«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НЕВРОЛОГИИ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК На правах рукописи РЫБАКОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА ...»
где t – время (дни), N0 – начальное количество клеток, Nt – количество клеток ко дню t. Nt вычисляли по уравнению экспоненциальной линии тренда (Рис. 2.1).
Рисунок 2.1. Пример кривой роста с экспоненциальной линией тренда и уравнением линии тренда для вычисления времени удвоения популяции. x – время (д), y – количество клеток ко дню х.
2.3.2. Эффективность посева и выживаемость клеток
Выживаемость клеток определяли по их способности формировать колонии. Клетки рассеивали в низких разведениях в 60 мм чашки Петри, по истечении 10 дней клетки фиксировали 2-4 мин в 70% этаноле, разведенном на фосфатном буфере, окрашивали 10 мин с помощью раствора содержащего 0.05% бриллиантового синего G-250, 50% метанола, 5% уксусной кислоты, 45% воды. Далее подсчитывали количество колоний состоящих из 50 и более клеток и вычисляли процент клеток образовавших колонии, эффективность посева (ЭП), по формуле:
ЭП = (количество колоний/количество посаженных клеток) х 100.
Выживаемость рассчитывали как процентное соотношение ЭП в клетках, обработанных карнозином или подвергнутых действию ионизирующего излучения, к ЭП клеток в контроле.
2.4. Проточная цитометрия
В данной работе все измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США), оснащенном ионным аргоновым лазером с длинной волны 488 нм и двумя светофильтрами: 585/42 нм для красной флуоресценции (PI) и 530/30 нм для зеленой флуоресценции (ФИТЦ, DCF).
2.4.1. Измерение уровня АФК
Уровень внутриклеточных АФК измеряли с помощью флуоресцентного красителя 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетата (DCFН2-DA) (Рис. 2.2).
![2. Реакция превращения DCFH2-DA в DCF (из [250] с изменениями). См.-8](/images1/370825/2-reakciya-prevrascheniya-dcfh2-da-dcf.png)
Рисунок 2.2. Реакция превращения DCFH2-DA в DCF (из [250] с изменениями). См. пояснения в тексте.
DCFН2-DA представляет собой липофильное соединение, легко проникающее через мембрану живых клеток. Внутриклеточные эстеразы отщепляют ацетильные группы от DCFН2-DA, превращая его в 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин (DCFН2), для которого мембрана живой клетки уже непроницаема. Под действием внутриклеточных АФК (в основном Н2О2) происходит окисление DCFН2 с образованием флуоресцирующего продукта 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, ex=504 нм, em=529) [250]. Для измерения уровня АФК клетки инкубировали с 100 мкМ DCFН2-DA (Biotium, США) в течение 30 мин в темноте (37оС) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции.
2.4.2. Определение доли мертвых клеток
Долю мертвых клеток определяли по интенсивности свечения флуоресцентного красителя йодида пропидия (PI) (Рис. 2.3.А). PI количественно связывается нуклеиновыми кислотами путем интеркаляции между основаниями двойной цепи ДНК или РНК в соотношении: 1 молекула красителя на 4-5 пар оснований [251, 252]. После связывания с нуклеиновой кислотой флуоресценция PI усиливается в 20 - 30 раз и максимум испускания смещается на 15 нм в УФ-сторону (максимум поглощения (ex) 535 нм, максимум испускания (em) – 617 нм) [253].
Рисунок 2.3. Флуоресцентные красители использованные в работе. (А) Йодид пропидия (PI). (Б) 5-бромдезоксиуридин (БДУ).
Для определения доли мертвых клеток клетки инкубировали с 1 мкМ PI (Invitrogen, Germany) в течение 3 мин в темноте при комнатной температуре (tкомн) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе Cell Quest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).
2.4.3. Анализ клеточного цикла
Распределение клеток по фазам клеточного цикла измеряли по интенсивности свечения PI (Рис. 2.3.А). PI связывается с ДНК пропорционально его количеству, то есть, чем выше содержание ДНК, тем интенсивнее флуоресценция PI. Количество ДНК в разных фазах клеточного цикла неодинаково. G0 и G1 фазы характеризуются диплоидным набором хромосом – 2n, где n – это количество хромосом, а 2 обозначает, что каждая хромосома содержит только две хроматиды. Во время S фазы происходит удвоение хроматид в каждой хромосоме, которое завершается к началу G2 фазы, поэтому набор хромосом клеток в G2 фазе составляет 4n. Клетки, содержащие >2n, но <4n хромосом, относятся к S фазе (Рис. 2.4). Иногда G1 пику предшествует sub-G1 пик, который отражает количество апоптотических клеток. Фрагментация ДНК под действием эндонуклеаз при апоптозе приводит к образованию большого количества коротких ДНК фрагментов. Часть ДНК фрагментов теряется при подготовке проб, приводя к снижению внутриклеточного количества ДНК, которое в апоптотических клетках составляет <2n, что отражается в появлении sub-G1 пика.
Рисунок 2.4. Пример анализа клеточного цикла согласно содержанию ДНК. См. пояснения в тексте.
Для анализа клеточного цикла клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч при - 4оС. Фиксированные клетки отмывали от этанола и инкубировали 30 мин с 1 мг/мл РНКазы (Invitrogen, Германия), затем 60 мин с 35 мкг/мл PI (Invitrogen, Германия) в темноте при tкомн. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LTTM (BD, США).
2.4.4. Двухпараметрический анализ клеточного цикла
Для двухпараметрического анализа клеточного цикла был использован маркер клеток в S фазе – 5-бромдезоксиуридин (БДУ) (Рис. 2.3.Б) [170, 254]. БДУ представляет собой аналог нуклеотида тимидина и включается в ДНК во время репликации, то есть в S фазе. Клетки инкубировали 30 мин с 5-бромдезоксиуридином (БДУ) (37оС) и фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч при - 4оС. Фиксированные клетки инкубировали 30 мин в 0.4 мг/мл пепсина, приготовленном на 2 N HCl, и нейтрализовали в 0.1 M боратном буфере. Пробы центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин при 4оС), осадок инкубировали 1 ч с мышиными антителами к БДУ (1:10, BD, США) и 1 ч с антимышиными козьими флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ)-коньюгированными антителами (1:10, BD, США). Далее клетки инкубировали с РНКазой и PI (см. предыдущий пункт). Данные обрабатывали в программе FlowJo v8.8.7.
2.5. Иммуноблоттинг
Для выделения белков клетки разрушали с помощью ультразвука в лизирующем буфере, содержащем фосфатный буфер (pH 7.8,) ингибитор фосфатаз (PhosSTOP, Roche, США), коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США), 2% NP-40 и ДНКазу (0,01 ед/мкл, Zimo Research Corp., США). Лизаты центрифугировали, для Иммуноблоттинга использовали супернатант.
Белки разделяли в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Леммли [255] и переносили с помощью полусухого электротранспорта на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США). Места неспецифического связывания 1 ч блокировали в 5% молоке. Мембраны инкубировали с антителами против MnСОД (1:1000, Millipore, США), циклина B1 (1:1000, BD, США), НАДФН (1:500, BD, США) и актина (1:1000, Millipore, США). В качестве вторичных антител были использованы: меченные пероксидазой хрена антимышиные овечьи антитела (1:5000, GE Healthcare, США) и антикроличьи ослиные антитела (1:10,000, GE Healthcare, США). Иммунореактивные полоски визуализировали с помощью набора Pierce ECL 2 Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, США) согласно инструкции разработчика и детектировали хемилюминисценцию с помощью Typhoon FLA 7000 (General Electric, США). Насыщенность полос анализировали в программе ImageJ (NIH, США). Уровень актина и НАДФН использовали для коррекции загрузки белка.
2.6. Определение активности MnСОД
Белки выделяли по методу, описанному в предыдущем разделе (2.5), и разделяли с помощью электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле без додецилсульфата по методу предложенному Weydert et al. [66, 256]. Гель инкубировали 20 мин при tкомн в окрашивающей смеси, содержащей 2,43 мМ нитросиний тетразолий, 2,8105 M рибофлавин и 28 мМ ТЕМЕД, и проявляли на свету до появления прозрачных полос. Метод основан на том, что на свету рибофлавин образует супероксид, который превращает нитросиний тетразолий из желтого в темно синий, что окрашивает гель. Поскольку MnСОД катализирует реакцию дисмутации супероксида, то MnСОД-содержащие полоски становятся прозрачными. Проявленный гель сканировали с помощью Epson Perfection 4990 PHOTO (Epson, США) и анализировали насыщенность полос в программе ImageJ (NIH, США).
2.7. Определение активности каталазы
Белок выделяли по методу, описанному выше (Раздел 2.5). Активность каталазы определяли биохимическим путем на спектрофотометре по скорости деградации пероксида водорода по методу, предложенному Aebi и соавторами [257]. Принцип метода основан на том, что активность каталазы рассчитывается исходя из скорости распада Н2О2. В кювете смешивали известные количества образца и Н2О2 и измеряли оптическую плотность при 240 нМ. Поскольку каталаза разрушает Н2О2, то чем выше была активность каталазы в образце, тем быстрее снижалась концентрация Н2О2 в кювете.
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени
Клетки лизировали в тризоле и затем выделяли РНК с помощью набора «Direct-zolTM RNA MiniPrep Kit» согласно инструкции производителя (Zimo Research Corp., США). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с помощью набора «High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» (Applied Biosystems, США). Количественную ПЦР в режиме реального времени (45 циклов) проводили на приборе StepOne™ System (Applied Biosystems, США) с использованием красителя SYBR Green и праймеров. Последовательности праймеров представленных в Таблице 1. Данные анализировали в программе StepOne™ Software v2.2 (Applied Biosystems, США) и Microsoft Excel (Microsoft, США). Результаты представлены в виде относительных значений экспрессии (2Ct), где Ct - значение порогового цикла реакции.
2.9. Статистическая обработка результатов
Результаты измерений, проведенных в 3-5 параллельных пробах, представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение». Статистическая значимость определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа с последующим тестом на наименьшую значимую разность и тестом на взвешенное среднее Тьюки. Данные тесты используются для сравнения и определения разницы между и в пределах групп данных в зависимости от значений среднего и среднеквадратических ошибок для каждой переменной. Гомогенность дисперсии бралась в пределах доверительного интервала в 95%. Результаты со значениями P<0.05 принимались как статистически значимые.
Таблица 1. Последовательности праймеров для ПЦР в реальном времени.
| Ген | Gene Bank No. | Последовательность (5’ 3’) | Размер ампликона (п.о.) |
| CCNB1 (циклин В1) | NM_031966.3 | Forward: TAGCACTGAAAATTCTGGATAATGGTGA Reverse: TTGATTTACCATGACTACATTCTTAGCCAG | 125 |
| ACTB (актин В) | NM_001101.3 | Forward: TCACCATTGGCAATGAGCGGTT Reverse: AGTTTCGTGGATGCCACAGGACT | 89 |
| CRNS1 (карнозин-синтетаза) | NM_001166222.1 | Forward: AAGCTGGAGGAGGAGGAGAGTGTC Reverse: CCTTGCTCAGCAGTGGCCTATCA | 154 |
| CNDP1 (карнозиназа) | NM_032649 | Forward: CAGCAATCACTTACGGAACCCG Resverse: CCGAGAAGAGCAACCAGATCAGC | 133 |
| MnСОД | NM_000636.2 | Forward: TTGGCCAAGGGAGATGTTAC Reverse: AGTCACGTTTGATGGCTTCC | 157 |
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
РАЗДЕЛ 3.1. Изучение характера действия карнозина и его производных на опухолевые клетки
Антипролиферативный эффект карнозина на опухолевые и трансформированные клетки был продемонстрирован на ряде различных моделей [20, 21, 23, 208], однако механизм регуляции клеточной пролиферации с помощью карнозина до сих пор остается до конца не исследованным.
3.1.1. Карнозин снижает количество клеток РС-12 в культуре
Для изучения влияния карнозина на пролиферацию опухолевых клеток, была выбрана культура клеток феохромоцитомы крысы РС-12. Клетки обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч и затем считали количество клеток в каждой пробе с помощью камеры Горяева.
Рисунок 3.1.1. Карнозин снижает количество клеток РС-12 в культуре. Клетки обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч. (А) Общее количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05. (В) Процент погибших клеток определяли с помощью проточного цитометра по количеству клеток меченных PI. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества некротических клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.1.1.А. представлены результаты подсчета количества клеток в контроле и пробах обработанных карнозином. Как следует из Рис. 3.1.1.А, инкубация с карнозином приводила к дозо-зависимому снижению количества клеток РС-12. Количество клеток в пробах обработанных 10 мМ карнозина составляло 69% от контроля, 25 мМ – 52%, 50 мМ – 45%. Уменьшение количества клеток происходит в результате их гибели или при замедлении пролиферации. Для того чтобы выяснить, усиливает ли карнозин гибель клеток РС-12 клетки обрабатывали карнозином (10 – 50 мМ) в течение 48 ч, окрашивали маркером погибших клеток, PI, и анализировали интенсивность флуоресценции PI на проточном цитометре. Из Рис. 3.1.1.Б. видно, что достоверных различий в количестве погибших клеток в контроле и пробах, обработанных карнозином, обнаружено не было (Рис. I.1.Б). Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что снижение общего количества клеток РС-12 под действием карнозина не связано с гибелью клеток и, предположительно, является результатом замедления пролиферации.
3.1.2. Карнозин снижает уровень АФК в клетках культуры РС-12
Рисунок 3.1.2. Карнозин снижает уровень АФК в клетках РС-12. Клетки инкубировали с 50 мМ карнозина в течение 0,5 - 48 ч. Уровень АФК измеряли на проточном цитометре по степени окисления DCFH2-DA. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня АФК в контроле; n=3, p<0.05.
Быстро пролиферирующие клетки часто характеризуются повышенным содержанием АФК. Понижение уровня АФК в этих клетках с помощью антиоксидантов приводит к снижению скорости пролиферации [26, 66, 149]. Принимая во внимание способность карнозина взаимодействовать с некоторыми видами АФК и снижать их реакционную способность [15-19] можно предположить, что замедление клеточной пролиферации под действием карнозина является результатом его антиоксидантного эффекта. Для того чтобы выяснить, сопровождается ли снижение количества клеток РС-12 под действием карнозина изменениями уровня АФК, клетки РС-12 обрабатывали карнозином (50 мМ) в течение 0,5 - 48 ч. Уровень АФК измеряли на проточном цитометре по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA, результаты измерения представлены на Рис. 3.1.2. Как следует из Рис. 3.1.2, уже через 30 мин инкубации уровень АФК в пробах с карнозином снижался на 50% по сравнению с контролем. Пониженный уровень АФК поддерживался на протяжении 24 ч и возвращался к контрольному уровню через 48 ч. Поскольку снижение уровня АФК по времени предшествовало снижению количества клеток (Рис. 3.1.1.Б), можно предположить, что индуцированное карнозином замедление пролиферации клеток РС-12 является результатом его антиоксидантного эффекта.
3.1.3. Карнозин и его производные индуцируют накопление клеток РС-12 в S и G2/М фазах клеточного цикла
Пролиферация - это процесс увеличения количества клеток путем деления. Период времени от образования новой клетки до ее деления на две называется клеточным циклом. Клеточный цикл представляет собой совокупность последовательных строго организованных переходов от G1 фазы к S, к G2 и М (митоз). Нарушение прогрессии клеточного цикла ведет к его остановке (блоку) и препятствует дальнейшей пролиферации [81]. Для того чтобы выяснить, связано ли индуцируемое карнозином снижение количества клеток РС-12 с изменениями в прогрессии клеточного цикла, клетки РС-12 обрабатывали карнозином (10 - 50 мМ) в течение 48 ч. По истечении периода инкубации клетки фиксировали, окрашивали PI и с помощью проточного цитометра измеряли количество клеток в G0/G1, S и G2/М фазах по интенсивности флуоресценции PI. На Рис. 3.1.3.А. представлен пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина. Результаты анализа процентного распределения клеток по фазам клеточного цикла представлены на Рис. 3.1.3.Б.
Рисунок 3.1.3. Карнозин индуцирует накопление клеток РС-12 в S и G2/М-фазах клеточного цикла. Клетки инкубировали с карнозином (5 - 50 мМ) в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
Как следует из Рис. 3.1.3.Б, карнозин дозо-зависимо увеличивал количество клеток в S и G2/M фазах клеточного цикла. Параллельно происходило снижение количества клеток в G0/G1 фазе. Достоверно отличимый от контроля результат был получен при концентрациях 25 - 50 мМ карнозина. В пробах, обработанных 50 мМ карнозина, число S и G2/M клеток возрастало, соответственно, до 15% и 22%, по сравнению с 12% и 17% в контроле. Количество G0/G1 клеток при этом снижалось до 62% по сравнению с 71% в контроле. Важно отметить, что увеличения количества апоптотических клеток под действием карнозина выявлено не было (отсутствует sub-G1 пик, Рис. 3.1.3.А). Это еще раз подтверждает способность карнозина воздействовать на процессы клеточной пролиферации, а не гибели. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что снижение количества клеток РС-12 под действием карнозина происходит в результате замедления прогрессии клеточного цикла и накопления клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла.
У карнозина есть несколько природных производных, среди которых наиболее изученными являются ацетил-карнозин (N-ацетил--аланил-L-гистидин) и анзерин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Изучение структурно-функциональных взаимосвязей между карнозином и его производными в отношении изменения прогрессии клеточного цикла клеток РС-12 может помочь оценить степень вовлеченности отдельных частей молекулы в исследуемый эффект карнозина. Для того чтобы сравнить, изменения в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина и его производных, клетки обрабатывали 50 мМ карнозина, анзерина или ацетил-карнозина в течение 48 ч и анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК (Рис. 3.1.4). Как видно из Рис. 3.1.4.А, все исследованные вещества индуцировали накопление клеток в S и G2/М фазах, однако наиболее выраженный эффект демонстрировал анзерин. В пробах обработанных анзерином количество S и G2/М клеток возрастало, соответственно, на 79% и 65%. А количество G0/G1 клеток уменьшалось на 21%. Наименее выраженный эффект демонстрировал ацетил-карнозин. Основываясь на полученных данных, было сделано заключение о том, что метилирование карнозина способствует усилению ингибирующего эффекта на прогрессию клеточного цикла, в то время как ацетилирование карнозина этот эффект ослабляет.
Рисунок 3.1.4. Анзерин и L-гистидин--аланин замедляют прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин. Клетки РС-12 инкубировали с карнозином и его производными в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина, анзерина, ацетил-карнозина (А) или 1 - 10 мМ L-гистидин--аланина (Б). Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
Синтетическое производное карнозина L-гистидин--аланин, представляющий собой последовательность аминокислот карнозина в обратном порядке (т.н. «Карнозин наоборот») эффективнее, чем карнозин индуцировал накопление клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла (Рис. 3.1.4.Б). Клетки обрабатывали L-гистидин--аланином в концентрации 1 - 10 мМ в течении 48 ч, затем с помощью проточного цитометра изучали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК. Достоверно отличимый от контроля результат наблюдали при концентрации 5 – 10 мМ, то есть в 5 раз ниже, чем для карнозина. Причем, под действием 10 мМ L-гистидин--аланина количество S и G2/М клеток возрастало на 80% и 60% соответственно, что превышало значения, полученные под действием 50 мМ карнозина. В концентрации выше 10 мМ L-гистидин--аланин проявлял токсическое действие, поскольку приводил к гибели более 90% клеток. Таким образом, L-гистидин--аланин замедлял прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом.
3.1.4. Изучение воздействия синтетического трипептида пинеалона на клеточный цикл
Пинеалон представляет собой синтетический трипептид (Glu-Asp-Arg), синтезированный на основе анализа экстракта коры головного мозга крупного рогатого скота и проявляющий эффективные антиоксидантные свойства [244-246]. Для изучения эффекта пинеалона на внутриклеточный уровень АФК клетки РС-12 обрабатывали пинеалоном (50 – 500 нМ) в течение 1 ч, а затем индуцировали окислительный стресс добавлением 1 мМ пероксида водорода (Н2О2) на 20 мин. Уровень АФК измеряли с помощью проточного цитометра по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA. Процент погибших клеток определяли по количеству клеток окрашенных PI. Результаты измерения внутриклеточного уровня АФК и процента погибших клеток представлены на Рис. 3.1.5. Как видно из Рис. 3.1.5.А. обработка клеток РС-12 пинеалоном 50 - 500 нМ приводила к снижению внутриклеточного уровня АФК на 40% по сравнению с контролем. Добавление Н2О2 индуцировало рост АФК. Уровень АФК в пробах обработанных 1 мМ Н2О2 в 5 раз превышал значение в контроле. Инкубация клеток с пинеалоном частично препятствовала увеличению уровня АФК под действием Н2О2. Клетки, обработанные пинеалоном (50 - 500 нМ) перед добавлением Н2О2, демонстрировали в 2 раза меньший уровень АФК, чем клетки обработанные только Н2О2. Параллельно с повышением уровня АФК под действием Н2О2 происходило увеличение клеточной гибели. В пробах обработанных Н2О2 количество погибших клеток составляло 42,5% по сравнению с 5% в контроле. Пинеалон (50 – 500 нМ) снижал количество погибших клеток до 32,5 – 20% (Рис. 3.1.5.Б). Таким образом, было продемонстрировано, что пинеалон снижает внутриклеточный уровень АФК, предотвращает развитие окислительного стресса индуцированного действием Н2О2 и защищает клетки РС-12 от гибели.
Рисунок 3.1.5. Пинеалон снижает уровень АФК в клетках РС-12 и уменьшает клеточную гибель. Клетки обрабатывали пинеалоном (50 – 500 нМ), через 1 час добавляли 1 мМ пероксида водорода (Н2О2), инкубировали 20 мин и анализировали на проточном цитометре. (А) Уровень АФК в контроле и в клетках обработанных пинеалоном и Н2О2 измеренный по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA. (Б) Процент погибших клеток определенный по количеству клеток окрашенных PI. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от количества клеток в контроле (*) или в присутствии 1 мМ Н2О2 (**); n=3, p<0.05.
Для того чтобы выяснить, способен ли пинеалон ввиду своих антиоксидантных свойств модифицировать прогрессию клеточного цикла клетки РС-12 обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 24 ч и с помощью проточного цитометра анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК.
Рисунок 3.1.6. Пинеалон индуцирует накопление клеток в S и G2/М фазах клеточного цикла. Клетки обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 24 часов. Распределение клеток по фазам клеточного цикла анализировали на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки пинеалоном. (В) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.1.6.А. представлен пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки пинеалоном 100 нМ. Процентное распределение клеток между G0/G1, S и G2/М фазами в контроле и в пробах обработанных пинеалоном (50 – 500 нМ) показано на Рис. 3.1.6.Б. Как следует из Рис. 3.1.6.Б, пинеалон приводил к дозо-зависимому увеличению количества клеток в S и G2/М фазах и снижению количества клеток в G0/G1 фазе. Распределение в контроле составляло: G0/G1 - 70%, S - 14%, G2/М - 16%. Достоверно отличимый от контроля результат был получен в клетках, обработанных 100 нМ и 500 нМ пинеалона и составлял, соответственно: G0/G1 - 55%, S - 21%, G2/М -24% и G0/G1 - 50%, S - 24%, G2/М - 26%. Существенного влияния пинеалона на количество апоптотических клеток выявлено не было (Рис. 3.1.6.Б). Исходя из полученных, данных был сделано предположение о том, что пинеалон проявляет антиоксидантные свойства в клетках РС-12, а также индуцирует накопление клеток в G2/М фазе клеточного цикла.
Заключение I: Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы РС-12 сопровождалось модификацией клеточного цикла и накоплением клеток в S и G2/М фазах. Метилирование карнозина приводило к усилению формирования G2-блока, а ацетилирование молекулы этот эффект ослабляло. L-гистидин--аланин (т.н. “карнозин наоборот”) демонстрировал в 5 раз большую эффективность по сравнению с карнозином, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом. Синтетический трипептид пениалон также демонстрировал антиоксидантные свойства и индуцировал накопление клеток в S и G2/М фазах. Однако концентрации пинеалона были на несколько порядков ниже, чем для карнозина. Поскольку изменениям в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина предшествовало снижение внутриклеточного уровня АФК, было предположено, что существует взаимосвязь между антипролиферативным и антиоксидантным эффектами карнозина.
РАЗДЕЛ 3.2. Изучение механизма регуляции клеточного цикла под действием карнозина
Исследования механизма антипролиферативного эффекта карнозина были продолжены с использованием культур опухолевых клеток человека, так как именно они представляют собой первостепенную важность и имеют перспективу применения полученных данных на практике.
3.2.1. Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы
Для изучения характера влияния карнозина на пролиферацию опухолевых клеток человека были выбраны четыре клеточные культуры: карцинома горла и рта (FaDu, Cal27), карцинома молочной железы (MB231), глиобластома (U-118-MG). Клетки всех четырех культур обрабатывали карнозином (40 мМ) и оставляли инкубироваться. Каждые два дня в течение 6 дней клетки подсчитывали и вычисляли время удвоения популяции (Td). Результаты действия карнозина (40 мМ) на пролиферацию исследуемых линий опухолевых клеток представлены на Рис. 3.2.1. Как следует из Рис. 3.2.1. карнозин приводил к увеличению Td всех исследованных клеточных линий. Для интактных клеток Td составляло: 18 ч (FaDu), 16 ч (Cal27), 22 ч (MB231) и 24 ч (U-118-MG). После инкубации с карнозином Td возрастало до: 19 ч (FaDu), 18 ч (Cal27), 26 ч (MB231) и 32 ч (U-118-MG). Увеличение Td под действием карнозина свидетельствовало о замедлении процессов клеточной пролиферации. Наибольшее увеличение Td было отмечено в клетках глиобластомы (Рис. 3.2.1).
Рисунок 3.2.1. Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы. Клетки обрабатывали карнозином (40 мМ) Время удвоения популяций (Td) вычисляли по формуле: Td=0.693t/ln(Nt/N0), где t – время (дни), N0 – начальное количество клеток, Nt – количество клеток ко дню t.
Различия в эффективности действия карнозина на опухолевые клетки могут быть связаны с различиями в экспрессии внутриклеточных ферментов, отвечающих за синтез и разрушение карнозина. В организме человека карнозин синтезируется с помощь фермента карнозинсинтетазы из -аланина и L-гистидина с использованием энергии молекулы АТФ [6, 258]. Гидролиз карнозина на исходные аминокислоты осуществляется в основном с помощью сывороточной карнозиназы [9, 195]. 
Рисунок 3.2.2. Избирательность действия карнозина сочеталась с различиями в уровнях мРНК карнозин-синтезирующих (А) и карнозин-разрушающих (Б) ферментов в исследуемых клеточных культурах. Результаты ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК в клетках U-118-MG; n=3, p<0.05.
На Рис 3.2.2. представлены результаты измерения экспрессии генов карнозин-синтетазы и карнозиназы в исследуемых клеточных линиях, с помощью метода ПЦР в реальном времени. Из Рис. 3.2.2. видно, что в клетках U-118-MG уровень мРНК карнозин-синтазы был в 3,5 - 5 раз ниже, чем в клетках карцином (Рис. 3.2.2.А), а уровень мРНК карнозиназы, наоборот, был 4 - 6 раз выше (Рис. 3.2.2.Б). На основании этих данных можно предположить, что уровень эндогенного карнозина в клетках глиобластомы изначально ниже, чем в клетках карцином. Изначально низкий уровень карнозина в клетках глиобластомы, вероятно, обуславливает их большую чувствительность к антипролиферативному эффекту карнозина, в то время как высокий уровень карнозина в клетках карцином способствует развитию в них толерантности рост-ингибирующему действию карнозина. Поскольку наиболее выраженный антипролиферативный эффект карнозина был получен на клетках глиобластомы человека U-118-MG, эти клетки были использованы в дальнейших исследованиях.
Для более подробного изучения антипролифативного действия карнозина, клетки U-118-MG инкубировали в среде, в которую добавляли 20-100 мМ карнозина и измеряли Td. На Рис. 3.2.3. представлены результаты подробного анализа влияния карнозина на пролиферацию клеток глиобластомы. Было выяснено, что карнозин приводит к дозо-зависимому увеличению Td клеток U-118-MG, что согласовывалось с полученными ранее данными (Рис. 3.2.1). Td в контроле составляло 35 ч, в присутствии 50 мМ карнозина Td снижалось до 66 ч. Пролиферация была полностью подавлена в пробах обработанных 80 мМ и 100 мМ карнозина (Рис. 3.2.3.А).
Ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию клеток U-118-MG был подтвержден результатами измерения способностей клеток формировать колонии, то есть делиться. Результаты анализа выживаемости представлены на Рис. 3.2.3.Б. Из полученных дынных видно, что инкубация клеток глиобластомы с карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч приводила к снижению их выживаемости. Выживаемость клеток U-118-MG, обработанных 100 мМ карнозина, снижалась до 60% по сравнению с контролем (Рис. 3.2.3.Б).
Рисунок 3.2.3. Карнозин дозо-зависимо подавляет пролиферацию клеток глиобластомы. (А) Кривые роста клеток U-118-MG в контроле и при добавлении к среде культивирования 20 – 100 мМ карнозина. Td рассчитывали, как описано на Рис. 3.2.1. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05. (Б) Выживаемость клеток оценивали по способности формировать колонии. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от выживаемости в контроле; n=3, p<0.05.
Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин оказывает ингибирующее действие на пролиферацию клеток глиобластомы (U-118-MG), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231). Наиболее выраженный эффект наблюдали в клетках глиобластомы. Избирательность действия карнозина может быть связана с пониженным уровнем экспрессии карнозин-синтетазы и повышенным уровнем экспрессии карнозиназы в клетках глиобластомы по сравнению с клетками карцином.
3.2.2. Карнозин снижает уровень АФК и индуцирует экспрессию MnСОД
АФК принимают активное участие в регуляции клеточной пролиферации. Изменения внутриклеточного уровня АФК часто приводит к нарушениям пролиферативных процессов [24, 25, 67, 174]. Карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, то есть способен влиять на внутриклеточный уровень АФК [15, 207, 215, 259]. Для того чтобы выяснить, связано ли замедление пролиферации глиобластомы под действием карнозина с изменениями внутриклеточного уровня АФК, клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч и измеряли уровень АФК с помощью проточного цитометра по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH2-DA.
Рисунок 3.2.4. Карнозин снижает уровень АФК в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. Уровень АФК измеряли, как с описано на Рис. I.2. Результаты представлены в виде среднего значения флуоресценции, рассчитанного относительно контроля. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня АФК в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.2.4. показано влияние карнозина на уровень АФК в клетках U-118-MG. Как следует из Рис. 3.2.4, карнозин приводил к дозо-зависимому понижению уровня АФК в клетках U-118-MG. Клетки, обработанные 50 – 100 мМ карнозина, содержали на 15 – 20% меньше АФК, чем клетки в контроле.
Уровень внутриклеточных АФК контролируется антиоксидантной системой клетки. Снижение уровня АФК возможно как в результате прямого эффекта карнозина, так и при активации антиоксидантных ферментов под действием карнозина. На сегодняшний день прямой антиоксидантный эффект карнозина установлен и хорошо описан в литературе [14, 16, 18, 19]. Для изучения действия карнозина на антиоксидантные ферменты клеток U-118-MG были выбраны два основных антиоксидантных фермента – митохондриальная супероксиддисмутаза (MnСОД) и каталаза. Клетки обрабатывали карнозином (50 – 100 мМ) в течение 24 ч, затем измеряли активность и экспрессию MnСОД и каталазы.
Рисунок 3.2.5. Карнозин индуцирует экспрессию MnСОД в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (25 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А) Активность MnСОД, измеренная с помощью метода белкового электрофореза в неденатурирующем геле. (Б, В) Уровень белка MnСОД измеряли методом иммуноблоттинга, актин использовали для нормирования количества белка. (Г) Уровень мРНК MnСОД, измеренный с помощью метода ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК MnСОД в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.2.5.А. представлены результаты измерения активности MnСОД с помощью метода электрофореза в неденатурирующем геле. В данной работе было впервые показано, что инкубация клеток глиобластомы с карнозином усиливает активность MnСОД. Активность MnСОД в клетках обработанных карнозином (50 - 100 мМ) была в 3,3 - 3,6 раз выше, чем в контроле (Рис. 3.2.5.А). Отсутствие изменений в активности цитозольной супероксиддисмутазы (CuZnСОД) (Рис. 3.2.5.А) позволяет предположить, что антипролиферативный эффект карнозина связан со снижением уровня АФК, генерируемых в митохондриях. С помощью метода иммуноблоттинга было выявлено, что повышение активности MnСОД сопровождалось увеличением уровня белка MnСОД. Клетки обработанные карнозином (50 и 100 мМ) содержали в 1,4 - 1,6 раз больше белка MnСОД, чем клетки в контроле (Рис. 3.2.5.Б). Исследование временной зависимости увеличения уровня MnСОД под действием карнозина выявило, что добавление карнозина в концентрации 50 мМ индуцирует увеличение уровня белка MnСОД через 16 ч (Рис. 3.2.5.В). Измерение уровня мРНК MnСОД методом ПЦР в реальном времени показало, что увеличение количества белка MnСОД сопровождалось увеличением мРНК MnСОД. Уровень мРНК MnСОД в клетках обработанных 50 и 100 мМ карнозина был в 1,5 - 2,5 раза выше, чем в контроле (Рис. 3.2.5.Г).
На Рис. 3.2.6. представлены результаты исследования действия карнозина на активность и экспрессию каталазы. Активность каталазы измеряли с помощью биохимического метода на спектрофотометре. Уровень белка определяли с помощью метода иммуноблоттинга. Активность каталазы в контроле составляла 4 мк ед/мг. Клетки обработанные 50 мМ карнозина не демонстрировали каких-либо изменений активности каталазы по сравнению с контролем. В то время как в клетках обработанных 100 мМ карнозина активность каталазы снижалась до 1,5 мк ед/мг (Рис. 3.2.6.А). Снижение активности каталазы сопровождалось соответствующим уменьшением уровня белка. В клетках обработанных 100 мМ карнозина уровень белка каталазы составлял 60% от контрольного уровня (Рис. 3.2.6). Снижение активности каталазы часто приводит к росту прооксидантного уровня, главным образом Н2О2. Поскольку роста Н2О2 под действием карнозина не происходило, было предположено, что исходное содержание каталазы в клетках U-118-MG настолько мало, что снижение ее активности не оказывает значительного влияния на антиоксидантный эффект карнозина.
Рисунок 3.2.6. Карнозин ингибирует экспрессию каталазы в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А) Активность каталазы измеряли с помощью биохимического метода. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от активности каталазы в контроле; n=3, p<0.05. (Б) Уровень белка каталазы измеряли методом иммуноблоттинга, актин использовали для нормирования количества белка.
Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин проявляет антиоксидантные свойства в клетках глиобластомы U-118-MG. Карнозин снижал внутриклеточный уровень АФК и усиливал активность и экспрессию антиоксидантного фермента MnСОД.
3.2.3. Карнозин индуцирует G2 блок и усиливает экспрессию циклина В1
Для того чтобы выяснить, является ли антипролиферативный эффект карнозина результатом изменений в прогрессии клеточного цикла, клетки U-118-MG обрабатывали карнозином (20 – 100 мМ) в течение 24 ч и измеряли количество клеток в G1, S и G2 фазах с помощью двухпараметрического анализа. 
Рисунок 3.2.7. Карнозин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (20 – 100 мМ) в течение 24 ч, метили БДУ и измеряли количество БДУ-положительных (S фаза) и БДУ-отрицательных (G1 и G2 фазы) клеток с помощью проточного цитометра. (А) Пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.2.7.А. представлен типичный пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Как видно из Рис. 3.2.7.Б. инкубация с карнозином (20 - 100 мМ) приводила к дозо-зависимому увеличению количества клеток в G2 фазе и сопровождалась уменьшением числа клеток в S фазе. Распределение в контроле составляло: G1 - 39%, S - 44% и G2 - 17% клеток. Карнозин в концентрации от 20 до 50 мМ не приводил к значительным изменениям в распределении клеток. Достоверно отличимый от контроля результат был получен в пробах обработанных карнозином в концентрации 80 - 100 мМ. Количество клеток в G2 фазе увеличивалось до 39% относительно 17% в контроле, количество клеток в S фазе уменьшалось до 22% относительно 44% в контроле (Рис. 3.2.7.Б). Таким образом, было показано, что инкубация клеток U-118-MG с карнозином приводит к формированию G2 блока в прогрессии клеточного цикла. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы за счет модификации прогрессии клеточного цикла через G2 фазу.
Прохождение клетки через фазы клеточного цикла регулируется последовательной экспрессией циклинов. Циклин В1 специфически экспрессируется во время G2 фазы [81]. Было показано, что индукция G2 блока в присутствии некоторых антиоксидантов, например, витамина С, сопровождается усилением экспрессии циклина В1 [181]. Для того чтобы определить, сопровождается ли индуцированное карнозином накопление клеток в G2 фазе с изменениями экспрессии циклина В1, клетки U-118-MG обрабатывали 50 и 100 мМ карнозина в течение 24 ч и измеряли уровень белка и мРНК циклина В1. Результаты иммуноблоттинга и ПЦР в реальном времени представлены на Рис. 3.2.8. Было показано, что инкубация с карнозином (50 и 100 мМ) индуцирует увеличение уровня белка циклина В1 в 2,5 – 4 раза (Рис. 3.2.8.А). Интересно отметить, что увеличение уровня белка циклина В1 по времени совпадало с ростом уровня MnСОД и происходило спустя 16 часов после добавления 50 мМ карнозина (Рис. 3.2.8.Б и 3.2.5.В). Данное наблюдение позволяет предположить существование взаимосвязи между антипролиферативным и антиоксидантным эффектами карнозина. Повышение уровня белка циклина В1 было сопряжено с небольшим увеличением уровня мРНК. В клетках обработанных 50 и 100 мМ карнозина уровень мРНК циклина В1 в 1,25 - 2 раза превышал значение в контроле (Рис. 3.2.8.В). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что антипролиферативный эффект карнозина является следствием активации экспрессии циклина В1 и остановки клеток в G2 фазе клеточного цикла.
Рисунок 3.2.8. Карнозин усиливает экспрессию циклина B1 в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А, Б) Уровень белка циклина В1 измеряли методом иммуноблоттинга, актин и НАДФН использовали для нормирования количества белка. (В) Уровень мРНК циклина В1 измеряли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК циклина В1 в контроле; n=3, p<0.05.
Заключение II: Карнозин ингибировал пролиферацию опухолевых клеток человека, что согласовывалось с данными, полученными на клетках РС-12. Наиболее выраженный ингибирующий эффект карнозина наблюдали в культуре клеток глиобластомы, что возможно было связано с изначально низким уровнем эндогенного карнозина в этих клетках. В данной работе было впервые показано, что замедление пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного уровня АФК, усилением экспрессии MnСОД и циклина В1, а также накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла. Полученные данные подкрепляют наше предположение о том, что карнозин ингибирует рост опухолевых клеток за счет усиления антиоксидантной защиты клетки и модификации клеточного цикла.
РАЗДЕЛ 3.3. Сравнение антипролиферативного эффекта карнозина с действием его производных
У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил--аланил-L-гистидин), анзерин (-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Для оценки вовлеченности отдельных групп молекулы карнозина в антипролиферативный эффект, действие карнозина сравнивали с эффектом его производных. К среде культивирования клеток U-118-MG добавляли исследуемые соединения в концентрации 40 мМ и оставляли на инкубацию. Каждые два дня в течение 6 дней клетки считали и вычисляли Td, результаты подсчета представлены на Рис. 3.3.1.
Рисунок 3.3.1. Анзерин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы U-118-MG эффективнее, чем другие производные карнозина. К среде культивирования добавляли дипептиды в концентрации 40 мМ и оставляли инкубироваться. Td рассчитывали как описано на Рис 3.2.1. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от Td в контроле; n=3, p<0.05.
Как следует из Рис. 3.3.1. все исследованные дипептиды приводили к удлинению Td, однако в разной степени, что свидетельствует о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Ацетил-карнозин обладал наименее выраженным эффектом, увеличивая Td клеток глиобластомы лишь на 3 ч по сравнению с контролем. Td клеток обработанных гомокарнозином и карнозином было примерно одинаковым и превышало контрольное значение на 6 - 7,5 ч. Анзерин ингибировал пролиферацию сильнее, чем остальные соединения. Td клеток обработанных анзерином было на 12 ч длиннее по сравнению с контролем. Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Метилирование молекулы карнозина в положении 1N имидазольного кольца (анзерин) повышает эффективность действия молекулы на процессы клеточной пролиферации. Ацетилирование молекулы по свободной -аминогруппе карнозина (ацетил-карнозин) приводит к снижению ее эффективности.
Для того чтобы выяснить, связано ли антипролиферативное действие анзерина с изменениями в прогрессии клеточного цикла, клетки обрабатывали 50 – 100 мМ анзерина в течение 24 ч, метили БДУ и измеряли распределение клеток по фазам клеточного цикла на проточном цитометре. На Рис. 3.3.2. продемонстрировано действие 50 – 100 мМ анзерина на прогрессию клеточного цикла клеток U-118-MG. Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с анзерином показан на Рис. 3.3.2.А. результаты анализа процентного распределения представлены на Рис. 3.3.2.Б. Как следует из Рис. 3.3.2.Б, инкубация с анзерином приводила к перераспределению клеток по фазам клеточного цикла. Распределение в контроле составляло: 38% - G1 фаза, 50% - S фаза и 12% - G2 фаза, в пробах обработанных 100 мМ анзерина: 48% - G1 фаза, 27% - S фаза и 25% - G2 фаза. Клетки, обработанные 50 мМ анзерина, не демонстрировали каких либо отличий прогрессии клеточного цикла по сравнению с контролем. Кроме того, было отмечено достоверное увеличение количества клеток в G1 фазе, с 38% в контроле до 48% в присутствии 100 мМ анзерина, что, возможно, является причиной более сильного эффекта анзерина по сравнению с карнозином. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что характер действия анзерина на клеточный цикл сходен с эффектом карнозина. Дополнительное понижение клеток в G1 фазе под действием анзерина, возможно, является причиной более сильного эффекта анзерина по сравнению с карнозином.
Рисунок 3.3.2. Анзерин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали анзерином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч, метили БДУ и анализировали с помощью проточного цитометра. (А) Пример распределения БДУ-положительных (S-фаза) и БДУ-отрицательных (G1 и G2 фазы) клеток в контроле и после инкубации с анзерином (100 мМ). (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.
На Рис. 3.3.3. показано влияние гомокарнозина на прогрессию клеточного цикла клеток глиобластомы. Клетки обрабатывали гомокарнозином (100 мМ) в течение 24 ч и измеряли распределение клеток по фазам клеточного цикла на проточном цитометре согласно содержанию ДНК. Результаты измерений представлены на Рис. 3.3.3. Пример распределения клеток между G0/G1, S и G2/М фазами показан на Рис. 3.3.3.А. Согласно результатам анализа процентного распределения клеток представленным на Рис. 3.3.3.Б, распределение в контроле составляло: 48% - G0/G1 фаза, 30,5% - S фаза и 22,5% - G2/М фаза, после инкубации с гомокарнозином: 40% - G0/G1 фаза, 23% - S фаза и 37% - G2/М фаза. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что гомокарнозин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Ингибирующее действие гомокарнозина на пролиферацию клеток глиобластомы, вероятно, связано с изменениями в прогрессии клеточного цикла.
Рисунок 3.3.3. Гомокарнозин индуцирует G2 блок в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали 100 мМ гомокарнозина в течение 24 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения и (Б) процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с гомокарнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от контроля; n=3, p<0.05.
Заключение III: производные карнозина (ацетил-карнозин, анзерин и гомокарнозин) оказывают ингибирующее действие на пролиферацию клеток глиобластомы, однако с разной эффективностью. Метилирование карнозина повышало его антипролиферативные свойства, ацетилирование молекулы, наоборот, приводило к снижению эффективности действия карнозина. Снижение пролиферации глиобластомы под действием анзерина и гомокарнозина, сопровождалось изменениями в прогрессии клеточного цикла и формированием G2 блока.
РАЗДЕЛ 3.4. Возможности применения карнозина в радиотерапии
На сегодняшний день лучевая терапия - один из наиболее эффективных способов лечения глиобластомы. Для того чтобы исследовать, последствия совместного применения карнозина и ионизирующего излучения, клетки обрабатывали карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассаживали в низких разведениях чашки Петри для формирования колоний.
На Рис. 3.4.1. показаны результаты совместного действия карнозина и ионизирующего облучения на гибель клеток глиобластомы. Примеры чашек Петри с колониями клеток сформированных в контроле, после инкубации с 100 мМ карнозина, облучения (4 Гр) и совместного действия карнозина и облучения показаны на Рис. 3.4.1.А. Результаты анализа выживаемости представлены на Рис. 3.4.1.Б. Как следует из Рис. 3.4.1.Б, подсчет количества колоний и расчет выживаемости показали, что инкубация клеток с 100 мМ карнозина приводит к снижению выживаемости клеток глиобластомы до 53% по сравнению с контролем (Рис. VI.Б). Облучение клеток при 4 Гр снижало выживаемость на 67%. Выживаемость клеток, подвергнутых совместному действию карнозина и ионизирующего излучения, составляло 17% от контроля. Таким образом, было продемонстрировано, что предварительная инкубация с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Рисунок 3.4.1. Предварительная инкубация с карнозином усиливает гибель клеток глиобластомы под действием ионизирующего облучения. Клетки инкубировали с карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассеивали в низких разведениях для формирования колоний. (А) Пример колоний, сформированных в контроле, после обработки карнозином, облучения или после совместного действия карнозина и облучения. (Б) Выживаемость рассчитывали, как описано на рисунке 3.2.3.Б. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от выживаемости в контроле (*) или от проб, облученных при 4 Гр (**); n=3, p<0.05.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Карнозин представляет собой природный дипептид встречающийся в высокой концентрации в мышцах и мозге. Антипролиферативный эффект карнозина на трансформированнные и опухолевые клетки был впервые описан порядка 30 лет назад. Однако, механизм ингибирующего действия карнозина на пролиферацию опухолевых клеток до сих пор до конца не понятен. Целью данной работы было исследование механизма ингибирующего действия карнозина на пролиферацию опухолевых клеток. На сегодняшний день в литературе накоплено множество данных об участии про- и антиоксидантов в регуляции клеточной пролиферации. Поскольку, карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства мы предположили, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток является следствием его антиоксидантной активности. Мы обнаружили, что карнозин ингибирует пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы (РС-12), глиобластомы человека (U-118-MG), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231) человека. Наиболее эффективно карнозин ингибировал пролиферацию клеток глиобластомы человека U-118-MG. В данной работе было впервые показано, что снижение пролиферации под действием карнозина сопровождается снижением уровня внутриклеточных АФК, усилением экспрессии MnСОД и циклина В1, а также накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла. Метилированное производное карнозина, анзерин, ингибировал пролиферацию опухолевых клеток эффективнее, чем карнозин. В работе впервые было показано, что обработка клеток глиобластомы карнозином перед облучением приводит к снижению их выживаемости. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что карнозин ингибирует пролиферацию опухолевых клеток за счет активации антиоксидантной системы и модификации клеточного цикла. Метилирование карнозина приводит к усилению антипролиферирующего эффекта. Усиление гибели опухолевых клеток при совместном использовании карнозина и ионизирующего излучения открывает перспективы применения карнозина в терапии опухолевых заболеваний.
Подсчет общего количества клеток феохромоцитомы крысы РС-12 с помощью камеры Горяева выявил снижение количества клеток в пробах обработанных карнозином по сравнению с контролем (Рис. 3.1.1.A). Уменьшение количества клеток не сопровождалось увеличением количества некротических или апоптотических клеток (Рис. 3.1.1.A, 3.1.3.A), указывая на то, что снижение количества клеток происходит в результате замедления пролиферации, а не усиления клеточной гибели. Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток было подтверждено результатами измерения времени удвоения популяции. Карнозин увеличивал Td четырех исследованных культур опухолевых клеток человека (карциномы горла и рта (FaDu, Cal27), карцином молочной железы (MB-231), глиобластомы (U-118-MG)). Наибольшее удлинение Td наблюдали в клетках культуры глиобластомы (Рис. 3.2.1). Анализ воздействия разных концентраций карнозина на пролиферацию клеток глиобластомы выявил, что карнозин дозо-зависимо ингибирует рост клеток глиобластомы. Полученные данные подтверждались результатами измерения клеточной выживаемости (Рис. 3.2.3). Наши наблюдения согласовывались с результатами предыдущих работ, демонстрирующими антипролиферативное действие карнозина на клетки, изолированные из мозга больных мультиформной глиобластомой [21, 208]. Снижение количества клеток глиобластомы под действием карнозина не сопровождалось усилением некроза или апоптоза. В пробах, обработанных карнозином, процент клеток включивших БДУ был значительно меньше, чем в контроле, что свидетельствовало о замедление пролиферативных процессов под действием карнозина [208]. Кроме того, инъекции карнозина мышам с ксенографами HER2/neu NIH3T3 фибробластов снижали количество митозов в опухолях и существенно подавляли опухолевый рост [21]. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, был сделан вывод о том, что противоопухолевый эффект карнозина обусловлен ингибирующим действием карнозина на пролиферацию опухолевых клеток.
Причины повышенной чувствительности клеток глиобластомы к карнозину до конца не понятны и требуют дальнейшего изучения. Полученные нами данные позволяют предположить, что одной из причин могут быть различия в уровне эндогенного карнозина в исследованных клеточных культурах. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени обнаружено, что в клетках глиобластомы уровень мРНК карнозин-синтетазы ниже, чем в клетках карцином, а уровень мРНК карнозиназы, наоборот, выше (Рис. 3.2.2). Мы полагаем, что изначально низкий уровень эндогенного карнозина в клетках глиобластомы вследствие повышенного уровня карнозиназы и сниженного уровня карнозин-синтетазы, делает клетки U-118-MG более чувствительными к добавлению карнозина извне. Клетки карцином с изначально повышенным уровнем карнозина обладают своего рода резистентностью. Из данного предположения можно также сделать вывод о том, что антипролиферативный эффект карнозина обоснован присутствием молекулы целиком, а не составляющими ее аминокислотами. Результаты более ранних работ подтверждают данное предположение. Показано, что -аланин сам по себе не проявляет неопластического эффекта, в то время как L-гистидин токсичен для всех типов клеток в концентрации выше 5 мМ [23, 260].
Измерение уровня АФК на проточном цитометре по степени окисления DCFH2-DA выявило, что ингибирование пролиферации клеток РС-12 и U-118-MG под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного уровня АФК (Рис. 3.1.2 и 3.2.4). Наши наблюдения согласуются с опубликованными ранее данными, демонстрирующими корреляцию между снижением внутриклеточного уровня АФК и уменьшением количества клеток карциномы толстой кишки человека HCT116 под действием карнозина [209]. Показано, что внутриклеточный уровень АФК повышается по мере прогрессии клеток через клеточный цикл, позволяя предположить, что быстро пролиферирующие клетки находятся в более окисленном состоянии по сравнению с клетками, делящимися медленно [32, 33]. Высокий уровень АФК в опухолевых клетках, вероятно, является одной из причин их активной пролиферации [69]. Исходя из данных литературы и наших результатов, мы предполагаем, что снижение внутриклеточного уровня АФК в клетках РС-12 и U-118-MG под действием карнозина, способствует замедлению пролиферации клеток глиобластомы.
Интересно отметить, что усиление экспрессии карнозиназы (CN1) в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y приводило к снижению защитного действия карнозина от цитотоксического эффекта известного индуктора окислительного стресса, малонового диальдегида [9]. Таким образом, прослеживается параллель между ослаблением антипролиферативного эффекта и антиоксидантных свойств карнозина при усилении экспрессии карнозиназы, указывая на существование взаимосвязи между способностью карнозина снижать уровень АФК и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток.
При дальнейшем исследовании действия карнозина на антиоксидантную систему клеток глиобластомы было обнаружено, что карнозин изменяет активность, основных ферментов антиоксидантной системы клетки, MnСОД и каталазы. С помощью метода электорофореза в неденатурирующем геле было выявлено усиление активности MnСОД в клетках глиобластомы обработанных карнозином (Рис. 3.2.5.А). С помощью методов иммуноблоттинга и ПЦР в реальном времени было установлено, что усиление активности MnСОД сопровождается повышением уровня белка и мРНК MnСОД (Рис. 3.2.5.Б-Г). MnСОД представляет собой антиоксидантный фермент, локализованый в митохондриях и катализирующий реакцию дисмутации супероксида в пероксид водорода [50]. Ранее мы показали, что прогрессия клеточного цикла зависит от активности MnСОД: повышение активности MnСОД ингибировало клеточный рост, в то время как понижение активности MnСОД усиливало пролиферацию [27, 151, 261]. Более того, в нескольких исследованиях было продемонстрировано значительное снижение активности MnСОД в опухолевых клетках, что совпадало с повышенным внутриклеточным уровнем АФК и активной пролиферацией. Усиление экспрессии MnСОД ингибировало пролиферацию многих линий опухолевых клеток, в том числе клеток глиобастомы человека U-118 [30, 74, 75, 256, 262, 263]. В нашей работе, увеличение активности MnСОД при инкубации клеток глиобластомы с карнозином сопровождалось значительным удлинением времени удвоения популяции. Следовательно, можно предположить, что антипролиферативный эффект карнозина обусловлен его способностью усиливать экспрессию MnСОД и приводить к снижению уровня АФК.
Измерение активности цитозольной формы СОД (CuZnСОД) в контроле и после инкубации с карнозином не выявило каких-либо различий. Поскольку MnСОД представляет собой антиоксидантный фермент расположенный в матриксе митохондрий, исходя из полученных данных можно предположить, что антипролиферативный эффект карнозина является результатом изменения уровня АФК, генерируемых в митохондриях.
Интересно отметить работу Renner et al., которые показали, что уменьшение количества клеток глиобластомы в культуре под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного количества АТФ и активности ЛДГ, что, по мнению авторов, являлось причиной замедления пролиферации опухолевых клеток [21, 208]. Ингибирование окислительного фосфорилирования с помощью KCN не влияло на выработку АТФ или выживаемость клеток глиобластомы, исходя из этого было предположено, что карнозин работает на уровне гликолиза, а не окислительного фосфорилирования [225]. Недавно Sarsour et al. продемонстрировали существование взаимосвязи между гликолизом и активностью MnСОД. Понижение активности MnСОД сопровождалось усилением интенсивности поглощения глюкозы, а усиление активности MnСОД, наоборот ингибировало гликолитические процессы [27]. Таким образом, можно предположить, что обнаруженное нами повышение активности MnСОД под действием карнозина является одним из механизмов ингибирующего действия карнозина на гликолиз, приводя к замедлению пролиферации опухолевых клеток.
Измерение активности каталазы в пробах обработанных карнозином выявило снижение ее активности в клетках глиобластомы обработанных карнозином по сравнению с контролем (Рис. 3.2.6). Снижение активности каталазы сопровождалось понижением уровня белка. Каталаза является важным участником антиоксидантной системы клетки, который катализирует реакцию разложения Н2О2 до воды и молекулярного кислорода. Таким образом, снижение активности каталазы должно приводить к повышению концентрации Н2О2, однако в нашей работе этого не наблюдалось. Более того, уровень АФК, наоборот, снижался. Возможно, это происходило потому, что изначальная активность каталазы была невелика (4 мк ед/мг). В то время как средняя активность каталазы в нормальных клетках на несколько порядков выше (примерно 5 ед/мг белка) [148]. Понижение активности каталазы в клетках глиобластомы с 4 до 2 мк ед/мг, вероятно, не вносило значительного вклада в повышение уровня Н2О2. Кроме того, снижение уровня АФК может объясняться включением компенсаторных механизмов, например усилением активности GPx, пероксиредоксинов и т.п.
Исследование влияния карнозина на прогрессию клеточного цикла клеток РС-12 и U-118-MG выявило, что замедление пролиферации под действием карнозина сопровождается увеличением количества клеток в G2 фазе (Рис. 3.2.7). На сегодняшний день накоплен большой объем экспериментальных данных, указывающий на важность роли АФК в регуляции прогрессии клеточного цикла. Показано, что по мере прогрессии клеточного цикла от G1 к митозу происходит увеличение уровня АФК и снижение активности MnСОД. Концентрация АФК максимальна в поздней S фазе и в G2/M [26]. Активность MnСОД, наоборот, была максимальна в G1 фазе и постепенно снижалась по мере прогрессии через S, G2 и М фазы [27, 148, 150]. Повышение экспрессии MnСОД усиливало формирование G2 блока индуцированное действием радиации в клетках карциномы [180]. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, мы предполагаем, что индуцированное карнозином снижение АФК и увеличение активности MnСОД приводят к нарушению внутриклеточного редокс-баланса, необходимого для прогрессии через G2 фазу (повышенный уровень АФК и низкая активность MnСОД). В результате не происходит активации редокс-зависимых регуляторов G2 фазы, что приводит к нарушению прогрессии клеточного цикла через G2 фазу.
В нашей лаборатории было также показано, что карнозин замедляет рост уровня активной формы МАР-киназы ERK1/2 в условиях окислительного стресса индуцированного активацией глутаматных рецепторов [234, 236]. Активация ERK1/2 необходима для пролиферации клеток, ингибирование ERK1/2 приводило к остановке пролиферации и накоплению клеток в одной из фаз клеточного цикла [106]. Есть данные о том, что активность ERK1/2 изменяется в зависимости от состояния редокс. Например, усиление экспрессия MnСОД подавляло активацию ERK1/2 в клетках глиобластомы человека U87, указывая на возможность регуляции активности ERK1/2 с помощью антиоксидантов [28, 160]. Несмотря на то, что для проверки данной гипотезы, необходимо проведение множества дополнительных экспериментов, мы полагаем, что ингибирование ERK1/2 при активации MnСОД и снижении уровня АФК под действием карнозина, может быть одним из механизмов его антипролифативного эффекта.
Увеличение количества G2 клеток сопровождалось усилением экспрессии циклина В1. Циклин В1 представляет собой функциональную субъединицу комплекса циклин В1/CDK1, который регулирует прогрессию клетки через G2 фазу (Рис. 3.2.8) [131]. Экспрессия циклина В1 усиливается в поздней S-фазе, достигает максимума в G2, и резко снижается в середине митоза. В G1-фазе циклин В1 не детектируется [81]. Таким образом, увеличение уровня циклина В1 в пробах обработанных карнозином может быть следствием повышенного содержания клеток в G2-фазе. С другой стороны, карнозин может напрямую активировать экспрессию циклина В1 независимо от индукции G2-блока. Дополнительные исследования необходимы для изучения механизма активации экспрессии циклина В1 в ответ на действие карнозина.
Мы полагаем, что индукция G2 блока под действием карнозина может быть также опосредована через фосфатазу Cdc25C, которая является редокс-чувствительным ферментом и играет важную роль в регуляции работы комплекса циклин В1/CDK1 [138, 177]. Thomas et al. показали, что низкомолекулярный антиоксидант витамин С индуцирует G2 блок в клетках HeLa и T98G. При более подробном исследовании механизма данного явления было выявлено, что витамин С препятствует перемещению Cdc25C в ядро, а следовательно и активации комплекса циклин В1/CDK1 [181]. В результате, несмотря на наличие комплекса циклин В1/CDK1 в клетке прогрессии клеточного цикла не происходило. Нами также было замечено, что рост уровня циклина В1 начинался одновременно с ростом уровня белка MnСОД, подтверждая наше предположение о том, что увеличение активности MnСОД приводит к изменениям в прогрессии клеточного цикла и формированию G2 блока. Исходя из наших данных, сопоставленных с данными литературы, был сделан вывод о том, что индуцированные карнозином изменения в соотношении внутриклеточных про- и антиоксидантов индуцирует G2 блок и увеличивают уровень циклина В1.
У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил--аланил-L-гистидин), анзерин (-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Изучение структурно-функциональных особенностей карнозина и его производных в отношении подавления пролиферации опухолевых клеток может помочь оценить степень вовлеченности отдельных частей молекулы в исследуемый эффект карнозина. Исследование антипролиферативых свойств производных карнозина выявило, что все исследованные производные карнозина ингибировали пролиферацию опухолевых клеток. Эффективность действия исследованных дипептидов возрастала в следующем порядке: ацетил-карнозин < карнозин гомокарнозин < анзерин (Рис. 3.1.4.А, 3.3.1, 3.3.2, 3.3.3). Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и пробах обработанных дипептидами показал, что все исследованные вещества индуцируют накопление клеток в G2 фазе клеточного цикла. Клетки U-118-MG обработанные анзерином также демонстрирововали небольшое увеличение количества клеток в G1 фазе, что, возможно, было причиной более сильного антипролиферативного эффекта анзерина. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что ацетилирование карнозина снижает его антипролиферативные способности, в то время как метилирование, наоборот, усиливает антипролиферативный эффект.
Характер влияния заместителей в молекуле карнозина на его антипролиферативные свойства был сходен с характером влияния заместителей на антиоксидантную активность карнозина. Согласно эффективности защиты суперскрученной ДНК от перекисного окисления липидов индуцированного в смеси Фентона дипептиды располагались следующим образом: гистидин < ацетил-карнозин < гомокарнозин карнозин анзерин [15, 264]. Совпадение принципов изменения силы антиоксидантного и антипролиферативного эффектов еще раз указывает на сопряженность между антиоксидантным и антипролиферативным свойствами карнозина.
Синтетический аналог карнозина - L-гистидин--аланин, представляющий собой т.н. «карнозина наоборот» также индуцировал накопление клеток в G2 фазе клеточного цикла и ингибировал пролиферацию опухолевых клеток (Рис. 3.1.4.Б). Причем, диапазон эффективных концентраций для антипролиферативного эффекта L-гистидин--аланина был в 10 раз ниже (5 – 10 мМ), чем для карнозина (50 - 100 мМ). Однако, при концентрации выше 10 мМ L-гистидин--аланин приводил к интенсивной гибели опухолевых клеток. Токсичность «карнозина наоборот» может быть связана с положением L-гистидина на первом месте. Известно, что в концентрации выше 5 мМ гистидин обладает цитотоксическими действием. Добавление -аланина к молекуле гистидина в молекуле карнозина, вероятно, способствует снижению токсичности гистидина. Было показано, что токсичность гистидина связана с присутствием ионов железа, удаление ионов железа из среды снижало токсический эффект гистидина. Имидазольное кольцо в молекуле гистидина способно хелатировать железо, отдавая протон от азота 1N. Металлы в металлоферментах часто координируются с помощью гистидина через незащищенный азот в имидазоле. Предполагается, что гистидин способен отнимать т.н. «хелатируемое железо», железо слабосвязанное с внутриклеточными ферментами, и делать его более доступным для окисления под действием АФК [265, 266]. Перемещение L-гистидина на первое место в молекуле «карнозина наоборот» делает имидазольное кольцо более открытым, и, следовательно, более доступным для взаимодействий, что, вероятно, является причиной цитотоксичности высоких концентраций L-гистидин--аланина.
Инкубация с синтетическим трипептидом пинеалоном приводила к снижению внутриклеточного уровня АФК в клетках РС-12 по сравнению с необработанным контролем (Рис. 3.1.5.А). Наши результаты согласовывались с полученными ранее данными об антиоксидантных свойствах пинеалона, продемонстрированных на модели гиперборической гипоксии [244-246]. Кроме того, на клетках РС-12 мы показали, что пинеалон обладает защитным антиоксидантным действием. Пинеалон частично препятствовал росту внутрикелточного уровня АФК индуцированного действием Н2О2 и снижал уровень клеточной гибели (Рис. 3.1.5). Анализ клеточного цикла выявил, что подобно карнозину, инкубация с пинеалоном приводит к увеличению количества S и G2/М клеток по сравнению с контролем (Рис. 3.1.6). Однако, для достижения сходного эффекта пинеалон требовался в концентрациях на несколько порядков ниже, чем карнозин (нМ – для пинеалона, мМ – для карнозина). Ранее в нашей лаборатории было показано, что пинеалон препятствует росту ERK1/2 в гранулярных клетках мозжечка индуцированное действием уабаина [234]. Поскольку активация ERK1/2 необходима для прогрессии клеточного цикла, снижение активности ERK1/2 под действием пинеалона может быть одним из механизмов индукции G2 блока в его присутствии. Кроме того, аминокислотный состав пинеалона и карнозина различается, указывая на то, что действие исследуемых короткоцепочечных пептидов на клеточный цикл, видимо, обосновано не присутствием конкретной аминокислоты, а скорее всего антиоксидантными свойствами веществ.
Глиобластома – это наиболее частая и агрессивная форма опухоли головного мозга [269]. На сегодняшний день лечение глиобластомы носит скорее паллиативный характер и продлевает жизнь больного максимум на 2 года [270]. Одним из наиболее эффективных способов лечения глиобластомы является лучевая терапия, применение которой ограничено повреждающим действием на нормальные ткани. Соединения, способные усиливать гибель опухолевых клеток, предохраняя при этом нормальные ткани, представляют собой одно из наиболее актуальных направлений исследований.
С помощью колониеформирующего метода было продемонстрировано, что предварительная инкубация клеток глиобластомы с карнозином приводит к снижению выживаемости клеток после действия ионизирующего излучения по сравнению с контролем (Рис. 3.4.1). Ранее было показано, что обработка нормальных клеток карнозином снижает последствия повреждающего действия радиации. Введение мышам карнозина в течение нескольких дней перед облучением способствовало повышению выживаемости животных и сопровождалось увеличением эффективности образования селезеночных колоний гематопоэтическими стволовыми клетками из костного мозга облученных животных [218-220]. Кроме того, карнозин снижал степень повреждения плазмиды ДНК и количество разрывов в цепи ДНК, индуцированные действием ионизирующего излучения [271]. Исходя из полученных нами данных мы предполагаем, что карнозин способен избирательно снижать выживаемость опухолевых клеток под действием ионизирующего излучения, защищая при этом нормальные клетки. Полученные нами данные могут быть использованы на практике для разработки протоколов применения карнозина в терапии опухолей головного мозга.
ВЫВОДЫ
1. Исследован характер воздействия карнозина на пролиферацию культур опухолевых клеток: феохромоцитомы крысы (РС-12), карциномы горла и рта (FaDu и Cal27), карциномы молочной железы (MB231) и глиобластомы человека (U-118-MG). Обнаружено, что карнозин ингибирует пролиферацию всех исследованных клеточных линий. Наиболее выраженный эффект проявлялся на клетках глиобластомы человека U-118-MG;
2. Изучено влияние карнозина на уровень АФК и активность антиоксидантных ферментов глиобластомы. Выявлено, что ингибирование пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением уровня АФК и увеличением активности MnСОД;
3. Исследовано воздействие карнозина на клеточный цикл клеток РС-12 и U-118-MG. Установлено, что изменения в антиоксидантной системе сопровождаются накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и усилением экспрессии циклина В1;
4. Проведено сравнение антипролиферативного эффекта карнозина с действием его производных и синтетического трипептида пинеалона. Выявлено, что метилированное производное карнозина, анзерин, ингибирует пролиферацию клеток опухолевых клеток эффективнее, чем карнозин;
5. Исследован эффект совместного применения карнозина и ионизирующего излучения на гибель опухолевых клеток. Обнаружено, что предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mannion, A.F., et al., Carnosine and anserine concentrations in the quadriceps femoris muscle of healthy humans. Eur J Appl Physiol Occup Physiol, 1992. 64(1): p. 47-50.
2. Margolis, F.L., Carnosine in the primary olfactory pathway. Science, 1974. 184(4139): p. 909-11.
3. Kalyankar, G.D. and A. Meister, Enzymatic synthesis of carnosine and related beta-alanyl and gamma-aminobutyryl peptides. J Biol Chem, 1959. 234: p. 3210-8.
4. Stenesh, J.J. and T. Winnick, Carnosine-anserine synthetase of muscle. 4. Partial purification of the enzyme and further studies of beta-alanyl peptide synthesis. Biochem J, 1960. 77(3): p. 575-81.
5. Skaper, S.D., S. Das, and F.D. Marshall, Some properties of a homocarnosine-carnosine synthetase isolated from rat brain. J Neurochem, 1973. 21(6): p. 1429-45.
