения спектров электронного, ИК-поглощения и 13С ЯМР, также приходят к заключению о различной химической природе разных по весу фракций ГК. Это различие заключается в том, что ароматичность макромолекул фракций ГК возрастает с уменьшением веса фракции. Аналогичный вывод следует и из результатов работы [20]. В этой работе было показано, что спектр флуоресценции более легкой фракции ГК находится в более длинноволновой области спектра. Наши данные подтверждают результаты работы [20]: величины М1, при которых наблюдаются плато, с уменьшением веса фракции возрастают, т.е. спектры флуоресценции легких фракций относительно тяжёлых претерпевают батохромный сдвиг.

На рис. 5 показана зависимость величины M1 = M1Сгк=50мг/л - M1Сгк = 0.5мг/л от величины среднего молекулярного веса фракции ГК. Из этой зависимости следует, что изменения величины М1 уменьшаются с ростом веса фракции ГК.

Возможная природа изменения М1

Основной экспериментальный результат заключается в том, что при возрастании концентрации фракций ГК наблюдается рост величины М1. Интерпретация наблюдаемых зависимостей априори возможна в рамках следующих гипотез: а) образование эксимеров (эксиплексов); б) образование жестких сфероколлоидов; в) образование ассоциатов. Рассмотрим каждую из них.

Образование эксимеров. Действительно наличие таких молекулярных образований (комплекс из электронно возбуждённой и невозбуждённой молекул) при возрастании концентрации ГК способно объяснить батохромный сдвиг спектра флуоресценции – спектры флуоресценции эксимеров всегда находятся в более длинноволновой области спектра, чем спектры исходных мономерных молекул [45,46]. Однако для образования эксимеров необходимым условием является близость времён жизни флуоресценции ГКфл и времени образования эксимера обр. Величина фл составляет ~ 10-8 с [23,42]. Время образования эксимера величина, определяемая как обр ~ (Kбим*СГК)-1, для концентрации ГК 1мг/л при средней массе молекулы ГК ~ 50 кДа и Kбим ~ 10-10 М–1с–1, составляет ~ 5*10–3 с, т.е. на несколько порядков превышает время жизни флуоресценции. Таким образом, условие фл ~обр не выполняется и поэтому гипотезу о возможном образовании эксимеров (эксиплексов) можно считать неприемлемой.

Образование жестких сфероколлоидов в результате скручивания мономера. Как уже было указано во введении, возможность образования сфероколлоидов при возрастании концентрации ГК ранее обсуждалось в [2-5]. В рамках этих представлений наблюдаемое плато в зависимости величины М1 от концентрации ГК могло бы объясняться только ростом числа сфероколлоидов (при независимости формы сфероколлоида от концентрации), а наблюдение роста величины М1 – при зависимости формы сфероколлоида от концентрации. Однако, если попытаться в рамках гипотезы об образовании сфероколлоидов количественно оценить расстояния, при которых макромолекулы ГК должны испытывать взаимодействие друг с другом, в результате которого происходит закручивание мономера, то возникает заметное противоречие с современным знанием о расстояниях, на котором возможно межмолекулярное взаимодействие. Действительно, значительные изменения величины М1 при возрастании концентрации ГК происходят уже в диапазоне концентраций до 1 мг/л. Для этих концентраций среднее расстояние R между центрами ближайшими соседей макромолекул ГК составляют порядка 400 нм. (Для оценки величины R взяли самую лёгкую фракцию С + D, концентрацию 1 мг/л, средний молекулярный вес 15 кД, средний вес одного атома 10Д, а расстояние между ближайшими соседями R при концентрации макромолекул [С] оценивалось по формуле R = 1.28*[C]-1/3 [47]). Это расстояние на 2 порядка превышает размер самой макромолекулы (~ 4 х 4 нм, если считать её плоской и, если принять, что расстояние между атомами составляет ~ 0.1 нм). Общепринятый физический механизм, который позволяет описать взаимодействие двух молекул в полярных средах на таких расстояниях, отсутствует. Отсюда заключаем, что с помощью гипотезы об образовании жестких сфероколлоидов в результате скручивания мономера объяснить наблюдаемые концентрационные изменения величины М1 также не представляется возможным.

Образование ассоциатов может происходить благодаря процессу агрегации мономерных макромолекул ГК. В рамках этой гипотезы изменения величины М1 (рис. 4, для фракций B + C и нефракционированная) можно объяснить, если принять, что ассоциат (димер, тример и т.д.) имеет длину волны флуоресценции, отличную от мономера. Действительно в этом случае величина М1 будет меняться во всём исследованном интервале концентраций ГК, поскольку соотношение концентраций ассоциатов разного стехиометрического состава будет зависеть от общей концентрации молекул. Наличие плато в зависимости величины М1 от концентрации для этих фракций (фракции А, B и C + D) можно объяснить тем, что параметры флуорофоров из-за особенностей структуры макромолекулы ГК не претерпевают изменений уже после образования димеров. Таким образом, в рамках гипотезы ассоциатов объяснение концентрационной зависимости М1 не встречает принципиальных противоречий и следовательно из представленных гипотез объяснения наличия зависимости М1 от концентрации ГК в рамках флуоресцентного эксперимента предпочтение следует, по-видимому, отдать гипотезе ассоциатов. Ниже рассматриваются возможные конкретные физические причины, объясняющие зависимость величины М1 от концентрации ГК.

Природа сдвига спектра флуоресценции ГК при увеличении концентрации

При интерпретации концентрационной зависимости первого момента спектров флуоресценции ГК в зависимости от концентрации мы принимаем, что с ростом концентрации ГК в результате гидрофобных взаимодействий имеет место агрегация мономеров. Ранее на возможность такого процесса было указано в [14, 15, 25, 26]. Структура ассоциата ГК такова, что доля полярных фрагментов непосредственно контактирующих с водой и другими полярными группами ГК становится большей, чем в мономере и ассоциат приобретает более мицеллоподобные свойства, чем это было в мономере. В качестве меры мицеллоподобия может служить, например, доля неполярных фрагментов ГК, непосредственно контактирующих с растворителем или размер псевдомицеллярного микродомена [29].

Изменения величин М1 в спектрах флуоресценции ГК при их ассоциации можно связать с двумя факторами: 1) конформационными изменениями флуорофора и 2) изменениями полярности микроокружения флуорофора.

Конформационные изменения флуорофора могут быть связаны с тем, что благодаря процессу ассоциации исходное состояние структуры макромолекулы незначительно деформируется из-за перераспределения электронной плотности внутри молекулы. Физическими факторами, которые при ассоциации могут вызывать эти изменения, являются диполь-дипольное взаимодействие, электростатическое взаимодействие и Н-связь, как это имеет место, например, в водных растворах белков [48]. Перераспределение электронной плотности в молекуле ГК может приводить к изменению углов между ковалентными связями или благодаря незначительному изменению расстояния между атомами (на пример в результате изменения энергии одной или нескольких внутримолекулярных Н-связей при агрегировании).

В настоящее время затруднительно указать, что эти структурные изменения будут приводить именно к батохромному сдвигу полосы флуоресценции ГК. Априори равновероятно, что в результате ассоциации перераспределение электронной плотности на хромоформных группах может приводить как к батохромному, так и к гипсохромному сдвигам спектра флуоресценции ГК. Для окончательного заключения необходима исчерпывающая дополнительная информация о химическом строении флуороформных групп, об их конкретном расположении в структурном «скелете» макромолекулы ГК, о типе взаимодействия и изменении их величины между структурными элементами внутри одной молекулы при изменении макроструктуры ГК т.д. Однако в качестве одной из возможных физических причин, приводящих к батохромному сдвигу спектра флуоресценции, фактор изменения структуры флуорофора вполне реален. Этот фактор может иметь место независимо от того, меняется или не меняется полярность микроокружения флуорофора.

Влияние изменения полярности микроокружения флуорофора на величину М1. Под микроокружением понимаются ближайшие соседи, которые способны оказывать влияние на флуорофор за счёт межмолекулярного взаимодействия (дисперсионные силы и Н-связь). В результате ассоциации флуорофоры могут оказаться в отличном от мономерного микроокружении. Возможность такой ситуации легко представить, если учесть, что структура ГК способна образовывать многочисленные хелатные соединения с ионами Mg2+, Ca2+, Fe2+ и т.д. [49]: при ассоциации могут возникнуть новые хелатные образования и флуорофор может оказаться в изменившемся микроокружении. Другой причиной, приводящей к изменению микроокружения флуорофора в результате ассоциации, несомненно является действие гидрофобных взаимодействий, которые благодаря свойству амфифильности макромолекулы ГК, будут способствовать «выстраиванию» полярных и неполярных структурных фрагментов, т.е. формированию мицеллоподобных конформаций. В результате флуорофор, например, находившийся в полярной части молекулы, может оказаться в ещё более полярном микроокружении, а флуорофор, находившейся в неполярной части, может иметь ещё более неполярное микроокружение.

Полярность микроокружения (среды) влияет на положение спектра флуоресценции [32, 33]. Это связано с тем, что уровни энергии основного и возбуждённого состояний, между которыми происходит радиационный переход, в зависимости от изменения полярности микроокружения претерпевают разную величину сдвига. Изменение положения спектра флуоресценции в зависимости от полярности среды зависит от типа электронного перехода: при увеличении полярности окружения флуорофора его спектр флуоресценции претерпевает батохромный сдвиг, если он определяется типом и наблюдается гипсохромный сдвиг, если спектр определяется флуорофорами, имеющими n тип [32, 33]. (Следует также заметить, что специфические донорно-акцепторные, электростатические взаимодействия и образование Н-связей флуорофора одной молекулы с полярной группой другой молекулы будут приводить к батохромным сдвигам спектров флуоресценции ГК, если он имеет тип и к гипсохромному сдвигу, если он имеет n тип [32]). Конкретные указания на тип флуорофоров, которые обуславливают флуоресценцию макромолекул ГК, в литературе отсутствуют. На этот счёт имеются лишь общие соображения о том, что флуоресценция ГК в видимой области может быть обусловлена как, так и n типами электронных переходов [16, 17].

Таким образом, в рамках модели образования ассоциатов факторы конформационного изменения структуры гуминовых кислот и изменения полярности микроокружения флуорофора позволяют непротиворечиво объяснить наблюдаемые концентрационные зависимости величин М1. Наличие двух факторов не позволяет делать однозначные выводы о характере конкретных структурных изменений в водных растворах ГК.

Например, в случае, если изменения интенсивности флуоресценции ГК определялись бы только изменениями полярности микроокружения, то при правильности выбранной нами модели агрегации ГК и, принимая во внимание то, что квантовые выходы флуоресценции флуорофоров, имеющих тип значительно выше, чем квантовые выходы флуорофоров, имеющих n тип [32,33], из наблюдения батохромного сдвига спектра флуоресценции при увеличении концентрации ГК можно было бы сделать вывод о том, что большая часть флуорофоров в структуре ГК находится в полярном окружении. Действительно в этом случае флуорофор, находившийся в полярной части молекулы, окажется в ещё более полярном микроокружении, а флуорофор, находящийся в неполярной части, попадёт в ещё более неполярное микроокружение. Соответственно спектр флуоресценции «первых» будет претерпевать батохромные сдвиги, а спектр флуоресценции «вторых» будет претерпевать гипсохромные сдвиги. Поскольку экспериментально наблюдается суммарное изменение спектра флуоресценции от изменения состояния всех флуорофоров, то общее изменение спектра будет обусловлено компонентой с большей интенсивностью, которой и является компонента, претерпевающая батохромный сдвиг, т.е. та, которая определяется флуорофорами, находящимися в полярной части макромолекулы ГК. Однако такое важное заключение не может считаться корректным, поскольку исходная предпосылка не принимала во внимание наличие возможного влияния структурного фактора. Действительно знак влияния каждого из факторов может быть противоположным и, поскольку оба имеют место одновременно, то в результате влияние каждого из них может вуалироваться и даже может быть вообще не регистрируемым. В связи с этим наблюдение заметного батохромного сдвига спектра флуоресценции в диапазоне концентраций 0–5 мг/л для всех фракций может являться лишь одним из возможных частных случаев наблюдения влияния изменения концентрации на спектр флуоресценции ГК (например, только конформационные изменения). Другой частный случай (независимость величины М1 от концентрации ГК при СГК > 10мг/л) реализуется для не фракционированного образца ГК и фракции B + С. В этом случае, для этих образцов кроме предложенной ранее интерпретации независимости М1 от концентрации, возможна и такая, согласно которой, суммарное действие обоих факторов в этой области концентраций отсутствует.

Можно полагать, что в случае, когда фактор изменения структуры ГК с ростом концентрации будет превалирующим во влиянии на спектр флуоресценции, то будут наблюдаться и гипсохромные сдвиги. Также возможна ситуация наблюдения гипсохромных сдвигов, если флуорофоры находятся преимущественно в неполярной части ГК, а фактор влияния деформации структуры ГК на флуорофор либо мал, либо приводит к гипсохромному сдвигу спектра флуоресценции. Наконец возможна ситуация, когда зависимость величины М1 от концентрации ГК будет не монотонна. Например, это будет в случае, если влияние первого фактора «положительно» и уменьшается с ростом концентрации, а влияние второго «отрицательно» и растет при увеличении концентрации.

В виду указанной неопределённости влияния указанных факторов на спектр флуоресценции ГК однозначная интерпретация данных, представленных на рис. 5, в рамках даже одной модели ассоциации также не представляется возможной. Например в качестве одного из возможных объяснений большего изменения величины М1 для малых по весу фракций относительно больших в предположении, что спектр определяется типом электронных переходов и флуорофор находится в полярном микродомене, может заключаться в том, что малые макромолекулы ГК при образовании ассоциатов претерпевают либо большие структурные изменения самой макромолекулы, которые приводят к батохромному сдвигу спектра флуоресценции, либо большее увеличение полярности микроокружения исходного состояния флуорофоров, либо одновременно имеют место обе указанные возможные причины. Другое возможное объяснение – структурные изменения при увеличении концентрации отсутствуют, а меняется только микроокружение флуорофора (например образование сендвичевых (пластинчатых) структур), которое у малых по весу фракций претерпевает большие изменения.

Полученные данные можно интерпретировать как с традиционной точки зрения на структуру ГК (заряженный полимер), так и с точки зрения супрамолекулярной модели, согласно которой структура ГК представляет собой образование из сравнительно небольших молекул, стабилизированных гидрофобными силами. Таким образом, отдать предпочтение в пользу какой-либо модели на основании результатов по наблюдению концентрационной зависимости спектров флуоресценции фракций ГК не представляется возможным.

Заключение

Полученные в настоящей работе спектроскопические данные и сделанные на их основе выводы о структурных изменениях макромолекулы ГК в зависимости от концентрации не противоречат ранее полученным заключениям о том, что рост концентрации сопровождается ассоциацией, а её эффективность зависит от веса исходного мономера [2, 29, 50]. Наличие концентрационной зависимости структуры макромолекулы ГК означает, что нужно с осторожностью использовать обычно применяемый метод получения информации о константах связывания различных поллютантов с ГК при помощи экспериментов по наблюдению тушения их флуоресценции макромолекулами ГК [33–35]. В этих экспериментах структура молекулы-тушителя (ГК) для каждой концентрации индивидуальна и следовательно реально тушение проводится разными по своей структуре макромолекулами. Это обстоятельство неизбежно может вносить неконтролируемые погрешности в получаемые таким способом константы связывания. Не исключено, что в ряде экспериментов именно этой причиной и объясняется отсутствия линейных зависимостей в экспериментах по наблюдению зависимостей Штерна–Фольмера. Таким образом, для получения достоверных констант связывания необходима предварительная информация о концентрационной зависимости макроструктуры ГК.

Следует подчеркнуть на сложность получения такой информации, основываясь только на данных по флуоресценции, поскольку спектры флуоресценции ГК являются мультипараметрической функцией, в которой аргументами являются размер мономера ГК, подвижность звеньев макроструктуры ГК, полидисперсность самого образца ГК и т.д., а для водных растворов рН и ионная сила. Наконец заметим, что применение представлений о том, что величина М1 пропорциональна только степени ароматичности в молекуле, как это имеет место для простых молекул [32], для интерпретации данных по концентрационной зависимости спектров флуоресценции макромолекул ГК заведомо не корректно.

Авторы искренне признательны О. А. Трубецкому и О. Е. Трубецкой за любезное предоставление образцов фракций ГК, Н. М. Бажину, В. Ф. Плюснину за критические замечания при обсуждении и фонду ИНТАС 01– 0186 за финансовую поддержку.

Список литературы

1. Д.С. Орлов. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. Москва: МГУ. 1990. c.325.
2. K.Ghosh, M.Schnitzer. // Soil Science,129, 5 (1980) 266.

3. W. Flaig, H. Beutelspresher. // Isotopes and Radiation in soil organic matter studies. International Atomic Energy Agency. Vienna. 1968.

4. Д.С.Орлов, Н.Горшкова. // Научные доклады высшей школы. Биол.науки,. 1б (1965) 207.

5. S.A. Visser. // J.Soil Sci., 15 (1964) 202.

6. P.N.Mukherjee, A.Lahiri. // Fuel, 112 (1958) 220.

7. E.L.Piret, R.G.White, H.C.Walther, A.J.Madden. // Sci. Proc. Dublin Soc.Ser., 1A, (1970) 69.

8. K.Ghosh, S.K.Mukherjee. // J.Appl.Polym.Sci., 15 (1971) 2073.

9. S.U.Khan. // Soil Sci., 112 (1971) 410.

10. R.L.Wershaw, P.J.Burcar, C.L.Sutula, B.J.Wiginton. // Science,157 (1967) 1429.

11. Ю.А.Чисмаджев.// Соросовский образовательный журнал, 2000 (8) 12.

12. И.С.Рыжкина, К.М.Еникеев, А.П.Тимофеев и др. // ЖСХ, 2005 (46) 70.

13. A.Piccolo, S.Nardi, G.Conchery. // Chemosphere, 1996 (33) 595.

14. P.Conte, A.Piccolo. // Develop.Soil Sci., 2002 (28A) 409.

15. R.L.Wershaw. // J.Contam.Hydrol., 1986 (1) 29.

16. N.Senesi, T. Miano, M.Provenzano, G.Brunetti. // Soil Science, 152 (1991) 259.

17. A.Zsolnau, E.Baigar, M.Jimenez. // Chemosphere, 38, 1 (1998) 45.

18. Н.Л. Лаврик, М.И. Дергачева, Е.И.Ковалёва. // Химия в интересах устойчивого развития, 8, 6 (2000) 815.

19. Н.Л. Лаврик, А.М. Сагдиев, М.И.Дергачева. // Там же. 12, (2004) 451.

20. O.Trubetskaya, O. Trubetskoj, G.Guyot, F.Andreux, C.Richard. // Organic Geochemistry, 33, 3 (2002) 213.

21. Н.Л. Лаврик, В.М. Андреевский, Ю.Я.Маркушин, М.И.Дергачева. // Химия в интересах устойчивого развития, 7 (1999) 175.

22. Н.Л. Лаврик. // Там же.11 (2003) 751.

23. C.H. Loshmuller, S.S.Saavedra. // Anal.Chem., 58 (1986) 1978.

24. Н.Л.Лаврик, М.И.Дергачёва. // Химия в интересах устойчивого развития, 13 (2005) 79.

25. M.J.Morra, M.O.Corapcioglu., R.M.von Wandruszka. // Soil Sci. Soc.Am.J., 54 (1990) 1283.

26. M.M Pushalski, M.J.Morra, R.M von Wandruszka. // Envir Sci.Technol., 26 (1992) 1787.

27. J.J.Mobed, S.L.Hemmiingsen, J.L.Auttry, L.B.McGown. // Envir.Sci.Tech., 30 (1996) 3061.

28. L.Klapper, D.M.McKnicht, J.R.Fulton, E.L.Blunt-Harris, K.P.Nevin, D.R.Lowly, P.G.Hatcher. // Envir.Sci.Tech., 36 (2002) 3170.

29. R.R.Engebretson, R.von Wadruszka.// Org.Geochem. 1997 (26) 757.

30. Т.Э. Хомутова. Автореферат диссертации на соискания степени кбн. Москва.1996. 17С.

31. M.Provenzano, T.Miano, N.Senesi. // Science Total Environment, 81/82 (1989) 129.

32. С.Паркер. Фотолюминесценция растворов. М. Мир.1972. с.510.

33. Д.Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии.// Москва. Мир. 1986, с.496.

34. T.D.Gauthier, E.C.Shane, W.F.Guerin, W.R.Seitz, C.L.Grant. // Envir.Sci.Technol., 1986 (20) 1162.

35. S.Chen, W.Inskeep, S.Williams, P.Calls. // Envir. Sci.Technol., 28 (1994) 1582.

36. K.M.Danielsen, Yu.Chin, J.Butterbauch, T.Gustafson, S.Traina. // Envir.Sci.Technol., 29 (1995) 2162.

37. O.A.Trubezkoj, O.E. Trubezkaya. // Finnish Humus News, 3 (1991) 347.

38. O.A.Trubezkoj, O.E.Trubezkaya, G.V.Afanas`eva, O.I. Reznikova, C.Saiz-Jimenez. // J.Chromatography A, 76 (1997) 285.

39. O.E.Trubezkaya, O.I.Reznikova, G.V.Afanas`eva, L.F.Markova, T.A.Muranova, O.A. Trubezkoj. // Environment International, 24, 5/6 (1998) 573.

40. Н.Л.Лаврик, И.А. Августинович. // Журн. физ. хим., 54, 6 (1986) 1216.

41. Н.Л.Лаврик, Ю.Я.Ефимов, Н.У.Муллоев. // Журн.прикл.спектроскопии, 2006. В печати.

42. L.B.Gown. // Appl.Spectrosc., 51 (1997) 921.

43. Handbook of Photochemistry. // Margel Dekker. Inc. NY* Basel* Hong Hong. 1993. p.420.

44. I.Christl, H.Knicker, I.Kogel-Knaber, R.Kretzschmar. // European J. Soil Science, 51 (2002) 617.

45. N.L.Lavrik, O.V.Nechaev. // Phys.Chem.,124 (1988) 273.

46. Е.И.Капинус. // Фотоника молекулярных комплексов. Киев. Наукова думка.1988.256с.

47. N.L. Lavrik, V.P.Voloshin. // J.Chem.Phys., 101 (2001) 1203.

48. Я.Кольман, К.-Г.Рём. Наглядная биохимия. Москва. Мир.2004.470с.

49. А.Ю.Кудеярова. // Агрохимия, 8 (2004) 66.

50. J.P.Hasset, M.A.Anderson. // Water Research., 1982 (16) 681.

Рис.1.

Рис.2.

Рис.3.

Рис.4.

Рис.5.

Подписи к рисункам.

Рис.1. Концентрационные зависимости спектров поглощения образца фракции B + С: а – 0.5 мг/л; б – 1 мг/л; в – 2.5 мг/л; г – 5 мг/л; д – 10 мг/л; е – 20 мг/л; ж – 30 мг/л; з – 40 мг/л; и – 50 мг/л. d = 0.5 см. Т = 295 K. На врезке: Зависимости оптической плотности образца фракции B + С от концентрации: 1 - = 410 нм; 2 - = 450 нм; 3 - = 550 нм.

Рис.2. Спектры флуоресценции фракции С + D: A – экспериментальные спектры флуоресценции. Б - корректированные спектры флуоресценции по формуле (2). В – нормированные корректированные спектры. 0 – спектр флуоресценции раствора щелочи; 1 – СГК = 0.5 мг/л; 2 – СГК = 1 мг/л; 3 – СГК = 2,5 мг/л. Т = 295К.

Рис.3. Концентрационная зависимость компонентов спектров флуоресценции, представленных на рис. 2: а – СГК = 0.5 мг/л; б – СГК = 1 мг/л; в – СГК = 2,5 мг/л. Квадраты – эксперимент; короткий пунктир – первая компонента; длинный пунктир – вторая компонента. Сплошная линия – сумма двух компонент. На врезке: концентрационная зависимость положения максимумов компонент спектра флуоресценции. Квадраты – первая компонента; кружки – вторая компонента.

Рис.4. Концентрационные зависимости величин М1 спектров флуоресценции фракций ГК:

а – фракция С+D; б – фракция B+С; в – фракция B; г – фракция А; д – не фракционированная ГК.

Рис.5. Зависимость величины M1 = M1Cгк=50мг/л – M1Сгк = 0.5мг/л от среднего значения массы макромолекул ГК.