Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Васильев
Игорь Анатольевич
КОРРЕКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В МОДЕЛИ НАРУШЕНИЙ ВЕНОЗНОГО КРОВОТОКА
14.01.18. – нейрохирургия
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научный руководитель:
д.м.н., проф. Ступак Вячеслав Владимирович
Научный консультант:
чл.-корр. РАМН,
д.м.н., проф. Черных Елена Рэмовна
Новосибирск – 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11
1.1. Патогенез нарушений церебрального кровообращения 11
1.2. Нарушение венозного кровотока при удалении менингиом в области средней трети верхнего сагиттального синуса 20
1.3. Экспериментальные модели сосудистых поражений головного мозга 26
1.4. МСК в лечении очаговых повреждений головного мозга у экспериментальных животных 29
1.4.1. Регенеративный ответ в ЦНС как новая мишень в лечении повреждений головного мозга 29
1.4.2. МСК как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга 30
1.4.3. Влияние МСК на неврологическое восстановление в моделях ишемического инсульта 33
1.4.4. Механизмы, лежащие в основе эффекта МСК 34
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
2.1. Объект исследования 37
2.2. Методика моделирования очагового нарушения венозного кровообращения головного мозга у экспериментальных животных 39
2.3. Характеристика сформированных групп 41
2.4. Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока 45
2.4.1. Оценка неврологического статуса животных 46
2.4.2. Электрофизиологическая активность головного мозга крыс 48
2.4.3. Магнитно-резонансная томография головного мозга крыс 49
2.4.4. Морфологическое исследование головного мозга 50
2.5. Генерация мезенхимальных стромальных клеток 51
2.6. Статистическая обработка полученных результатов 52
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 53
3.1. Морфо-функциональная характеристика созданной экспериментальной модели очага нарушения венозного кровообращения головного мозга 53
3.1.1. Характеристика общего состояния и неврологических выпадений при самопроизвольном восстановлении функции головного мозга животных 53
3.1.2. Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока 60
3.2. Влияние МСК на восстановление неврологических выпадений крыс при экспериментальном очаговом повреждении головного мозга, вызванном нарушением венозного кровотока 76
3.3. Влияние МСК на электрофизиологическую активность головного мозга в модели очагового нарушения венозного кровообращения 83
3.4. Влияние МСК на характер морфологических изменений в модели очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока 89
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98
ВЫВОДЫ 103
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 105
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
ВВЕДЕНИЕ
Поражение головного мозга (ПГМ) в результате нарушения мозгового кровообращения представляет серьезную медико-социальную проблему и наносит огромный экономический ущерб обществу, поскольку является причиной экстренной госпитализации, длительной инвалидизации и в развитых странах занимает третье место среди причин смертности взрослого населения после онкологических заболеваний и сердечной патологии [19, 24, 49, 70, 119].
Лидирующая позиция в структуре сосудистых заболеваний головного мозга принадлежит ишемическим инсультам, которые встречаются в 70–80% случаев, 20–30% приходится на долю геморрагических инсультов и 5 % в структуре цереброваскулярных патологий занимают субарахноидальные кровоизлияния [23].
Наряду с нарушениями артериального кровообращения серьезную проблему – в связи со сложностью диагностики, недостаточной изученностью патогенеза и отсутствием эффективных методов лечения – представляют нарушения венозного кровотока, обусловленные венозными кровоизлияниями, тромбозами мозговых вен и тромбозами синусов. В последнее время этой патологии было посвящено немало работ [22, 32, 41, 57, 61, 79, 98, 121, 215, 221, 122, 145, 146, 196, 215, 221].
Вместе с этим, развитие очаговых церебрально-васкулярных нарушений может быть следствием осложнений хирургического лечения парасагиттальных менингиом, локализованных в средней и задней трети верхнего сагиттального синуса (ВСС) [15, 22, 45]. Это связано с тем, что удаление парасагиттальных менингиом данной локализации нередко ведет к травматизации впадающих в синус крупных венозных коллекторов и развитию обширного венозного инфаркта мозга. Все это нередко приводит у больного к развитию нового или к углублению уже имеющегося неврологического дефицита. Развитие парезов и параличей в конечностях приводит к значительному снижению качества жизни. Об этом свидетельствует тот факт, что после удаления менингиом, растущих из верхнего сагиттального синуса, большое число больных остаются инвалидами. Так, по данным Габибов [15], только 50% больных через 5 лет после операции были практически здоровы и трудоспособны, 15% являлись инвалидами, но могли обслуживать себя, а остальные оставались глубокими инвалидами. Согласно исследованиям [15, 33] до 50% (28,8–47,5%) больных после операции имеют неврологические нарушения, а 18,6% – остаются глубокими инвалидами [7, 45, 78].
Отсутствие эффективных методов лечения при данных поражениях головного мозга побуждает искать новые терапевтические подходы, направленные на стимуляцию процессов репарации нервной ткани. Особая роль в этом направлении отводится клеточным технологиям. Долгое время считалось, что центральная нервная система (ЦНС) не способна к репарации. Однако экспериментальные исследования последних лет показали, что процессы репарации могут наблюдаться в поврежденной ткани ЦНС, причем эти процессы во многом обусловлены образованием новых сосудов, генерацией новых нервных клеток и в значительной степени – реорганизацией нейронной сети (нейропластичность) [224]. Более того, многочисленные экспериментальные исследования показали эффективность клеточной терапии при коррекции неврологических нарушений в моделях повреждения головного мозга сосудистого генеза [1, 85, 113, 206].
Среди различных типов клеток наибольшее внимание в последнее время привлекают мезенхимальные стромальные клетки (МСК), способные стимулировать ангиогенез, активировать нейральные стволовые клетки, оказывать нейротрофическую поддержку и модулировать процессы воспаления [14, 144, 211, 228, 229, 232].
Однако ограниченность моделей очаговых поражений головного мозга сосудистого генеза, среди которых основной является окклюзия среднемозговой артерии, а также отсутствие ясности в отношении оптимальных сроков и путей введения клеток, существенно тормозят развитие клеточных технологий и их трансляцию в клиническую практику.
Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель настоящего исследования.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработать экспериментальную модель очагового церебрального поражения, индуцированного нарушением венозного кровотока, и на основании комплексных исследований оценить влияние мезенхимальных стромальных клеток на морфо-функциональное восстановление головного мозга.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Разработать модель очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока, и оценить характер повреждений головного мозга, тяжесть неврологических расстройств и эффективность их спонтанного восстановления.
2. В разработанной модели исследовать влияние мезенхимальных стромальных клеток на восстановление неврологического дефицита в зависимости от путей и сроков проведения клеточной терапии.
3.Провести сравнительную оценку электрофизиологических параметров головного мозга путем регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов (ССВП) до и после оперативного вмешательства в группах животных с самопроизвольным восстановлением неврологического дефицита и с трансплантацией МСК.
4. В рамках разработанной модели провести сравнительную характеристику патогистологических изменений головного мозга у экспериментальных животных после трансплантации МСК и в группах с самопроизвольным восстановлением.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые показано, что облитерация верхнего сагиттального синуса в средней трети путем его полной биполярной коагуляции с одновременной коагуляцией корковых вен в теменно-височной области у крыс моделирует выраженное ПГМ, которое характеризуется тяжелым неврологическим дефицитом с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся в остром периоде с общемозговой симптоматикой, и низким уровнем спонтанного восстановления.
Установлено, что морфологическим субстратом церебрального повреждения является зона омертвения (некроза) головного мозга, который развивается на фоне выраженного отека и нарушения микроциркуляции в венозном русле по смешанному типу (стазы, тромбозы, кровоизлияния), и впоследствии подвергается рубцовому замещению с кистозной дегенерацией. Формирование очага отека на фоне выключения венозного кровотока при сохранении артериального кровообращения с последующим образованием в зоне повреждения кистозной полости подтверждается также данными магнитно-резонансной томографии (МРТ).
На основе полученных экспериментальных данных разработан новый способ очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровообращения «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга» Патент № 2 432 619 РФ. Авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г.
В разработанной оригинальной модели очагового нарушения церебрального венозного кровотока продемонстрирована безопасность и эффективность трансплантации МСК с целью коррекции неврологического дефицита.
Установлено, что трансплантация животным МСК в разработанной модели не вызывает локальных или системных осложнений и приводит к достоверному улучшению неврологических функций. Положительный эффект трансплантации МСК проявляется при внутривенном и локальном их введении, как в остром, так и в подостром периодах. При этом наиболее эффективным режимом является внутривенное введение клеток и проведение терапии в остром периоде, начиная с 1-х суток с момента формирования очага венозной ишемии.
Клиническая эффективность трансплантации МСК подтверждается данными электрофизиологического обследования. У животных контрольной группы снижение амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов (ССВП) в послеоперационном периоде носит выраженный и стойкий характер. У крыс с трансплантацией МСК с 14-х суток наблюдается возрастание амплитуды ССВП, а к 21-м суткам – восстановление электрофизиологической активности практически до исходного уровня.
На основании исследований морфологических изменений головного мозга животных после трансплантации МСК установлено, что позитивный эффект внутривенного введения клеток ассоциирован с активацией ангиогенеза, подавлением деструктивного отека, дистрофических изменений и воспаления и более эффективной организацией поврежденной ткани (образование компактного глиомезодермального рубца с меньшей кистозной дегенерацией).
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Разработанная модель тяжелых очаговых повреждений головного мозга позволяет оценить безопасность и эффективность различных фармакологических и клеточных воздействий. Данный способ приближен к патогенезу повреждений, связанных с развитием венозного инфаркта, возникающих после травматизации крупных венозных коллекторов и венозных синусов после удаления парасагиттальных менингиом.
Выявленный позитивный эффект трансплантации МСК на восстановление неврологического дефицита у экспериментальных животных в разработанной модели очагового ишемического поражения головного мозга является обоснованием для дальнейшего продвижения клеточных технологий в клиническую практику.
Морфо-функциональные данные в виде ССВП и МРТ-исследования головного мозга свидетельствуют о целесообразности их использования в клинической практике для объективизации эффектов клеточной терапии при очаговых повреждениях головного мозга.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Моделирование поражений головного мозга венозного характера путем биполярной коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области приводит к развитию тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств и низким уровнем самостоятельного восстановления.
2. Морфологическим субстратом в разработанной модели является очаг некроза головного мозга с последующим замещением зоны повреждения рубцовой тканью с кистозной дегенерацией.
3. Трансплантация МСК в разработанной модели является эффективным методом восстановления неврологического дефицита с наилучшим клиническим эффектом при использовании внутривенного режима введения и проведения терапии в ранние сроки, что подтверждается данными клинических, электрофизиологических и морфологических исследований.
Основные положения работы доложены на: Всероссийской научной школе-конференции МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2010 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск, 2010 г.; Заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска. 2011 г.; VII Сибирском физиологическом съезде, г. Красноярск, 2012 г.; VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск 2013 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21-а научная работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах, содержит 32 рисунка, 10 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка использованной литературы, содержащего 241 источник, из них 85 на русском и 156 на иностранных языках.
Личный вклад автора
Автор лично произвел все оперативные вмешательства на животных по моделированию очагового поражения головного мозга венозного характера и отработал методику забора клеточного материала. Весь клинический материал, полученный в эксперименте, проанализирован и статистически обработан автором самостоятельно.
Глава 1. КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Патогенез нарушений церебрального кровообращения
Нарушения венозного кровообращения в головном мозге, вызванные преимущественно тромбозом или сдавлением церебральных венозных синусов, крайне трудны для диагностики в связи с небольшой распространенностью и отсутствием характерной симптоматики поражения. И поэтому механизмы нарушений венозной гемоциркуляции остаются во многом не изученными.
Единственным крупным исследованием тромбоза церебрального венозного синуса (ТЦВС) является завершенное в 2004 году исследование (International Studyon Cerebral Veinand Dural Sinus Thrombosis) [212], охватившее 624 пациента в 89 центрах Европы.
Анализируя патологические факторы, вызывающие нарушения мозгового венозного кровообращения, важно отметить, что многие из них известны как причины расстройства кровообращения в артериальном русле. Это подтверждает взаимосвязь и взаимозависимость артериального и венозного компонентов мозгового кровообращения.
Раннее возникновение очага некроза в какой-либо области мозга при сосудистых заболеваниях объясняли закрытием соответствующего сосуда. При этом в тех наблюдениях, в которых причина образования инфаркта была неясна, чаще всего формирование его считали результатом эмболии мозгового сосуда. Несколько позже было установлено, что параллелизм между анатомическими изменениями мозга и его сосудов отмечается только в небольшом проценте наблюдений.
Основные положения о сосудистой мозговой недостаточности разработаны Corday et al., Denny-Brown [115, 118]. Согласно этой теории, в развитии инфаркта мозга имеют значение не только местные условия кровообращения в мозге (анатомическое состояние сосудов, степень развития коллатерального кровообращения, особенности ангиоархитектоники), но и экстрацеребральные факторы. Среди последних главными являются состояние сердечно-сосудистой системы, кровопотери, перераспределение крови с отвлечением ее от головы. Каждый из факторов может выявить уже имеющуюся недостаточность снабжения кровью мозга, при этом полная закупорка просвета сосуда не является обязательным условием для возникновения инфаркта.
Еще ранее в экспериментальных исследованиях [27, 30] было показано, что в развитии очаговых изменений в головном мозге при перевязке крупной артерии большое значение имеют величина системного артериального давления и состояние коллатерального кровообращения.
В 60-х годах прошлого века были уточнены отдельные положения концепции сосудистой мозговой недостаточности [82, 83, 190, 191]. Было установлено, что у лиц со стенозом внечерепных и внутричерепных отделов артерий мозга повторные неврологические нарушения могут быть обусловлены преходящим внезапным уменьшением кровотока в той или иной области мозга.
Сосудистая мозговая недостаточность в самой общей форме определяется как состояние диспропорции между потребностью и возможностями обеспечения головного мозга полноценным кровоснабжением. Возникновение мозговой недостаточности происходит на фоне неполноценности кровоснабжения мозга вследствие изменений в его сосудистой системе и при дополнительном уменьшении притока крови к мозгу под влиянием экстрацеребральных факторов. В участках мозга с критическим уровнем кровоснабжения требуется усиление мозгового кровотока вдвое в связи с повышением в них неврональной активности [2].
До настоящего времени причина возникновения разных видов инфарктов точно не установлена. Остается открытым вопрос о том, почему при одинаковых условиях в одних случаях возникают белые, а в других красные или смешанные инфаркты [241]. Существуют различные объяснения, но ни одно из них не является исчерпывающим.
Чаще всего белые инфаркты возникают при очень слабо развитом коллатеральном кровообращении. Причины его недостаточности могут быть разными: быстрое наступление недостаточности кровоснабжения, вследствие чего коллатерали не успевают развиться, низкий уровень артериального давления, патологические изменения стенок сосудов [27, 30].
Большинство исследователей считают, что в патогенезе красных инфарктов важную роль играют повышенное артериальное давление и хорошо развитое коллатеральное кровообращение [126]. Некоторые авторы полагают, что возникновение геморрагических инфарктов возможно лишь при неполном или кратковременном закрытии просвета сосуда с последующим восстановлением кровотока [108]. Многие авторы [12] придают значение повышению проницаемости сосудов, находящихся в ишемизированной зоне. Немаловажную роль, как в развитии ишемии, так и восстановлении кровотока, играет фактор внезапности. Верещагин и Колтовер [12] наблюдали развитие обширных геморрагических инфарктов в полушариях мозга в зонах смежного кровообращения при внезапном распрямлении двусторонних перегибов сонных и позвоночных артерий в связи с восстановлением кровотока в них. В редких случаях в механизме развития красных инфарктов ведущим является прекращение или значительное затруднение венозного оттока [53, 138].
Обращает на себя внимание то, что красные инфаркты развиваются только в сером веществе мозга, а при смешанных инфарктах геморрагические участки располагаются также лишь в сером веществе мозга. Этот факт подчеркивает значение в патогенезе инфарктов (помимо приведенных выше факторов) местных условий, в основном ангиоархитектоники. Серое вещество гораздо богаче сосудами, чем белое, при этом в нем особенно обильна сеть мелких сосудов, в которых легче (а потому и чаще) возникают процессы дистонии с последующими диапедезными кровоизлияниями. Кроме того, в сером веществе более высок уровень процессов обмена, поэтому любое нарушение его питания скорее всего выявляется в этих образованиях мозга.
Расхождение во взглядах на патогенез инфаркта мозга, с одной стороны, свидетельствует о сложности и многообразии патогенетических факторов, непосредственно вызывающих их развитие; с другой стороны, эта разноречивость может быть объяснена неоднородностью материалов, анализируемых авторами, и не всегда достаточно полным исследованием мозга и его сосудов, особенно магистральных. Например, Moossy [195], отрицающий роль механизма сосудистой мозговой недостаточности при анализе патогенеза развития инфарктов мозга, исключил все наблюдения с острой сердечной недостаточностью. Другие авторы [81, 99], не исследовав состояние экстракраниальных отделов магистральных артерий головы, делают вывод о преимущественной роли механической закупорки внутричерепных сосудов в возникновении очаговых некрозов мозга.
Регуляторные процессы мозгового кровообращения могут реализовываться лишь при компенсации изменений кровенаполнения в полости черепа. Особую важность при этом имеет связь изменений объемов артериальной, венозной крови и спинномозговой жидкости в полости черепа.
Большая часть крупных мозговых сосудов непосредственно соприкасается с циркулирующим ликвором, формирует единую систему, постоянно изменяющую свой объем. В исследованиях, при которых одновременно регистрировалось ликворное, артериальное и венозное давление, обнаружена более тесная корреляция между венозным и ликворным, чем между артериальным и ликворным давлениями [117]. Это связано с тонкостью стенок вен мозга, их слабым собственным тонусом и нахождением в ликворной среде, что способствует взаимодействию колебаний венозного и ликворного давления [6]. На значительное снижение ликворного давления реагируют прежде всего мозговые вены: они максимально дилатируются [147]. Однако полной идентичности ликворного и венозного давления нет, а их взаимосвязь не является жесткой.
В синусах твердой мозговой оболочки кровяное давление ниже ликворного, а в мозговых венах оно несколько превышает ликворное. В свою очередь ликворное давление превышает артериальное и определяет выраженность венозного компонента пульсовых колебаний спинномозговой жидкости. Колебания внутричерепного давления вызывают быстрые изменения объема венозных сосудов, но до определенных пределов мало влияют на приток артериальной крови в полость черепа. Регулирующая роль венозной системы определяется главным образом ее участием в активном перераспределении давления в сосудистой системе мозга [38]. При этом адекватность компенсаторных механизмов регуляции кровенаполнения мозга зависит от возможностей перераспределения объемов крови в полости черепа и позвоночного канала в максимально короткий срок [55].
Регуляция мозгового кровотока представляет собой сложный процесс поиска оптимального варианта изменения кровообращения для каждой комбинации экзогенных и эндогенных воздействий, а сложность такой системы позволяет предположить, что ведущую и организующую роль в этом процессе играет нервный механизм [39].
В развитии тромбоза синуса участвуют два патогенетических механизма. Первый – это окклюзия церебральных вен, вызывающая отек головного мозга и нарушение венозного кровообращения. Отек может быть цитотоксическим, т. е развивающимся вследствие ишемического повреждения нейронов с нарушением межклеточного транспорта и некрозом тканей мозга, и вазогенным, возникшим вследствие повреждения гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) и проникновения плазмы крови в межклеточное пространство. Вторым звеном патогенеза является развитие внутричерепной гипертензии вследствие окклюзии крупных венозных синусов. В норме цереброспинальная жидкость транспортируется из желудочков мозга через субарахноидальное пространство на основание и конвекситальную поверхность головного мозга, абсорбируется в паутинных сплетениях и оттекает в ВСС. Вследствие тромбоза происходит повышение венозного давления, в результате чего нарушается абсорбция цереброспинальной жидкости, сопровождающаяся внутричерепной гипертензией и формированием синус-тромбозов [17].
Трудности прижизненной диагностики нарушений венозного кровообращения явились причиной ложного представления о низкой частоте встречаемости этой патологии. Однако, в последние годы, становится очевидным, что при нарушениях мозгового кровообращения наиболее важное патогенетическое значение имеют два фактора: недостаточность притока крови к тканям мозга и недостаточность (задержка) венозного оттока. Эти два процесса тесно взаимосвязаны, так как при нарушении кровообращения в артериях мозга в той или иной степени страдает и венозный отток. Равным образом патология вен мозга приводит к нарушению артериальной гемодинамики и метаболизма мозга [9]. До последних лет изучение венозного компонента мозгового кровообращения значительно отставало от исследований артериальной гемодинамики, хотя венозная система мозга – это высокоорганизованная рефлексогенная зона, ответственная за развитие сложных и имеющих важнейшее физиологическое значение компенсаторных реакций, обеспечивающих постоянство мозгового кровотока. Поскольку из общего объема крови около 70% находится в венозном русле, понятна важная роль механизмов, регулирующих венозный отток, в частности от головного мозга. Венозный застой может возникать, как одно из проявлений сосудистой патологии мозга. Рядом авторов показано, что если в артериоле наступает спазм, то в соответствующих капиллярах происходит не опустошение, а заполнение венозной кровью, и клинические симптомы будут обусловлены не ишемией, а стазом [9, 26, 170, 231, 236].
Закупорка артерии тромбом или эмболом может привести к быстрому отеку мозговой ткани и нарушению оттока крови из мозговых вен, вследствие их сдавливания. Кровь из этих вен проникает в область инфаркта.
В последние годы особое значение в формировании внутричерепного венозного застоя придается дистонии и гипотонии церебральных вен. Выявленная богатая иннервация вен мозга доказывает наличие сложных нервнорефлекторных механизмов регуляции венозного тонуса. В развитии венозной циркуляторной дистонии ведущее значение может иметь нарушение центральной регуляции, в частности тонуса вазомоторного центра, его возбудимости и реактивности, приводящее к повышению венозного давления. Вместе с тем, для формирования венозного застоя имеют значение и такие периферические факторы, как изменение транскапиллярного обмена, нарушение микроциркуляции, состояние клапанного аппарата венозной системы [11, 31, 50]. В таких случаях развивается гиперволемический тип венозной гипертонии. Первичным звеном патогенеза при этой форме венозного застоя является нарушение двустороннего тока жидкости ткань-кровь и кровь-ткань. Преобладает переход жидкости и белка из ткани в кровь, что способствует увеличению объема венозной крови. Венозный застой в свою очередь может приводить к вторичным мозговым нарушениям. При затруднении интракраниального венозного оттока и повышении давления в венозной системе мозга наступает компенсаторное сужение мозговых артерий, показывая взаимозависимость уровней сосудистого тонуса и давления в венозной и артериальной системах головного мозга [38, 51]. В дальнейшем была выявлена возможность замедления не только венозного оттока, но и артериального притока при выраженном внутричерепном венозном застое [3]. Подобные реакции артериального русла на венозный застой являются защитным механизмом, предохраняющим мозг от избыточного кровенаполнения в условиях замедленного оттока, но, в то же время, компенсаторные возможности такого механизма защиты имеют свои пределы, после чего возникает субкомпенсация или декомпенсация мозгового венозного кровообращения с развитием своеобразного комплекса клинических проявлений.
Не менее сложен патогенез застойно-гипоксических интракраниальных венозных нарушений, связанных с тромбозом вен и синусов твердой мозговой оболочки и другой интракраниальной патологией. Таким образом, венозный отток, это не пассивный процесс, зависящий только от гидродинамических и гидростатических факторов.
Как обоснованно считает Холоденко [77], венозная энцефалопатия в большинстве случаев не является самостоятельной нозологической формой, а возникает как осложнение других заболеваний при нарушении интракраниального венозного оттока, при этом важно, что клинические и субъективные проявления венозной энцефалопатии часто оказываются более выраженными, чем основное заболевание. Интракраниальный венозный застой с отеком мозга часто развивается при церебральных опухолях. При этом в патогенезе венозных расстройств имеют значение непосредственное сдавление определенного участка венозного русла опухолью, дислокация мозга и сдавление большой мозговой вены и других основных венозных магистралей. Особенно рано развивается повышение внутричерепного давления при опухолях задней черепной ямки, что связано с затруднением оттока крови через яремные вены. Если в онкологический процесс вовлечены полушария большого мозга, нарушение венозного оттока чаще всего связано с реакцией венозных отделов сердечно-сосудистой системы на мозговой опухолевый процесс. Выявляемые изменения свидетельствуют об общей венозной недостаточности, вызываемой интракраниальными расстройствами регуляции нормальных веномоторных реакций организма [6, 46].
Не менее сложен патогенез застойно-гипоксических интракраниальных венозных нарушений, вызванных тромбозом вен и синусов твердой мозговой оболочки, что заканчивается их грубыми структурными нарушениями, прежде всего вследствие расстройств иннервации стенок сосудов с перивенозными кровоизлияниями. Развивающаяся мозговая патология в этих случаях связана с сочетанным воздействием гемодинамических, гуморальных и рефлекторных факторов, что приводит к нарастанию внутричерепного ликворного давления, снижению насыщения крови кислородом и замедлению мозгового кровотока [42]. К гемодинамическим факторам относится затруднение оттока из полости черепа. Гипоксия и гиперкапния приводят к сосудорасширяющему эффекту с повышением проницаемости стенок расширенных и атоничных сосудов, затруднением резорбции ликвора в венозную систему и отеком мягких мозговых оболочек. Рефлекторным фактором являются усиленная и извращенная импульсация от проприорецепторов дыхательных мышц и интерорецепторов, изменение функционального состояния дыхательного центра и других стволовых структур [40, 43].
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что патогенез дисциркуляторной венозной патологии весьма сложен. Многие звенья его развития, особенно динамика ультраструктурных изменений и соответственно метаболизма мозговых структур изучены недостаточно и в чем-то гипотетичны. Многие возникающие проблемы определяются прежде всего уровнем наших знаний о функции, метаболизме и структурно-клеточных особенностях, возникающих при венозных повреждениях мозга. Детальное изучение этой проблемы может иметь важное практическое значение для рационального выбора фармакологических средств, разработки эффективных лечебных мероприятий при различных формах расстройств мозгового венозного кровообращения.
Выраженные морфологические изменения вен мозга при внутричерепном венозном застое наблюдали Leu, Vogt, Pfrunder, Wu, Mansfield, Mannick [179, 237]. По их мнению, именно рассеянность этих изменений и обусловливает многоочаговость, полиморфность неврологических проявлений. Богатые компенсаторные возможности системы кровоснабжения объясняют тот факт, что признаки затруднения венозного оттока даже при длительном его существовании могут быть мало выраженными или отсутствовать. Только при явлениях декомпенсации или при внезапном развитии венозного застоя выявляются его характерные симптомы; некоторые из них отмечены еще Говерсом, впоследствии они были более детально описаны рядом авторов, изучавших венозную патологию мозга [21, 77].
В этиологии вторичных венозных энцефалопатий большую роль играет фактор венозного застоя в мозге вследствие разнообразных причин, воздействующих на интра- и экстракраниальные пути оттока венозной крови.
1.2. Нарушение венозного кровотока при удалении менингиом в области средней трети верхнего сагиттального синуса
Феликс Плетер (Felix Plater) был первым, кто описал экстрацеребральное образование, напоминающее менингиому, еще в 1614 году. Официально термин «менингиома» был предложен Кушингом (Harvey William Cushing, 1869–1939) в 1922 г. [116]. Гистологическая классификация менингиом постоянно пересматривается. Подобному пересмотру подвергается и классификация парасагиттальных менингиом (ПСМ). И хотя сам термин также предложен Кушингом [116], определение вплоть до настоящего времени трактуется неоднозначно [15, 28, 62, 181]. Данные опухоли располагаются вдоль верхнего сагиттального синуса, а также имеют рост из его стенок, способны прорастать просвет синуса, распространяться в одну или обе стороны, формируя частичную или полную обтурацию и вызывая, тем самым, венозные нарушения.
Среди первичных внутричерепных опухолей головного мозга у взрослых менингиомы занимают второе место, составляя от 18 до 34 % [47, 67, 132].
ПСМ встречаются в 18–38 % наблюдений [5, 15, 16, 25, 37, 48, 67, 103, 104, 112, 116, 132, 137, 151, 174, 239]. По данным Российского научно-исследовательского института им. проф. А.Л. Поленова частота встречаемости менингиом ВСС у женщин в 3 раза превышает таковую у мужчин [80].
ПСМ в зависимости от места их локализации принято разделять на менингиомы передней, средней или задней третей ВСС [204]. По данным ряда авторов встречаемость менингиом передней трети ВСС составляет от 18,4 до 31,5 %, средней трети – от 55,0 до 67,2 % и задней трети – от 11,2 до 14,4 % [78]. Подобное распределение менингиом относительно ВСС приводят и другие авторы [5, 65], которые наблюдали менингиомы вдоль средней трети верхнего продольного синуса в 55,0%, вдоль передней – в 31,5% и вдоль задней трети – в 13,5% случаев.
Неврологические нарушения в виде двигательных расстройств у больных с ПСМ наблюдаются на догоспитальном этапе и наиболее часто (у 87,7 % больных) выявляются при менингиомах средней трети ВСС. У пациентов с менингиомами передней и задней трети эти нарушения выявляют редко – в 7,7 и 9,6 % случаев соответственно [80].
Габибов [15] выделяет три формы роста менингиом: шаровидная, инфильтративная и смешанная. При шаровидной форме роста менингиома имеет небольшой по площади матрикс. При инфильтративной форме роста новообразование может поражать не только обширные участки твёрдой мозговой оболочки, синус, серповидный отросток, кости, но иногда и мягкие ткани головы. При смешанной форме роста менингиом возможности радикального удаления новообразования определяются степенью выраженности инфильтративного компонента, обширностью поражения верхнего продольного синуса и серповидного отростка.
Важной особенностью менингиом ВСС является вовлечение опухолью в свой рост костей свода черепа, а именно – образование узураций, эндостоза или гиперостоза. На долю таких локальных изменений в костях свода черепа, по данным ряда авторов, приходится от 16,0 до 30,0 % случаев, а в отдельных публикациях их доля достигает 40,0–43,6 % от общего числа ПСМ [15, 110]. ПСМ, в зависимости от степени вовлечения ВСС в опухолевый процесс, подразделили на 6–8 типов поражения синуса [107, 184, 220]. Можаев [37] предложил 5 вариантов поражения синуса менингиомой. При I варианте опухоль поражает один наружный листок стенки синуса, при II – оба листка или его угол, при III – прорастает одну или две стенки синуса, частично окклюзируя его просвет и распространяясь на серповидный отросток, при IV – прорастает две или три стенки синуса, полностью облитерируя его просвет, распространяется на серповидный отросток, имеет одностороннюю локализацию, при V варианте опухоль окклюзирует синус, прорастая все его стенки, серповидный отросток и имеет двустороннее распространение. Эта классификация наиболее распространена в нашей стране.
Тактика лечения зависит от варианта анатомического строения ВСС и крупных дренирующих вен, а также от локализации и направления роста опухоли в пределах ВСС [16, 37, 68, 72].
Основным методом лечения ПСМ является хирургический. Техника удаления ПСМ достаточно хорошо изучена и описана [15, 29, 44, 59, 67, 73, 74, 75, 76, 94, 178, 183, 239]. Использование микрохирургической техники при удалении менингиом головного мозга значительно увеличивает процент радикального удаления опухолей, уменьшает количество послеоперационных осложнений в виде усугубления неврологического дефицита и позволяет значительно снизить послеоперационную летальность.
Основная задача хирургического лечения ПСМ состоит не только в радикальном удаление самой опухоли, но и в сохранении как ранее существовавших, так и развившихся под влиянием опухоли дополнительных путей венозного оттока [52]. Значимое участие экстрацеребральных вен в коллатеральном венозном кровообращении мозга обусловило необходимость как предоперационного планирования с целью выбора оптимального доступа, так и разделения операции у ряда больных с ПСМ на отдельные этапы [52]. В качестве критерия физиологической дозволенности объёма каждого этапа хирургического вмешательства могут быть использованы данные клинико-физиологического контроля [8, 69] и, в частности, динамика изменений электроэнцефалографии (ЭЭГ) в ходе операции, которые позволяют получить важную информацию, отражающую выраженность перестроек венозного церебрального кровотока.
Особое внимание, по мнению многих нейрохирургов [15, 16, 20, 64, 74], должно уделяться кожному разрезу, поскольку при обтурации синуса кровоток в значительной степени компенсируется через покровы головы. Срединный S-образный разрез при двусторонней локализации менингиом считается оптимальным [20, 180].
При удалении менингиом ВСС важным является степень и целесообразность резекции ВСС в том или ином случае [109]. Так, резекция даже полностью окклюзированного ВСС в его передней трети может привести к глубоким перестройкам венозного кровообращения головного мозга и, тем самым, вызвать развитие грубой неврологической симптоматики в послеоперационном периоде.
Наиболее достоверным доказательством того, что состояние венозного кровотока является одним из главных факторов, обеспечивающих нормальное функционирование жизненно важных центров головного мозга, является тот факт, что даже малейшее отклонение в сбалансированности венозного оттока при хирургическом лечении менингиом и нарушение целостности ВСС приводят к тяжелым осложнениям в послеоперационном периоде, проявляющимся двигательными нарушениями разной степени выраженности [7].
При полной окклюзии ВСС возможно резецировать облитерированный участок с обязательным сохранением компенсаторных вен впереди и кзади от места окклюзии [182, 220]. Но даже в случаях полной обтурации просвета ВСС, особенно кзади от Роландовых вен, резекция его может приводить к развитию тяжёлых неврологических выпадений. Описаны случаи и смерти больного [15, 52].
До сих пор не существует четкой хирургической стратегии при инвазии менингиомы в ВСС. Значительные трудности заключаются в лечении пациентов и с проходимым ВСС. Хирургу в момент операции порой трудно принять решение об удалении той части опухоли, которая находится в полости синуса. Для этого существует две хирургические стратегии: максимальное безопасное удаление опухоли за пределами синуса и агрессивная хирургическая резекция части синуса с последующей его реконструкцией [101, 107, 173, 177, 182, 223].
С целью восстановления физиологического оттока венозной крови через пророщенный опухолью ВСС и предупреждения развития грубых неврологических осложнений в раннем послеоперационном периоде были разработаны различные способы коллатерального шунтирования типа «by pass» или пластического восстановления резецированного участка синуса [107, 124].
Послеоперационная летальность после операций по поводу ПСМ, проведенных в 1956–1962 годах, по данным Габибова [15] составляла 9,3 %. В настоящее время этот показатель составляет от 1,1 % до 3,0 % [16, 66]. анализ летальных исходов, выполненный на материале РНХИ им. проф. А.Л. Поленова, показал, что нарушения венозного оттока вследствие одномоментного выключения из мозгового кровообращения большого количества венозных интракраниальных и экстрацеребральных коллекторов, является основной причиной не только послеоперационной летальности среди больных с ПСМ, но и развития грубого неврологического дефицита. Об этом свидетельствуют результаты оперативного лечения менингиом ВСС. Так, например, в работе Боровковой и др. [60] показано, что основным грозным осложнением в послеоперационном периоде являются грубые стойкие двигательные расстройства. По данным этой работы частота инвалидизации таких больных отмечается в 28,8–47,5 % случаев.
Исследованиями Габибова [15] показано, что только 50 % больных через 5 лет после операции были практически здоровыми и трудоспособными, 15 % остаются инвалидами, но могут обслуживать себя, а 35 % из общего числа прооперированных остаются глубокими инвалидами. Можаев [37] сообщает, что только 48 % больных после операции были здоровыми, 35 % больных остаются инвалидами, но могут себя обслуживать, 17 % больных остаются глубокими инвалидами.
По данным работы Тиглиева и др. [67] полная реадаптация больных с возвращением их к работе в рамках прежней профессии наблюдалась у 26,9 %, оперированных до 1981 года, у 45,8 % – до 1986 года и 79,1 % оперированных после 1987 года. Принимая во внимание то, что двигательные нарушения после удаления ПСМ по данным авторов составляют практически 50,0 %, поиск новых способов лечения очаговых поражений головного мозга остается весьма актуальной задачей и в настоящее время.
Подходы к лечению неврологических нарушений после удаления менингиом.
Как было отмечено выше, практически половина больных после хирургического удаления менингиом ВСС имеет неврологические нарушения, что ведет к снижению качества жизни самих пациентов и создает серьезные проблемы для родственников, которые за ними ухаживают. На сегодняшний день подходы к лечение данного рода пациентов немногочисленны и включают как консервативные, так и хирургические методы.
К терапевтическим методам относятся комплексная медикаментозная терапия (ноотропная, нейрометаболическая, дезагрегационная) с курсами восстановительной терапии, включающей ЛФК и массаж. Неудовлетворенность результатами консервативного лечения очаговой церебральной ишемии послужила причиной поиска альтернативных, главным образом, хирургических методов коррекции мозгового кровообращения.
Одним из предложенных методов хирургического лечения таких патологий было применение сальника.
Экспериментальные исследования показали, что сальник приобретает пластичность, свойство абсорбировать жидкость и микрочастицы, способность к сращению с травмированной и воспаленной поверхностью, к гемостазу, к врастанию и реваскуляризации, к фагоцитозу и иммунологическому реагированию [10, 192, 219]. Экспериментальные исследования доказывают, что между трансплантированным сальником и подлежащим головным мозгом развиваются сосудистые анастомозы, через которые открывается дополнительный источник церебрального кровоснабжения [33, 131, 136, 142, 205]. Экспериментальные исследования также свидетельствуют, что сальник может обеспечить регионарный кровоток мозговой ткани на уровне 75 % от нормального [149].
Рядом авторов описано применение трансплантации сальника при лечении очаговой церебральной ишемии различного генеза: ишемическом инсульте [33, 71, 139, 149, 240]. Снижение неврологического дефицита после трансплантации сальника отмечено в исследованиях [139]. Однако, как свидетельствуют результаты вышеперечисленных литературных данных, трансплантация сальника не позволяет эффективно купировать неврологический дефицит. Кроме этого, применение большого сальника является дополнительной инвазивной манипуляцией, которая увеличивает продолжительность операции и сказывается на общем состоянии пациента.
1.3. Экспериментальные модели сосудистых поражений головного мозга
Моделирование повреждений головного мозга на экспериментальных животных является важным экспериментальным методом нейрохирургических исследований, поскольку позволяет изучать патогенез цереброваскулярных расстройств, обосновать новые терапевтические стратегии и оценить безопасность и клиническую эффективность разработанных приемов лечения.
На данный период времени описано много разнообразных методик по формированию церебральной ишемии головного мозга (ИГМ) у животных, что является бесценным вкладом в изучение патогенеза ИГМ. Доминирующими в экспериментальных работах являются искусственно вызванные нарушения мозгового кровообращения артериального характера, в том числе и глобальная ишемия головного мозга. Имеются отдельные экспериментальные работы по формированию поражений головного мозга, индуцированных смоделированным нарушением и венозного кровотока.
Так, например, Минакина [34, 35] предложила способ формирования глобальной ишемии мозга (ГИШ) у мышей. Для получения ГИШ мышам вводили внутрисердечно 50 мкл 0,5 М водного раствора калия хлорида, который угнетал автоматизм и сократительную способность миокарда вплоть до остановки сердца. Данная модель, по мнению автора, открывает новые подходы для лечения глобальной ишемии мозга и крыс.
В работе Багметова [4] описывается модель преходящей тотальной ишемии головного мозга. Животным (крысам) под наркозом производилось десятиминутное пережатие общих сонных артерий в сочетании с гипотонией (50 мм. рт. ст.), вызванной путем геморрагии методом кровопускания. Тотальная преходящая ишемия головного мозга сопровождается характерными изменениями кровотока в коре головного мозга. В результате окклюзии общих сонных артерий и кровопускания имело место значительное уменьшение локального мозгового кровотока.
Трофименко и др. [36] предложили модель церебральной ишемии у крыс посредством коагуляции средней мозговой артерии (СМА). Оригинальная методика авторов заключалась в следующем: производилось выделение и перевязка шелковой нитью правой общей сонной артерии, далее выполняли разрез кожи по ходу скуловой кости (около 2,5 см) справа. Осуществляли подход к овальному отверстию и отверстию зрительного бугра. В данной области накладывали фрезевое отверстие диаметром 3 мм, обнажали место расположения СМА, последнюю пережигали. После чего восстанавливали топографию мышц и мягких тканей.
Ишемическое повреждение создавали необратимой окклюзией левой ветви СМА и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии [54] для стабилизации размера области поражения. Трепанацию осуществляли на латеральной стороне лобной кости с левой стороны в зоне расположения центрального ствола СМА. Далее проводили необратимую окклюзию левой ветви СМА проксимальнее места ее бифуркации на фронтальную и париетальную ветви, а также рядом расположенной мозговой вены до ее пересечения с артерией. Сразу после коагуляции перевязывали лигатуру, на которой находилась сонная артерия.
Известен способ моделирования фокальной ишемии у наркотизированных крыс путем лигирования СМА через трепанационное отверстие, выполненное в том месте, где артерия пересекает носовую расщелину [225].
Описана модель экспериментального геморрагического инсульта у крыс [84, 135]. Под общим наркозом животное фиксировали на спине и проводили катетеризацию правой бедренной артерии. Далее животное фиксировали в стереотаксической установке, проводили разрез кожи головы, скальпирование черепа и накладывали фрезевое отверстие диаметром 1,0 мм по координатам 0,2 мм кпереди и 3 мм вправо от брегмы. Затем проводили забор 1 мл крови из бедренной артерии животного. Введение аутологичной крови осуществляли на глубину 5,5 мм при помощи иглы с закругленным концом, после чего иглу извлекали и рану ушивали. Данная методика является проверенным и широко используемым методом изучения течения геморрагического инсульта.
Существует ряд способов формирования очагового поражения головного мозга венозного характера [87, 111, 213]. После трепанации черепа тромбоз ВСС головного мозга у крыс индуцировали методом нанесения хлорного железа. При этом сразу после применения хлорного железа на ранних стадиях формировался цитотоксический отек головного мозга, а затем вазогенный отек, связанный с реканализацией ВСС. Настоящая экспериментальная модель, по мнению авторов, проста и легко выполнима.
Описана модель нарушения венозного кровообращения путем окклюзии корковых вен и средней трети верхнего сагиттального синуса у домашних свиней. В среднею треть ВСС вводили баллон, управляемый с помощью катетера, закрывая полностью просвет синуса, после чего проводили дополнительные инъекции 1 мл фибринового клея в ВСС, что приводило к обструкции мостовых и корковых вен. Все эти изменения были подтверждены данными ангиографии [203].
Похожая модель окклюзии ВСС была предложена Wang et al. [88]. Тромбоз у крыс вызывался медленными инъекциями тромбогенного агента в ВВС с помощью микрокатетера, развитие тромбоза подтверждалось МРТ и, по данным авторов, окклюзия сохранялась в течение 4 недель.
Предложен еще один способ тромбоза ВСС у крыс путем эмболизации последнего самодельным пластиковым трансплантатом, который вводился в просвет синуса [133]. Каждый пластиковый трансплантат имел длину 0,4 см, с наибольшим диаметром конического переднего сегмента 0,12 см, а задний сегмент постепенно утончался и уплощался до ширины 0,2 см и длины 0,1 см. По данным авторов, новая модель тромбоза ВСС является легко воспроизводимой и достоверной.
Все вышеперечисленные способы формирования очага поражения головного мозга как артериального, так и венозного характера имеют один общий недостаток – формирование нестойкой неврологической симптоматики, которая в течение недельного времени практически регрессирует. Нам же, с целью изучения влияния МСК на восстановление функции головного мозга при очаговом его поражении, обусловленном венозной ишемией, необходима экспериментальная модель, вызывающая у крыс развитие стойкого и грубого неврологического дефицита.
1.4. МСК в лечении очаговых повреждений головного мозга у экспериментальных животных
1.4.1. Регенеративный ответ в ЦНС как новая мишень в лечении повреждений головного мозга
На протяжении долго времени считалось, что поврежденная нервная ткань не восстанавливается. Тем не менее, исследования 2-х последних десятилетий показали, что ЦНС также подвержена репаративной регенерации, хотя и в меньшей степени, чем другие ткани. Во-первых, выяснилось, что в головном мозге присутствуют нейральные стволовые клетки, которые сосредоточены в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и зубчатой извилине гипокампа [156, 202,]. При повреждении головного мозга эти клетки могут мигрировать в зону повреждения и дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [134, 176]. Во-вторых, стало очевидно, что важнейшим механизмом репарации является реорганизация нейронной сети – т.е. изменение количества и длины нейритов и установление новых синаптических связей – явление, получившее название нейропластичности [216]. Кроме того, обязательным компонентом репарации является восстановление гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и образование новых сосудов за счет ангио- и васкулогенеза [172, 238]. Способность ЦНС к репарации позволила предположить, что репаративный её ответ при сосудистых повреждениях головного мозга может являться новой мишенью терапевтических воздействий. Поэтому за последние годы произошло существенное смещение интереса от исследований в области нейропротекции к исследованиям нейрорегенеративных подходов, среди которых наибольший интерес представляют клеточные технологии. Перспективы использования клеточных технологий связывают, прежде всего, с тем, что данный подход может расширить терапевтическое окно. Вторым моментом является то, что клеточная терапия может быть одновременно направлена против нескольких мишеней, что позволит повысить результативность лечения.
1.4.2. МСК как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга
Выявленное участие НСК в репарации ЦНС послужило основой для экспериментальных исследований, которые в первую очередь были сосредоточены на стволовых клетках (СК). В настоящее время по происхождению СК разделяются на эмбриональные и соматические. Первые выделяют из внутреннего слоя бластоцисты, вторые – из органов и тканей человека (постнатальные СК) или плода (фетальные СК). СК у взрослого человека присутствуют во всех органах и тканях, в том числе ЦНС. Среди них наиболее доступными и изученными являются СК костного мозга, обеспечивающие регенеративный резерв организма [96]. Костный мозг содержит как минимум три типа предшественников – гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), МСК и эндотелиальные предшественники (ЭП). ГСК дают начало всем типам клеток крови, ЭП – клеткам эндотелиального ряда, МСК дифференцируются в клетки мезенхимальных тканей. Среди них МСК привлекают особое внимание в качестве кандидатов для клеточной терапии при повреждениях ЦНС в силу ряда их биологических свойств [208].
МСК были впервые обнаружены отечественным исследователем А.Я. Фридештейом и описаны как адгезивные клетки костного мозга, способные к самообновлению. Свое название они получили благодаря возможности дифференцировки в различные виды клеток (остеоциты, адипоциты, хондроциты и др.) в рамках мезенхимальной линии [140]. Хотя впервые эти клетки были выявлены в костном мозге, впоследствии выяснилось, что МСК могут быть выделены из жировой ткани, скелетных мышц, пульпы зуба, плаценты, амниотической жидкости, вартонова студня и пуповинной крови [171, 197, 209]. Предполагается также, что в организме нативные формы МСК могут быть представлены периваскулярными перицитами, локализованными во всех органах и тканях, а периваскулярные ниши являются естественным микроокружением для МСК в различных тканях [198, 199].
В 2006 году Международное общество по клеточной терапии предложило три «минимальных» критерия для идентификации МСК. Первый – это адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология; второй – характерный иммунофенотип, т.е. более 95 % МСК должны нести на поверхности стромальные маркеры CD105, CD73 и CD90 и менее 2 % – экспрессировать линейные маркеры гемопоэтических клеток (CD45), стволовых кроветворных клеток (CD34) и линейные маркеры лимфоцитов или моноцитов; и третий – способность к трилинейной дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты [193].
Исследование биологической активности МСК показало, что МСК обладают целым рядом привлекательных свойств [102, 189]:
- относительно легко выделяются из различных тканей;
- быстро разращиваются в культуре in vitro;
- обладают низкой способностью к спонтанной дифференцировке при экспансии ex vivo;
- способны мигрировать в очаг повреждения/воспаления, что позволяет использовать не только локальный, но и системный (внутривенный) путь введения клеток;
- иммунологически интертны, что дает возможность использовать не только аутологичные, но и аллогенные МСК;
- обладают противовоспалительной/иммуносупрессивной активностью;
- секретируют множество трофических факторов, способных стимулировать рост различных клеток и обладающих противовоспалительной, антиапоптотической и антифибротической активностями;
- характеризуются достаточно высокой пластичностью и могут в определенных условиях дифференцироваться в клетки тканей экто- и мезодермального происхождения.
Способность МСК к миграции в зону повреждения обусловлена экспрессией этими клетками различных хемокинов и хемокиновых рецепторов. Основными факторами, которые сопровождают любое повреждение и обеспечивают миграцию МСК, являются воспаление и гипоксия [105, 152, 200]. Клетки в зоне повреждения продуцируют различные цитокины, хемокины и ростовые факторы, которые привлекают МСК через взаимодействие с соответствующими рецепторами на поверхности клеток. Ключевая роль в миграции МСК отводится взаимодействию хемокинового рецептора CXCR4 на МСК с его лигандом SDF-1 [128, 175]. В адгезии МСК к эндотелию принимают участие молекулы E- and P-selectin, CD44, и VCAM-1 [185]. Миграция МСК в зону повреждения может также опосредоваться через взаимодействие высвобождаемого апоптотическими и некротическими клетками фактора роста гепатоцитов (HGF) с рецептором c-Met на МСК [148].
Иммуносупрессорные свойства МСК были впервые обнаружены по способности этих клеток ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов. Впоследствии было показано, что МСК также подавляют функции В-лимфоцитов и способствуют генерации регуляторных Т-клеток. Супрессорная активность МСК опосредуется с вовлечением самых разнообразных механизмов – продукцией имммуносупрессивных факторов (IL-6, TGF-b, HGF, IL-10, PGE-2, NO), индукцией IDO и появлением на МСК ингибиторных молекул B7-H1, индуцирующих гибель Т-клеток при взаимодействии с PD1-лигандом, а также генерацией регуляторных Т-клеток [158].
Особо следует отметить способность МСК продуцировать исключительно большое количество растворимых факторов, включающих плейотропные ростовые и нейротрофические факторы, колониестимулирующие факторы, иммунорегуляторные цитокины, хемокины, металопротеиназы и их ингибиторы, а также белки внеклеточного матрикса [208, 224].
1.4.3. Влияние МСК на неврологическое восстановление в моделях ишемического инсульта
Основной целью экспериментальных исследований МСК в моделях инсульта явилась оценка безопасности и переносимости клеточной терапии и оценка клинического эффекта. Обобщенные в недавних обзорах результаты доклинических исследований МСК [123, 150, 210] позволили заключить, что внутривенное [228], интраартериальное и интрацеребральное введение МСК в модели окклюзии СМА [164, 227] является безопасным и не вызывает тяжелых токсических реакций и осложнений. При этом введение МСК сопровождается улучшением функционального восстановления, что проявляется повышением моторной активности, улучшением поведенческих реакций и когнитивных функций [89, 127, 153, 227, 228].
Важно отметить, что восстановление неврологических функций наблюдается как при интрацеребральном/внутрижелудочковом, так и внутрисосудистом введении клеток [165, 228, 234]. Более того, в ряде исследований было показано, что внутривенное введении клеток является более эффективным по сравнению с интрацеребральной имплантацией МСК [168].
Еще одним важным моментом является тот факт, что функциональное улучшение наблюдалось как при введении МСК в остром периоде (на 1–2-е сутки после окклюзии СМА, так и в более отдаленные сроки, – соответствующие подострой (через 1 неделю) и хронической (через 1 мес.) стадиям инсульта [141, 163, 226].
Исследования на животных также продемонстрировали, что МСК способны мигрировать в зону повреждения и этот процесс зависит от экспрессии хемокина SDF-1, экспрессируемого астроцитами, нейронами и эндотелиальными клетками в зоне микроокружения [226]. Причем миграция и интеграция МСК в зоне повреждения обнаруживается не только при интрацеребральном, но и внутривенном или интраартериальном введении [13, 63, 161, 162].
1.4.4. Механизмы, лежащие в основе эффекта МСК
Механизмы, посредством которых трансплантируемые клетки улучшают неврологическое восстановление, окончательно не ясны. Ранние экспериментальные исследования объясняли позитивный клинический эффект способностью МСК дифференцироваться в нервные клетки [92, 93]. Действительно, в 1997 г. Eglitis et al. [130] впервые сообщили о возможности нейрональной дифференцировки стволовых клеток костного мозга in vivo. Позднее были опубликованы результаты исследования, в котором клетки костного мозга генетически маркировали зеленым флюоресцентным белком, а затем трансплантировали облученным мышам. Мозговые срезы окрашивались специфическими антителами против различных нервных клеток (антителами против нейрон-специфической энолазы для выявления нейронов; антителами против глиофибриллярного кислого белка (GFAP) для выявления астроцитов; антителами к карбоангидразе II (CaII) для идентификации олигодендроцитов и ионизированной кальций-связывающей адаптерной молекулой 1 (Iba1) – для выявления клеток микроглии). Через 12 недель после прямой инъекции пересаженные клетки окрашивались антителами против GFAP, Caii и Iba1, а через 24 недели они экспрессировали только Iba1. На основании этих данных авторы сделали заключение, что стволовые клетки костного мозга способны дифференцироваться в олигодендроциты, астроциты и микроглию при воздействии на них мозговой микросреды [120].
Также в экспериментальных исследованиях была продемонстрирована возможность дифференцировки трансплантированных МСК в нейрогенном и глиальном направлениях в головном мозге. Так, меченные зеленым флуоресцентным белком GFP МСК при внутривенном введении мигрировали в зону пенумбры, после чего часть этих клеток начинала экспрессировать нейрогенный маркер NeuN, а часть – глиальный фибриллярный кислый белок GFAP. На этом основании авторы предположили, что введенные МСК могут дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [91, 169].
Однако незначительное количество интегрированных в очаге повреждения МСК, быстрый клинический эффект и возможность в ряде исследований получить его при замене трансплантируемых клеток их факторами позволили предположить, что клеточное замещение вряд ли является ведущим механизмом функционального восстановления. Кроме того, многие последующие исследования, выполненные с привлечением конфокальной микроскопии, не смогли воспроизвести феномен трансдифференцировки МСК, и интерпретировали предшествующие результаты как технические артефакты.
Поэтому сегодня неврологическое улучшение связывают в большей степени с трофическим и иммуномодулирующим эффектами МСК [91]. Трофическая поддержка при повреждениях ЦНС направлена на обеспечение нейропротекции, стимуляцию нейрорегенерации и ангиогенеза и опосредуется с участием широкого спектра цитокинов и ростовых факторов при их взаимодействии с нервными, эндотелиальными и иммунными клетками. МСК продуцируют нейтротрофические (BDNF, GDNF, NGF, IGF-1, нейротрофины 4/5), плеотропные ростовые (HGF, PDGF, FGF-2, SCF, PDGF, ВМР, TGF-, SDF), колоние-стимулирующие (G-CSF, GM-CSF, M-CSF) и ангиогенные факторы (VEGF, ANG-1, ANG-2, bFGF, IL-6, MCP-1), иммунорегуляторные цитокины (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, IL-13, TNF-a, IFN-), хемокины (MCP-1, IL-8, MIP-1, RANTES), металопротеиназы и их ингибиторы, а также белки внеклеточного матрикса (коллаген, фибронектин, ламинин, перлекан, декорин). Среди них многие факторы способны оказывать антиапоптотический эффект; активировать миграцию, пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых клеток, нейритогенез и синаптогенез, усиливать ангиогенез и способствовать восстановлению гематоэнцефалического барьера [155, 157, 187, 214, 218].
Иммуномодулирующий эффект направлен на ограничение воспалительного ответа, который при избыточной выраженности или длительной персистенции может оказывать нейротоксический эффект на ткани мозга [143, 211]. Поскольку меньшее воспалительное микроокружение способствует репаративной нейрорегенерации, иммуномодуляция является еще одним механизмом позитивного эффекта МСК на неврологическое восстановление.
Действительно, экспериментальные исследования в моделях окклюзии средне-мозговой артерии показали, что введение МСК сопровождается снижением экспрессии маркеров апоптоза в зоне повреждения и улучшением выживаемости нервных клеток [153, 154, 160, 166, 229]. Многочисленными исследованиями также показано, что трансплантация МСК в модели ишемического инсульта активирует нейрорегенерацию (активацию нейральных стволовых клеток, нейрито/синаптогенез) и ангиогенез [106, 153, 154, 160, 186, 233]. Кроме того, внутривенное введение МСК крысам с очаговой ишемией головного мозга, как в острую, так и хроническую фазу приводит к уменьшению размеров глиального рубца [141, 188]. Схожие данные получены авторами [125], которые показали снижение количества нейрокана и усиление аксонального роста в зоне пенумбра у крыс с очаговой ишемией после трансплантации.
Важно отметить, что в силу отсутствия адекватных и хорошо воспроизводимых моделей нарушений венозного кровотока, эффективность МСК в восстановлении нервной ткани при повреждениях венозного генеза остается неизученной. Согласно рекомендациям STEPS-I (“Stem Cell Therapies as an Emerging Paradigm in Stroke”), одним из препятствий на пути трансляции клеточных технологий в клиническую практику является недостаточное количество экспериментальных моделей сосудистых расстройств, приближенных по патогенезу к повреждениям головного мозга у человека [222].
С этой точки зрения разработка новых моделей сосудистых повреждений головного мозга, характеризующихся тяжестью неврологических расстройств и низким уровнем естественного восстановления, и исследование возможностей применения МСК для купирования неврологического дефицита в указанных моделях является актуальной научно-практической задачей, решение которой может ускорить клиническое внедрение новых методов лечения в области нейрохирургии.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
Для экспериментальных исследований было отобрано 97 белых крыс породы Wistar с массой тела от 210 до 220 граммов. Возраст животных находился в пределах 3–4 месяца. Они содержались в условиях вивария Новосибирского НИИТО, в клетках по 2 особи. Животные получали пищу 3 раза в день, питьевая вода находилась в клетках круглосуточно. Чистка клеток и мойка посуды производилась ежедневно в моечном отделении вивария.
Животные были распределены по группам и сериям в соответствии с целями и задачами исследования (таблица 1).
Все исследования выполнялись с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. В частности, содержание лабораторных животных и экспериментальные работы проводилось в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей и приказом Министерства Здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».
Таблица 1 – Распределение экспериментальных животных по сериям и группам
| Серия | № группы | Кол-во животных | Тип хирургического вмешательства | Клето- чная терапия | Время введения клеток | Путь введения клеток | |
| S1 | 1 | 8 | коагуляция верхнего сагиттального синуса | - | - | - | |
| 2 | 8 | коагуляция корковых вен в теменно-височной области | - | - | - | ||
| 3 | 16 | коагуляция сагиттального синуса + коагуляция корковых вен в левой теменно-височной области. | - | - | - | ||
| S2 | Контрольные группы | 1 | 8 | трепанация + моделирование ПГМ | - | - | - |
| 2 | 8 | трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера | - | - | - | ||
| Исследуемые группы | 3 | 6 | трепанация + моделирование ПГМ | + | 1 сутки | в/в | |
| 4 | 6 | трепанация + моделирование ПГМ | + | 7 сутки | в/в | ||
| 5 | 6 | трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера | + | 1 сутки | местно | ||
| 6 | 6 | трепанация + моделирование ПГМ + установка катетера | + | 7 сутки | местно | ||
| S3 | 1 | 6 | резекционная трепанация | - | - | - | |
| 2 | 8 | трепанация + моделирование ПГМ | - | - | - | ||
| 3 | 8 | трепанация + моделирование ПГМ | + | 1 сутки | в/в | ||
| S4 | 1 | 3 | трепанация + моделирование ПГМ | - | - | - | |
| Всего 97 | |||||||
2.2. Методика моделирования очагового нарушения венозного кровообращения головного мозга у экспериментальных животных
Операции по моделированию очаговых ПГМ, обусловленных нарушением венозного кровотока, проводили в условиях экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. В качестве анестезиологической поддержки использовали внутрибрюшинное введение раствора кетамина (125мг/кг). Операционное поле экспериментального животного выбривали от краниовертебрального перехода до линии глаз по длине и на уровне ушных раковин по ширине. Животное фиксировали на операционном столике. Зону операционного поля обрабатывали 70% этиловым спиртом двукратно и изолировали с помощью стерильных салфеток, прикрепляемых к коже цапками.
При выполнении операций использовали микрохирургический инструментарий и операционную оптику с пятикратным увеличением (бинокулярная лупа, Carl Zeiss, Germany). Выполняли дугообразный разрез мягких тканей в левой теменно-височной области с заходом за среднюю линию. Кожно- апоневротический лоскут отводили, прошивали двумя лигатурами и фиксировали на держалках. Височную мышцу выделяли и отводили в сторону кожно- апоневротического лоскута, кость скелетировали. Используя шаровидный бор, в левой теменной области с помощью стоматологической электродрели накладывали фрезевое отверстие, после чего проводилась резекционная трепанация черепа в левой теменной височной области с заходом за среднюю линию на 0,2–0,4 см, обнажая тем самым ВСС. Трепанация осуществлялась с использованием разработанного нами оригинального инструмента, на который получен патент РФ «Устройство для резекционной трепанации черепа» Патент № 2467714 РФ, авторы Васильев И.А., Самохин А.Г., Ступак В.В., Кузьмин А.В.
Дальнейшие манипуляции на головном мозге выполнялись в зависимости от методики формирования очага нарушения венозного кровообращения.
Для отработки оптимальной модели очагового поражения мозга венозного характера была сформирована серия S1 животных, состоящая из 3-х экспериментальных групп. Суммарное число крыс в серии S1 составляло 32 (таблица 2).
Таблица 2 – Распределение экспериментальных животных серии S1 по группам при отработке модели очагового поражение мозга венозного характера
| Группа | Кол-во животных | Вид хирургического вмешательства |
| 1 | 8 | трепанация + коагуляция верхнего сагиттального синуса |
| 2 | 8 | трепанация + коагуляция корковых вен в левой теменно-височной области |
| 3 | 16 | трепанация + коагуляция верхнего сагиттального синуса + коагуляция корковых вен в левой теменно-височной области |
| Всего | 32 |
