Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и особенности проявления болезни в современных условиях ведения животноводства
На правах рукописи
СТРОГАНОВА
ИРИНА ЯКОВЛЕВНА
ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ БОЛЕЗНИ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ ВЕДЕНИЯ
ЖИВОТНОВОДСТВА
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Новосибирск – 2011
Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и в Институте прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор
Глотов Александр Гаврилович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
старший научный сотрудник
Семенихин Владимир Иванович,
доктор ветеринарных наук, профессор
Барышников Петр Иванович,
доктор биологических наук, профессор
Забережный Алексей Дмитриевич
Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии
Защита состоится «29» ноября 2011 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8.
С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «___» ________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Г.М. Стеблева
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств по производству молока. В некоторые из них осуществляется ввоз высокопродуктивного скота из других стран. Высокая молочная продуктивность коров часто сопровождается нарушением обмена веществ, что приводит, в частности, к активизации различных инфекционных агентов (А.Г. Шахов и соавт., 2000; Ю.Н. Федоров, 2006). Существуют также молочно-товарные фермы, в которых концентрация животных и их продуктивность бывают разными, а ввод новых животных ограничен. Учитывая существование различных по направлению, численности, концентрации и продуктивности животных хозяйств, эпизоотическая ситуация в них по инфекционным болезням может различаться.
Широкое распространение в молочных хозяйствах получили респираторные болезни животных (О.Г. Петрова и соавт., 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; Т.И. Глотова, 2006; М.И. Гулюкин и соавт., 2007; J. Kampa et al., 2009; K.A. Woodbine, 2009; J.F. Ridpath, 2010).
Эти болезни, как правило, протекают с участием нескольких возбудителей, синергетическое взаимодействие которых приводит к усилению тяжести инфекционного процесса (Н.Н. Крюков и соавт., 1984; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; А.Г. Глотов и соавт., 2008; Н.Р. Будулов, 2009; D.G. Bryson, 2000; K. A. Brogden et al., 2002).
Одним из этиологических агентов данной патологии является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Во многих зарубежных странах его относят к числу наиболее важных патогенов молочного скота (L.E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; C. Luzzago et al., 2010; B.W. Brodersen, 2010).
Первые сообщения о РСИ КРС в нашей стране относятся к 1975 году (В.В. Гуненков и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы Г.А. Халенева (1976),
Г.Д. Метревели (1983), Т.М. Кочиш (2004), И.Н. Матвеевой (2008) и других.
Несмотря на относительно высокую степень изученности многих вирусных болезней, в нашей стране данных, касающихся роли этого возбудителя в возникновении респираторных болезней, в том числе в ассоциациях с другими вирусами, недостаточно. Изучение этой инфекции длительное время сдерживалось из-за высокой лабильности вируса и слабой его способности к размножению в культурах клеток, что, в свою очередь препятствовало разработке диагностических препаратов. Поэтому многие вопросы, касающиеся диагностики, особенностей эпизоотической ситуации, возрастной восприимчивости животных к инфицированию вирусом, характера проявления болезни в молочных хозяйствах в зависимости от их специализации и уровня молочной продуктивности коров остаются открытыми.
Цель и задачи исследований. В связи с этим целью работы являлась разработка эффективных способов серологической и вирусологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение их роли при комплексной оценке особенностей проявления болезни в современных условиях ведения молочного животноводства, в том числе в аспекте смешанных инфекций, протекающих с участием других вирусов и условно-патогенных бактерий.
Для достижения указанной цели были поставлены задачи:
1. Определить и отработать оптимальные параметры выделения, типирования и культивирования РСВ КРС в различных культурах клеток с целью получения антигена, а также – изготовить и испытать эффективность экспериментальных серий эритроцитарного диагностикума в РНГА для выявления антител к вирусу.
2. Изучить пригодность ОТ-ПЦР для типирования вируса в лабораторных условиях, определить ее значение в диагностике болезни у крупного рогатого скота, выяснении роли вируса в этиологии массовых респираторных болезней, а также выявлении наиболее восприимчивых половозрастных групп животных в молочных хозяйствах различного профиля, с учетом наличия импортного и местного скота.
3. С использованием серологического и молекулярного методов исследований провести комплексный анализ особенностей проявления респираторно-синцитиальной инфекции в современных условиях при различных эпизоотических и хозяйственных ситуациях, в том числе в ассоциации с другими вирусными и бактериальными агентами.
Научная новизна. Выделен штамм вируса К-18, депонированный в коллекции микроорганизмов ФГУ ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под наименованием «Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406». Подана заявка на получение патента на изобретение РФ № №2010134476 от 17.08.2010 г. «Метод первичной изоляции штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, штамм вируса Bovine Respiratory Syncitial Virus для изготовления диагностических препаратов».
Новизной обладают данные по изучению чувствительности первично-трипсинизированных и перевиваемых (гомологичных и гетерологичных) линий культур клеток к РСВ КРС. Подобраны и рекомендованы для практического использования наиболее чувствительные культуры клеток. Определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление вируса. Показана чувствительность к вирусу новой перевиваемой линии культуры клеток ТЭБ, рекомендованной для его выделения из проб биоматериала от животных.
Отработаны методы ранней индикации, контроля размножения и учета инфекционной активности вируса в чувствительных культурах клеток. В том числе показано преимущество ОТ-ПЦР перед традиционными методиками выявления и титрования вируса: цитопатогенное действие (ЦПД); методы бляшкообразующих единиц (БОЕ) и фокусообразующих единиц (ФОЕ); цитоморфологические исследования и электронная микроскопия. Установлены сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена возможность дальнейшего использования штаммов вируса PC-Б и К-18 для изготовления эритроцитарного диагностикума. Показано, что чувствительность культур клеток к вирусу имеет «штаммовую» зависимость. Разработан лабораторный регламент культивирования вируса с целью изготовления специфического эритроцитарного антигена для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА.
С помощью серологических и молекулярных методов исследований показано широкое распространение РСИ КРС в Российской Федерации, а также в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. При помощи ОТ-ПЦР выявлены наиболее восприимчивые к инфицированию вирусом половозрастные группы животных. Выявлены особенности эпизоотической ситуации по РСИ КРС, а также смешанным вирусно-бактериальным болезням в условиях промышленного молочного животноводства Сибири с наличием или отсутствием импортированного скота. Изучена частота проявления болезни в зависимости от наличия сопутствующих вирусных инфекций (инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, аденовирусная инфекция и других), а также от некоторых эпизоотологических и хозяйственных факторов. Впервые показана зависимость частоты инцидентности болезни в крупных молочных хозяйствах от уровня серопозитивности и наличия животных, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС. Выявлены и изучены ассоциации вирусов и бактерий, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней, протекающих у крупного рогатого скота с участием РСВ КРС. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellacceae.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования серологического и вирусологического методов диагностики РСИ КРС в производственных условиях с целью объективной комплексной оценки эпизоотической ситуации и для оптимизации противоэпизоотических мероприятий в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства, в том числе решении вопроса о специфической профилактике болезни.
Кроме того, они расширяют научные знания относительно спектра чувствительных культур клеток к РСВ КРС, биологических свойств и роли вируса в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Комплекс диагностических методов исследований может использоваться также при дальнейшем изучении эпизоотической ситуации, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусных и вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.
Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке научно-методических рекомендаций и положений:
- «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26 января 2010 г.).
- «Вирусные и вирусно-бактериальные респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота», утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 2 от 14 декабря 2010 г.).
- «Стратегия общих и специальных мероприятий при респираторных болезнях молодняка крупного рогатого скота вирусно-бактериальной природы», утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 2 от 14 декабря 2010 г.).
- «Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике вирусных болезней крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 11 февраля 2011 г.).
- «Индикация и идентификация респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 11 февраля 2011 г.).
- «Профилактика и лечение вирусных респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота", утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 4 от 20 апреля 2011 г.).
Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на:
1. Тест-систему для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА (ТУ-10-19-162-91).
2. Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на: Всесоюзной научно-практической конференции «Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной экономической реформы», Сумы, 1989; Научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Наука – сельскохозяйственному производству», Красноярск, 1993; Научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Наука – сельскохозяйственному производству», Красноярск, 1995; ХI Международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири», Новосибирск, 2006; Международной школе – конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири», Красноярск, 2008; Всероссийской научно-практической конференции ФГОУ ВПО КрасГАУ «Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития», Красноярск, 2009; Межрегионарной научно-практической конференции «Аграрно-экономическая наука республики Тыва: основные результаты и перспективы», Кызыл, 2009; Международной конференции «Проблемы современной аграрной науки» ФГОУ ВПО КрасГАУ, Красноярск, 2009; Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП, Московская область, Щелковский район, поселок Биокомбината, ВНИТИБП, 2009; Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития», Саратов, 2010; Международной научно-практической конференции «Современные научно-практические достижения в ветеринарии», Киров, 2010; IV Международной конференции молодых ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Новосибирская область, п. Краснообск, 2010; Всероссийской очно-заочной научно-практической конференции «Инновация в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития», Красноярск, 2010; Международной научно-практической конференции «Научные основы улучшения ветеринарного благополучия и продуктивности сельскохозяйственных животных», Кызыл, 2010; XIII Международной научно-практической конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Улаанбаатар, 2010; Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экономического развития и обеспечения безопасности в области ветеринарии», Троицк, 2010; Международной заочно научной конференции «Проблемы современной аграрной науки», Красноярск, 2010; Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири», Новосибирская область, п. Краснообск, 2010; VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», Москва, 2010.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 47 научных работ, в том числе 20 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ», «Достижения науки и техники АПК», «Аграрный вестник Урала», «Сельскохозяйственная биология»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 486 источников, из них 135 отечественных и 351 зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Результаты разработки и изучения эффективности серологического и молекулярного методов диагностики РСИ КРС в экспериментальных и производственных условиях;
2. Эффективность усовершенствованных методов диагностики РСИ КРС при комплексной оценке особенностей проявления болезни в различных эпизоотических и хозяйственных условиях, в том числе в ассоциациях с другими вирусами и условно-патогенными бактериями в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии-диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и на кафедре эпизоотологии и паразитологии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» в 1988-2011 гг. Отдельные разделы диссертации выполнены совместно с сотрудниками проблемной лаборатории ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.
Вирус. В опытах использовали штаммы РС-Б, полученный из БелНИИЭВ им. С.Н. Вышелесского, и К-18, выделенный и охарактеризованный нами.
Культуры клеток. Для выделения, адаптации и крупномасштабного культивирования вируса использовали 18 культур клеток различного происхождения. В качестве ростовой использовали питательную среду Игла МЕМ с однократным набором аминокислот и витаминов, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 370С в условиях 5% СО2. В качестве ростового фактора добавляли 5-10% эмбриональной сыворотки крови (HyClone, лот №ASA28574), тестированной на наличие вируса ВД-БС КРС и антител к нему. В качестве поддерживающей использовали ту же среду с 2% сыворотки.
При выращивании культур клеток и для культивирования вируса использовали 0,25% раствор трипсина, 0,01% раствор химопсина в 0,02% растворе Версена, диметилсульфоксид (ДМСО), ДЭАЭ – декстран, дрожжевой экстракт (ДЭ), фитогемагглютинин (ФГА), коммерческий 7,5% раствор бикарбоната натрия.
Реакцию нейтрализации проводили микрометодом с использованием наиболее чувствительных культур клеток. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в чувствительной культуре клеток по ЦПД: в пробирочных культурах клеток и микрометодом; титр рассчитывали по методу Reed и Muencn (1938) и выражали в ТЦД50/мл. Использовали также методы бляшек (БОЕ) по Прингл К. (1988) и окрашенных фокусов по Calnek В. et al. (1972); титр выражали в БОЕ/мл и ФОЕ/мл.
Электронная микроскопия. Образцы культурального и концентрированного очищенного вируса просматривали на электронном микроскопе JEM-100 CX-II совместно со ст. науч. сотр., канд. биол. наук ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов Россельхознадзора Ю.И. Могильным Препараты готовили по методу негативного контрастирования с применением 2%-ного водного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0).
Препараты для цитоморфологического исследования готовили из пробирочных культур клеток целлоидиновым методом и окрашивали гематоксилин-эозином по методу Волковой О.В., Елецкого Ю.К. (1971).
Эритроцитарный диагностикум готовили по методу Л. Денер. и др. (1976), Н. Martin (1983) в нашей модификации. Полученные препараты использовали для серодиагностики РСИ КРС, овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).
Для получения гипериммунных сывороток к РСВ КРС использовали белых мышей линии BALB/C массой 20-30 г и морских свинок массой 300-350 г. Гипериммунизацию животных проводили путем введения культуральной вируссодержащей суспензии, а также концентрированного и очищенного по методу Trudel M. (1986) вируса интраназально с учетом схемы, предложенной Астаховой Л.Н. и Брайнингер М.Г. (1976). Дополнительно использовали баранов и кроликов.
Вирусологические и молекулярные исследования. При изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований. Дополнительно анализу были подвергнуты результаты серологических, вирусологических и бактериологические исследований, проведенных в ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ЦНМВЛ), ГУ Тюменская областная ветеринарная лаборатория, ФГУ Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория, КГУ Алтайская ветеринарная лаборатория, КГУ Красноярская краевая ветеринарная лаборатория, ФГУ Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория, РГУ Хакасская ветеринарная лаборатория, проведенных в 1991-2010 гг.
При анализе материалов по распространению инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота использовали результаты вирусологических исследований, предусмотренные Стандартом МЭБ (OIE Manual, Manual of Standarts //Chapter 2.3.5., 2000; Chapter 2.10.6., 2004), а также полученные при помощи ПЦР-тест-систем на основе ПЦР для диагностики ИРТ, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции (РСИ), разработанных в ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии: Свидетельства о Госрегистрации №№ ПВР-1-2.6/01845; ПВР-1-8.9/02498 и ПВР-1-8.9/02499. При исследовании на хламидиоз использовали тест-систему «Хлаком» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Биоматериал. Выделение вируса проводили из проб носовых выделений, трахеального, бронхиального экссудатов, бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных, подозреваемых в инфицировании вирусом из нескольких областей Сибири.
Для доставки биоматериала использовали 3 метода. В двух – пробы помещали в пластиковые контейнеры и транспортировали в лабораторию в охлажденном виде на льду или в замороженном состоянии. В третьем случае их доставляли в пластиковых пробирках с транспортной средой в течение не более 24 часов с момента отбора.
В лаборатории пробы в день доставки гомогенизировали, разводили 1:10 питательной средой Игла МЕМ, центрифугировали, а надосадочную жидкость фильтровали через фильтры диаметром 0,22 -µm. Полученные суспензии исследовали методом ОТ-ПЦР. Пробы, давшие положительный результат, использовали для выделения вируса. Для этого их в объеме 0,1 мл вносили в монослой культур клеток, выращенных микрометодом в 24-луночных пластиковых планшетах или 25 см3 матрасах.
Культивирование инфицированных культур клеток проводили при 20-37оС в атмосфере 5 ±0,5% СО2 в течение 5-8 дней. Всего проводили не менее 10 «слепых» пассажей до наступления видимого цитопатического действия (ЦПД) вируса.
Для заражения культур клеток использовали три метода: с адсорбцией вируссодержащей суспензии в течение часа при +20 оС и последующим внесением поддерживающей среды с 2% эмбриональной сыворотки крови, с предварительным внесением в монослой культуры клеток 1% диметилсульфоксида (ДМСО) и адсорбцией вируссодержащей суспензии в течение часа при +20 оС и с внесением вируса без адсорбции.
Идентификация цитопатических агентов. Вируссодержащую суспензию каждого пассажа исследовали в ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса. Для выявления синцитиев под световым микроскопом просматривали фиксированные и окрашенные по Романовскому-Гимза препараты инфицированных культур клеток каждого пассажа (об. 40х, ок. 10х), выращенных в пробирках на покровных стеклах. После образования монослоя клеток его трижды отмывали раствором Хенкса и вносили вирус из расчета 1-2 ТЦД50 на клетку и добавляли питательную среду. Покровные стекла с монослоем культуры клеток извлекали из пробирок через 24;48;72;96 и 120 часов после заражения, промывали теплым раствором Хенкса и просушивали под струей теплого воздуха.
После тридцатиминутной фиксации в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1) их промывали 70о этиловым спиртом, просушивали и окрашивали, доводя рН красителя до 7,0 при помощи 1% раствора бикарбоната натрия. Препараты погружали в краситель на 60-90 минут, затем тщательно ополаскивали теплой дистиллированной водой и высушивали.
Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства изучали по общепринятым методикам.
Изучение эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Исследования проводили на крупных молочных комплексах, средних и мелких молочно-товарных фермах в 16 административных регионах России, в том числе двух республиках, расположенных на территории Сибири, а также Республики Казахстан среди местного и импортированного скота.
Математические расчеты. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами (И.П. Ашмарин и соавт., 1962). Достоверность результатов подтверждали с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р< 0,05. Для обработки данных использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office 7.0».
Личное участие автора. Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие сотрудники ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии: д-р биол. наук, проф. Т.И. Глотова, ст. науч. сотр., канд. биол. наук О.В. Кунгурцева, ст. науч. сотр., канд. ветеринар. наук С.В. Котенева и А.В. Нефедченко, аспирант К.В. Войтова, а также ст. науч. сотр. проблемной лаборатории ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Л.М. Акбаева, которым автор выражает глубокую благодарность.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Параметры выделения респираторно-синцитиального вируса
в культурах клеток
На начальном этапе предварительному исследованию в ОТ-ПЦР подвергли 190 проб биоматериала, из них выявили положительных 38, что составило 20%. В первично-трипсинизированной культуре клеток ТБ из проб легких, бронхов и трахеального экссудата, отобранных от животных на ранней стадии развития клинических признаков, выделили 6 изолятов вируса.
Наиболее эффективным было выделение вируса при условии транспортировки проб биоматериала не дольше 24 часов с момента отбора, в охлажденном состоянии на льду или в транспортной среде, заражения двухсуточного монослоя клеток в день доставки, избегая заморозки и хранения при низких температурах.
Дальнейшую работу проводили с изолятом К-18, выделенным из легких 3-х месячного теленка с признаками интерстициальной бронхопневмонии. В связи с невозможностью получения культуры клеток ТБ, его адаптацию с целью получения стабильного ЦПД и «урожая» проводили в перевиваемых линиях культур клеток.
Наиболее чувствительной к вирусу оказалась перевиваемая линия культуры клеток ТЭБ. В ней видимое ЦПД регистрировали после 8 «слепых» пассажей. Оно проявлялось на четвертые сутки девятого пассажа в виде образования характерных синцитиев. В окрашенных препаратах наблюдали гигантские клетки, содержащие от 4-х до 10-ти ядер, формирование которых начиналось уже с 24-72 часов после заражения до наступления видимого ЦПД. Результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении всех пассажей. Титр вируса на уровне девятого пассажа составил 103,5ТЦД50/мл. Наиболее эффективным способом оказалось заражение монослоя клеток с часовой адсорбцией и добавлением 2% фетальной сыворотки КРС при 37оС.
Выделенный изолят не обладал гемагглютинирующими и гемадсорбирующими свойствами в отношении эритроцитов морской свинки.
При электронной микроскопии концентрированного препарата вируса девятого пассажа выявили филаментозные вирусные частицы размером 160 нанометров, однако часть из них была повреждена.
Адаптировать вирус к другим перевиваемым линиям культур клеток при данной методике заражения не удалось. Линии Vero, FLK, Taurus, MDBK, FBN, FBTR, KCT, T-1, не поддерживали репликацию вируса, и результаты выделения в них были отрицательными. Однако чувствительность их к вирусу была различной. Так, например, результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении 2 «слепых» пассажей в культурах клеток FLK, MDBK, KCT и Vero, после чего вирус не выявляли.
В результате изолят был депонирован нами в коллекции микроорганизмов ФГУ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под наименованием «Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406».
2.2.1.1. Спектр чувствительных культур клеток к штаммам
респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота
При выборе чувствительной клеточной системы использовали 18 разных культур клеток, учитывая время проявления ЦПД и накопление вируса в пяти серийных пассажах. Исходный титр вируса при заражении составлял 1,5-3,0 lg ТЦД50/мл. Культивирование осуществляли при 37°С в стационарных условиях. Результаты представлены в таблице 1.
Чувствительность первично-трипсинизированных культур клеток к штаммам РС-Б и К-18. В результате установили, что штаммы РСВ КРС РС-Б и К-18 репродуцировались в культурах клеток: ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ и их субкультурах. Титры вируса были выше в первично-трипсинизированных культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ, чем в их субкультурах и ТЭК.
Чувствительность перевиваемых клеточных линий к штаммам РС-Б и К-18. Из перевиваемых культур клеток крупного рогатого скота нечувствительными к штамму РС-Б оказались четыре (FBG, FBN, FBTR, КСТ и CEF). Наибольшую чувствительность проявила линия T-I, в которой на протяжении 5 пассажей цитопатическое действие вируса было наиболее стабильным. Клеточная линия овечьего происхождения FLK также поддерживала репликацию этого штамма, титр которого в ней составил 3,74±0,12 lg ТЦД50/мл. Линии культур клеток Vero, FLK, Taurus, MDBK, FBN, FBTR, КСТ, T-1 не поддерживали репликацию штамма К-18 РСВ КРС.
Таблица 1 – Спектр чувствительных культур клеток к двум штаммам вируса РСИ КРС
(n = 18; P < 0,05)
| № п/п | Вид клеточной культуры | Наименование культуры клеток | Сроки наступления ЦПД, сутки после заражения штаммом РСВ КРС | Титр вируса в lg ТЦД50/мл (M ± m) | ||
| РС-Б | К-18 | РС-Б | К-18 | |||
| 1 | Первично - трипсинизированные | ТЭК | 3-4 | 4-5 | 2,89±0,20 | 2,92±0,07 |
| 2 | ПЭК | 4-5 | 3-5 | 3,20±0,15 | 3,58±0,07 | |
| 3 | ЛЭК | 3-5 | 4-5 | 3,36±0,17 | 4,83±0,07 | |
| 4 | ТБ | |||||
| 5 | Субкультуры | ПЭК | 4-5 | 3-4 | 2,87±0,07 | 2,83±0,07 |
| 6 | ЛЭК | 3-5 | 3-6 | 2,95±0,05 | 2,79±0,03 | |
| 7 | ТБ | |||||
| 8 | Перевиваемые линии | FBG | - | - | - | - |
| 9 | FBN | |||||
| 10 | FBTR | |||||
| 11 | MDBK | 4-6 | - | 1,65±0,10 | - | |
| 12 | T - 1 | 2-3 | 3-4 | 3,63±0,11 | 2,92±0,07 | |
| 13 | ТЭБ | 3-5 | 3-5 | 3,17±0,07 | 4,58±0,07 | |
| 14 | Taurus | 1,75±0,12 | 1,75±0,12 | |||
| 15 | Vero | 2-3 | - | 0,75±0,38 | - | |
| 16 | FLK | - | 3,74±0,12 | - | ||
| 17 | CEF | - | - | - | ||
| 18 | КСТ | - | - | - | - | |
Результаты исследований показали, что чувствительность культур клеток к вирусу имеет «штаммовую» зависимость, т.к. спектр чувствительных культур клеток для двух штаммов вируса оказался различным. В связи с этим дальнейшую работу проводили с использованием первично трипсинизированной культуры клеток ЛЭК и перевиваемой линии FLK.
2.2.1.2. Оптимизация параметров культивирования вируса в
чувствительных клеточных системах
Изучение оптимальных условий культивирования вируса проводили по следующим параметрам: метод (стационарный и роллерный), температура культивирования в атмосфере 5% СО2 при 33-37°С; возраст культуры клеток (2-7 суток); время адсорбции вируссодержащей суспензии (I- 1,5 – 2 ч), множественность заражения (0,0001-0,1 ТЦД50/клетка), рН питательной среды (6,0-7,8); вид сыворотки в поддерживающей среде (крупного рогатого скота, телят, эмбриона коровы, северных оленей, цыплят) и ее процентное содержание (2, 5 и 10%%).
В результате опытов изучили динамику накопления вируса, а также влияние некоторых биологических и химических веществ (ДЭ, ФГА, трипсин, ДМС0, ДЭАЭ-декстран) на титр вируса при культивировании. Была проведена адаптация штамма к чувствительным культурам клеток.
В результате серии опытов установили, что оптимальными условиями для накопления штамма РС-Б вируса являлись: использование 3-5 суточной культуры клеток ЛЭК и Л5Э и 3-х суточной FLK с предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя от ростовой среды, в состав которой входит коммерческая сыворотка крови крупного рогатого скота или телят (10%),
Оптимальными условиями культивирования штамма К-18 были: использование 2-3 суточных культур клеток ТЭБ и ТБ с предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя клеток от ростовой среды. При использовании сыворотки эмбриона коровы производства фирмы «Hyclone» необходимость отмывания монослоя клеток отпадала.
В процессе адаптации штаммов вируса к различным культурам клеток установили, что в 30 сериях коммерческих сывороток взрослого крупного рогатого скота и телят, используемых для культивирования культур клеток, присутствовали антитела к вирусу в титрах 4 – 7 lg2, отрицательно влияющие на сроки появления и характер ЦПД вируса и его репродукцию.
Множественность заражения составила 0,1 ТЦЦ50/клетка; время адсорбции 1,5 ч с использованием питательной среды Игла MEM, Игла и RPMI - 1640 (2:1) с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, сыворотки северных оленей или сыворотки цыплят при рН 7,4-7,8 с последующим инкубированием в стационарных или роллерных условиях при температуре 37°С.
При данном режиме культивирования максимальное накопление вируса происходило на 6 сутки культивирования в ЛЭК и на 5 сутки в Л5Э и FLK, а для штамма К-18 – в ТЭБ. Добавление ДЭАЭ-декстрана 50 мкг на 1 мл и ДМСО в 1%-ной концентрации повышало инфекционную активность вируса на 0,84 lg ТЦЦ50/мл и 0,52 lg ТЦЦ50/мл, соответственно.
В результате адаптации штамма к Л5Э и П5Э к 20-му пассажу титр вируса составлял 4,96±0,03 и 4,95±0,05 lg ТЦЦ50/мл, соответственно. С помощью перемежающихся пассажей (1:2) из указанных диплоидных культур клеток провели адаптацию вируса к культурам клеток ЛЭК и FLK, в которых титр вируса к 10 пассажу достигал 4,82±0,07 и 4,83± 0,04 lg ТЦД50/мл, соответственно. Дальнейшее пассирование вируса в этих культурах клеток не привело к повышению его инфекционной активности.
2.2.2. Эффективность различных методов индикации вируса
в инфицированных культурах клеток
В связи с тем, что размножение вируса в культурах клеток не всегда сопровождается развитием видимого цитопатического действия (ЦПД), для его ранней индикации в них использовали методы бляшкообразования (БОЕ), окрашенных фокусов (ФОЕ), цитоморфологические исследования (окраска инфицированных культур клеток 0,5%-ным раствором амидового черного на 0,5% -ной уксусной кислоте и выявление синцитиев в окрашенных по Романовскому-Гимза препаратах инфицированных клеток при помощи световой микроскопии), а также ОТ-ПЦР.
Учет результатов проводили в течение 7 суток культивирования вируса. Данные представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Сравнительная эффективность различных методов индикации вируса в инфицированных культурах клеток
| Вид культуры клеток | Метод индикации вируса | Сроки выявления вируса, (сутки) | Возможность количественного определения инфекционной активности вируса | Специфичность метода, (+; -) |
| FLK, ТЭБ | БОЕ | 3-7 | + | + |
| ФОЕ | 3-7 | ± | ± | |
| Цитоморфологический | 2-7 | - | ± | |
| ОТ-ПЦР | 1-7 | + | + |
Из данных таблицы 2 видно, что наиболее точным методом титрования явился метод бляшек. Однако он более трудоемок, требует тщательного подбора ингредиентов и определенного навыка в постановке.
Фокусы цитопатического действия вируса в культуре клеток, различаемые микроскопически как скопления клеток, образовывались на 3-4 сутки после ее заражения и были видимыми на 5-8 день. Однако если деструкция в центре фокусов была слабо выражена, их учет без предварительной окраски затруднялся. Поэтому для выявления фокусов визуально необходимо дополнительно использовать окраску инфицированных клеточных культур 0,5%-ным раствором амидового черного на 0,5% -ной уксусной кислоте.
В фиксированных и окрашенных клеточных культурах фокусы ЦПД вируса были отчетливо видны и визуально. Окраска их не изменялась при длительном хранении, что значительно облегчало учет и анализ полученных результатов.
Далее необходимо было установить продолжительность инкубации вируса при окраске инфицированных культур для визуального учета фокусов. При окрашивании клеточных культур через 3-4 суток после заражения вирусом, различать и подсчитывать фокусы визуально было трудно. Окрашивание инфицированной культуры клеток FLK на 5-6 сутки инкубирования приводило к увеличению размеров фокусов и возможности их визуального подсчета, а на 7-8 сутки приводило к увеличению размеров фокусов, но и образованию вторичных фокусов или слиянию первичных. Поэтому окраску зараженных культур клеток проводили на 5-6 сутки инкубирования. Кроме того, указанный срок был признан оптимальным для накопления вируса, что было установлено в предыдущих исследованиях.
Результаты сравнительного определения инфекционной активности вируса штамма РС-Б в культуре клеток FLK представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Сравнительное титрование штамма РС-Б респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток FLK (n=3)
| Методы титрования | Инфекционность вируса | |
| M ± m | Р | |
| Титрование в пробирочной монослойной культуре клеток Титрование по ФОЕ в 50 мл флаконах | 3,96± 0,02 lg ТЦД 50/мл 4,40± 0,06 х 104,0 ФОЕ/ мл | < 0,001 < 0,001 |
В результате метод титрования по ФОЕ оказался несколько чувствительнее метода титрования по ЦПД в пробирках и простым в учете. Наиболее эффективными методами контроля репродукции вируса в инфицированных культурах клеток оказались ОТ-ПЦР и методы титрования по БОЕ и ФОЕ, однако результаты ОТ-ПЦР были положительными в более ранние сроки.
При электронной микроскопии проб культурального, концентрированного и очищенного вирусов обнаруживали характерные для PC-вируса вирионы, морфологически представляющие собой округлые или полиморфные частицы (80-160 Нм), наружная мембрана которых покрыта отростками.
Изучение морфологических изменений в зараженных культурах клеток FLK и ТЭБ проводили также на примере двух штаммов вируса – РС-Б и К-18. Размножение вируса сопровождалось образованием цитоплазматических включений, а также синцитиев различного размера, содержащих от 5 до 10 ядер. Цитоморфологический метод позволял выявлять вирус в культуре клеток в затруднительных случаях учета ЦПД световым микроскопированием, обнаруживать его в клетках на ранних стадиях репродукции, а также подтверждать специфичность цитопатогенного действия, однако по срокам постановки и специфичности уступал ОТ-ПЦР.
2.2.3. Параметры хранения вируссодержащей суспензии в
лабораторных условиях
Учитывая высокую чувствительность вируса к замораживанию и оттаиванию, изучали сроки его сохранности при различных температурных режимах. Результаты показали, что хранение культуральной вируссодержащей жидкости при температуре 4°С снижает инфекционную активность вируса на 3,0 lg в течение 2 месяцев, при минус 25°С на 3,5 lg - в течение 6 месяцев, при минус 70° на 2,5 lg в течение 7 месяцев. Хранение лиофилизированного вируса при минус 25°С в течение 12 месяцев снижало его титр на 1 lg ТЦД50/мл. Таким образом, оптимальными условиями хранения лиофилизированного вируса (штаммы РС-Б и К-18) являлись температура минус 25°С, а нативного – минус 70°С.
Хранение вируссодержащих суспензий, полученных из проб внутренних органов животных, при минус 18°С обеспечивало сохранность материала из слизистой оболочки трахеи в течение двух месяцев, носовых выделений и бронхов – 4-х месяцев, бронхиального экссудата – 6-ти месяцев, а легких – 12 месяцев. Оптимальным режимом хранения выделенной РНК вируса являлся минус 18оС в течение 2-10 месяцев, в зависимости от вида исследуемого материала. Наиболее пригодным материалом для исследований в ОТ-ПЦР являлись пробы легких, бронхиального экссудата и бронхов.
2.2.4. Разработка эритроцитарного диагностикума для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного
рогатого скота, овец и коз методом РНГА
При разработке специфического эритроцитарного антигена для серологической диагностики болезни использовали методы Денера и Martin в авторской модификации. Технология изготовления антигена изложена в НТД на «Набор для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции (РС-инфекции) крупного рогатого скота, овец и коз» (ТУ-10-19-162-91). Данные по сравнительной активности эритроцитарных антигенов представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Сравнительная активность эритроцитарных антигенов, полученных при репродукции штамма РС-Б РСВ КРС в различных культурах клеток (n = 3)
| № п/п | Культура клеток | Титр вируса, lg ТЦД50/мл М ±m; Р<0,05 | Количество серий | Активность антигена со специфической сывороткой к РСВ в титрах, lg2, М ±m; Р<0,05 |
| 1 | МDВК | 1,65±0,10 | 12 | 4,5±0,25 |
| 2 | ДЛЭК | 2,14±0,21 | 2 | 5,5±0,25 |
| 3 | ЭЛЭК | 2,17±0,46 | 3 | 5,67±0,24 |
| 4 | ТБ | 3,04±0,04 | 2 | 6,5±0,25 |
| 5 | ПЭК | 3,20±0,15 | 3 | 6,67±0,24 |
| 6 | Т-1 | 3,78±0,11 | 29 | 7,52±0,12 |
| 7 | 46/47 | 3,64±0,11 | 2 | 6,5±0,25 |
| 8 | ЛЭК | 4,75±0,14 | 19 | 7,73±0,11 |
| 9 | FLK | 4,76±0,13 | 18 | 8,55±0,09 |
| 10 | П5Э | 4,95±0,05 | 7 | 9,36±0,12 |
| 11 | Л5Э | 4,96±0,03 | 16 | 9,69±0,14 |
| 12 | ПТ | 3,74±0,11 | 13 | 7,38±0,09 |
| Всего серий | 126 | |||
Из данных таблицы 4 следует, что активность эритроцитарных антигенов зависела от титра вируса, который использовали для их получения. По мере повышения титра вируса повышался и титр антигена, что было связано с видом культуры клеток, в которой размножали вирус. Так, в культуре клеток 46/47 титр вируса составил 3,64±0,11 lg ТЦД 50/мл, а титр эритроцитарного антигена 6,5±0,25. В культуре клеток ЛЭК титр вируса составил 4,75±0,14 lg ТЦД 50/мл, в FLК – 4,76±0,13 lg ТЦД 50/мл, П5Э –4,95±0,05 lg ТЦД 50/мл, Л5Э –4,96±0,03 lg ТЦД 50/мл, а активность антигена в разведениях - 7,73±0,11; 8,55±0,09; 9,36±0,12 и 9,69±0,14 lg2, соответственно.
После адаптации штамма к перевиваемым линиям культур клеток Т-1 и ПТ его титр достигал 3,78±0,11 lg ТЦД 50/мл и 3,74±0,11 lg ТЦД 50/мл, а активность эритроцитарного антигена 7,52±0,12 и 7,38±0,09 lg2.
Таким образом, было показано, что наиболее пригодными для репродукции штамма РС-Б с целью получения эритроцитарного антигена оказались диплоидные клетки легких и почки эмбриона коровы, несколько уступали им перевиваемая линия почки эмбриона овцы и первичная культура легкого эмбриона коровы и перевиваемые линии почка теленка (Т-1) и почка теленка (ПТ).
Из вируссодержащей суспензии, полученной в этих культурах клеток, готовили наиболее активные эритроцитарные антигены, титры которых со специфической к PC-вирусу сывороткой составляли от 7,92±0,22 до 10,15±0,09 lg2.
Совместно с Л.М. Акбаевой изготовили 126 серий эритроцитарного антигена, из них 96 использовали для выявления антител к вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА. Полученные антигены сохраняли активность в течение 12 месяцев со дня приготовления при хранении в сухом месте и температуре 2-10°С.
С целью получения положительного контроля в РНГА получали специфические гипериммунные сыворотки к штамму РС-Б РСВ КРС с использованием мышей, морских свинок, баранов и кроликов. Результаты, опытов показали, что штамм РС-Б РС-вируса крупного рогатого скота не обладает выраженной антигенной активностью для белых мышей и морских свинок при использованном способе иммунизации. На его введение у животных синтезировались вируснейтрализующие антитела в титре 2,22 ±0,11 lg2. Для иммунизации баранов и кроликов использовали концентрированный препарат РСВ КРС с адьювантом Фрейнда, на который получили сыворотки крови с титром в РН у баранов 6,08±0,09 lg2, у кроликов 5,38±0,16 lg2, которые и использовали в дальнейшей работе.
2.2.5. Распространение РСИ КРС в хозяйствах Российской Федерации
по результатам серологических исследований
Исследованию подвергли 3623 пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота различных половозрастных групп из 16 регионов Российской Федерации. Результаты показали, что РСИ КРС широко распространена во всех обследованных областях и краях Российской Федерации. Наибольшее распространение она получила в регионе 12 (94,9%), 13 (93,2%), 7 (87,2%) и 9 (86,6%), 11 (83,3%), 10 (83,2%). В других регионах инфицированность животных находилась в пределах 52,6% - 81,8%. Наименьшее количество положительных проб выявляли от животных из регионов 1 и 2: 34,7% и 15,1%, соответственно.
Нами не установлено различий в географическом распространении болезни среди крупного рогатого скота различных возрастов. Наибольшее количество серопозитивных к вирусу животных выявили в крупных молочных хозяйствах с высокой концентрацией и молочной продуктивностью коров, куда вводились новые животные. Инфицированность крупного рогатого скота в средних и мелких хозяйствах была ниже, однако при повышении молочной продуктивности она возрастала, а вместе с ней – риск возникновения респираторных болезней, протекающих с участием данного вируса. Большое значение имела плотность животных на единицу площади, а также ввод вирусоносителей в стадо.
Антитела к вирусу чаще выявляли у молодняка крупного рогатого скота в возрасте: 4-6 месяцев (71,9%); 2-4 месяца (69,2%); 6-9 месяцев (55,9%); взрослых животных (50,8%) и до 1,5 месяцев (36,8%).
При ретроспективных исследованиях сероконверсию к вирусу, свидетельствующую о его роли в развитии респираторной патологии, выявляли у телят в возрасте: 4-6 месяцев в 52,6% случаев; 7-9 месяцев в 50,0%; 3-4 месяца в 37,5%; 6-8 месяцев – 25,0%; 2-3 месяца – 6,7%; 1 месяц – 4,0% случаев.
Таблица 5 – Результаты серологических исследований крупного рогатого скота на респираторно-синцитиальную инфекцию в различных регионах РФ
| Регион | Исследовано проб всего | Выявлено положительных | |
| всего | % от числа исследованных | ||
| 1 | 533 | 185 | 34,71 |
| 2 | 378 | 57 | 15,08 |
| 3 | 165 | 135 | 81,82 |
| 4 | 57 | 30 | 52,63 |
| 5 | 233 | 130 | 55,79 |
| 6 | 32 | 25 | 78,13 |
| 7 | 179 | 156 | 87,15 |
| 8 | 139 | 108 | 77,70 |
| 9 | 575 | 498 | 86,61 |
| 10 | 196 | 163 | 83,16 |
| 11 | 215 | 179 | 83,26 |
| 12 | 237 | 225 | 94,94 |
| 13 | 44 | 41 | 93,18 |
| 14 | 239 | 140 | 58,58 |
| 15 | 351 | 191 | 54,42 |
| 16 | 50 | 40 | 80,00 |
| Всего | 3623 | 2303 | 63,57 |
Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что наиболее восприимчивыми к заболеванию респираторно-синцитиальной инфекцией являются телята в возрасте от одного до 6-месячного возраста. В некоторых случаях болезнь может проявляться и у животных старших возрастов.
Наличие циркуляции вируса подтверждено также среди овец и коз. Антитела к вирусу выявляли у 33,01% обследованных овец и 87,76% коз, что может свидетельствовать о межвидовой передаче возбудителя и роли этих животных в эпизоотическом процессе болезни. Полученные результаты свидетельствуют также о возможности применения РНГА для ретроспективной диагностики РС-инфекции крупного рогатого скота, овец и коз.
2.2.6. Особенности эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота
в современных условиях
2.2.6.1. Распространение и характер проявления РСИ КРС
в хозяйствах региона Сибири в зависимости
от наличия импортного скота
Характеристика хозяйств. Сопоставляемые хозяйства, несмотря на сходство целого ряда элементов в технологии производства молока, имели существенные различия в системе содержания, кормления, эксплуатации, а также отличались по ряду других хозяйственных признаков. В связи с этим они были разделены на три группы. Первая группа включала шесть крупных молочных комплексов, куда осуществлялся ввоз импортного скота из различных стран, и концентрация и молочная продуктивность животных были высокими (интенсивный способ ведения животноводства: 800 и более дойных коров со среднегодовой молочной продуктивностью около 7000 л молока). Вторая группа: 14 крупных молочных хозяйств аналогичного профиля со среднегодовой продуктивностью от 4000 до 7000 л молока, куда не было ввода животных, поступающих по импорту. Третья насчитывала 9 мелких и средних хозяйств, где концентрация животных и их продуктивность были относительно невысоки (в среднем до 300 дойных коров с продуктивностью не выше 3000-4000 л молока в год), куда новых животных не вводили в течение нескольких лет.
До 2008 г. случаев массовых заболеваний РСИ КРС животных в Сибири не регистрировали в связи с тем, что лабораторные исследования проводились в незначительном объеме. В период с декабря 2007 г. по январь 2008 г. инфекцию установили на молочном комплексе в Иркутской области после завоза нетелей из Канады.
Во все хозяйства первой группы (табл. 6) осуществлялся импорт скота из разных стран. В некоторых случаях животные за 2 недели до отправки были иммунизированы вакциной против РСИ КРС, поэтому уровень их серопозитивности к полевому вирусу установить было сложно. В двух хозяйствах импортные животные содержались отдельно, и признаки болезни регистрировались, в основном, у телят до 6 месяцев, рожденных от них (до 80%) и у незначительного количества нетелей и коров до 5 лет. В остальных допускали смешивание местного и импортного скота. Несмотря на хорошие условия кормления и содержания в одном из хозяйств признаки болезни выявили у коров и телят местной фермы, тогда как импортные нетели не болели. Заболеваемость и отход коров и телят были очень высокими. В других хозяйствах заболеванию были подвержены телята до 6-месячного возраста, рожденные как от импортированных, так и от местных матерей, а также незначительное количество молодых коров. Большой разницы в показателях заболеваемости и падежа импортных и местных телят не выявляли. Клинические признаки болезни у местного скота после контакта с завезенным развивались через 2-5 дней. В одном хозяйстве болели телята в возрасте до 10 дней.
Таблица 6 – Особенности проявления РСИ КРС на крупных молочных комплексах после завоза импортных животных
| № хозяйства | Категории восприимчивых животных, (+;-) | Сопутствующие инфекции | Выявление возбудителя/ наличие сероконверсии к вирусу, (+;-) | |||
| нетели, коровы | телята | нетели, коровы | телята | нетели, коровы | телята | |
| 1 | + | + | ИРТ, ВД-БС | Сальмонеллез, микоплазмоз | +/+ | +/+ |
| 2 | + | + | ИРТ, ВД-БС, хламидиоз | Диплококковая септицемия, сальмонеллез, | -/+ | +/+ |
| 3 | - | + | ВД-БС | ВД, ИРТ, ПГ-3, сальмонеллез, диплококковая септицемия | +/+ | +/+ |
| 4 | - | + | ВД-БС | ВД, ИРТ, ПГ-3, сальмонеллез, диплококковая септицемия | Не проводили | +/+ |
| 5 | + | + | ВД-БС, ИРТ | диплококковая септицемия, сальмонеллез | +/+ | |
| 6 | + | + | ВД-БС, ИРТ | ИРТ, ВД-БС, диплококковая септицемия, сальмонеллез | +/+ | +/+ |
Течение болезни и характер клинических признаков можно было разделить на три группы: сверхострая форма инфекции, сопровождавшаяся угнетением, повышением температуры тела до 420С, снижением молочной продуктивности у коров, выделением обильной пены из ротовой полости, хрипами, кашлем, конъюнктивитами и быстрой гибелью животных. Такую ситуацию наблюдали в хозяйстве №1 у коров и телят и в хозяйствах №№ 2-4 только у телят до 6-месячного возраста и у незначительного количества молодых коров. Летальность во всех случаях была высокой. На вскрытии регистрировали интерстициальную пневмонию вплоть до полного разрушения паренхимы, бронхиты, увеличение и геморрагическое воспаление легочных лимфоузлов и легочную или бронхиальную эмфизему. Гибель животных наступала в течение нескольких дней, несмотря на проводимое лечение.
При остром течении у животных регистрировали бронхиты и интерстициальную бронхопневмонию. При всех клинических формах течение болезни осложнялось развитием вторичной микрофлоры (пастереллез) с выделением из легких павших и вынужденно убитых животных всех возрастов Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida. На вскрытии выявляли петехиальные кровоизлияния на миокарде и фибринозную бронхопневмонию.
В некоторых хозяйствах второй и третьей категорий, неблагополучных по бронхопневмониям, произошло наслоение РСИ КРС на хроническое течение сальмонеллеза и диплококковой септицемии у телят. Кроме этого у коров и телят регистрировали ИРТ и ВД-БС, что было подтверждено вирусологическими и ретроспективными серологическими исследованиями. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был очень высоким (до 128-кратного), что, на наш взгляд, свидетельствовало о его ведущей роли в этиологии массовых вспышек респираторных болезней. Во всех случаях результаты ОТ-ПЦР были положительными, а от животных различного возраста выделили изоляты вируса.
Субклиническая форма болезни проявлялась у восприимчивых животных в виде слабого респираторного синдрома.
2.2.6.2. Распространение и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах Сибири с наличием местного скота
В крупных и мелких хозяйствах второй и третьей групп, куда не вводился импортный скот, клинические признаки болезни регистрировали только у телят в виде острой или субклинической формы инфекции, а ее признаки варьировали от транзитной лихорадки до одышки. Серопозитивность к вирусу варьировала от 20 до 70%% у коров и 20-40%% у телят. Поражались органы верхнего, либо одновременно верхнего и нижнего респираторного тракта, сопровождавшиеся повышением температуры тела, брюшным типом дыхания, выделением слюны из ротовой полости, кашлем с серозно-слизистыми выделениями из носа и глаз. При хороших условиях кормления и содержания выздоровление наступало в течение недели, однако переболевшие животные отставали в росте, не давали высоких привесов. Сероконверсию к вирусу устанавливали не у всех животных, однако не всегда удавалось получить парные пробы сыворотки крови от них, поэтому истинную роль вируса в возникновении респираторных болезней в этих хозяйствах установить было трудно. Результаты ОТ-ПЦР были положительными в 8 хозяйствах, однако вирус выделить не удалось.
Зимой 2009 г. болезнь зарегистрировали в 6 закрытых хозяйствах (крупных и мелких), находящихся в разных территориальных зонах одной области, и стационарно неблагополучных по респираторным болезням. Между ними хозяйственных связей не было, как и ввода новых животных из других источников. Серопозитивность скота была несколько выше (в пределах 40-70%% у коров и 40-60%% у телят), при этом сероконверсию к вирусу установили во всех из них. Геном вируса был выявлен в ОТ-ПЦР. Болезнь проявлялась на всех возрастных группах, но заболеваемость и летальность среди телят были выше. В настоящее время трудно установить причину этих вспышек, но, возможно, что их возникновению способствовали плохие условия содержания и кормления животных. В одном из них возникновению вспышки РСИ КРС предшествовала вакцинация поголовья против ящура. Возможно, что в этих хозяйствах болезнь носила стационарный характер и при воздействии отрицательных факторов внешней среды она проявилась клинически.
Результаты серологических исследований показали, что в настоящее время РСИ КРС имеет широкое распространение в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства региона Сибири. Однако инфицированность животных по различным административным территориям несколько различается.
Так, серопозитивность животных к вирусу составила в среднем по Тюменской области 66,6%, Новосибирской – 43,8; Омской – 42,8; Иркутской – 32,6; Красноярскому краю – 38,4; Республике Хакасия – 30,8%.
По результатам обследования хозяйств Новосибирской области установили, что у 92,6% телят до 30-ти дневного возраста отсутствовали колостральные антитела к вирусу. Серопозитивность телят 1-6-месячного возраста составила 25,5%, а средние титры антител – 2,1±0,33 lg2, телят от 6 месяцев и старше – 50,0% (2,4±0,67 lg2), телок – 66,7% (5,2±0,14 lg2), а коров и быков 76,3% (4,5±0,09 lg2). Средние титры антител у животных всех половозрастных групп составили 3,02±0,47 lg2.
Инфицированность животных вирусом была выше в хозяйствах Тюменской области, что, возможно, связано с интенсивным типом ведения животноводства (с высокой молочной продуктивностью и концентрацией животных на единицу площади) и наличием импортного скота.
Серопозитивность телят до 30 дней составила 45,7%, а величина средних титров антител – 1,9±0,42 lg2, телят 1-6-месячного возраста – 29,9% (1,81±0,06 lg2), телок – 100% (5,4±0,43 lg2), нетелей – 82,6% (5,1±0,02 lg2), коров и быков – 86,7% (4,8±0,19 lg2).Средние титры антител у животных всех половозрастных групп были равны 3,8±0,43 lg2. Высокая инфицированность животных этого региона связана, вероятно, с более активной циркуляцией вируса среди нетелей, завезенных по импорту (нетели – 5,1±0,02 lg2).
Особый интерес представляли три крупных хозяйства Красноярского края, куда не было ввоза импортного скота. Серопозитивность животных всех обследованных категорий составила в среднем 38,4%. В том числе: телят до 30 дней – 34,6% (средние титры антител 2,5±0,72 lg2), телят 1-6-месячного возраста 20,4% (1,5±0,03 lg2). 35,5% телят до 30 дней не имели колостральных антител. Серопозитивность коров достигала 75%, а титры антител к вирусу – 7,4±0,21 lg2, что было выше, чем у животных этой категории в хозяйствах Новосибирской и Тюменской областей (4,5±0,09 lg2 и 4,8±0,19 lg2 соответственно). Разница достоверна при Р<0,05.
Титры антител к вирусу у телят до одного месяца были также выше (2,5±0,72 lg2), чем у животных других областей (0,9±0,57 и 1,9±0,42 lg2, соответственно). Это можно объяснить тем, что на момент исследований в данных хозяйствах регистрировали вспышки респираторных болезней среди телят до 6-месячного возраста и коров.
Уровень инфицированности животных в Омской области находился в пределах 42,8%. 63,6% телят до 30-ти дневного возраста также не содержали антител к вирусу. Серопозитивность телят 1-6-месячного возраста составила 23,8%, а средние титры антител - 2,2±0,03 lg2, телят от 6 месяцев и старше – 40,0% (2,4±0,67 lg2), телок – 56,2% (5,2±0,18 lg2), а коров 72,4% (4,5±0,09 lg2). Средние титры антител у животных всех половозрастных групп составили 3,02±0,47 lg2.
Уровень инфицированности животных в Иркутской области был ниже, чем в других территориальных регионах Сибири, за исключением хозяйств, куда осуществлялся ввоз импортного скота.
Показатели инфицированности животных в Республике Хакасия были низкими, что связано, вероятно, с низкой концентрацией поголовья в хозяйствах.
Таким образом, уровень серопозитивности к вирусу увеличивался с возрастом животных, а титры антител достоверно повышались к 12-ти месяцам и старше. Высокие титры антител к вирусу у коров, вероятно, являлись следствием его активной циркуляции среди этой категории животных, являющейся источником возбудителя для неимунных телят.
Сероконверсию (4 – 32 кратное повышение титров антител) к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4-6 месяцев и коров. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).
2.2.7. Частота выявления вируса у животных различных
половозрастных групп методом ОТ-ПЦР
С целью изучения возрастной восприимчивости животных к инфицированию вирусом методом ОТ-ПЦР исследовали 273 пробы биологического материала от телят до 6-ти месяцев, телок, нетелей и коров.
Из данных таблицы 7 видно, что в среднем вирус присутствовал в 15,4% исследованных проб биоматериала, полученных от крупного рогатого скота при вспышках болезни. Чаще геном вируса выявляли у телят до 6-месячного (27/19,7%) и коров (10/16,1%), что свидетельствует об их восприимчивости к инфицированию вирусом. При исследовании биоматериала от телят до 10-дневного возраста количество положительных проб составило 4,5% от числа исследованных.
Таблица 7 – Частота выявления РСВ КРС у животных различных половозрастных групп
| Половозрастная группа животных | Исследовано проб биоматериала | Выявлено положительных проб | Процент положительных проб от числа исследованных |
| Телята от 10 дней до 1 месяца | 66 | 3 | 4,5 |
| Телята от 1 мес. до 6 мес. | 137 | 27 | 19,7 |
| Телки | 3 | 0 | 0 |
| Нетели | 5 | 2 | 40,0 |
| Коровы | 62 | 10 | 16,1 |
| Всего: | 273 | 42 | 15,4 |
Таким образом, по данным ОТ-ПЦР, к инфицированию вирусом восприимчивы все категории животных, но наиболее восприимчивыми являются телята до 6-месячного возраста и коровы. Выявление генома вируса в пробах биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствует, по нашему мнению, о вовлечении в эпизоотический процесс этой категории животных. Полученные результаты согласуются с результатами серологических исследований, приведенных в предыдущем разделе.
2.2.8. Особенности течения РСИ КРС в ассоциации с другими
инфекционными заболеваниями по результатам
серологических исследований
При серологическом обследовании животных хозяйств региона, отнесенных ко всем категориям, выявили специфические антитела к вирусам РСИ, ИРТ, ВД-БС и ПГ-3 КРС в 63,8 %, ИРТ, ВД-БС и возбудителям хламидиоза в 9,5 %; ИРТ, ВД-БС КРС, аденовирусной инфекции в 70,6%, этим возбудителям и рота- и коронавирусным инфекциям в 23,4% случаев.
Таким образом, в племенных и товарных хозяйствах РСИ, ИРТ и ВД-БС КРС у телят могут протекать в ассоциации с другими инфекциями. Однако наличие диагностического прироста титров вируснейтрализующих антител чаще выявляемое у больных животных именно к этим вирусам, а также более частое выделение возбудителей от больных животных свидетельствует, на наш взгляд, об их ведущей роли в данных ассоциациях.
2.2.8.1. Частота инцидентности РСИ КРС в молочных хозяйствах
в зависимости от уровня серопозитивности животных к вирусу
ВД-БС КРС и наличия в них персистентно инфицированных животных
Известно, что возбудитель ВД-БС КРС способен вызывать иммунотолерантные эмбриональные инфекции, что приводит к рождению персистентно инфицированных (ПИ) телят, служащих постоянным источником (резервуаром) возбудителя инфекции в популяции КРС. Вследствие иммуносупрессивного свойства вируса у инфицированных животных повышается восприимчивость к инфицированию другими вирусными и бактериальными патогенами. Высокий уровень серопозитивности животных в стадах, где не проводится специфическая профилактика болезни, может свидетельствовать о наличии в них ПИ животных.
В связи с этим целью настоящего раздела было изучение влияния уровня серопозитивности к вирусу ВД-БС КРС и наличия в стадах ПИ животных на частоту проявления респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота.
Из данных таблицы 8 видно, что в хозяйствах с наличием импортированного скота уровень инфицированности животных вирусом ВД-БС КРС был высоким и достигал 90,27%. Количество ПИ животных в них составило 3,13%. В этих хозяйствах регистрировали острые вспышки инфекции, сопровождающиеся, в частности, болезнями молодняка в постнатальный период.
Таблица 8 – Частота проявления РСИ КРС в зависимости от уровня инфицированности животных вирусом ВД-БС КРС и наличия ПИ-животных в молочных стадах различного размера
| Категория хозяйств | Половозрастные группы животных | Исследовано проб | Серопозитивность к вирусу ВД-БС КРС, % | Выявление ПИ животных, % | Серопозитивность к РСВ КРС | Наличие клинических признаков РСИ КРС/выявление вируса в ОТ-ПЦР (+;-) |
| Крупные с наличием импортного скота | Телята до 6 мес. | 372 | 92,74 | 9,14 | 29,9 | +/высокая |
| Телки случного возраста | 445 | 73,26 | 6,74 | 86,2 | -/низкая | |
| Коровы и нетели | 2 060 | 93,50 | 1,26 | 86,6 | +/высокая | |
| Всего | 2877 | 90,27 | 3,13 | 67,5 | ||
| Крупные без импортного скота | Телята до 6 мес. | 488 | 83,40 | 6,56 | 25,5 | +/ высокая |
| Телки случного возраста | 1588 | 65,43 | 1,13 | 66,6 | -/ низкая | |
| Коровы и нетели | 3292 | 83,29 | 0,94 | 76,3 | +/ низкая | |
| Всего | 5368 | 78,02 | 1,51 | 56,1 | ||
| Средние и мелкие без импортного скота | Телята до 6 мес. | 364 | 67,31 | 3,30 | 20,4 | ±/ низкая |
| Телки случного возраста | 1499 | 27,69 | 0,87 | Не исследовали | -/ низкая | |
| Коровы и нетели | 2232 | 41,31 | 1,12 | 75 | -/ низкая | |
| Всего | 4095 | 38,63 | 1,03 | 47,7 |
Количество ПИ животных по половозрастным группам распределилось следующим образом: телята до 6 месяцев – 9,14 %, телки – 6,74 %, коровы и нетели – 1,26%. Анализ происхождения этих животных показал, что более 80% инфицированных телят были рождены от нетелей, завезенных из-за рубежа. Уровень серопозитивности животных к РСВ КРС в этих хозяйствах был также высоким и достигал 67,5%. Частота проявления клинических признаков респираторно-синцитиальной инфекции в них была выше, чем в хозяйствах второй и третьей категорий. Регистрировали клинические проявления как ВД-БС, так и РСИ КРС у телят до 6-месячного возраста и коров. У телок случного возраста отмечали только проявление вирусной диареи, но не респираторно-синцитиальной инфекции.
В крупных молочных комплексах без импорта скота (вторая категория) уровень инфицированности животных вирусом ВД-БС КРС был также высоким (78,02%). Превалентность ПИ животных в них была ниже и составила 1,51%, а по половозрастным группам: 6,56%, 1,13 % и 0,94 %, соответственно. В этих хозяйствах также регистрировали респираторные болезни телят.
Инфицированность животных РСВ КРС в этих хозяйствах находилась в пределах 25,5% у телят 1-6-месячного возраста, 50% у телят от 6 месяцев и старше, телок – 66,6%, а у коров 76,3% (в среднем 56,1%). Частота выявления РСВ была также высокой, однако его чаще обнаруживали у телят.
В мелких товарных хозяйствах серопозитивность скота к вирусу ВД-БС КРС составила 38,63%, а превалентность ПИ животных -1,03 %. Болезнь протекала в субклинической, реже в острой форме у телят и нетелей в респираторной форме ассоциативно с другими инфекциями.
Респираторно-синцитиальная инфекция имела распространение и в этих хозяйствах, однако уровень инфицированности животных был ниже, чем в хозяйствах первой и второй категории и составлял 47,7%. Клинические признаки болезни у животных регистрировались значительно реже и только у телят до 6-месячного возраста в виде слабого респираторного синдрома.
Таким образом, в крупных молочных стадах установлено ассоциативное течение вирусной диареи-болезни слизистых и респираторно-синцитальной инфекции крупного рогатого скота. Установлена взаимосвязь между уровнем инфицированности животных вирусом ВД-БС КРС и наличием в них животных, персистентно инфицированных этим вирусом. Количество ПИ животных коррелировало с возникновением клинических признаков респираторных болезней у телят, протекающих с участием респираторно-синцитиального вируса. Инцидентность респираторных болезней телят в крупных молочных хозяйствах с высокой молочной продуктивностью коров была выше, чем в средних и малых за счет наличия в них ПИ телят. Частота проявления клинических признаков РСИ у телят была выше в крупных хозяйствах и также зависела от количества персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС животных.
2.2.8.2. Влияние хозяйственных факторов на частоту проявления
клинических признаков респираторно-синцитиальной инфекции
и легочного пастереллеза крупного рогатого скота
Целью этого раздела являлось изучение влияния концентрации животных и уровня молочной продуктивности коров на проявление РСИ и легочного пастереллеза КРС (табл. 9).
Предварительные результаты серологических и вирусологических исследований также позволили разделить все хозяйства на три категории. К первой (низкий уровень серопозитивности) отнесли 9%, ко второй (средний) – 22, а к третьей (высокий уровень) – 60% от числа обследованных хозяйств.
Таблица 9 – Проявление РСИ КРС и легочного пастереллеза в зависимости от концентрации и продуктивности животных в хозяйстве
| Поголовье (коров) | Среднегодовой надой на фур. голову, кг | Серопозитивность, (%)/наличие сероконверсии (+;±;-) | Выделение возбудителя (+;±;-) | Клинические проявления (+;-) | Частота выделения бактерий семейства Pasteurellaceae, их патогенность (+; -) | |
| РСИ КРС | ||||||
| коровы | телята | |||||
| До 300 | До 2500 | 0-30/- | - | + | ± | Редко (-) |
| До 500 | 2500-4000 | 31-60/± | ± | ± | + | Относительно редко (±) |
| 800 и более | 4000-7000 | 61 и выше/+ | + | + | + | Часто (±) |
Известно, что на возникновение, развитие и течение респираторных болезней большое влияние оказывают хозяйственные факторы, в том числе, концентрация животных и их продуктивность (Н.Н. Крюков и соавт., 1984).
Анализируя влияние хозяйственных факторов на проявление вирусных инфекций, нами высказано предположение, что интенсивность проявления респираторных болезней молодняка КРС, а также их этиологическая структура различны и зависели от концентрации животных в хозяйствах и их продуктивности, в частности, молочной.
В мелких хозяйствах серопозитивность животных к вирусам ИРТ и ВД-БС КРС составляла 20-30%, отмечалась, как правило, циркуляция одного-двух возбудителей бактериальной природы, вызывающих респираторные болезни молодняка КРС до 1,5-месячного возраста. В хозяйствах, насчитывающих более 500 коров, серопозитивность животных к этим вирусам достигала 60%. В такой ситуации происходила активизация вирусных агентов и их участие в возникновении и развитии респираторных болезней молодняка. От больных телят выделялись вирусы, и отмечалась сероконверсия к ним. Спектр бактериальных агентов возрастал и насчитывал 4-5 и более, патогенность их варьировала от низкой до высокой. Возраст восприимчивых животных достигал 6 месяцев.
В хозяйствах, насчитывающих 800 и более коров с высокой молочной продуктивностью, инфицированность животных достигала 90-100%, выделение вирусов происходило чаще, процент сероконверсии также значительно возрастал. Спектр возбудителей бактериальной природы, вовлекаемых в инфекционный процесс, значительно расширялся, патогенность их также варьировала от низкой до высокой.
Важным аспектом патогенеза РСИ КРС является подавление неспецифических механизмов иммунной защиты респираторного тракта, а также инициация и усиление бактериальной колонизации легких после первичного размножения возбудителя. Вирус может вызывать бронхиты, пневмонии и эмфиземы легких самостоятельно, но главным его свойством является иммуносупрессия и формирование предрасположенности к возникновению бактериальных пневмоний, в частности, легочного пастереллеза. Исследованиями установлено, что культуры пастерелл, выступающие в качестве основного агента, осложняющего течение вирусных болезней, изолировали в 33,3% случаев, при этом они относились к родам multocida и haemolytica, вирулентность их варьировала от низкой до высокой.
Анализ данных ветеринарной отчетности за 1992-2010 гг. показал, что пастереллез крупного рогатого скота регистрировался в нескольких областях Сибири и чаще протекал в виде эндогенной инфекции на фоне предшествующих вирусных инфекций. С середины 90-х годов была отмечена тенденция к снижению случаев выделения этих бактерий (рис.).
Рисунок – Частота выделения бактерий сем. Pasteurellaceae при респираторных болезнях крупного рогатого скота в молочных хозяйствах, % от числа исследованных проб.
В 1992-97 гг. культуры пастерелл выделяли чаще от телят в крупных животноводческих хозяйствах по откорму молодняка. В период 1998-2006 гг. они присутствовали в пробах биоматериала от телят из хозяйств различного направления значительно реже. Начиная с 2007 г. количество проб, содержащих этот возбудитель, также стало возрастать.
В настоящее время заболевание телят пастереллезом, подтвержденное лабораторными исследованиями, регистрируется в хозяйствах с высокой концентрацией животных, специализирующихся на производстве молока, где серопозитивность животных к вирусам ВД-БС, ИРТ, РСИ КРС достигает 60-70% и выше.
2.2.8.3. Частота выделения возбудителей смешанных вирусных
инфекций и бактерий семейства Pasteurellaceae от больных телят в молочных хозяйствах, неблагополучных по респираторным болезням
Целью настоящего раздела было изучение частоты выявления респираторно-синцитиального вируса в ассоциациях с вирусами ИРТ, ВД-БС и бактериями семейства Pasteurellaceae в крупных молочных хозяйствах, стационарно неблагополучных по респираторным болезням КРС.
Из данных таблицы 10 видно, что количество проб, содержащих вирус ИРТ в моноварианте, составляло 30%, ВД-БС КРС – 18%; ассоциации этих вирусов - 71,7%. Высокий процент выявления положительных проб свидетельствует о широком распространении этих инфекций среди восприимчивого поголовья и, возможно, ведущей роли вирусов в инфекционном процессе. Культуры пастерелл изолировали в 33,3% случаев; при этом они относились к видам P. multocida (20%) и M. haemolytica (13,3%).
Таблица 10 – Частота выделения вирусов ВД-БС, ИРТ, РСИ КРС и бактерий семейства Pasteurellaceae от больных телят в хозяйствах, стационарно неблагополучных по респираторным болезням (2001-2010 гг.)
n=998
| № п/п | Наименование возбудителя, ассоциации возбудителей | Количество положительных проб | Выявлено положительных проб от числа исследованных, % |
| 1 | Вирус ИРТ КРС | 299 | 30 |
| 2 | Вирус ВД-БС КРС | 180 | 18 |
| 3 | Бактерии семейства Pasteurellaceae: а) M. haemolytica | 133 | 13,3 |
| б) P. multocida (A и D) | 200 | 20 | |
| 4 | Вирус ИРТ КРС и ВД-БС | 716 | 71,7 |
| 5 | Вирус ИРТ КРС и Pasteurella spp. | 200 | 20 |
| 6 | Вирус ВД-БС КРС и Pasteurella spp. | 519 | 52,9 |
| 7 | Вирус РСИ КРС | 123 | 11,0 |
| 8 | Вирус ИРТ, ВД-БС и РСИ КРС | 89 | 10,0 |
| 9 | Вирус РСИ КРС и Pasteurella spp. | 123 | 20,0 |
| 10 | Вирус ИРТ, ВД-БС и РСИ КРС и Pasteurella spp. | 235 | 15,0 |
Сочетание вирусов ИРТ и ВД-БС чаще всего выявляли в легких (37,8%), трахеальном и бронхиальном экссудате (16,5%), слизистой носа (10,2%) и трахеи (9,82%). Вирусно-бактериальные ассоциации – в легких: вирус ИРТ и бактерии семейства Pasteurellaceae – в 20,0%, а вирус ВД-БС КРС и бактерии этого семейства в 52,9% исследованных проб.
Количество проб биоматериала, содержащих вирус ВД-БС КРС и Р. multocida сероваров А и D, составило 6,8% в легочных лимфоузлах, 11,2% в бронхах, 3,4% в трахеальном и бронхиальном экссудатах. Число проб, содержащих этот вирус и M. haemolytica, составило 3,6% в легочных лимфоузлах и 9,9% в легких. Ассоциацию вирусов ИРТ, ВД-БС и бактерий семейства Pasteurellaceae выявляли также в легких (43,1%).
Количество проб, содержащих РСВ КРС в моноварианте, составило 11,0%, ИРТ, ВД-БС и РСВ КРС -10,0%, РСВ КРС и бактерии семейства Pasteurellaceae – 20,0%, а вирус ИРТ, ВД-БС и РСВ КРС в сочетании с бактериями этого семейства в 15,0% случаев. При этом РСВ КРС чаще выявляли в легких и бронхах (35,0%), носовых выделениях и органах верхнего респираторного тракта (11,0%).
Результаты исследований показали, что спектр микроорганизмов, вызывающих патологию респираторной системы крупного рогатого скота достаточно широк. Бактериальные заболевания часто являются вторичными, но могут протекать как сопутствующие или самостоятельные. Это зависит от концентрации животных, наличия или отсутствия специфической профилактики вирусных и бактериальных болезней, а также хозяйственных факторов.
В таких случаях смешанного течения респираторных инфекций изолировать возбудители вирусной природы обычными вирусологическими методами сложно и часто их первичная этиологическая роль остается не установленной вследствие постановки диагноза на бактериальные инфекции.
В связи с этим при планировании противоэпизоотических мероприятий крайне необходимо проводить весь комплекс диагностических исследований (вирусологических, бактериологических) с целью расшифровки этиологической структуры конкретной вспышки респираторных заболеваний и выяснения этиологической роли каждого инфекционного агента.
3.ВЫВОДЫ
1. Оптимальными параметрами выделения РСВ КРС являлись: отбор проб биоматериала от животных на ранних стадиях инфекции, транспортировка в охлажденном виде или в транспортной среде в течение суток в лабораторию с последующей немедленной обработкой и заражением культур клеток в день доставки. Выделение вируса эффективно в двухсуточной первично-трипсинизированной культуре клеток ТБ с адсорбцией в течение часа и добавлением 2% сыворотки плода крупного рогатого скота при 37оС с проведением не менее 8 «слепых» пассажей. Эффективность выделения повышалась при отсутствии стадии центрифугирования суспензии биоматериала или при адсорбции вируса на клетках в течение часа при +20°С с добавлением 1% димексида. Пригодной для выделения и культивирования вируса являлась также перевиваемая линия культуры клеток ТЭБ, обеспечивающая его накопление в титре не ниже 103,5 ТЦД50/мл. Контроль выделения, накопления, а также типирование вируса в зараженных культурах клеток необходимо осуществлять при помощи ОТ-ПЦР путем исследования вируссодержащей суспензии каждого пассажа.
2. При изучении чувствительности 18 культур клеток к двум штаммам вируса (РС-Б и К-18) установлено, что цитопатогенное действие вируса имело «штаммовый» характер. Наиболее чувствительной к штамму РС-Б оказались первично-трипсинизированная культура клеток ЛЭК и перевиваемая линия клеток FLK, титр вируса в которых составлял 3,74+0,12 lgТЦД50/мл и 3,36±0,17 lgТЦД50/мл, а к штамму К-18 – ТБ и ТЭБ, обеспечивавшие его накопление в титре 4,83±0,07 lg ТЦД 50/мл и 4,58±0,07 lg ТЦД 50/мл.
3. Размножение штаммов вируса в инфицированных культурах клеток не всегда сопровождалось развитием видимого ЦПД. Для контроля его репликации и определения инфекционной активности эффективными были методы бляшкообразующих единиц и окрашенных фокусов, электронная микроскопия, цитоморфологические исследования и ОТ-ПЦР. Более эффективным методом титрования вируса являлся метод БОЕ, наиболее простым – метод ФОЕ, а наиболее специфичным - метод ОТ-ПЦР.
4. Оптимальными условиями культивирования штамма РС-Б вируса с целью получения эритроцитарного антигена являлись: возраст культуры клеток 3-5 суток; множественность заражения 0,1 ТЦД50/клетка; адсорбция 1,5 часа; поддерживающие, питательные среды – Игла MEM, Игла и RPMI -1640 в соотношении 2:1 с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, сыворотки северных оленей или сыворотки цыплят; рН 7,4-7,8; инкубирование в стационарных или роллерных условиях при температуре 37°С; культивирование в течение 5-6 суток до выраженного ЦПД. Добавление 1% ДМСО и ДЭАЭ - декстрана 50 мкг на 1 мл положительно влияло на проявление ЦПД и повышало титр вируса на 0,5 и 1 lg ТЦД50/мл. Оптимальными условиями культивирования штамма К-18 были: использование 2-3 суточных культур клеток ТЭБ и ТБ с предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя клеток от ростовой среды с 10% коммерческой сыворотки крови крупного рогатого скота или телят. При использовании сыворотки эмбриона коровы необходимость отмывания монослоя клеток отпадала.
5. Активность эритроцитарных антигенов зависела от титра вируса в чувствительной культуре клеток. Наиболее активные антигены, титры которых со специфической к вирусу сывороткой составляли от 7,92±0,22 до 10,15±0,09 lg2, были получены из вируссодержащей суспензии, накопленной в культурах клеток Л5Э и П5Э, FLK и ЛЭК, а после адаптации и в перевиваемых линиях клеток Т-1 и ПТ. Штамм РС-Б обладал слабой антигенной активностью в отношении белых мышей линии BALB/c и морских свинок. Активность гипериммунных сывороток, использованных для положительного контроля набора, полученных на кроликах и баранах в реакции нейтрализации составила 5,38±0,16 - 6,08±0,09 lg2. Производственные испытания опытных серий специфических эритроцитарных антигенов в РНГА показали их высокую специфичность и активность.
6. С помощью РНГА выявлено наличие антител к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции у 71,9% молодняка в возрасте 4-6 месяцев; 69,2% – в возрасте 2-4 месяца; 55,9% – в возрасте 6-9 месяцев и у 50,8% крупного рогатого скота в 16 регионах Российской Федерации, в том числе у 33,01% овец и 87,76% коз. Сероконверсию к вирусу устанавливали у телят в возрасте: 4-6 месяцев в 52,6% случаев; 7-9 месяцев – 50,0%; 3-4 месяца – 37,5%, что свидетельствовало о переболевании животных в эти возрастные периоды. Диагностический прирост титров антител к вирусу у телят в возрасте 1-3 месяца устанавливали редко: в 4,0 и 6,7% случаев, соответственно 1 месяц (4,0%). Уровень инфицированности и частота проявления клинических признаков болезни зависели от концентрации животных на единицу площади, уровня молочной продуктивности коров и частоты ввода новых животных. Средние показатели инфицированности крупного рогатого скота различались по регионам и варьировали от 30,8% в регионах с низкой плотностью скота до 66,6% в регионах с высокой плотностью и наличием завозного скота. В крупных хозяйствах циркуляция вируса могла быть непрерывной за счет транзитной инфекции у коров и телят, что обеспечивало постоянный риск возникновения повторных вспышек болезни.
7. По данным метода ОТ-ПЦР к инфицированию вирусом восприимчивы все половозрастные группы животных. В среднем вирус присутствовал в 15,4% исследованных проб биоматериала, полученных от крупного рогатого скота при вспышках болезни. Частота выявления генома вируса от телят до 6-месячного возраста составила 19,7%, а от коров – 16,1% при наличии признаков острых респираторных заболеваний. Выявление вируса в 4,5% проб биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствовало о вовлечении их в инфекционный процесс.
8. В крупных молочных комплексах частота проявления РСИ КРС зависела от уровня инфицированности животных вирусом ВД-БС КРС, а также наличия в стадах животных, персистентно инфицированных этим вирусом. При уровне инфицированности животных вирусом ВД-БС КРС от 78,02 до 90,3% и наличии в стадах крупного рогатого скота не менее 3,13% ПИ вирусоносителей инцидентность РСИ КРС повышалась и сопровождалась выявлением возбудителя и сероконверсией к нему у животных различных половозрастных групп, включая коров и телят до 6-месячного возраста.
9. Этиологическая структура респираторных болезней на молочных комплексах носила полиэтиологический характер. Количество проб, содержащих вирус ИРТ в моноварианте в среднем, составляло 30%, ВД-БС КРС – 18%; ассоциации этих вирусов – 71,7%. Сочетание этих вирусов выявляли в легких (37,8%), трахеальном и бронхиальном экссудате (16,5%), слизистой носа (10,2%) и трахеи (9,82%). Количество проб, содержащих РСВ в моноварианте, составило 11,0%, его выявляли в 35,0% проб легких и бронхов, 11,0% проб носовых выделений и органов верхнего респираторного тракта. В 10,0% проб выявляли три вируса одновременно.
10. Вирусно-бактериальные ассоциации выявляли в легких: вирус ИРТ и бактерии семейства Pasteurellaceae – в 20,0%, а вирус ВД-БС КРС и бактерии этого семейства в 52,9% исследованных проб. РСВ КРС и бактерии семейства Pasteurellaceae – 20,0%, а сочетание трех вирусов и пастерелл – 15,0% случаев. Культуры пастерелл в моноварианте изолировали в 33,3% от общего числа исследованных проб, при этом они относились к видам P. multocida (20,0%) и M. haemolytica (13,3%). Патогенность их варьировала от низкой до высокой. M. haemolytica выделяли от животных всех половозрастных групп с острой формой легочного пастереллеза при завозе импортированного скота, а P. multocida от молодняка до 6-месяцев при энзоотическом проявлении болезни.
11. Результаты разработки и апробации комплекса диагностических исследований открывают возможность проведения мониторинга РСИ КРС в молочных хозяйствах различного профиля с наличием или отсутствием импортированных животных, а также послужат основой стратегии диагностических исследований для объективной оценки эпизоотической ситуации и установления роли вируса в этиологии массовых респираторных болезней, протекающих с участием этого патогена и других вирусов и бактерий, создавая перспективы оптимизации противоэпизоотических мероприятий, в том числе схем специфической профилактики болезни.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. В хозяйствах молочного направления, неблагополучных по вирусно-бактериальным болезням крупного рогатого скота, необходимо проводить комплекс серологических и молекулярных исследований с целью расшифровки этиологической структуры инфекционной патологии и установления роли респираторно-синцитиального вируса;
2. Комплекс диагностических исследований проводить с использованием
- «Набора для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции (РС-инфекции) крупного рогатого скота овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» ТУ- 10-19-162-91.
- «Тест-системы для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в программе подготовки студентов по курсам «Вирусология», «Эпизоотология» по специальности «Ветеринария» в ФГОУ ВПО «Новосибирский Государственный аграрный университет», ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», ФГОУ ВПО «Красноярский Государственный аграрный университет», ФГОУ ВПО «Алтайский Государственный аграрный университет», ГОУ ВПО «Хакасский Государственный университет им. Н.Ф. Катанова».
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных
ВАК Минобразования и науки РФ
1. Васильев, А.В. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / А.В. Васильев, Н.Г. Осидзе, В.Н. Сюрин, Л.М. Акбаева, И.Я. Строганова, Л.И. Баринова // Ветеринария. – 1988. – № 10. – С. 33-34.
2. Строганова, И.Я. Специфические гипериммунные сыворотки к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2009. – Вып. 11. – С.161-163.
3. Строганова, И.Я. Этиологические факторы и особенности эпизоотологии вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота в условиях Красноярского края / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2009. – Вып. 7 – С.116-119.
4. Строганова, И.Я. Реакция непрямой гемагглютинации в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2009. – Вып. 9. - С. 134-136.
5. Строганова, И.Я. Распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / И.Я. Строганова, А.Г. Глотов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2009. – № 12. – С. 87-91.
6. Строганова, И.Я. Изучение активности эритроцитарных антигенов респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота для реакции непрямой гемагглютинации / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2009. – Вып. 11. – С. 158-161.
7. Строганова, И.Я. Инфекционная активность респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в процессе хранения / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2009. – Вып. 12. – С.155-157.
8. Строганова, И.Я. Эритроцитарный антигенный диагностикум респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / И.Я. Строганова // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2010. - №6. – С.79-82.
9. Строганова, И.Я. Анализ эпизоотической ситуации по вирусным респираторным болезням крупного рогатого скота в Средней Сибири / И.Я. Строганова // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2010. – № 8. – С.73-76.
10. Глотова, Т.И. Выделение и типирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота при помощи ОТ-ПЦР / Т.И. Глотова, О.В. Кунгурцева, А.Г. Глотов, И.Я. Строганова, К.В. Войтова, Т.В. Гальнбек // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2010. – № 10. – С.59-64.
11. Строганова, И.Я. Особенности эпизоотической ситуации по вирусным респираторным болезням крупного рогатого скота в Восточной Сибири / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 1. – С.125-128.
12. Строганова, И.Я. Обнаружение и определение инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток / И.Я. Строганова // Достижения науки и техники АПК. – 2011. – № 2. – С. 59 – 60.
13. Строганова, И.Я. Чувствительность клеточных культур к различным штаммам респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота / И.Я. Строганова, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 2. – С.127-130.
14. Строганова, И.Я. Методы обнаружения и идентификации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток / И.Я. Строганова, К.В. Войтова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 3. – С. 128-133.
15. Строганова, И.Я. Цитоморфологический метод исследования для контроля размножения респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток / И.Я. Строганова // Аграрный вестник Урала. – 2011. – № 3(82). – С. 29-31.
16. Строганова, И.Я. Распространение аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Восточной Сибири / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 4. – С. 108-111.
17. Строганова, И.Я. Инфекционная активность респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в клеточных культурах / И.Я. Строганова, Л.М. Акбаева // Сельскохозяйственная биология. – 2011. - №2. – С. 99-102.
18. Строганова, И.Я. Анализ распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в двух регионах Восточной Сибири / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 5. – С. 124-127.
19. Строганова, И.Я. Распространение парагриппа-3 крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Восточной Сибири / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 6. – С. 115-118.
20. Строганова, И.Я. Закономерности распространения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в Восточной Сибири / И.Я. Строганова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – Вып. 7. – С. 118-120.
Монография
21. Глотов, А.Г. Вирусные болезни крупного рогатого скота при интенсивном ведении молочного животноводства: монография / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова; КрасГАУ. – Красноярск, 2010. – 188 с.
Учебное пособие
22. Строганова, И.Я. Вирусные болезни крупного рогатого скота: учебное пособие, рекомендованное Сибирским региональным методическим центром высшего профессионального образования для межвузовского использования/ И.Я. Строганова, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова; КрасГАУ и ИЭВСиДВ Россельхозакадемии. – Красноярск. – 2011. – 192 с.
Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах
конференций и других изданиях
23. Строганова, И.Я. Чувствительность диплоидных культур клеток к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота / И.Я. Строганова, Н.П. Симбирцев // Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной экономической реформы: тез. докл. Всесоюзной науч.-практ. конф. (Сумы, 1989). – Сумы, 1989. – С. 175-176.
24. Строганова, И.Я. Чувствительность перевиваемых клеточных линий к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота /И.Я. Строганова // Наука – сельскохозяйственному производству: Тез. науч. конф. (КрасГАУ). – Красноярск, 1993. – С. 4-5.
25. Строганова, И.Я. Изучение оптимальных условий культивирования штамма «РС-Б» респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в чувствительных культурах клеток / И.Я. Строганова // Наука – сельскохозяйственному производству: Тез. науч. конф. (КрасГАУ). – Красноярск, 1995. – С. 36-37.
26. Строганова, И.Я. Методы контроля размножения и определения инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток / И.Я. Строганова // Реконструкция гомеостаза: материалы IX Международного симпозиума (Красноярск, 16-20 марта 1998). – Красноярск, 1998. – Т. 4. – С. 97-99.
27. Глотов, А.Г. Особенности эпизоотической ситуации по вирусным респираторным болезням крупного рогатого скота в Сибири / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, А.В. Нефедченко, В.И. Аксенов, И.Я. Строганова, В.А. Качанов, Ю.Н. Зайцев // Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири: сб. науч. тр. (РАСХН. Сиб. отделен. ИЭВСиДВ). – Новосибирск, 2006. – С. 52-56.
28. Строганова, И.Я. Адаптация респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота к перевиваемым линиям клеток / И.Я. Строганова // Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири: материалы междунар. школы – конф. (Красноярск, 7-9 октября 2008). – Красноярск, 2008. – С. 307-308.
29. Строганова, И.Я. Получение специфических гипериммунных сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота / И.Я. Строганова // Аграрно-экономическая наука республики Тыва: основные результаты и перспективы: Сб. материалов межрегион. науч.–практ. конф. ( Кызыл, 8-10 августа 2009). – Кызыл, 2009. – С. 137-140.
30. Строганова, И.Я. Активность эритроцитарных антигенов респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота / И.Я. Строганова, Л.М. Акбаева // Там же. – С. 141-144.
31. Строганова, И.Я. Серологическая диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и коз в реакции непрямой гемагглютинации / И.Я. Строганова, А. М. Акбаева // Там же. – С. 144-148.
32. Строганова, И.Я. Распространение вирусных пневмоэнтеритов крупного рогатого скота в хозяйствах Красноярского края / И.Я. Строганова // Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития: материалы Всероссийской науч.–практ. конф. (ФГОУ ВПО КрасГАУ, 20 апреля 2009). – Красноярск, 2009. – С. 308-309.
33. Строганова, И.Я. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Средней Сибири / И.Я. Строганова // Проблемы современной аграрной науки: материалы междунар. заочн. науч. конф. (Красноярск,15 октября 2009). – Красноярск, 2009. – С. 99-101.
34. Войтова, К.В. Распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в молочно – товарных хозяйствах / К.В. Войтова, А.В. Нефедченко, С.В. Котенева, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, А.Г. Глотов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: междунар. конф., посвящ. 40-летию ВНИТИБП, отдел вет. мед. Россельхозакадемии (Щелково, 9-10 декабря 2009). – ВНИТИБП, 2009. – С. 242-245.
35. Строганова, И.Я. Вирусные болезни крупного рогатого скота в Средней Сибири / И.Я. Строганова // Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: междунар. науч.–практ. конф. (Саратов, 16 марта 2010). – Саратов, 2010. – С. 408-410.
36. Глотов, А.Г. Экономическая эффективность диагностических мероприятий при вирусных болезнях крупного рогатого скота /А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, В.В. Краснов // Проблемы экономического развития и обеспечения безопасности в области ветеринарии: Всероссийская науч.-практ. конф. (Троицк,18 марта 2010). – Троицк, 2010 – С. 53-56.
37. Строганова, И.Я. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота в Восточной Сибири / И.Я. Строганова // Современные научно–практические достижения в ветеринарии: междунар. науч.–практ. конф. (Киров, 15-16 апреля 2010). – Киров, 2010. – С. 210-212.
38. Луков, П.В. Респираторные болезни крупного рогатого скота в Восточной Сибири / П.В. Луков, И.Я. Строганова // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: тр. IV межд. науч. конф. молодых ученых 22-23 апреля 2010 г. (п. Краснообск, 22-23 апреля 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 91-94.
39. Строганова, И.Я. Вирусная респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота в хозяйствах Красноярского края / И.Я. Строганова, А.Г. Хлыстунов // Инновация в науке и образовании: опыт, проблемы перспективы развития: материалы Всероссийской очно-заочной науч.-практ. конф. (Красноярск, 22 апреля 2010). – Красноярск, 2010. – С. 256-258.
40. Строганова, И.Я. Анализ эпизоотической ситуации по вирусным респираторным болезням крупного рогатого скота в Иркутской области / И.Я. Строганова, В.И. Мельцов // Научные основы улучшения ветеринарного благополучия и продуктивности животных: сб. материалов междунар. науч.-практ. конф. (Кызыл, 14-16 июня 2010). – Кызыл, 2010. – С. 139-142.
41. Акбаева, Л.М. Получение специфических гипериммунных сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота на баранах и кроликах / Л.М. Акбаева, И.Я. Строганова // Там же. – С.19-21.
42. Акбаева, Л.М. Подготовка антигена респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота при получении тест-системы для серологической диагностики РСИ в реакции непрямой гемагглютинации / Л.М. Акбаева, И.Я. Строганова // Там же. – С. 15-18.
43. Глотов, А.Г. Использование ПЦР для индикации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, К.В. Войтова, И.Я.Строганова // Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана: сб. науч. докл. XII междунар. науч.-практ. конф. (Улаанбаатор, 6-7 июня 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 78-81.
44. Строганова, И.Я. Анализ эпизоотической ситуации по вирусным болезням крупного рогатого скота в Республике Хакасия / И.Я. Строганова, А.Г. Хлыстунов // Проблемы современной аграрной науки: материалы междунар. заочной науч. конф. (Красноярск, 15 октября 2010). – Красноярск, 2010. – С. 68-70.
45. Глотов, А.Г. Молекулярные механизмы синергизма вирусов и бактерий Mannheimia haemolytica A1, способствующие возникновению бронхопневмонии у телят / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию со дня основания ИЭВСиДВ (п. Краснообск, 28-29 октября 2010). Россельхозакадемия. Сиб. регион. отд-ние. ГНУ ИЭВСиДВ. – Краснообск, 2010. – С. 27-32.
46. Глотов, А.Г. Особенности диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, К.В. Войтова // Там же. – С. 33-40.
47. Войтова, К.В. Применение методов ПЦР для изучения распространения респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Сибири / К.В. Войтова, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, И.Я. Строганова // Молекулярная диагностика – 2010: сб. науч. тр. VII Всероссийской науч.-практ. конф. с междунар. участием 24-26 ноября. Т.2. – Москва, 2010. – С. 79-80.
