Лечебно профилактическая эффективность пробиотика лаксубтил при колибактериозе телят
На правах рукописи
Каримов Мунирджон Мухторович
ЛЕЧЕБНО ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОБИОТИКА ЛАКСУБТИЛ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ТЕЛЯТ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Душанбе – 2012
Работа выполнена в лаборатории микробиотехнологии Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура.
| Научный руководитель: | доктор ветеринарных наук, профессор, академик ТАСХН Саттори И. |
| Официальные оппоненты: | доктор ветеринарных наук Муминов А. М. |
| Кандидат ветеринарных наук Вазиров Ш. |
Ведущая организация: НПО «Биологические препараты»
Защита диссертации состоится 23 ноября 2012 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета ДМ 050.001.01 при Институте ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, г. Душанбе, ул. Каххарова, 43, тел. (992-372) 27-39-95
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ветеринарного института ТАСХН, или на официальных сайтах ВИ ТАСХН www.tajnivi.tj и ВАКа России www.vak2.ed.gov.ru
Автореферат разослан 28 сентября 2012 г.
| Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор ветеринарных наук | Н. Ярбаев |
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Желудочно-кишечные молодняка сельскохозяйственных животных наносят животноводческим хозяйствам Республики Таджикистан значительный экономический ущерб, который выражается в снижении привеса, падеже, затрат на диагностику, профилактику и терапию.
Инфекционные энтериты распространены повсеместно, наиболее часто во всех животноводческих хозяйствах его наблюдают ранней весной, осенью и зимой. Отход телят от диареи может достигать 30 – 50% и более, от количества родившихся животных. (Салахутдинов К.Г. 1993., Волков Г. К.1997., Жумаев Н. С. 1986., Сатторов И.Т.1991.)
На молочно-товарных фермах, одной из главных причин гибели молодняка является желудочно-кишечные болезни, вызываемые бактериальными и вирусными агентами.
В борьбе с патогеннами, возбудителей болезней животных первостепенная роль отводится неспецифическим и специфическим факторам резистентности организма. Накопление антибиотикорезистентных бактерий в организме животных и окружающей среде снижает эффективность профилактических и лечебных мероприятий и приводит к тяжелым экологическим последствиям (Субботин В. В., Сидоров М. А. 2001.).
Профилактика и лечение этих болезней антибиотиками, сульфаниламидами, нитрофурановыми и химиотерапевтическими препаратами не всегда даёт желаемый результат.
В настоящее время для профилактики и терапии желудочно-кишечных болезней и повышения продуктивности молодняка сельскохозяйственных животных широко применяют различные симбиотические микроорганизмы - пробиотики, среди которых наиболее перспективными признаны молочнокислые, пропионовокислые, бифидобактерии, Bacillus subtilis и др., проявляющие избирательную антагонистическую активность в отношении патогенной кишечной флоры, эффективно и быстро восстанавливающие микробиоценоз кишечника (Антипов В. А., 1991; Панин А. Н. и др., 1993; Паршин П. А. и др., 1997; Малик Н. И. и др., 2000; Сатторов И.Т. и др.2001 и др.).
Вышеизложенное, обуславливает актуальность настоящей работы целью, которой является распространения колибактериоза телят и разработка эффективных методов профилактики и лечения этой болезни с помощью пробиотика Лаксубтил.
Для достижения поставленной цели в задачи исследования входило:
- Изучить распространение колибактериоза телят в животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан.
- Разработать эффективный пробиотический препарат Лаксубтил на основе штаммов B.subtilis и изучить его свойства
- Определить лечебную и профилактическую эффективность Лаксубтила при колибактериозе телят в экспериментальных и производственных условиях.
- Разработать рекомендацию по использованию пробиотика Лаксубтил при профилактике колибактериозов телят.
Научная новизна. Изучено роль эшерихии коли в возникновении энтеритов телят в хозяйствах и определена характер чувствительности возбудителей к пробиотику.
Подобраны штаммы B. subtilis и изучена их антибактериальная активность в отношении музейных штаммов и изолятов возбудителя колибактериозе телят.
Разработан новый пробиотический препарат Лаксубтил в форме суспензии на основе местных штаммов B. subtilis, отработаны методы изготовления и контроля препарата, изучены его антимикробные свойства и безвредность.
Установлена лечебная и профилактическая эффективность Лаксубтила при колибактериозе телят, отработан рациональный способ применения препарата.
Практическая ценность. На основании полученных результатов, предложен пробиотичекий препарат Лаксубтил для профилактики и лечения колибактериоза телят.
Материалы диссертации вошли в нормативную документацию на препарат:
- Научно обоснованная система получения здорового молодняка и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят (рекомендации) (утв. ГУВ МСХ РТ 11.09.2012 г.);
- Рекомендация по профилактике и лечению пневмоэнтеритов телят (11.09.2012 г.).
- Пат. TJ 819 Республика Таджикистан, Способ получения биопрепарата Лаксубтил / Саттори И., Сатторов Н.Р., Турдиев Ш.А., Хасанов Н.Р., Сафаралиев А.Р., Баротов С.Т., Юсупов М.М. // Гос. регис. № 1200719 19.04.2012.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- результаты исследования этиологической роли эшерихии коли в возникновении колибактериоза телят;
- результаты подбора штаммов B. Subtilis, для создания пробиотического препарата и изучения их антагонистической активности;
- технология изготовления и методы контроля физико-химических и биологических свойств Лаксубтила;
- результаты изучения антибактериальной активности и безвредности Лаксубтила;
- результаты экспериментальных и производственных испытаний эффективности препарата при колибактериозе телят.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета Таджикского аграрного университета имени Ш.Шотемур (ТАУ) (2006 – 2010 гг.); республиканских конференциях и семинарах-совещаниях (Душанбе, 2006 – 2010 гг.); Международной научно-практической конференции «Биобезопасность и зоонозные инфекции» Алматы, Казахстан – 2009 г, Международной научно-практической конференции “Research and Clinical Application of Traditional Medicine in Xinjiang and Neighbouring Countries” Урумчи, Китай - 2011, Международной научно-практической конференции «Ветеринарные проблемы в Центральной Азии - Продовольственная безопасность: Использование современных методов диагностики и профилактики инфекционных болезней животных» Душанбе, Таджикистан - 2011,
Публикации. По результатам исследований опубликованы 5 научных работ, получены: 1 патент РТ и 2 рекомендации.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.
Диссертация изложена на 108 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 6 рисунками. Список литературы содержит 240 источников. В приложение включены материалы, подтверждающие внедрение результатов исследования в практику.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в 2006 – 2011 гг. в лаборатории микробиотехнологии Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура в соответствии с республиканской научно-технической программой «Разработка и внедрение пробиотика на основе Bacillus subtilis» на 2006 – 2010 гг., зарегистрированной в Национальном патентно-информационном центре (НПИЦентр) РТ (№ госрегистрации 0105 ТД 233).
Научно-производственные опыты, апробация и производственная проверка полученных результатов, проведены в 12 животноводческих хозяйствах РТ.
Диагностика колибактериоза. Колибактериоз диагностировали на основании анализа эпизоотологических данных с учетом клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования патологического материала от больных, павших и вынужденно убитых больных телят.
При бактериологической диагностике микроскопировали мазки крови и мазки-отпечатки внутренних органов, на элективные питательные среды высевали выделеные из патологического материала культуры, для определения патогенности которых заражали лабораторных животных, затем культуры идентифицировали и типизировали серологическим методом.
Подопытные животные. Эксперименты проводили на 120 белых мышах (массой 18 – 20 г), 60 кролике, породы шиншилла (массой 2,5 – 2,7 кг), 288 телятах черно-пестрой породы (массой 28 – 30 кг), производственные испытания – 422 телятах черно-пестрой породы (массой 29 – 31 кг). Разброс в экспериментальных группах по исходной массе тела не превышал 10%.
Распространение колибактериоза телят в Республике Таджикистан выяснили по данным ветеринарной отчетности ГУВ МСХ РТ и результатам исследования патологического материала от животных.
Культуральные, морфологические и биохимические свойства культур изучали согласно методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза животных (утв. ГУВ МСХ СССР в 1981г.).
Определение серологических вариантов эшерихий проводили согласно наставлению по применению агглютинирующих О – коли-сывороток (утв. ГУВ МСХ СССР в 1980г.).
Препараты. В работе применяли разработанный в ТАУ пробиотик Лаксубтил, представляющий собой комплекс взвеси микробных клеток местных штаммов (BS TJ 09, BS TJ Д 26) B. Subtilis и коровье молоко.
При разработке Лаксубтила использовали штамм B. subtilis, выделенных из ЖКТ новорожденных телят (BS TJ 08, BS TJ 09) и штамм из коллекции ТАУ (BS TJ Д 24, BS TJ Д 26).
Для стандартизации и контроля качества Лаксубтила, а также изучения его стабильности при хранении, разработаны методы качественного и количественного контроля препарата.
Физико-химические свойства Лаксубтила
Внешний вид, наличие механических примесей, плесени определяли визуально при рассмотрении отобранных образцов, при хорошем естественном освещении на белом фоне на расстоянии 25 – 30 см от глаз.
Концентрацию водородных ионов (рН) 10% водной суспензии определяли потенциометрически (ГФ XI, вып. 1, с. 175).
Биологические свойства Лаксубтила
Однородность определяли методом микроскопии.
Подсчет количества микробных клеток (м.к.) B. subtilis. Культуру разводили физиологическим раствором в 10 – 15 раз и заправляли суспензией подготовленную камеру Горяева, в 5 квадратах которой под микроскопом определяли количество м.к. и рассчитывали их число в 1 см3.
Определение количества жизнеспособных клеток B. subtilis. В пробирку, содержавшую 1 мл Лаксубтил добавляли 9 см3 стерильного физиологического раствора, после тщательного перемешивания 0,5 см3 суспензии переносили во вторую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора, из которой 0,5 см3 разведенной суспензии – в третью, из третьей – в четвертую, из четвертой – в пятую, из пятой – в шестую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора.
Из последней (шестой) пробирки по 0,5 см3 суспензии пипеткой засевали в шесть чашек Петри с агаром СБД (комплекс минеральных и растительного компонентов), колебательными движениями распределяя суспензию по всей поверхности агара. Культивировали 36 ч при 37оС, после чего учитывали результаты исследования (определяли количество больших и малых по диаметру колоний).
Стерильность Лаксубтила определяли по ГОСТу 28085-89.
Для исключения контаминации микоплазмами производили посевы проб субтилбена на среду Эдварда (жидкую, полужидкую и твердую), обогащенную 20% сыворотки крови лошади, 10% дрожжевого экстракта, 0,5% глюкозы с добавлением фенол-рота в конечной концентрации 0,001%.
Изучение антагонистических свойств Лаксубтила в сравнительном аспекте (контроль – субтилбен) проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой и плотной питательной средах на 6-и музейных штаммах и 10-и изолятах E. Coli выделенных от больных диареей телят в животноводческих хозяйствах РТ.
Токсические свойства Лаксубтила
Безвредность Лаксубтила изучали двумя способами. Первый, который используют для проверки продуктов микробиологического синтеза (ГОСТ Р 52337-2005, ТУ 9388-001-885-95), а второй – для установления острой токсичности лекарственных средств на лабораторных животных (Методические указания по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве М., 1988).
В процессе проведения исследований в первом методе, определение степени токсичности экспериментального пробиотика. проводили с использованием сухой культуры инфузорий колподы, согласно требований ГОСТ Р 52337-2005. Примененный метод базируется на экстрагировании с исследуемых продуктов различных фракций токсических веществ дистиллированной водой и в последствии воздействием, полученных экстрактов, на на культуру инфузории Colpoda steinii. Оценку результатов данного биотеста проводят по результатам гибели стилохоний.
Исполнение опыта, по определению токсичности экспериментального препарата, с помощью этого экспрес-метода, состояло в последовательном исполнении следующих действий: подготовка инфузорий, приготовление питательной среды и водного экстракта продукта, проведение эксперимента и оценки его результатов.
Средой для культивирования инфузорий и разбавления экстрактов служил раствор Лозина-Лозинского. Его готовили из следующих компонентов: NaCl – 0,01%; KCl – 0,001%; CaCl2-двуводный – 0,001%; MgCl2-шeстиводный – 0,001%; NaHCO3 – 0,002%. Затем, в ту часть раствора, какую планировали использовать для культивирования инфузорий, вносили свеже высушенные хлебопекарские дрожжи (12 мг на 100 мл), которые предварительно тестировали на токсичность.
Для проведения опытов настоящей методикой, использовали суточную культуру стилохоний, находящихся в фазе экспоненциального (активного) роста. Поэтому, за сутки до опыта, стилохонии в ампулах, в которых поставляли их цисты и споры культуры, пересаживали в новую питательную среду со свежим кормом и помещали в термостат при температуре 22-24о С.
Для приготовления водного экстракта, испытываемых образцов, брали навеску массой 1000+10 мг, вносили ее в колбу вместимостью 25 мл, заливали 10 мл дистиллированной воды и на 20 минут колбу помещали в аппарат для встряхивания жидкостей. Затем раствор в течении 5 минут центрифугировали с частотой вращения 1000 об/мин и использовали над осадочную жидкость.
Каждую пробу исследовали в пяти повторностях. Пересадку и подсчет стилохоний проводили под микроскопом при увеличении 2 х 8 или 2 х 14. Сначала автоматической пипеткой отбирали по 20 мкл среды со стилохониями и помещали в каждую лунку двух рядов блока микроаквариумов (5 лунок в ряде – всего 10 лунок). Через 2 минуты, учитывали в каждой лунке, количество живых стилохоний. Затем, в пят (опытных) лун первого ряда добавляли по 20 мкл полученного водного экстракта, а в 5 лунок второго ряда (контроль) – такое же количество дистиллированной воды и засекали время. Спустя три часа, в лунках опытного и контрольного рядов снова проводили подсчет количества активных стилохоний и сопоставляли результаты.
Выживаемость стилохоний кожного ряда (N,%) вычисляли по следующей формуле –
N = N2 : N1 х 100 где:
N1 – среднеарифметическое (из пяти) значение количества активных стилохоний в начале опыта, шт;
N2 – среднеарифметическое (из пяти) значение количества активных стилохоний в конце опыта, шт.
Изучение острой токсичности нового пробиотика, на лабораторных животных, проводили в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве». Опыты провели на 40 белых мышах двухмесячного возраста, массой 18-21 г. Перед началом исследований их содержали в обычных условиях и наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали вечером накануне опыта, прием воды не ограничивали.
Из белых мышей по принципу парных аналогов, сформировали 5 групп (n=8). Из них 4 опытных и одна – контрольная.
Исходя из результатов предыдущего опыта, о нетоксичности препарата Лаксубтил на культуре колпод, в этой серии наблюдений сразу применили высшие дозы исследуемого препарата. Для этого, мышам 4-х опытных групп пробиотик в виде суспензии вводили однократно перорально в дозе – 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я группа), 0,3 мл (3-я группа) и 0,5 мл (4-я группа), что в пересчете на 1 кг массы тела составляло соответственно: 5 мл; 10мл; 15 мл и 25 мл.
Контрольным животным (5-я группа), в таком же объеме, ввели только физиологический раствор.
Через 6 часов после введения препарата произвели очередную дачу корма белым мышам всех групп, которых в дальнейшем переводили на обычный режим кормления. За животными наблюдали в течение 15 дней, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.
Стабильность Лаксубтила. Срок годности Лаксубтила изучали при естественном хранении (+18-+20оС) и в условиях холодильника (+2 - +4оС). С этой целью часть образцов экспериментальных серий препарата оставляли при комнатном температуре, а другую часть помещали в холодильник на сроки, соответствующие 1; 5; 10; и 15 дней. Оценку качества препарата проводили по основным показателям.
Ветеринарно-санитарную экспертизу мяса осуществляли согласно ГОСТу 202353.
Для изучения профилактической эффективности Лаксубтила вводили перорально в дозе 3; 5 и 10 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 10 дней, лечебной – в тех же дозах 2 раза в сутки до выздоровления.
Экономическую эффективность научных разработок рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (утв. ГУВ МСХ СССР в 1982 г.), а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений» (утв. МСХ СССР в 1983 г.).
Методики отдельных экспериментов изложены в соответствующих разделах диссертации.
Цифровой материал диссертации обработан статистически по критерию Стьюдента, для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при p0,05 (Лакин Г. Ф., 1990).
За основу выводов и практических предложений взяты результаты контролируемых опытов в лабораторных и производственных условиях.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Распространение колибактериоза телят в хозяйствах РТ
При диагностике патологического материала от больных животных определено, что на молочно-товарных фермах Таджикистана в возникновении диареи телят большую роль играют эшерихии коли. Вероятность возникновения и тяжесть течения колибактериоза определяют внешние факторы, влияющие на естественную резистентность и иммунологическую реактивность организма.
В 2006 – 2011 гг. нами исследованы 422 проб патологического материала (фекалии, кровь, паренхиматозные органы) от новорожденных телят из 12 животноводческих хозяйств РТ (табл. 1).
Таблица 1
Результаты бактериологического исследования
патологического материала от новорожденных телят (2006 – 2011 гг)
| Количество хозяйств | Количество проб | |||
| всего | неблагополучных | Всего | положительных | |
| РРП | 3 | 3 | 120 | 52 (43,3) |
| Согдийская область | 5 | 4 | 206 | 78 (37,8) |
| Хатлонский область | 4 | 1 | 96 | 32 (33,3) |
| Итого | 12 | 8 | 422 | 162 (38,3) |
Примечание. В скобках указано процентное значение.
Наибольшее количество, больных колибактериозом телят (43,3%), выявлено в хозяйствах РРП, наименьшее (37,8%) в Согдийской и (33,3% ) Хатлонской областях.
При идентификации выделенных культур в основном были выявлены серотипы – О8, О101, О26, О86, О115, О137, О117, О118, О119, О82 и О32.
Таблица 2
Соотношение серотипов E. Coli по регионам Республики Таджикистан (%)
| Серотипы | Таджикистан | ||
| Северный | Центральный | Южный | |
| О101 | 3,8 | 5,4 | 3,6 |
| О8 | 3,5 | 4,8 | 2,7 |
| О26 | 4,0 | 5,0 | 3,0 |
| О115 | 1,1 | 3,3 | 0,5 |
| О86 | 7,2 | 9,5 | 3,3 |
| О137 | 2,4 | 3,8 | 2,8 |
| О117 | 4,1 | 8,0 | 2,1 |
| О118 | 2,0 | 4,3 | 1,3 |
| О119 | 0,8 | 2,9 | 1,1 |
| О82 | 1,4 | 3,0 | 1,1 |
| О32 | 1,2 | 1,2 | 0,9 |
В процентном отношении больше всего титровались серотипы О86 (20,0%), О101 (12,8%), О137 (9,0%), О8 (11,0%), О117 (14,2%) и О26 (12,0%). Из патологического материала одного животного выделяли от 1 до 3 серотипов эшерихий. При этом закрепленности какого либо серотипа за определенной географической зоной не установлено. Колибактериоз у телят отмечали в зимне-весенний период (51,8% от общего количества заболевших за год). Летом заболеваемость составляло 8,0%, осенью 40,2%. При проведении круглогодовых отелов телята заболевали на протяжении всего года с некоторыми колебаниями по месяцам.
Установлено, что заболеваемость по мере увеличения численности приплода повышалась и составляла 32,0%. После пика заболеваний в марте количество заболевших снижалось а в ноябре и декабре повышалось до 18,0%
Таким образом, колибактериоз широко распространено в хозяйствах РТ, что обусловливает актуальность разработки новых противобактериальных лекарственных средств и рациональных способов их применения.
3.2. Подбор штаммов B. subtilis и изучение их антагонистических свойств
Отбор производственных штаммов B. Subtilis, производили из 4 штамма B. subtilis, выделенного из ЖКТ новорожденных телят (BS TJ 09, BS TJ 08), и штаммы из коллекции ТАУ (BS TJ Д 24, BS TJ Д 26).
В результате изучения морфологических свойств было установлено, что исследуемые культуры представляют собой грамположительные спорообразующие палочки с закругленными концами. Размер клеток – 1,90,5 нм; в мазках 18-часовой культуры клетки расположены одиночно, попарно, реже – в цепочку. Споры в клетке расположены центрально, размер спор – 0,90,5 нм.
На твердых питательных средах, при температуре 37оС, через 24 ч наблюдали рост бактерий в виде кремово-белых складчатых колоний с кратерообразным центром, вязкой консистенции, края колоний изрезанные.
Испытуемые культуры восстанавливали нитраты до нитритов, образовывали каталазу, кислоты из D-глюкозы, L-арабинозы, D-ксилозы и D-маннита, окисляли глюкозу с образованием ацетона (ацетилметилкарбинола), расплавляли крахмал, желатин и казеин.
При пероральном и парентеральном введении смывов суточной агаровой культуры, испытуемых штаммов B. Subtilis, белым мышам, кроликам и телятам в концентрациях 3 – 10 млрд м.к./гол. признаки заболевания и других физиологических отклонений у опытных (в сравнении с контрольными) животных не отмечали.
Для установления бактерицидного действия штаммов B. Subtilis, с учетом результатов предварительного микроскопического исследования, проводили посев на агаровую или бульонную картофельную среды. Наименьшую концентрацию препарата, при которой после 24 – 72 ч инкубации, при микроскопии наблюдали только грамположительные палочки B. subtilis и принимали за минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК).
Оценку бактерицидной активности (изменение морфологии, лизис клеток тест-культуры) проводили через 12, 18, 24, 36, 48 и 72 часов.
При МПК в мазках тест-культуры, окрашенных по Граму, наблюдали задержку роста, МБцК (после пересева на агаровую или бульонную среды СБД) через 24 – 72 ч инкубации – только грамположительные палочки B. subtilis.
Таблица 3
Антагонистические свойства штаммов B.subtilis
к серотипам, (млн м.к./мл)
| Серотипы E. coli | BS TJ 08 | BS TJ 09 | BS TJ 24 | BS TJ Д 26 | ||||
| МПК | МБцК | МПК | МБцК | МПК | МБцК | МПК | МБцК | |
| О86 | 62,5 | 125,0 | 15,6 | 31,2 | 31,2 | 62,5 | 31,2 | 62,5 |
| О117 | 62,5 | 125,0 | 31,2 | 62,5 | 62,5 | 125,0 | 31,2 | 62,5 |
| О101 | 31,2 | 62,5 | 31,2 | 62,5 | 31,2 | 62,5 | 7,8 | 15,6 |
| О26 | 31,2 | 62,5 | 15,6 | 31,2 | 31,2 | 62,5 | 7,8 | 15,6 |
Результаты бактериологического исследования показали, что МПК культур B. subtilis составляет 7,8 – 125,0 млн м.к./мл. Высокую противобактериальную активность (15,6 – 62,5) млн м.к./мл) проявили культуры BS TJ 09 и BS TJ Д 26.
Полученные данные о морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных свойствах, патогенностости и противомикробной активности штаммов BS TJ 09 и BS TJ Д 26 послужили основанием для использования их при изготовлении Лаксубтила.
3.3. Разработка лекарственной формы Лаксубтила
3.3.1. Состав
Для успешной профилактики и лечения бактериальных желудочно-кишечных и респираторных болезней, необходима одновременная обработка большого поголовья, поэтому наиболее удобной и эффективной лекарственной формой является суспензия для перорального применения.
Действующим веществом пробиотика Лаксубтил на основе штаммов BS TJ 09 и BS TJ Д 26 в форме суспензии являются субстанции в форме порошков, содержащих бактериальную массу, минеральные и растительные вещества, в количестве, указанном в таблице 4.
Таблица 4
Состав пробиотика Лаксубтил в форме суспензии, %
| Компонент | Кол-во |
| Порошок, содержащий бактериальную массу BS TJ Д 24 (30 млрд м.к./г) | 0,0005 |
| Порошок, содержащий бактериальную массу BS TJ Д 24 (30 млрд м.к./г) | 0,0005 |
| Сахароза | 5,0 |
| Коровье молоко | 94,999 |
3.3.2.Технологический процесс производства пробиотика Лаксубтил.
С полужидкого агара культуру производственного штамма B. subtilis засевали в пробирку с бульоном ДСС, и выращивали в течение 18-24 часов, при температуре 37С. Проверяли на чистоту и пересеивали на 1-литр пастеризованного и охлажденного до 37оС молока, перемешивая в течение 5-10 минут хорошо растворяли и ставили в термостат в течение 16-24 часов, при температуре 37оС. (Производственное молоко не должно содержать ингибиторов, (например, антибиотики) и проверяется его способность к сквашиванию (ферментационный тест).
Для проверки на стерильность, пробы, отобранные из каждого варианта приготовленного пробиотика Лаксубтила, по 1 мл разводили в 4 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса и делали посевы в объеме 0,2 мл в две пробирки с МПБ, МПА, мясопептонным печеночным бульоном (МППБ) под вазелиновым маслом, среду Сабуро и в объеме 1 мл в два флакона с МПБ. Посевы на среде Сабуро выдерживали при 22 – 24, а остальные – 37оС. Визуально отмечали рост бактерий в виде кремово-белых складчатых колоний с кратерообразным центром, вязкой консистенции, края колонии изрезанные. При микроскопии видны грамположительные спорообразующие палочки с закругленными концами. Размер бактерий – 1,9х8 мкм; в мазках 28 часовой культуры клетки расположены одиночно и попарно, реже – в цепочке.
Для подсчета количество микробных клеток, культуру разводили физиологическим раствором в 10 – 15 раз и заправляли суспензией подготовленную камеру Горяева, в 5 квадратах которой под микроскопом определяли количество м.к. и рассчитывали их число в 1 см3 (Х) по формуле:
где А – количество микробных клеток в 5 квадратах камеры;
1000 – количество кубических миллиметров в 1 см3;
225 – количество квадратов в камере Горяева;
0,9 – объем камеры Горяева, мм3;
Для определение количества жизнеспособных клеток B. Subtilis, в пробирку, содержавшую 1 г субтилбена добавляли 9 см3 стерильного физиологического раствора, после тщательного перемешивания 0,5 см3 суспензии переносили во вторую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора, из которой 0,5 см3 разведенной суспензии – в третью, из третьей – в четвертую, из четвертой – в пятую, из пятой – в шестую, из шестой - в седьмую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора.
Из последней (седьмой) пробирки по 0,5 см3 суспензии, пипеткой засевали в шесть чашек Петри с агаром СБД (комплекс минеральных и растительного компонентов), колебательными движениями распределяя суспензию по всей поверхности агара. Культивировали 36 ч при 37оС, после чего, учитывали результаты исследования (определяли количество больших и малых по диаметру колоний). В первом варианте насчитали от 20 до 30 колонии, во втором от 50 до 70 колоний и в третьем от 10 до 20 колонии. Результаты исследования показали, что количество микробных клеток в одном мл в:
1 варианте от 200 до 300 млн/м.к.
2 вариант от 500 до 700 млн/м.к.
3 вариант от 100 до 200 млн/м.к.
Основные технологические стадии изготовления Лаксубтила в форме суспензии:
1. Взвешивание компонентов.
2. Пастеризация и охлаждение молока до 40оС.
3. Смешивание компонентов до образования суспензии.
4. Инкубация бактериальной суспензии при температуре 25 – 30оС в течение 24 ч.
5. Упаковка и хранение.
6. Контроль серии.
3.4. Антагонистические свойства Лаксубтила
Изучено противомикробное действие Лаксубтила по методу Першина (1985) в сравнении с субтилбеном, по отношении к серотипам E. coli. Опыт проведен трехкратно. Результаты опытов представлены в таблице № 5.
Таблица 5
Противомикробное действие Лаксубтила в отношении к серотипам эшерихии коли
| Серотипы эшерихии коли | количество бактерий в пробиотиках, млн/мл | |||||||
| 500 | 250 | 125 | 62,5 | 31,2 | 15,6 | 7,8 | Контроль | |
| О86 | - | - | - | + | + | + | + | + |
| О101 | - | - | - | - | + | + | + | + |
| О137 | - | - | - | + | + | + | + | + |
| О8 | - | - | - | + | + | + | + | + |
| О117 | - | - | - | + | + | + | + | + |
| О26 | - | - | - | + | + | + | + | + |
| О115 | - | - | - | - | + | + | + | + |
примечание: ( – ) – гибель бактерий. ( + ) – рост бактерий.
Из таблицы видно, что Лаксубтил обладает высокой антагонистической активностью в отношении серотипов изолята E. coli, Минимальное количество пробиотика, что обеспечило гибель бактерий, составило 15,1-31,2 млн. бактерий на 1 мл. Противомикробное действие Лаксубтила было равно субтилбену.
3.5. Токсические свойства Лаксубтила
При изучение безвредности Лаксубтила первым методом, определение степени токсичности экспериментального пробиотика, проводили с использованием сухой культуры инфузорий колподы согласно требований ГОСТ Р 52337-2005.
Для проведения опытов за настоящей методикой использовали суточную культуру стилохоний, находящихся в фазе экспоненциального (активного) роста. Поэтому, за сутки до опыта, стилохонии, их ампулы, в которых поставляли их цисты и споры культуры, пересаживали в новую питательную среду со свежим кормом и помещали в термостат при температуре 22-24о С.
В ходе анализа результатов опыта на культуре колпод (табл.6), после проведения исчислений в соответствии с приведенной выше формулой, установлено, что через три часа опыта активность стилохоний опытного ряда составила 89%, а в контроле – 90%.
Руководствуясь требованием ГОСТ-а Р 52337-2005, к не токсичным препаратам микробиологического синтеза, относят средства, под действием которых за установленное время, остаются активными свыше 80% стилохоний. Исходя из этого, пробиотик Лаксубтил является не токсичным препаратом.
Таблица 6
Результаты реагирования стилохоний на пробиотик Лаксубтил
| Ряд лунок | Кол-во активных стилохоний | |||||||||||
| в начале опыта | через 3 ч | |||||||||||
| № лунки | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | N1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | N2 | |
| Опытный | 9 | 11 | 8 | 9 | 8 | 45 | 8 | 9 | 8 | 8 | 7 | 40 |
| Контроль | 10 | 8 | 12 | 9 | 11 | 50 | 9 | 7 | 10 | 9 | 10 | 45 |
Примечание: N1 и N2– общее количество активных стилохоний
3.5.1. Острая токсичность
Изучение острой токсичности нового пробиотика, на лабораторных животных, проводили в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве». Опыты проводили на 40 белых мышах двухмесячного возраста (массой 18 – 21 г). Перед началом исследований лабораторных животных содержали в обычных условиях и наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали накануне опыта вечером, прием воды не ограничивали. Из белых мышей по принципу парных аналогов сформировали 5 групп (n=8): 4 опытные и 1 контрольная.
Исходя из результатов предыдущего опыта о нетоксичности препарата Лаксубтил на культуре инфузории Colpoda steinii, в этой серии наблюдений мышам опытных групп пробиотик вводили перорально однократно в дозах 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я группа), 0,3 мл (3-я группа) и 0,5 мл (4-я группа), что в пересчете на 1 кг массы тела составляло соответственно 5 мл; 10 мл; 15 мл и 25 мл. Контрольным животным (5-я группа) в таком же объеме вводили физиологический раствор.
Через 6 ч после введения препарата белым мышам всех групп давали корм и переводили их на обычный режим кормления. За лабораторными животными наблюдали в течение 15 сут, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.
При определении острой токсичности пробиотика за клиническим состоянием белых мышей наблюдали в течение первых шести часов, потом через каждые 3 ч в течение первых суток опыта, учитывая начало и динамику развития клинических проявлений отравления, время гибели опытных животных или симптомы улучшения их физиологического состояния. В последующие 14 дней опыта ежесуточно три раза отмечали клиническое состояние лабораторных животных. За все время наблюдения не было ни одного случая гибели белых мышей кроме кратковременного снижения двигательной активности в первые 3 – 4 ч наблюдений. В дальнейшем клиническое состояние опытных и контрольных лабораторных животных не отличалось (табл. 7).
Таблица 7
Результат изучения острой токсичности пробиотика Лаксубтил
на белых мышах.
| Показание | Номер группы и доза препарата, г /кг | ||||
| №1 | №2 | №3 | №4 | №5 | |
| 9,0 | 11,0 | 13,0 | 15,0 | 0 | |
| Количество животных, гол. | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| Из них выжило | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| Пало | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Таким образом, опыты на белых мышах свидетельствуют о том, что пробиотик Лаксубтил при энтеральном введении в максимальной дозе (25000 мг/кг) не вызывает гибели экспериментальных животных. Следовательно, препарат в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 относится к VI классу токсичности, то есть к нетоксичным веществам.
3.5.2. Хроническая токсичность
Исследования по определению хроническая токсичности, раздражающие и аллергенные свойства пробиотика Лаксубтил были проведены согласно «Методическим указаниям по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве». Опыты провели на кроликах породы шиншилла массой 2,5-2,7 кг (n=60).
Хроническую токсичность Лаксубтила изучали в опытах по скармливанию препарата один раз в день в течение 30 сут трем группам (n=10) кроликов породы шиншилла (n=60, масса – 2,5 – 2,7 кг) в 1-, 2- и 3-кратной ориентировочно-терапевтической дозе (5 мл/кг массы тела). Животные контрольной группы (n=10) препарат не получали. За лабораторными животными наблюдали во время всего опыта, по окончании которого их усыпляли и проводили патологоанатомическое вскрытие.
Таблица 8
Схема опыта на кроликах по определению хронической токсичности
| Группа | Препарат | Путь введения | Доза, г/кг | Кратность введения | Кратность превышения терапевтической дозы |
| 1-я опытная | Лаксубтил | Внутрь | 5 | Один раз в день в течение 30 дней | 1 |
| 2-я опытная | 10 | 2 | |||
| 3-я опытная | 15 | 3 | |||
| 4-я контроль | - | - |
3.5.3. Влияние на кожу и слизистые оболочки белых мышей и кроликов.
Раздражающее действие пробиотика Лаксубтил на кожу кроликов изучали на 6 кроликах, которым ежедневно делали аппликации на выстриженных участках кожи нативного препарата в дозе 0,1 см3 в течение 26 сут, учитывая реакцию кожи (гиперемия, болезненность, утолщение кожной складки, расчесы) и клиническое состояние организма лабораторных животных.
Раздражающее действие Лаксубтила на слизистую оболочку глаза определяли на двух группах (n=6) самок кроликов, первым (опытная группа) из которых в конъюнктивальный мешок однократно закапывали 10%-ную суспензию Лаксубтила в объеме 0,1 см3, вторым (контроль) – инстилировали воду в том же объеме. Влияние препарата оценивали по проявлению гиперемии, инъекции сосудов склеры, слезотечению.
Аллергенные свойства Лаксубтила определяли на 12 кроликах, из которых сформировали 2 группы (n=6). Опытным животным на выстриженные участки кожи наносили ежедневно в течение 14 дней по 0,1 см3 10%-ной суспензии препарата, контрольным – физраствора. После 14-дневного перерыва однократной аппликацией в том же объеме наносили разрешающую дозу соответственно Лаксубтила и физраствор, учитывая реакцию кожи и общее состояние животных.
При изучении хронической токсичности препарата установлено, что его длительное введение в дозах 5, 10 и 15 мл/кг массы тела не влияет на поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова опытных и контрольных лабораторных животных. При применении Лаксубтила в этих дозах не наблюдали повышения температуры тела, характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость кроликов не изменялись.
Лабораторные животные в течение всего опыта оставались живы, охотно принимали корм, были подвижными и не имели отклонений как в клиническом состоянии, так и во внутренних паренхиматозных органах. При исследовании сердца, печени и селезенки у опытных животных нарушений в размере и структуре органов не отмечали. Они были однородного цвета, без кровоизлияний и дистрофических изменений.
Таким образом, пробиотик Лаксубтил не обладает хронической токсичностью при оральном введении лабораторным животным. При изучении раздражающего свойства препарата методами аппликации на кожу и инсталляции на слизистую оболочку глаз установлено, что кожа кроликов на месте нанесения препарата оставалась гладкой, эластичной, неутолщенной, безболезненной и без признаков гиперемии, не наблюдали гиперемии слизистой (оболочки) глаз, инъекции сосудов склеры, слезотечения. Отрицательная реакция кожи и организма кроликов на нанесение разрешающей дозы Лаксубтила свидетельствует об отсутствии сенсибилизации организма.
3.5.4. Доклиническое исследование
Переносимость препарата Лаксубтил исследовали общепринятыми методами на МТФ им. Л. Муродова Гиссарского района. По принципу аналогов сформированы 4 группы (n=11; опытные – 1 – 3-я, контрольная – 4-я) новорожденных телят черно-пестрой породы массой 31 – 33 кг. В опытных группах Лаксубтил применяли из расчета 5, 10, 15 мл/кг массы тела (условно-терапевтическая, двух- и трехкратная дозы от условно-терапевтической) в течение 20 сут.
За телятами наблюдали во время опыта и в течение 14 дней после него, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.
Перед проведением опыта, а также в 1-ый, на 3-ий, 5-ый, 10-ый, 15-ый и 20-ый день применения Лаксубтила проводили биохимические исследования крови.
В течение всего экспериментального периода ни одна из применяемых доз Лаксубтила не оказала отрицательного действия на организм телят, которые были активны и не отставали в развитии и приросте живой массы от контрольных животных.
Ни в опытных, ни в контрольной группах гибели животных не наблюдали. Среднесуточный прирост телят в опытных группах превышал контрольные показатели на 2,5 (1-я группа) и 3,6% (2- и 3-я группы), что свидетельствует о безвредности Лаксубтила, применение которого не оказывает отрицательного влияния на организм телят.
Использование Лаксубтила в указанных дозах не вызывало повышения температуры тела и не влияло на характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.
Проведенные нами исследования показали, что пробиотик Лаксубтил позитивно влияет на количество лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и уровень гематокрита.
Гематологические показатели крови телят как опытной, так и контрольной групп находились в пределах нормы. Повышение количества гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, уровня гематокрита в крови телят опытных групп в пределах верхних границ физиологической нормы свидетельствует, что препарат стимулирует эритропоэз и лейкопоэз, не изменяя стабильности кроветворения и постоянства в составе и общем количестве периферической крови.
Пробиотик Лаксубтил не оказывает существенного влияния на биохимические показатели крови телят. При воздействии препарата на организм животных все изучавшиеся показатели не претерпевали существенных изменений и существенно не отличались от контрольных, что свидетельствует об отсутствии у Лаксубтила токсического действия на организм животных.
3.6. Стандартизация Лаксубтила
Для стандартизации и контроля качества Лаксубтила, изучения его стабильности при хранении, нами разработаны качественные и количественные методы исследований, предусмотренные ОСТ 91500.05.001.00 в требованиях к качеству суспензий.
Результаты проверки качества трех экспериментальных серий, показали хорошую воспроизводимость и точность разработанных качественных и количественных методов контроля Лаксубтила.
Качество препарата характеризуется следующими физико-химическими и биологическими показателями:
1. Внешний вид и цвет – суспензия желтовато-белого цвета.
2. Наличие механических примесей, плесени – нет.
3. Концентрация водородных ионов (рН) – 4,5 – 5,0.
4. Однородность – посторонняя микрофлора отсутствует.
6. Количество м.к. B. subtilis – 500 млн/мл.
7. Количество жизнеспособных клеток B. subtilis – 85 – 90%.
8. Контаминация бактериальной и грибной микрофлорой – отсутствует.
9. Контаминация c микоплазмами – отсутствует.
10. Антагонистические свойства (МБцК в отношении E. Coli,) – 7,8 – 31,2 млн м.к./мл.
11. Токсичность в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 можно отнести к VI классу токсичности, т.е. к веществу относительно безопасному.
3.7. Стабильность Лаксубтила
Изучение стабильности Лаксубтила, при естественном хранении (+18-+20оС) и в условиях холодильника (+2 - +4оС) (часть образцов экспериментальных серий препарата оставляли при комнатной температуре, а другую часть помещали в холодильник на сроки, соответствующие 1; 5; 10 и 15 дней) показало, что по физико-химическим и биологическим показателям качества препарат оставался стабильным в течение соответствующего срока.
При естественном хранении в комнатной температуре (+18-+20оС) физико-химические и биологические свойства Лаксубтила оставались стабильными в течение 2 суток, а при хранении в условиях холодильника (+2 - +4оС) 10 дней.
На основании полученных данных установлен срок хранения препарата – 10 дней. Препарат хранят по списку Б, в сухом, хорошо проветриваемом, защищенном от света и атмосферных осадков месте, при температуре не выше 4оС.
3.8. Ветеринарно-санитарная оценка качества мяса
при введении Лаксубтила
Результаты ветеринарно-санитарной экспертизы и бактериологических исследований мяса, полученного после убоя кроликов, обработанных Лаксубтилом, свидетельствуют о его доброкачественности.
После 5- (2 раза в сутки; 1-я группа) и 10-кратной (1 раз в сутки; 2-я группа) дачи Лаксубтила в дозе 5 мл/кг массы тела, установлено, что мясо кроликов опытных групп не отличалось по качеству от мяса контрольных животных, на разрезе мышечная ткань красноватого цвета, поверхность разреза влажная, эластичная, плотная; бульон прозрачный без посторонних запахов.
Бактериологическими исследованиями обсемененности проб мяса и внутренних органов микроорганизмами из групп токсикоинфекций, не обнаружено. Мазки-отпечатки из проб мяса опытных и контрольных животных окрашивались плохо.
В препаратах, из поверхностных слоев, обнаруживались отдельные колонии (по 1 – 3 в поле зрения микроскопа) кокковой микрофлоры. В препаратах, приготовленных из глубоких слоев мышц, микрофлора не выделялась.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что многократное введение Лаксубтила не приводит к статистически значимым изменениям качественных и биохимических показателей мяса животных.
3.9 Эффективность Лаксубтила при колибактериозе телят
В настоящее время, с целью профилактики и терапии желудочно-кишечных заболеваний, а также повышения продуктивности молодняка сельскохозяйственных животных, широко используют различные симбиотические микроорганизмы, среди которых наиболее перспективными признаны молочнокислые, пропионовокислые, бифидобактерии, B. subtilis и др.
Нами на основе B. subtilis был изготовлен препарат Лаксубтил в форме суспензии, лечебно-профилактическая эффективность которого, изучена в животноводческих хозяйствах РТ.
3.9.1. Профилактическая эффективность
Профилактическую эффективность Лаксубтила в экспериментальных условиях изучали на телятах 2-х дневного возраста, в сравнении с препаратом-аналогом (субтилбен), на 4 молочно-товарных фермах, стационарно-неблагополучных по пневмоэнтеритам.
Лаксубтил телятам выпаивали в 3 – х дозах 3 мл (1-я группа, n=15), 5мл (2-я группа, n=15) и 10 мл/кг массы тела (3-я группа, n=15) в течение 10 дней 1 раз в сутки; Биоспорин (4-я группа, n=15) использовали в соответствии с наставлением по применению препарата.
В течение месяца за животными вели клиническое наблюдение, учитывая общее состояние, заболеваемость и сохранность.
Таблица 9
Результаты изучения в эксперименте
профилактической эффективности Лаксубтила в форме суспензии
(МТФ им. Муккарамова, 2009 г.)
| Показатель | Группа | Контроль (биоспорин) | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| Доза, г/кг массы тела | ||||
| 0,2 | 0,3 | 0,4 | ||
| Кол-во больных телят, гол. | 15 | 15 | 15 | 15 |
| Заболело, гол. | 2 | – | – | 6 |
| Пало, гол. | 1 | – | – | 3 |
| Стоимость 1 дозы препарата, сомони | 0,16 | 0,24 | 0,32 | 0,80 |
| Затраты на профилактику, сомони | 32 | 48 | 64 | 160 |
| Терапевтическая эффективность, % | 90 | 100 | 100 | 70 |
Результаты клинических наблюдений (табл. 9) свидетельствуют о высокой профилактической эффективности Лаксубтила, выразившейся в предотвращении колибактериоза (2 и 3-я группы), полной сохранности и хорошем общем состоянии телят, увеличении пророста массы тела.
Для изучения профилактической эффективности Лаксубтила, в производственных условиях телятам в 2-х дневном возрасте вводили перорально в дозе 10-12 мл/кг массы тела, один раз в сутки в течение 10 дней.
При производственном испытании Лаксубтила на 422 телятах в 4 хозяйствах РРП, Согдийской и Хатлонской областей РТ в 2006 – 2011 гг. профилактическая эффективность препарата составила 86,5 – 92,0%. Профилактические мероприятия, проводившиеся по схеме принятой в хозяйствах, предотвращали колибактериоз телят (198 гол.) на 80 – 83%.
Таким образом, установлена профилактическая эффективность Лаксубтила, которая в экспериментальных условиях составляет 96,0% в производственных – 92,0%.
3.9.2. Лечебная эффективность
Изучение терапевтической эффективности Лаксубтила, при колибактериозе телят, провели в 5 хозяйствах Республики Таджикистан.
Колибактериоз диагностировали на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов бактериологических исследований.
При изучении клинического состояния, у больных животных с острой формой колибактериоза отмечали кратковременное повышение температуры тела в начале болезни до 40 – 40,5оС, снижение аппетита, вялость, малоподвижность. Пульс становился частым, нитевидным (частота пульса доходила до 140 уд/мин). На 2 – 3 дни болезни появлялся профузный понос. Испражнения были бело-желтого цвета, часто пенистые, с непереваренными сгустками казеина, иногда с примесью крови. Спустя 12 ч после инфицирования у больных телят начиналось обезвоживание организма. Глазные яблоки западали в орбиты. Состояние животных было угнетенным, реакция на окружающее – сниженной.
При патологоанатомическом вскрытии павших телят на эпикарде и под эпикардом наблюдали точечные кровоизлияния. Ткань печени перерождена. Селезенка незначительно увеличена, под капсулой – точечные кровоизлияния. Преджелудки содержали смесь серовато-желтого цвета. На слизистой оболочке, покрытой слизью, местами имелись кровоизлияния. Слизистая оболочка кишечника набухшая, гиперемированная, с кровоизлияниями. Мезентеральные лимфатические узлы увеличены и гиперемированы.
При бактериологическом исследовании паренхиматозных органов, павших и вынужденно убитых с диагностической целью телят, выделены патогенные культуры E. coli.
Для опыта подобрали 4 группы больных колибактериозом телят 4 – 7-дневного возраста. Животным 1-ой группы (n=16) Лаксубтил, в дозе 3 мл/кг, 2-ой (n=16) – 5 мл/кг, 3-ей (n=16) – 10 мл/кг массы тела, выпаивали дважды в сутки. Контрольную группу телят (n=16) лечили Биоспорином в соответствии с наставлением по применению препарата.
За животными в течение 14 дней вели клиническое наблюдение, учитывая длительность болезни, выздоровление, сохранность поголовья, прирост массы и температуру тела.
Таблица 10
Результаты изучения в эксперименте терапевтической эффективности
Лаксубтила в форме суспензии (МТФ им. Муккарамова, 2009 г.)
| Показатель | Группа | Контроль (Биоспорин) | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| Доза, мл/кг массы тела | ||||
| 3,0 | 5,0 | 10,0 | ||
| Кол-во больных телят, гол. | 16 | 16 | 16 | 16 |
| Выздоровело, гол. | 19 | 20 | 20 | 17 |
| Пало, гол. | 1 | – | – | 3 |
| Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол. | 2 | – | – | 3 |
| Продолжительность терапии, сут | 5,0 | 4,0 | 4,0 | 6,2 |
| Среднесуточный прирост, г | 135 | 150 | 150 | 125 |
| Терапевтическая эффективность, % | 95 | 100 | 100 | 85 |
Прирост живой массы животных в опытных группах при применении Лаксубтила в форме суспензии был соответственно на 8,3 – 25,0%; 4,0 – 8,3 и 8,0 – 28,0% выше, чем в контрольной (соответственно по 120 и 125 г).
Таким образом, результаты эксперимертального изучения терапевтической эффективности свидетельствуют о целесообразности применения пробиотика Лаксубтил в форме суспензии в дозе 5,0 мл/кг массы тела в производственных условиях для лечения колибактериоза телят.
Экономическая эффективность Лаксубтила в расчете на 1 сомони затрат, при лечении колибактериоза телят составила 1,9 сомони, что больше в 2 раза, чем соответствующий показатель Биоспорина.
Определение суммарного индекса показало, что при терапии колибактериозов телят Лаксубтил эффективнее препарата-аналога в 2 раза.
Таким образом, установлена высокая лечебная и экономическая эффективность Лаксубтила при колибактериозе телят.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что в возникновении желудочно-кишечных болезней телят на молочно-товарных фермах Таджикистана важную роль играют E. coli, Колибактериоз из 12 обследованных хозяйств диагностирован в 8 (38,3%) и при бактериологическом исследовании в основном идентифицировали серотипы эшерихии коли: О86 (20,0%), О101 (12,8%), О137 (9,0%), О8 (11,0%), О117 (14,2%) и О26 (12,0%).
2. Определено, что поражаемость телят колибактериозом отмечается в зимне-весенний период (59,5% от общего количества заболевших за год).
3. Отработано технология изготовления Лаксубтила на основе B. Subtilis с использованием местного сырья и методы контроля препарата
4. Лаксубтил обладает высокой бактерицидной активностью по отношению патогенных серотипов эшерихии коли (30 – 60 млн м.к./ мл.).
5. Лаксубтил относится к категории малотоксичных препаратов, не оказывает местного раздражающего и аллергенного действия.
6. Эффективность лечения больных телят при пероральном применении Лаксубтила в дозах 5 – 10 мл на кг массы тела 2 раза в день в течении 7 дней достигает 95%.
7. Профилактическая эффективность Лаксубтила в дозе 5 мл на кг массы тела 1 раза в день в течении 10 дней достигает 96% в экспериментальных и – 92,0% в производственных условиях.
8. Экономическая эффективность Лаксубтила в расчете на 1 сомони затрат, при лечении колибактериоза телят, составила 1,9 сомони, что больше в 2 раза, чем соответствующий показатель субтилбена.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Рекомендации по применению пробиотиков для профилактики и лечения пневмоэнтеритов телят (утв. ГУВ МСХ РТ 11.09.2012 г.).
2. Научно обоснованная система получения здорового молодняка и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят (Рекомендации) (утв. ГУВ МСХ РТ 11.09.2012 г.).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Саттори И. Способ приготовления препарата Лаксубтил / Саттори И., Каримов М.М. // Биобезопасность и зоонозные инфекции: матер. Первой ежегодной конф. Ассоциации Биологической Безопасности Центральной Азии – Казахстан, Алматы, 2009. – С. 94. – 95.
2. Саттори И. Профилактическая эффективность пробиотика Лаксубтил при желудочно-кишечных болезнях телят / Саттори И., Сатторов Н.Р., Каримов М.М. // Биобезопасность и зоонозные инфекции: матер. Первой ежегодной конф. Ассоциации Биологической Безопасности Центральной Азии – Казахстан, Алматы, 2009. – С. 65. – 66.
3. Саттори И. Изучение противомикробных свойств пробиотика Лаксубтил / И. Саттори, Н.Р. Сатторов, М.М. Каримов // Овцеводство, козоводство и шерстиное дело / Тимирязевская МСХА. – М., 2009. – №4. – С. 78 – 80.
4. Турдиев Ш.А. Применение пробиотика Лаксубтил при пневмоэнтерите телят / Турдиев Ш.А., Сатторов Н.Р. Каримов М.М. // Сумский аграрный университет, Украина, Сумы 2010.–С 33-34.
5. Сатторов Н.Р. Изучение острой токсичности пробиотичекого препарата Лаксубтил / Сатторов Н.Р., Хасанов Н.Р., Каримов М.М. // Кишоварз № 3 – Душанбе, 2012. – С. 32 – 34.
6. - Пат. TJ 819 Республика Таджикистан, Способ получения биопрепарата Лаксубтил / Саттори И., Сатторов Н.Р., Турдиев Ш.А., Хасанов Н.Р., Сафаралиев А.Р., Баротов С.Т., Юсупов М.М. // Гос. регис. № 1200719 19.04.2012.
Сдано в набор 7.09.2012 г. Подп. к печ. 14.09.2012 г. Формат бум. 60841/16.
Зак. 144. Тираж 100 экз. Объем 11/4 п. л.
Типография Таджикского аграрного университета им.Ш. Шотемура.
Душанбе, пр. Рудаки, 146.
