Вирусные болезни и современные методы оздоровления плодовых и ягодных культур спе ци аль ность
На правах рукописи
УПАДЫШЕВ МИХАИЛ ТАРЬЕВИЧ
ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ И СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
ОЗДОРОВЛЕНИЯ ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР
Специальность 06.01.07 – защита растений
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
доктора сельскохозяйственных наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор
Белошапкина Ольга Олеговна
Российский Государственный Аграрный Университет – Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева;
доктор биологических наук
Балашова Ирина Тимофеевна
Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур РАСХН;
доктор биологических наук
Перевертин Кирилл Александрович
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН
Ведущая организация: Государственное научное учреждение
Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства
имени И.В. Мичурина Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится “ 09 ” июня 2011 года в 13 час. на заседании диссертационного совета Д 006.035.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии по адресу: 115598, Москва, ул. Загорьевская, 4, конференц-зал, факс 8 (495) 329 31 66, e-mail [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии.
Автореферат разослан и выставлен на сайте ВАК РФ “___” __________ 2011 г.
Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.
Учёный секретарь диссертационного совета
кандидат сельскохозяйственных наук Л.А. Марченко
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В связи с необходимостью интенсификации садоводства все большее значение приобретает разработка высокоэффективных технологий производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур.
В настоящее время в условиях антропогенных систем распространенность и вредоносность вирусов вследствие появления новых штаммов и размножения неоздоровленного посадочного материала, как правило, существенно возрастают (Романенко, Перевертин и др., 2006). Наиболее вредоносные вирусы способны приводить к потерям 20-70 % урожая (Вердеревская, Маринеску, 1985; Clever, Stehr, 1996; Белошапкина, 2005; Лукьянова, 2007). Поэтому анализ распространенности вирусных болезней, прогноз их развития, уничтожение очагов карантинных объектов и создание безвирусного питомниководства плодовых и ягодных культур являются актуальными задачами защиты растений. Видовой состав и распространённость вирусов на груше, рябине, жимолости, ежевике, малине чёрной, малино-ежевичном гибриде, лимоннике, актинидии в условиях России изучены недостаточно, нуждаются в научном обобщении и анализе.
«Концепцией развития аграрной науки и научного обеспечения АПК России до 2025 г.», принятой МСХ в 2007 г., в качестве важной задачи в области защиты растений определено создание новых методов фитосанитарной диагностики. В настоящее время отечественными и зарубежными учеными широкое применение методов молекулярного анализа рассматривается как стратегическое направление эпидемиологии вирусов (Kummert et al., 2001; Балашова, Пивоваров, 2003; Jelkmann, 2004).
При оздоровлении растений от вирусов актуальным является совершенствование методов суховоздушной термотерапии, культуры меристем, хемотерапии, а также разработка новых высокоэффективных способов оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов.
Для успешного оздоровления и последующего микроразмножения растений необходимо совершенствование существующих биотехнологических методов и разработка новых технологических приемов, направленных на увеличение выхода здоровых растений.
Целью исследований является изучение распространенности и вредоносности основных вирусных болезней плодовых и ягодных культур и разработка современной научно обоснованной технологии оздоровления.
Задачи исследований:
1. Определить видовой состав и установить закономерности распространения вирусов на ряде плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне России.
2. Оценить вредоносность основных вирусов и обосновать необходимость оздоровления посадочного материала.
3. Усовершенствовать основные методы диагностики вирусов (индикаторный метод, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция).
4. Установить закономерности оздоровления садовых растений от вредоносных вирусов.
5. Изучить антивирусную активность фенольных соединений при хемотерапии.
6. Выявить влияние магнитного поля на некоторые вирусы растений.
7. Изучить действие различных факторов на регенерационные процессы при ускоренном размножении оздоровленных растений.
8. Оценить экономическую эффективность получения здорового посадочного материала с применением разработанной технологии.
Методология исследований заключается в поиске путей решения проблемы снижения вредоносности вирусов, разработке оптимальных методов диагностики и комплекса оздоровительных мероприятий, позволяющих на основе использования современных вирусологических и биотехнологических приемов ускорить получение здорового посадочного материала ягодных и плодовых культур.
Научная новизна результатов исследований. Разработана и научно обоснована современная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от основных вредоносных вирусов. Впервые предложена теория оздоровления растений от вирусов, в основе которой лежит постулат о взаимодействии вируса, растения-хозяина и окружающей среды.
Установлены закономерности распространения вирусов разной этиологии в различных насаждениях ряда плодовых и ягодных культур в зависимости от возраста и местоположения плантации, сортовых особенностей, способа размножения и условий выращивания. В результате серомониторинга в Нечерноземной зоне России выявлено широкое распространение вирусных болезней (в среднем от 21 до 51 %) с преобладанием комплекса из 2 (реже из 3-5) вирусов. Впервые дана оценка уровня изменчивости распространенности разных видов вирусных патогенов.
Показано отрицательное влияние латентных вирусов на генеративную продуктивность и биохимические показатели у груши; неповирусов и вируса SLRSV – на генеративную и вегетативную продуктивность ежевики и малино-ежевичного гибрида. Установлено, что некоторые вирусы способны ингибировать процессы органогенеза при микроразмножении и размножении стеблевыми черенками.
Впервые применительно к биологическим особенностям изученных культур усовершенствованы методы диагностики вирусов (индикаторный метод, ИФА, ПЦР) с применением гидроксипроизводного бензойной кислоты (патенты № 2147173, 2389795).
Предложена научно обоснованная концепция оздоровления растений. Определена зависимость эффективности оздоровления от вида вируса, генетических особенностей растений, способа оздоровления, типа и величины инициальных эксплантов. Впервые при использовании культуры тканей доказана возможность увеличения размера апекса до 1 мм без существенного снижения эффекта оздоровления от основных вредоносных вирусов.
Разработан эффективный способ хемотерапии in vitro зараженных вирусами растений с использованием экологически безопасных гидроксибензойных кислот (патент № 2233579).
Впервые предложена концепция магнитотерапии вирусов растений и установлено антивирусное действие импульсного магнитного поля в отношении латентных вирусов на груше, вирусов кустистой карликовости малины и черной кольцевой пятнистости томата – на малино-ежевичном гибриде (патенты № 2277771, 2310318).
Разработаны приемы ускоренного размножения оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур на основе концепции чередования питательных сред, оптимизации состава среды, использования экологически безопасных фенольных соединений и регуляторов роста нового поколения, магнитно-импульсной обработки и модификации спектрального состава света.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Специфичность видового состава и закономерности распространения вирусов в насаждениях ряда плодовых и ягодных культур.
2. Преимущества ИФА и ПЦР в современной системе диагностики вирусов.
3. Концепция оздоровления растений с применением биологических, физических и химических методов.
4. Принципы использования фенольных соединений в системе диагностики, оздоровления от вирусов и ускоренного размножения здоровых растений.
5. Научно обоснованные приемы ускоренного размножения плодовых и ягодных культур в системе производства здорового посадочного материала.
Предметом исследований являются закономерности распространения и локализации вирусов в растениях, диагностики вирусных патогенов и оздоровления растений.
Практическая значимость исследований. Разработана современная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от основных вредоносных вирусов, включающая инновационные методы диагностики и эффективные вирусологические и биотехнологические приемы получения здорового посадочного материала, что позволяет повысить достоверность диагностики и выявляемость вирусов до 90-100 %, увеличить выход здорового материала в 1,7-2,1 раза на ягодных культурах и в 3,5-10,5 раза на плодовых культурах, снизить себестоимость базисных растений в 1,2-1,8 раза.
Испытания предложенной технологии были проведены в НПЦ биотехнологии «Фитогенетика» (г. Тула) в условиях лаборатории биотехнологии и зимней теплицы, где получены положительные результаты от применения предложенного заменителя агар-агара на ряде ягодных и плодовых культур.
Изобретения «Питательная среда для выращивания растений in vitro» (патент № 2039428) и «Способ размножения садовых растений» (патент № 2183057) регулярно использовались в лаборатории вирусологии ВСТИСП при получении оздоровленного посадочного материала ягодных и плодовых культур.
Разработанный способ диагностики внедрен и применяется в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, а также прошел успешные испытания в ООО «АгроДиагностика», где показано повышение эффективности выявления вирусов на 25 % при выполнении ОТ-ПЦР по предложенному способу в сравнении с известным.
Эффективность магнитно-импульсной обработки при ускоренном размножении здорового посадочного материала плодовых и ягодных культур подтверждена результатами испытаний, проведенных специалистами ФГНУ «Росинформагротех».
Показано положительное действие иммуностимуляторов на продуктивность деревьев груши в условиях промышленных насаждений ГНУ ВСТИСП (2006-2008 гг.).
Оздоровленным посадочным материалом плодовых и ягодных культур, полученным диссертантом, заложены маточные насаждения в 18 хозяйствах 15 областей. Всего за период с 1992 по 2010 гг. получено около 80 тысяч здоровых растений плодовых и ягодных культур.
Работа отмечена 1 золотой и 2 серебряными медалями ВВЦ, награждена дипломом за лучшую завершенную научную разработку 2006 года.
Результаты исследований были использованы при разработке национальных стандартов ГОСТ Р 53135-2008 «Посадочный материал плодовых, ягодных, субтропических, орехоплодных, цитрусовых культур и чая. Технические условия» и ГОСТ Р 54051-2010 «Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия», а также при составлении 6 методических указаний.
Личный вклад автора. Постановка проблемы, формулировка цели и задач исследований, разработка программы и методологии исследований, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично. Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75 %) с профессором В.А. Высоцким, в. н. с. В.И. Донецких, зав. ОНТИ Г.В. Бешновым, к. с.-х. н. А.А. Томилиным, в. н. с. Г.Ю. Упадышевой, зав. лабораторией вирусологии Н.Н. Мельниковой, с. н. с. О.Ю. Сурковой, аспирантами А.Д. Петровой, Е.А. Туть, П.А. Походенко, И.И. Сауниной (ГНУ ВСТИСП), зав. лабораторией биохимии А.В. Гуськовым (ИФР РАН).
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были представлены на международных конференциях: II и VIII конференциях «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» (Алматы, 1993; Саратов, 2003), III, IV и V конференциях «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1995, 1997, 1999), «Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур» (Москва, 2001), 9 конференции по садоводству «Fruit growing and viticulture II. Floriculture and medicinal plants and other general themes» (Ледница, 2001), «Современное плодоводство: состояние и перспективы развития» (Самохваловичи, 2005), «Мониторинг и методика исследований в садоводстве в нестабильных экологических условиях» (Москва, 2005), «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов» (Москва, 2006), 2-ом «Форуме возрождения китайской северо-восточной старой промышленной базы: научно техническое сотрудничество Китая и СНГ» (Харбин, 2006), «Состояние и перспективы развития культуры жимолости в современных условиях» (Мичуринск, 2009), «Инновационные технологии в питомниководстве» (Самохваловичи, 2009), «Оценка состояния и резервы повышения эффективности производства продукции садоводства и пчеловодства» (Новосибирск, 2010), «Инновационные направления и проблемы в защите садовых культур от вредных организмов на современном этапе» (Москва, 2010); международных симпозиумах: IV, VI, VII и VIII симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001, 2005, 2009; Белгород, 2006), VI и VII симпозиумах по фенольным соединениям (Москва, 2004, 2009); Всероссийских конференциях и совещаниях: «Актуальные проблемы развития питомниководства и научное обеспечение отрасли» (Москва, 1993), Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 1995), «Актуальные вопросы теории и практики защиты плодовых и ягодных культур от вредных организмов в условиях многоукладности сельского хозяйства» (Москва, 1998), «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1999, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 170 печатных работ, в том числе 31 – в рецензируемых научных журналах списка ВАК, 3 монографии (2 – в соавторстве), 1 книга (в соавторстве), 6 методических указаний, получено 3 авторских свидетельства СССР на изобретения и 17 патентов РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 480 страницах (основной текст на 326 страницах), содержит 117 таблиц, 59 рисунков; состоит из введения, 8 глав, выводов и рекомендаций производству, 12 приложений, списка цитируемой литературы из 816 наименований, в том числе 513 – на иностранных языках.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Систематизированы сведения по современной классификации вирусов. На основе анализа мировой и отечественной литературы детально рассмотрены видовой состав, распространенность и вредоносность основных вирусов плодовых и ягодных культур. Отмечена широкая распространенность вирусов разной этиологии в насаждениях плодовых и ягодных культур, обоснована необходимость проведения комплекса защитных мероприятий в зависимости от вида вируса и биологических особенностей растения-хозяина.
Критически проанализированы современные методы диагностики вирусных болезней, дана оценка их преимуществ и недостатков, показана необходимость их дальнейшего развития и совершенствования.
Рассмотрены методы оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов, приведены сведения по их эффективности, доказана целесообразность поиска альтернативных и экологически безопасных методов оздоровления.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Основные исследования проводили с 1992 по 2010 гг. на базе лаборатории вирусологии и на вирусологическом участке отдела защиты растений ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии.
Тест-образцы для изучения распространенности вирусных болезней отбирали в процессе маршрутных обследований насаждений плодовых и ягодных культур в 14 учреждениях Московской, Брянской, Тульской, Самарской, Свердловской, Вологодской областей.
Основными объектами исследований служили растения груши 11 сортов; рябины 9 сортов; ирги Ламарка; ежевики 4 сортов; малино-ежевичного гибрида 4 сортов; малины чёрной сорта Кумберленд; малины красной 2 сортов; жимолости 10 сортов; лимонника китайского 3 сортов; актинидии коломикта 7 сортов; актинидии полигама 3 сортов; актинидии аргута 1 сорта.
Изучали следующие вирусы: бороздчатости древесины яблони (Apple stem grooving virus – ASGV), ямчатости древесины яблони (Apple stem pitting virus – ASPV), хлоротической пятнистости листьев яблони (Apple chlorotic leaf spot virus – ACLSV), мозаики яблони (Apple mosaic virus – ApMV), шарки сливы (Plum pox virus – PPV), некротической кольцевой пятнистости косточковых (Prunus necrotic ringspot virus – PNRSV), карликовости сливы (Prune dwarf virus – PDV), скручивания листьев черешни (Cherry leaf roll spot virus – CLRV), мозаики резухи (Arabis mosaic virus – ArMV), кольцевой пятнистости малины (Raspberry ringspot virus – RpRSV), кустистой карликовости малины (Raspberry bushy dwarf virus – RBDV), латентной кольцевой пятнистости земляники (Strawberry latent ringspot virus – SLRSV), черной кольцевой пятнистости томата (Tomato black ring virus – TBRV), огуречной мозаики (Cucumber mosaic virus – CMV), табачной мозаики (Tobacco mosaic virus – TMV).
Диагностику вирусов проводили методами иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием тестов на травянистых и древесных индикаторах в соответствии с «Типовыми методиками диагностики вирусных болезней сельскохозяйственных культур, одобренными специалистами стран-членов СЭВ» (1970), «Технологией производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда» (1989), методическими указаниями «Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур» (2001), «Методическими указаниями по экспресс-диагностике вирусов на ягодных культурах» (2002), «Диагностикой вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР» (2008). Применяли сэндвич-вариант твердофазного ИФА в планшетном формате с использованием базовой методики (Clark, Adams, 1977) и диагностических наборов из НИИ садоводства Молдовы, фирм «Loewe» (Германия), «Savoir Faire» (INRA, Франция), «Bioreba» (Швейцария). Регистрацию результатов анализов выполняли на фотометре при длине волны 405 нм. Всего за годы исследований протестировано более 3 тысяч образцов (каждый образец – на 4-5 вирусов в 2-кратной повторности).
ПЦР-тесты проводили с праймерами, синтезированными в компании «СибЭнзим» и готовыми наборами для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанными в ООО «Агродиагностика» и компании «Биоком». Экстракцию РНК осуществляли методом сорбции на препарате силика (по Menzel et al., 2002; Uyemoto, Rwahnih, 2006), модифицированным нами. Амплификацию выполняли в программируемом термостате «Терцик». Для проведения ПЦР в реальном времени использовали систему «MiniOpticon» (США) с выводом графиков флуоресценции на монитор компьютера. Повторность в опытах – 5-кратная.
Тесты на древесных индикаторах осуществляли в условиях открытого грунта способом двойной окулировки (OEPP/EPPO Bulletin, 1991-1992) и в зимней теплице по методике P.R. Fridlund (1980) на плодовых культурах или прививкой на растениях рода Rubus (OEPP/EPPO Bulletin, 1994); на травянистых индикаторах – в условиях зимней теплицы. Повторность – 5-кратная.
Оздоровление растений от вирусов проводили с использованием методов суховоздушной термотерапии, культуры апексов, хемотерапии и магнитотерапии in vitro. Термотерапию осуществляли в соответствии с «Технологией производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда» (1989) в термокамерах «Универсал-1» в течение 30-82 суток с последующей прививкой верхушек на безвирусные сеянцы или высадкой апексов на питательные среды. В качестве антивирусных препаратов использовали следующие соединения: ДГТ (2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин), цианогуанидин, 2-тиоурацил, салициловую, галловую, сиреневую, п-кумаровую, кофейную и феруловую кислоты. Магнитотерапию микрочеренков груши и малино-ежевичного гибрида проводили с помощью прибора СИ-3, разработанного в отделе механизации ВСТИСП в. н. с. В.И. Донецких, импульсами с частотой 0,2-51,2 Гц. Каждый вариант в экспериментах по хемо- или магнитотерапии включал 15-20 эксплантов.
Оценку продуктивности здоровых и зараженных вирусами растений груши, ежевики и малино-ежевичного гибрида проводили в соответствии с «Программой и методикой сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (1999). Повторность в опытах – 10-кратная. Определяли количество хлорофилла (а + b) по методике Н.Н. Иванова (1946) с фотоколориметрическим завершением, активность растворимой формы пероксидазы – по модифицированной методике А.В. Гуськова и др. (1988) в 3-кратной повторности.
Клональное микроразмножение осуществляли в соответствии с «Методическими указаниями по клональному микроразмножению черной и красной смородины» (1986). Для культивирования эксплантов применяли питательные среды T. Murashige и F. Skoog в модификации В.А. Высоцкого и др. (1976), E.C.M. Lee и R.A. Fossard (1975) и W.C. Anderson (1980). В варианте – 20-25 эксплантов.
Оптимизацию минерального состава среды для размножения осуществляли по усеченной матрице 6-факторного эксперимента (по Малышеву, 1977) и с применением компьютерной программы. На этапе размножения в питательную среду добавляли 6-БАП, тидиазурон, этрел; салициловую, галловую, сиреневую, п-кумаровую, кофейную и феруловую кислоты. На этапе укоренения испытывали регуляторы роста: ИМК, ИУК, НУК, рибав-экстра, амбиол, этрел, флоридзин, фенолкарбоновые кислоты.
Статистическую обработку осуществляли методами дисперсионного, корреляционного и регрессионного анализа по Б.А. Доспехову (1985). Использовали компьютерные программы Excel и STRAZ.
Расчёт экономической эффективности выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве» (2005) и на основе технологических карт.
Глава 3. АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Груша. Изучение распространённости вирусных болезней груши в насаждениях 4-х областей (Московской, Самарской, Свердловской и Вологодской) и 8 учреждениях показало, что наиболее часто встречающимся вирусом является вирус ASPV, которым было заражено в среднем 45 % проверенных деревьев (таблица 1). Остальными видами вирусов было заражено от 28 до 34 % деревьев груши. Распространенность латентных вирусов в некоторых учреждениях достигала 60-83 %.
Таблица 1 – Распространенность вирусов на груше в некоторых учреждениях
России, в % к числу обследованных деревьев (2001-2006 гг.)
| Учреждение | Число тест-образцов | ASGV | ASPV | ApMV | ACLSV |
| Коллекция лаборатории вирусологии ВСТИСП | 271 | 26,9 | 42,6 | 68,1 | 32,2 |
| Коллекция отдела питомниководства ВСТИСП | 351 | 19,8 | 60,0 | 42,6 | 47,3 |
| Коллекция отдела селекции ВСТИСП | 85 | 44,1 | 64,3 | 37,9 | 8,3 |
| ГУ ОС «Центральная» (Московская обл.) | 120 | 15,3 | 12,8 | 20,0 | 24,4 |
| ОПК «Непецино» (Московская обл.) | 60 | 20,0 | 10,0 | 0,0 | 17,0 |
| РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева | 58 | 27,6 | 82,8 | 35,9 | 21,9 |
| ГБС имени Н.В. Цицина | 120 | 60,0 | 7,0 | 27,0 | 60,0 |
| Самарская опытная станция | 48 | 40,7 | 45,0 | 39,6 | 39,1 |
| Свердловская опытная станция | 45 | 0,0 | 80,0 | 34,5 | 26,8 |
| СХПК «Майский» (Вологодская обл.) | 36 | 25,0 | 41,5 | 38,5 | 12,5 |
Большинство сортов оказались заражёнными комплексом вирусов, причём чаще всего (в 20-35 % случаев) – комплексом из двух вирусов (ApMV + ACLSV), несколько реже (в 15-27 % случаев) – комплексом из трёх вирусов (ApMV + ASGV + ACLSV; ApMV + ASPV + ACLSV; ASGV + ASPV + ApMV). Комплексом из 4-х вирусов было заражено 15 % образцов. Как наиболее чувствительные к латентным вирусам, выявлены сорта Нарядная Ефимова, Память Жегалова, Петровская, Юрьевская, Самарская зимняя, Румяная Кедрина, Самарская жемчужина и вид груши лохолистная.
Установлена сильная положительная корреляция между индексами зараженности вирусами ApMV и ACLSV (r = 0,80), ACLSV и ASPV (r = 0,75). Поэтому данные комплексы вирусов можно рассматривать как стабильно существующие во времени и пространстве.
С увеличением возраста деревьев груши имелась выраженная закономерность возрастания зараженности вирусами (рисунок 1). На сортах груши Велеса, Венера, Чижовская и Кокинская с увеличением возраста отмечали относительно плавное увеличение числа деревьев, зараженных вирусом ASGV. По другим видам вирусов, начиная с 2003-2004 годов, происходило резкое увеличение числа зараженных деревьев, возможно, из-за сильной омолаживающей обрезки.
Вирусы на груше находились в латентной форме. Иногда на листьях деревьев отмечали симптомы вирусной инфекции в виде хлоротических пятен и мозаики.
Рисунок 1 – Зараженность деревьев груши сорта Велеса различными
вирусами в условиях Московской области в динамике по годам исследований.
Рябина. Изучение вирусной инфекции на рябине показало, что эта культура характеризуется повышенной восприимчивостью к вирусам различной этиологии. В ходе обследований на рябине нами выявлено наличие 8 вирусов (таблица 2).
Таблица 2 – Распространенность вирусов в насаждениях рябины в различных
хозяйствах РФ (1992–2000 гг.)
| Хозяйство, область | Число тест-образцов | Зараженность (%) тест-образцов вирусами | |||||||
| PNRSV | PDV | ACLSV | ASGV | PPV | ArMV | TBRV | SLSRV | ||
| Агрофирма "Саженец", Тульская область | 55 | 1,9 | 6,3 | 0,0 | 0,0 | 48,2 | 0,0 | 0,0 | 12,5 |
| СХПК «Майский», Вологодская область | 35 | 42,9 | 0,0 | 28,6 | 14,3 | 16,7 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| Ленинский ГСУ, Московская область | 20 | 100 | 0,0 | 0,0 | 66,7 | -* | 55,5 | 77,8 | 66,7 |
| ГНУ ВСТИСП, Московская область | 398 | 52,6 | 0,0 | 5,3 | 0,0 | 10,5 | 63,2 | 15,8 | 0,0 |
| ООО "Стародубский", Брянская область | 40 | 57,0 | 0,0 | 0,0 | - | - | 0,0 | 50,0 | 0,0 |
*Диагностика на данный вирус не проводилась.
Во всех насаждениях выявлен вирус PNRSV, которым было инфицировано в среднем 51 % тест-образцов. Вирусы ASGV, PPV, ArMV, TBRV и SLRSV выявлены в 2–3 насаждениях из 5 обследованных у 15–28 % тест-образцов. Встречаемость вирусов PDV и ACLSV была невысокой. Вирус CLRV диагностирован лишь у 7 % растений.
Установлено, что распространенность вирусов обусловливается местоположением плантации и происхождением исходного посадочного материала.
Симптомы вирозов на листьях рябины чаще всего представляли собой кольцевые пятна и мозаику на листьях, причем преимущественно в нижнем ярусе кроны и у основания побегов. Наиболее поражаемыми сортами рябины являются Невежинская жёлтая, Невежинская красная, Бусинка, Розина, Ликёрная.
Тестирование на вирусы PNRSV, PPV, PDV и ACLSV сеянцев рябины, полученных от сортов Розина, Концентра и Невежинская с симптомами вирусных болезней, показало отсутствие вирусов. На сеянцах рябины сорта Рубиновая, выращенных из семян бессимптомных растений, был идентифицирован вирус PNRSV в высокой концентрации (индекс зараженности 3,5).
Ягодные культуры. Анализ распространенности вирусов на растениях ежевики показал, что процент заражения неповирусами ArMV и TBRV был почти одинаковым (таблица 3). Вирусы SLRSV и RpRSV встречались у 16 и 17 % растений ежевики.
Таблица 3 – Распространённость (%) вирусов на некоторых ягодных культурах в Московской области (в среднем за 1992-2007 гг.)
| Культура | Число тест-образцов | ArMV | RpRSV | SLRSV | TBRV |
| Ежевика | 643 | 25,0 | 17,1 | 15,9 | 22,0 |
| Малина чёрная | 114 | 10,0 | 9,4 | 12,1 | 20,5 |
| Малино-ежевичный гибрид | 392 | 14,8 | 30,6 | 28,1 | 25,4 |
| Жимолость | 146 | 11,1 | 12,2 | 17,6 | 33,1 |
| Актинидия | 123 | 43,3 | 33,3 | 32,2 | 13,3 |
| Лимонник | 80 | 40,0 | 30,0 | 30,0 | 10,0 |
На малине чёрной преобладал неповирус TBRV. Наибольшее распространение на малино-ежевичных гибридах имели вирусы RpRSV, SLRSV и TBRV, на жимолости – TBRV, на актинидии и лимоннике – ArMV.
На растениях рода Rubus изучена распространённость вируса кустистой карликовости малины (RBDV). На ежевике сортов Агавам, Торнфри, Смутстем и малине черной сорта Кумберленд вирус RBDV отсутствовал, тогда как на малино-ежевичном гибриде сортов Краснодарская и Логанберри он выявлен в очень высокой концентрации (индекс зараженности 11,4 и 7,4 соответственно).
Установлена закономерность возрастания концентрации вирусов по мере увеличения возраста растений. В среднем по 3-м сортам ежевики (Торнфри, Агавам, Дарроу) через 7 лет выращивания число безвирусных растений снизилось на 25 %, а через 9 лет – на 40 %. На ежевике сорта Смутстем за период с 1992 по 1995 годы индекс зараженности возрос в 2,4-10,4 раза в зависимости от вида возбудителя.
На бесшипных сортах ежевики американского происхождения (Торнфри и Смутстем) отмечена наибольшая распространенность вирусов среди ежевик (10-39 %). Ежевика сорта Агавам отличалась более низкими процентами зараженности (4,5-20 %). Среди малино-ежевичных гибридов наиболее поражаемым оказался сорт Логанберри (25-50 %).
На растениях рода Rubus симптомы вирусной инфекции, как правило, отсутствовали, реже проявлялись в виде хлороза жилок и искривления листовой пластинки.
Установлено, что большинство сортов жимолости (66,7 %) заражено комплексом вирусов. Сорта Юля, Избранница, Вырицкая крупная, Лазурная, Салют и Нимфа были заражены двумя вирусами (чаще TBRV и RpRSV; TBRV и SLRSV); сорта Старт, Парабельская, Синяя птица – тремя (обычно TBRV, SLRSV и CMV); Камчадалка, Берель и Голубое веретено – четырьмя; Роксана и Павловская – пятью вирусами. Для некоторых сортов (Ленинградский великан, Томичка) была характерна моновирусная инфекция. На сортах Бажовская и Морена вирусы не обнаружены. Анализ зависимости зараженности вирусами сортов жимолости от их происхождения и зоны выведения показал более сильную зараженность и наличие более широкого круга вирусов на сортах селекции НИИС имени М.А. Лисавенко (диагностировалась по 2-5 вирусов) по сравнению с сортами селекции ВНИИР имени Н.И. Вавилова (по 1-2 вируса).
Выявлена тенденция увеличения индекса зараженности растений жимолости вирусами RpRSV и ArMV по мере увеличения длительности выращивания. В большинстве случаев вирусы на жимолости находились в латентной форме, хотя на отдельных кустах ряда сортов отмечали зелёную крапчатость листьев, жёлтую штриховатость и межжилковый хлороз.
На актинидии чаще других диагностировались вирусы CLRV, ArMV и PNRSV. Несколько меньший процент зараженности (около 30 %) отмечен для вирусов RpRSV, SLRSV, PDV и CMV. Вирус TBRV встречался редко.
Наибольшее число растений лимонника было заражено вирусами CLRV и АrMV. Реже встречались (у 30 % растений) вирусы SLRSV, RpRSV и PNRSV. Низкая распространенность была характерна для CMV, PDV и TBRV.
Изучение передачи вирусов при семенном размножении жимолости показало наличие вируса TBRV у 22 %, а SLRSV – у 11 % растений. В наших экспериментах с ежевикой процент зараженных сеянцев колебался от 15 % по вирусу RpRSV до 57,5 % по вирусу SLRSV. Неповирусами ArMV и TBRV было заражено 35 % сеянцев ежевики.
Таким образом, серомониторинг насаждений изученных плодовых и ягодных культур позволил выявить довольно широкую распространённость вирусных заболеваний различной этиологии.
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ВРЕДОНОСНОСТИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Груша. Генеративная продуктивность деревьев груши, зараженных вирусами, в среднем по 6 сортам снижалась на 20 % по сравнению с безвирусными деревьями (таблица 4). Сорта Венера и Москвичка оказались чувствительными к заражению латентными вирусами, снизив генеративную продуктивность на 50-58 %.
Корреляционный анализ показал, что между индексом зараженности вирусами и числом плодов на деревьях груши имеет место средняя отрицательная корреляция. Вирусы ACLSV, ApMV и ASPV характеризовались средним отрицательным и существенным
Таблица 4 – Продуктивность деревьев груши (кг/дерево) в зависимости от
заражённости латентными вирусами ASPV, ASGV и ACLSV
| Сорт | Наличие вирусов | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | Среднее |
| Венера | 0,5 б* | 0,1 а | 1,6 б | 1,5 б | 0,9 б | |
| + | 0,3 а | 0,1 а | 1,0 а | 1,0 а | 0,6 а | |
| Кокинская | 0,2 а | 0,8 а | 1,0 а | 0,1 а | 0,5 а | |
| + | 2,5 б | 2,5 б | 1,8 б | 1,2 б | 2,0 б | |
| Велеса | 5,3 а | 0,5 а | 4,0 а | 3,4 а | 3,3 а | |
| + | 4,3 а | 0,6 а | 4,5 а | 3,0 а | 3,1 а | |
| Москвичка | 14,9 б | 5,1 а | 12,2 б | 10,2 а | 10,6 б | |
| + | 7,4 а | 4,5 а | 5,2 а | 9,5 а | 6,7 а | |
| Чижовская | 15,2 а | 8,0 а | 16,6 б | 12,1 а | 13,0 а | |
| + | 14,4 а | 7,3 а | 11,5 а | 11,8 а | 11,3 а | |
| Нарядная Ефимова | 1,0 а | 0,1 а | 0,2 а | 0,2 а | 0,4 а | |
| + | 0,6 а | 0,02 а | 0,02 а | 0,6 а | 0,3 а | |
| Среднее | 6,2 б | 2,4 а | 5,9 б | 4,6 а | 4,8 б | |
| + | 4,9 а | 2,5 а | 4,0 а | 4,5 а | 4,0 а |
*Статистическая обработка сделана отдельно по каждому сорту. Разные буквы обозначают существенность различий при 5 %-ом уровне значимости.
на 5 %-ом уровне значимости влиянием (r = – 0,35…– 0,38) на число плодов. На сорте Велеса наиболее сильное негативное влияние на число плодов оказывали вирусы ApMV и ACLSV: коэффициент корреляции составил соответственно – 0,64 и – 0,61.
Зараженные вирусами деревья груши сорта Чижовская характеризовались на 30 % более низкой вегетативной продуктивностью по сравнению с безвирусными деревьями. У сорта Венера латентные вирусы приводили к снижению суммарной длины побегов на 17 %, а числа побегов – на 14 %.
Содержание хлорофилла в свободных от вирусной инфекции листьях груши было в среднем на 14 % выше, чем в образцах, зараженных комплексом латентных вирусов. Наибольшая разница по содержанию хлорофилла в листьях зараженных и свободных от вирусов деревьев отмечена у сорта Чижовская – 25 %.
В зараженных латентными вирусами образцах груши активность пероксидазы повышалась на 58 %. Наиболее существенные различия по активности пероксидазы в зараженных и безвирусных образцах отмечены у сортов Венера, Кокинская и Чижовская – в 2-2,4 раза.
Следовательно, латентные вирусы вызывали изменения метаболизма, приводя к снижению содержания суммарного хлорофилла и повышению активности пероксидазы в листьях.
Ягодные культуры. Изучение вредоносности вирусов на ежевике и малино-ежевичном гибриде показало снижение урожая у заражённых растений в среднем на 71 % (таблица 5).
Таблица 5 – Вегетативная и генеративная продуктивность ежевики и малино-ежевичного гибрида в зависимости от заражённости вирусами ArMV, RpRSV и SLRSV (в среднем за 1999-2007 гг.)
| Сорт | Наличие вирусов | Суммарная длина побегов, м. | Число побегов | Урожай, кг/куст |
| Агавам | 7,9 а | 8,1 а | 2,2 б | |
| + | 6,5 а | 7,4 а | 1,4 а | |
| Торнфри | 6,5 б | 13,8 а | 0,8 б | |
| + | 4,4 а | 10,9 а | 0,3 а | |
| Тэйберри | 5,5 б | 10,7 б | 0,5 б | |
| + | 3,1 а | 6,6 а | 0,3 а | |
| Среднее | 6,6 б | 10,9 а | 1,2 б | |
| + | 4,7 а | 8,3 а | 0,7 а |
Наиболее существенное снижение урожая отмечали у заражённых вирусами растений сорта Торнфри – в 2,7 раза по сравнению со здоровыми кустами. У сортов Агавам и Тэйберри под действием вирусов урожай снижался соответственно в 1,6 и 1,7 раза.
Суммарная длина побегов ежевики, зараженной вирусами, снижалась на 22-48 % в зависимости от сорта, малино-ежевичного гибрида – на 77 % в отличие от безвирусных растений.
Вредоносность вирусов при зеленом черенковании. Вирусы снижали укореняемость черенков ежевики сорта Торнфри и ухудшали показатели их вегетативного развития. При заражении неповирусами и вирусом SLRSV отмечено снижение укореняемости ежевики в 1,8 раза. На черенках, зараженных вирусами RpRSV и SLRSV, формировалось на 18 % меньше корней, а прирост побегов снижался на 20 %.
Вирус CLRV оказывал негативное влияние на ризогенез клоновых подвоев вишни АВЧ-2, снижая укореняемость зеленых черенков на 20 % и выход стандартных подвоев – на 33 %.
Вредоносность вирусов при культивировании растений in vitro. Выявлено, что неповирусы ухудшают вегетативное развитие растений на этапе клонального микроразмножения. Комплекс вирусов RpRSV и SLRSV на ежевике сорта Торнфри приводил к ингибированию вегетативного развития эксплантов, уменьшая суммарную длину побегов в 1,6 раза, а их число – в 1,5 раза (таблица 6).
Таблица 6 – Показатели вегетативного развития микрорастений ежевики в
зависимости от их зараженности вирусами (в среднем за 1996-2001 гг)
| Сорт | Наличие вирусов | Суммарная дли- на побегов, мм | Число побегов | Укореняе-мость, % | Приживаемость при адаптации,% |
| Торнфри | – | 113,6 б | 6,7 б | 94,4 б | 87,0 а |
| RpRSV + SLRSV | 72,5 а | 4,4 а | 80,0 а | 77,8 а | |
| Агавам | – | 41,9 а | 6,5 а | 92,1 б | 53,7 б |
| ArMV + SLRSV | 35,1 а | 5,6 а | 75,4 а | 21,2 а |
Укореняемость микропобегов ежевики сорта Торнфри при заражении вирусами снизилась на 14 %, а на сорте Агавам значительно ухудшилась как укореняемость побегов, так и приживаемость в нестерильных условиях. Одновременно уменьшились в 1,8-2,1 раза число и длина корней.
Экспланты малины черной, зараженные вирусом RpRSV, характеризовались на 24 % более низким коэффициентом размножения по сравнению со здоровыми растениями.
Микрорастения рябины сорта Титан, инфицированные вирусом PDV, имели на 41 % меньшую длину побегов. Коэффициент корреляции между индексом зараженности этим вирусом и числом побегов составил r = – 0,57.
Таким образом, вирусы оказывают негативное влияние на процессы регенерации и роста растений в культуре тканей. Размножение здоровых растений на питательных средах обеспечивает улучшение вегетативного развития и увеличение выхода посадочного материала.
Глава 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ
ВИРУСОВ САДОВЫХ КУЛЬТУР
5.1. Повышение эффективности индикаторного метода
Тестирование на травянистых индикаторах. Для улучшения переноса вирусов на травянистые индикаторы требуется совершенствование состава буфера путем введения в него антиоксидантов.
Включение в состав буфера салициловой кислоты улучшало передачу вируса PDV с рябины сорта Бусинка на индикатор Chenopodium quinoa. При использовании контрольного буфера (с никотин-основанием) симптомы инфекции отсутствовали (таблица 7).
Таблица 7 – Эффективность выявления вируса PDV на рябине сорта Бусинка при тестировании на индикаторе Chenopodium quinoa в зависимости от препарата в составе буфера для заражения
| Препарат | Концен-трация, М | Число растений с вирусными симпто-мами, в % | Число дней от инокуляции до появления симптомов | Наличие и вид симптомов |
| Контроль (никотин-основание) | 0,1 | 0 | – | – |
| Диэтилдитио- карбамат натрия | 0,015 | 20,0 | 10 | Хлоротические пятна |
| Салициловая кислота | 0,0001 | 25,0 | 6-7 | Хлоротические пятна, скручивание краёв молодых листьев |
При передаче вирусов АrМV, RpRSV, TBRV и SLRSV с ежевики сорта Смутстем на индикатор Chenopodium quinoa включение в состав буфера гидроксипроизводного бензойной кислоты (ГПБК) приводило к появлению симптомов инфекции на листьях индикатора. В варианте с никотин-основанием (10-1 М) симптомы отсутствовали. По мере снижения концентрации ГПБК с 10-3 до 10-5 М имелась тенденция к увеличению числа растений с симптомами вирусной инфекции от 40 до 80 % (патент РФ № 2147173). Разработанный способ позволяет повысить накопление вирусов в тканях индикаторов и ускорить процесс тестирования.
Тестирование на древесных индикаторах. При тестировании рябины на древесных индикаторах симптомы вирусных заболеваний отсутствовали, а по результатам ИФА высокие значения индексов зараженности вирусами ACLSV и ApMV отмечены для рябины сортов Красавица, Рубиновая и вида моравская (таблица 8).
Таблица 8 – Зараженность древесных индикаторов вирусами ACLSV и ApMV при тестировании рябины (по результатам ИФА)
| Сорт рябины | Вид индикатора | ACLSV | ApMV | |||
| Ао/Ак * | НВ | Ао/Ак | НВ | |||
| Моравская | Spy-227 | 3,3 | + | 4,2 | + | |
| Красавица | Spy-227 | 3,9 | + | 4,4 | + | |
| Malus platycarpa | 1,2 | 6,0 | + | |||
| Рубиновая | Spy-227 | 3,6 | + | 3,5 | + | |
| Форма № 3 | Jay Darling | 2,5 | + | 3,8 | + | |
* Ао/Ак – индекс зараженности (экстинкция образца/экстинкция контроля); НВ – наличие вируса.
При тестировании ежевики сорта Смутстем у индикатора Malling Exploit отмечали отставание в росте и хлороз листовой пластинки. Накопление вирусов в тканях индикатора Malling Exploit проходило интенсивнее, чем у R. occidentalis. Поэтому для тестирования ежевики на неповирусы предпочтительнее использовать сорта красной малины по сравнению с черной.
5.2. Оптимизация метода иммуноферментного анализа
5.2.1. Влияние распределения вирусов в органах растений и подбора
оптимального вида образца на результаты диагностики
Вирусы в тканях растений распределены неравномерно, поэтому при выполнении ИФА важное значение имеет выбор оптимального вида образца. В фазу начала цветения для выявления вирусов ASPV, ASGV и ApMV на груше предпочтительней оказалось использование в качестве образцов для ИФА лепестков цветков по сравнению с листьями, а при диагностике вируса ACLSV оба вида образцов давали близкие результаты (таблица 9).
Таблица 9 – Концентрация вирусов в различных органах и заражённость деревьев груши латентными вирусами в зависимости от фазы цветения и вида тестируемого органа в открытом грунте (в среднем за 2003-2004 гг.)
| Тести- руемый орган | Показа- тель зара- жённости вирусом | ASPV | ASGV | ApMV | ACLSV | ||||
| НЦ* | КЦ | НЦ | КЦ | НЦ | КЦ | НЦ | КЦ | ||
| Листья | Ао/Ак | 1,3 а | 2,1 б | 1,5 а | 2,1 б | 1,4 а | 1,6 а | 1,7 а | 1,5 а |
| % зара-женности | 28,6 а | 61,5 б | 21,4 а | 46,2 б | 21,4 а | 23,0 а | 71,5 б | 25,0 а | |
| Лепестки цветков | Ао/Ак | 1,7 а | 1,4 а | 1,4 а | 1,8 а | 1,6 а | 1,2 а | 1,6 б | 1,1 а |
| % зара-женности | 71,4 б | 15,4 а | 25,7 а | 38,5 б | 78,6 б | 0,0 а | 64,3 б | 0,0 а | |
*НЦ – начало цветения, КЦ – конец цветения.
В фазу окончания цветения вирусы лучше выявлялись в листьях, чем в лепестках цветков. Для идентификации вируса ASGV следует отбирать листья или лепестки цветков в фазу окончания цветения, вируса ASPV – лепестки цветков в фазу начала цветения или листья в фазу окончания цветения. Диагностику вируса ApMV лучше осуществлять путем тестирования лепестков цветков, а вируса ACLSV – листьев и лепестков цветков в фазу начала цветения.
При выявлении вируса ACLSV в условиях зимней теплицы использование лепестков цветков оказалось предпочтительней, чем листьев. Вирус ASPV выявлялся в листьях лучше (концентрация в 2,6 раза выше), чем в цветках. В завязях груши концентрация вирусов была ниже, чем в листьях. Наибольшая концентрация вирусов ASPV, ASGV, ACLSV и ApMV отмечена в листьях груши у основания побега, а вируса PNRSV – в средней части и у основания побега.
На рябине вирус ASGV успешно диагностировался в древесине побега и листьях. Концентрация вирусов в верхушечных листьях рябины была выше, чем в нижних (таблица 10).
Таблица 10 – Индекс зараженности растений рябины различными вирусами в зависимости от расположения листьев на побеге (в среднем по 4 срокам тестирования)
| Сорт | PNRSV | PDV | PPV | |||
| В* | О | В | О | В | О | |
| Невежинская желтая | 2,8 а | 2,4 а | 2,2 а | 3,0 а | 1,8 а | 1,8 а |
| Невежинская крупноплодная | 2,7 б | 1,9 а | 2,8 б | 1,3 а | 2,2 б | 1,3 а |
| Невежинская красная | 2,4 б | 1,6 а | 3,2 б | 1,8 а | 1,3 а | 1,6 а |
| Алая крупная | 2,5 а | 1,9 а | 2,1 а | 4,1 б | 1,8 а | 2,2 а |
| Розина | 3,3 б | 2,3 а | 2,0 а | 2,2 а | 1,8 а | 1,4 а |
| Бусинка | 2,8 б | 1,5 а | 3,0 б | 2,1 а | 2,3 б | 1,5 а |
| Среднее по сорту | 2, 8б | 1,9 а | 2,6 а | 2,4 а | 1,9 а | 1,6 а |
*В – верхушечные листья, О – листья у основания побега.
В условиях защищенного грунта для рябины оптимальным периодом диагностики являлся срок тестирования с февраля по май.
У большинства ягодных культур вирусы более интенсивно накапливались в молодых листьях верхушечной части побега (таблица 11).
Таблица 11 – Распределение вирусов по побегу у ягодных культур, индекс зараженности Ао/Ак (в среднем за 2003 и 2005 г.г.)
| Культура | Сорт | ArMV | RpRSV | SLRSV | TBRV | ||||
| В | О | В | О | В | О | В | О | ||
| Ежевика | Торн- фри | 2,1 б | 1,0 а | 1,2 а | 1,0 а | 1,3 а | 1,4 а | 1,3 а | 1,5 а |
| Смут- стем | 2,6 а | 2,6 а | 1,3 а | 1,3 а | 1,0 а | 1,5 б | 1,8 а | 2,8 б | |
| Малино- ежевичный гибрид | Логан- берри | 1,7 а | 1,5 а | 1,6 а | 1,3 а | 1,9 б | 0,8 а | 2,1 б | 1,4 а |
| Малина чёрная | Кумбер- ленд | 1,3 а | 1,0 а | 1,1 а | 1,0 а | 1,6 а | 1,4 а | 1,8 а | 1,6 а |
| Жимолость | Салют | 1,5 а | 1,3 а | 2,0 б | 1,5 а | 1,8 б | 1,2 а | 1,9 б | 1,1 а |
У ежевики сорта Смутстем вирус ArMV равномерно распределялся по побегу, а вирус TBRV интенсивнее накапливался в листьях у основания побега.
Вирус ArMV на ежевике лучше выявлялся в листьях и завязях, а в лепестках цветков он отсутствовал. Вирус TBRV присутствовал в листьях и бутонах ежевики, а в завязях не обнаруживался.
На актинидии не выявлено преимущество использования почек, бутонов и коры побегов для диагностики вирусов по сравнению с листьями. У форм актинидии с пестролистностью вирусы чаще обнаруживались в бесхлорофилльных сегментах листьев.
5.2.2. Выявление оптимальных сроков тестирования
Выбор оптимального срока диагностики тесно связан с условиями выращивания тестируемых растений. В условиях зимней теплицы вирус ASPV на груше выявлялся при тестировании в весенний период (март и май) – 35-40 %, тогда как в июле он не диагностировался. Вирус ASGV примерно на одном уровне (26-27 %) диагностировался во все изученные сроки, что связано с его термостабильностью. Диагностику вирусов ApMV и ACLSV на груше предпочтительней оказалось осуществлять в марте, тогда как в более поздние сроки процент достоверно зараженных растений существенно снижался.
В условиях открытого грунта вирусы на груше лучше диагностировалось в начале июня, чем в мае и июле (таблица 12). В мае процессы репликации и распространения вирусов по побегу отстают от процессов пролиферации. К июню концентрация вирусов достигает максимума, и диагностика в этот срок наиболее эффективна.
Таблица 12 – Результаты тестирования растений груши на вирусы в зависимости от срока в условиях открытого грунта, % зараженных растений (в среднем за 2000-2004 гг.)
| Месяц | ASPV | ASGV | ACLSV | ApMV |
| Май | 31,3 б | 18,8 а | 50,0 б | 12,5 а |
| Июнь | 62,2 в | 35,1 б | 62,2 б | 48,6 б |
| Июль | 17,4 а | 14,2 а | 18,8 а | 15,2 а |
При диагностике вируса ACLSV он не обнаруживался в мае только у 7 %, тогда как в июле – уже у 80 % растений груши (рисунок 2).
Рисунок 2 – Результаты диагностики груши на вирус ACLSV методом ИФА в зависимости от срока: внутренний круг – май, внешний – июль (открытый грунт).
При тестировании рябины в феврале – апреле в условиях защищённого грунта показатели индекса зараженности вирусами PDV и PNRSV были в 2,4 и 3,7 раза выше, чем в июне. У сорта Титан вирус PNRSV успешно диагностировался в феврале и июле, а в период с марта по июнь его концентрация снижалась ниже достоверных значений (рисунок 3). На сортах Алая крупная и Розина отмечали подъём концентрации PNRSV в феврале и апреле. По вирусу PDV наиболее высокие индексы зараженности были с марта по май. Максимальная концентрация вируса PPV у пяти сортов приходилась на март, у сорта Розина – на апрель.
А Б
Рисунок 3 – Индекс зараженности рябины вирусами в зависимости от сортовых особенностей и срока тестирования в условиях зимней теплицы: А. Титан; Б. Розина.
На ягодных культурах оптимальные сроки анализа приходились на май – начало июня для условий открытого грунта, на февраль – апрель – для теплиц. На ежевике отмечена высокая эффективность ИФА и в сентябре.
В условиях зимней теплицы максимальная концентрация вирусов в листьях ежевики и малины черной отмечалась с февраля по апрель. Летом концентрация вирусов снижалась: индексы зараженности к июню уменьшались в 1,5-3 раза (таблица 13).
Таблица 13 – Зараженность растений ежевики и малины черной вирусами в зависимости от срока тестирования в условиях зимней теплицы, индекс зараженности
| Срок тестирования | Ежевика | Малина черная | ||||||
| ArMV | RpRSV | SLRSV | TBRV | ArMV | RpRSV | SLRSV | TBRV | |
| Февраль | 2,7 | 2,2 | 3,1 | 2,7 | 2,1 | 1,9 | 2,6 | 2,1 |
| Апрель | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Июнь | 1,5 | 2,3 | 1,0 | 1,0 | 1,4 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| НСР05 | 0,5 | 0,4 | 0,8 | 0,7 | 0,5 | 0,4 | 0,6 | 0,5 |
На актинидии вирусы успешно выявлялись при тестировании в июне.
Следовательно, репликация вирусов на плодовых и ягодных культурах на протяжении вегетационного сезона подвержена значительным колебаниям и находится в прямой зависимости от погодных условий и степени старения листового аппарата.
5.2.3. Повышение чувствительности ИФА путем подбора экстрагирующего буфера
Для повышения чувствительности ИФА в экстрагирующий буфер добавляли ГПБК в концентрации 0,01 М, что повысило выявляемость вирусов ACLSV и ASGV в образцах груши по сравнению с использованием диэтилдитиокарбамата натрия (таблица 14).
Таблица 14 – Эффективность выявления вирусов на груше при использовании ГПБК в составе экстрагирующего буфера при выполнении ИФА (индекс зараженности)
| Сорт (клон) | ACLSV | ASGV | ||
| Контроль (DIEKA*, 0,015 М) | ГПБК, 0,01 М | Контроль (DIEKA, 0,015 М) | ГПБК, 0,01 М | |
| Кафедральная (1) | 1,9 а | 6,0 б | 0,9 а | 2,0 б |
| Москвичка (1) | 1,3 а | 6,0 б | 0,7 а | 0,7 а |
| Москвичка (3) | 1,8 а | 4,2 б | 1,8 а | 5,6 б |
| Румяная (1) | 1,4 а | 6,2 б | 1,0 а | 0,9 а |
| Башкирская крупная | 1,5 а | 2,5 б | 1,0 а | 1,0 а |
| Велеса | 0,9 а | 5,3 б | 0,7 а | 1,2 б |
| Память Жегалова | 1,2 а | 8,9 б | 1,4 а | 1,1 а |
| Чижовская | 1,3 а | 9,0 б | 1,7 б | 0,8 а |
| Берри Харди | 2,3 а | 16,4 б | 1,0 а | 6,4 б |
| Берри Харди (1) | 1,0 а | 2,3 б | 1,0 а | 1,1 а |
| В среднем по сортам | 1,5 а | 6,7 б | 1,1 а | 2,1 б |
| Выявлено вирусов, % | 10,0 | 100 | 0 | 30,0 |
*DIEKA – диэтилдитиокарбамат натрия.
Использование стандартного буфера не позволило обнаружить вирус ASGV, тогда как буфер с ГПБК обеспечил его выявление у 3-х сортов груши. Вирус ACLSV в контроле был идентифицирован лишь у одного сорта, а на буфере с ГПБК – у всех сортов груши.
На образцах рябины эффективность выявления вирусов ACLSV и ASGV при использовании экстрагирующего буфера с ГПБК также возрастала.
При тестировании ежевики сорта Торнфри на вирусы АrМV, TBRV, RpRSV и SLRSV применение салициловой и галловой кислот в концентрациях 0,001 и 0,01 М в составе экстрагирующего буфера повышало выявляемость вирусов.
Испытанные соединения выступают как активные антиоксиданты, препятствующие разрушению вирусных частиц при гомогенизации растительных образцов. Фенольные соединения могут формировать комплексы с таннинами, снижая их реакционную способность, что оказывает благоприятное действие на сохранность вирусных частиц.
5.3. Применение метода полимеразной цепной реакции
Для корректной и надежной оценки наличия вирусов в растительном материале необходима отработка метода ПЦР применительно к биологическим особенностям культуры, поскольку на результат выделения вирусной РНК большое влияние оказывают вещества вторичного происхождения, в том числе фенольной природы. Это особенно актуально для плодовых культур, ткани которых содержат большие количества такого рода соединений.
Груша. Экстракция РНК вирусов на груше в силу особенностей биохимического состава её тканей протекает недостаточно эффективно (хуже по сравнению с яблоней), поэтому данный этап ПЦР нуждался в совершенствовании. При выполнении ОТ-ПЦР добавление ГПБК к лизирующему буферу улучшало экстракцию РНК и позволило успешно диагностировать вирусы ACLSV, ASGV и ASPV в образцах груши.
При тестировании на вирус ACLSV оптимальными навесками препарата ГПБК являлись 20 и 30 мг, которые обеспечивали успешную экстракцию РНК из листьев груши сорта Чижовская, зараженной указанным вирусом (рисунок 4).
Рисунок 4 – Электрофореграмма продуктов амплификации при тестировании груши сорта Чижовская методом ОТ-ПЦР на наличие вируса ACLSV с применением
гидроксипроизводного бензойной кислоты:
1 – без ГПБК; 2 – ГПБК 10 мг; 3 – ГПБК 20 мг; 4 – ГПБК 30 мг; 5 – ГПБК 40 мг/образец; 6 – отрицательный контроль; 7 – положительный контроль.
При диагностике груши на другие вирусы методом ОТ-ПЦР использовали выявленные оптимальные концентрации ГПБК. Оптимизация этапа экстракции РНК способствовала успешной диагностике вируса ASGV на груше сорта Beurre Hardy. Ранее на данном образце вирус также был диагностирован методом ИФА. При диагностике 6 сортов груши на вирус ASPV зараженным оказался сорт Велеса. На разработанный способ экстракции РНК получен патент РФ № 2389795.
Сравнительная оценка ИФА и ОТ-ПЦР при тестировании груши на вирусы подтвердила более высокую чувствительность и специфичность ПЦР. У сорта Москвичка (клон 1) методом ИФА не удалось диагностировать все исследованные вирусы, тогда как метод ПЦР успешно их выявлял. На клоне 3 сорта Москвичка ИФА показал вероятное заражение вирусами ACLSV и ASPV, в то время как ПЦР – достоверное заражение.
Рябина. На сортах рябины Алая крупная и Красавица методом ПЦР в реальном времени был диагностирован вирус PPV: интенсивность флуоресценции превышала отрицательный контроль соответственно в 3,9 и 3,4 раза (рисунок 5). На сорте Алая крупная экстремум флуоресценции почти достиг уровня положительного контроля. Вместе с тем наработка продуктов амплификации у положительного контроля началась раньше (с 19 цикла) по сравнению с образцами рябины (с 24 цикла), что связано как с концентрацией вируса, так и с эффективностью экстракции нуклеиновой кислоты.
Рисунок 5 – Интенсивность флуоресценции при тестировании образцов рябины
методом ПЦР в реальном времени на вирус PPV:
1 – положительный контроль; 2 – Алая крупная; 3 – Красавица; 4 – рябина,
инокулированная вирусом PPV; 5 – отрицательный контроль.
Косточковые культуры. При диагностике некоторых косточковых культур так же, как и на груше, существует проблема выделения РНК. Если на вишне экстракция РНК протекает успешно, то на многих сортах сливы возникают трудности с получением высококачественных препаратов нуклеиновых кислот. При диагностике вируса шарки сливы в буфер добавляли ГПБК. Анализ продуктов амплификации вируса шарки сливы показал, что оптимальная навеска ГПБК составила 20 мг на один образец (рисунок 6).
Рисунок 6 – Влияние концентрации антиоксиданта ГПБК на интенсивность флуоресценции при тестировании сливы на вирус PPV: 1 – ГПБК 20 мг/образец, 2 – ГПБК 30 мг, 3 – без ГПБК, 4 – ГПБК 10 мг, 5 – положительный контроль,
6 – отрицательный контроль.
Увеличение количества ГПБК до 30 мг/образец приводило к снижению интенсивности флуоресценции на 9,5 % по сравнению с навеской 20 мг. Повышение интенсивности флуоресценции конечного продукта в оптимальных вариантах свидетельствует о лучшем выделении вирусной РНК вследствие предположительной оптимизации солюбилизации клеточного дебриса и усиления денатурации нуклеаз.
Повышение выявляемости вирусов в разработанной технологии диагностики до 90-100 % достигается за счет использования ГПБК в качестве эффективного антиоксиданта, учета биологических особенностей культур и условий окружающей среды (рисунок 7). ГПБК в низкой концентрации (10-4 – 10-5 М), введенное в состав буфера для инокуляции, повышает сохранность вирусов и улучшает их передачу, позволяя получать более достоверные результаты по зараженности тестируемых растений вирусами. В более высокой концентрации ГПБК повышает эффективность выявления вирусов при тестировании методом ИФА. Добавление в лизирующий буфер ГПБК значительно улучшает экстракцию РНК, особенно в образцах груши и сливы, при выполнении ПЦР. Подобраны оптимальные виды образцов и сроки анализа.
Глава 6. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ОЗДОРОВЛЕНИЯ
САДОВЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
В ходе многолетних исследований нами изучены и усовершенствованы различные методы оздоровления садовых растений от вирусов: суховоздушная термотерапия, культура меристем, хемотерапия и магнитотерапия.
6.1. Особенности сортовой устойчивости при проведении
суховоздушной термотерапии
Суховоздушная термотерапия на груше была малоэффективной: после термообработки в течение 82 дней удалось оздоровить от двух вирусов (ACLSV и ASGV) 56 % растений, а с учетом вероятно зараженных растений – всего 11 %. Некоторые прививки сортов Память Жегалова, Кафедральная и Москвичка оказались свободными от вирусов, а некоторые – зараженными. Недостаточно высокий выход здоровых растений связан с термостабильностью данных вирусов.
В наших опытах показано, что можно успешно проводить суховоздушную термотерапию заокулированных подвоев груши. В условиях термокамеры из окулировки развивается побег длиной 30-40 см, с которого берут верхушки для введения в культуру тканей.
При проведении суховоздушной термотерапии устойчивость растений к высоким температурам определялась видовыми и сортовыми особенностями.
Изученные сорта рябины по устойчивости к высокой температуре мы разделили на 2 группы: 1) с низкой устойчивостью, которые почти не дают приростов и погибают через 2-3 недели после начала термообработки (сорта и формы Невежинской рябины, Бусинка, Сорбинка); 2) со средней устойчивостью, которые формируют небольшие приросты, позволяющие изолировать меристематические верхушки с последующей высадкой на питательные среды (Титан, Гранатная, Рубиновая, Ликерная).
Из сортов ежевики лучше всего переносил термотерапию сорт Новаго, у которого отсутствовали некрозы, а приросты побегов достигали 10 – 20 см. У ежевики сорта Торнфри и гибрида Тэйберри имелись местные некрозы листьев, а приросты составляли 5–8 см.
Жимолость оказалась чувствительной к высоким температурам: через 2 месяца термотерапии все растения сорта Роксана погибли, у сорта Избранница гибель составила 33 %.
Рисунок 7 – Усовершенствованные методы диагностики вирусов на плодовых и ягодных культурах.
6.2. Зависимость эффективности оздоровления методом культуры
меристем от величины экспланта
Оздоровление интактных растений. Выход здоровых растений зависит от величины и расположения на побеге инициального экспланта, вида вируса, наличия одного или комплекса вирусов, степени заражения исходного материала, биологических особенностей культуры.
Эффективность оздоровления растений рябины от вирусов на 3 изученных сортах варьировала от 55 % до 64 %. Наряду с меристемами величиной 0,4–0,8 мм хорошие результаты по оздоровлению от иларвируса PDV обеспечивали и экспланты величиной 1,0–1,5 мм (таблица 15). Однако при увеличении размера инициального экспланта до 2–5 мм имелась тенденция к уменьшению числа оздоровленных растений рябины.
Таблица 15 – Эффективность оздоровления (%) растений рябины от вируса PDV в зависимости от размера меристематических верхушек
| Величина меристемы, мм | Сорт | Среднее | ||
| Титан | Рубиновая | Невежинская | ||
| 0,4-0,8 | 25,0 а | 75,0 б | 100 в | 66,7 б |
| 1,0-1,5 | 100 в | 100 в | 66,7 б | 88,9 б |
| 2,0-5,0 | 33,3 аб | 16,8 а | 0,0 а | 16,7 а |
Эффективность оздоровления растений рябины от иларвируса PDV была одинаковой как при использовании апикальных, так и латеральных меристем.
При оздоровлении малины Rubus idaeus L. от вируса ArMV показано, что освобождение от него происходило при использовании как меристем, так и почек. Выход здоровых растений составил 20–40 % и не зависел от размера экспланта. Экспланты одного и того же размера оказывались как инфицированными, так и здоровыми. Вероятно, данный феномен может быть связан с неравномерным распределением вирусов по растению и с возможным подавлением их репликации под влиянием условий культивирования.
Процесс оздоровления от вирусов имеет сложный характер, и его эффективность определяется тесным взаимодействием случайности и закономерности. При этом под случайностью понимается вероятностный характер освобождения от вирусной инфекции, а под закономерностью – увеличение выхода оздоровленных клонов по мере уменьшения размера инициальных эксплантов.
С увеличением возраста растений в условиях зимней теплицы выход здоровых растений снижался на 10 – 27 % по сравнению с микрорастениями вследствие постепенного накопления вирусов. Тестирование ежевики на вирусы показало наличие четырехкратной разницы в индексах зараженности однолетних и двухлетних растений. Поэтому окончательное заключение о безвирусности растений, прошедших оздоровление, следует делать на основании результатов ИФА, проведенного не менее чем через 2 года после адаптации.
Оздоровление микрорастений. Нами предложен приём оздоровления микрорастений, инфицированных вирусами. Меристемы, вычлененные из микрорастений, уже адаптированы к условиям культивирования, поэтому хорошо приживаются и развиваются на питательной среде.
При оздоровлении микрорастений ежевики сорта Торнфри от вируса ArMV количество растений, свободных от этого вируса, при использовании меристем размером 0,12-0,62 мм было несколько больше (71 %), чем микрочеренков 1-5 мм (63 %). Однако эти различия несущественны, что свидетельствует о возможности использования при оздоровлении растений ежевики от данного вируса достаточно крупных по размеру эксплантов. Это заметно облегчает работу по их изоляции и снижает затраты. Кроме того, при относительно высоком проценте оздоровления отпадает необходимость в термотерапии.
В экспериментах с микрорастениями других видов и сортов рода Rubus прослеживалась четкая тенденция снижения эффективности оздоровления от неповирусов и вируса SLRSV при увеличении размера экспланта более 1 мм (таблица 16).
Таблица 16 – Эффективность оздоровления (%) от неповирусов и вируса SLRSV микрорастений рода Rubus в зависимости от размера экспланта (в среднем за 1994-1997 гг.)
| Величина экспланта, мм | Малина черная, Кумберленд | Малино-ежевичный гибрид, Тэйберри | Ежевика, Новаго |
| 0,2-0,8 | 50,0 б | 83,3 б | 76,7 аб |
| 1,0 | 58,4 б | 83,3 б | 91,7 б |
| 2,0-5,0 | 31,5 а | 33,3 а | 55,6 а |
На малине черной сорта Кумберленд изоляция эксплантов величиной 2-5 мм приводила к снижению выхода здоровых растений в 1,6-1,9 раза в сравнении с эксплантами размером 0,2-1,0 мм. Наряду с эксплантами малого размера (0,2-0,8 мм) устойчиво высокие показатели оздоровления обеспечивали экспланты величиной 1 мм.
6.3. Повышение эффективности оздоровления от вирусов при
сочетании термотерапии и культуры меристем
Наибольший эффект по оздоровлению растений достигался при сочетании суховоздушной термотерапии и культуры меристем, причем эффект зависел от величины меристемы.
При оздоровлении рябины сорта Титан от вируса PPV выход оздоровленных растений при использовании апексов 0,5-1,0 мм составил 83 %. Однако при увеличении размера экспланта более 1 мм все растения рябины оказались зараженными данным вирусом.
Эффективность оздоровления ежевики и малино-ежевичного гибрида от неповирусов зависела как от способа терапии, так и величины экспланта (таблица 17).
Таблица 17 – Эффективность оздоровления растений ежевики и малино-ежевичного гибрида от неповирусов в зависимости от метода терапии и величины экспланта, в % (в среднем за 1994-1997 гг.)
| Величина экспланта, мм | Гибрид Тэйберри | Ежевика Новаго | Среднее | |||
| Культура тканей | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей | Термотерапия + культура тканей | |
| 0,2-0,8 | 83,3 б | 85,8 б | 76,7 аб | 90,0 б | 80,0 б | 87,9 б |
| 1,0 | 83,3 б | 95,9 б | 91,7 б | 100 б | 87,5 б | 98,0 б |
| 2,0-5,0 | 33,3 а | 70,8 а | 55,6 а | 50,0 а | 44,5 а | 60,4 а |
Применение комплексной терапии способствовало увеличению выхода здоровых растений в среднем на 11 % по сравнению с культурой тканей. Изоляция эксплантов величиной до 1 мм обеспечивала высокий выход безвирусных растений независимо от культуры и метода терапии. Высадка на среду эксплантов 2-5 мм приводила к снижению выхода безвирусных растений в 1,5-2 раза по сравнению с эксплантами не более 1 мм.
Зависимость оздоровления от расположения на побеге инициальных эксплантов не носила четко выраженный характер: для сортов Торнфри и Тэйберри различия между апикальными и латеральными меристемами в среднем за 1996–1998 гг. отсутствовали, для сорта Новаго в 1996 г. предпочтительней оказалось использовать верхушечные меристемы.
На жимолости сочетание термотерапии и культуры in vitro обеспечивало оздоровление от неповирусов около 80 % эксплантов.
6.4. Использование экологически безопасных препаратов при
оздоровлении методом хемотерапии
Особый интерес для практического применения представляют экологически чистые ингибиторы фитопатогенных вирусов со стимулирующим ростовым действием. К таким препаратам относятся и некоторые фенольные соединения, способные индуцировать неспецифическую устойчивость.
При введении в состав среды фенолкарбоновых кислот выход здоровых растений зависел от видовых особенностей культуры, вида вируса и фенольного соединения.
Экспланты рябины сорта Невежинская удалось успешно оздоровить от вирусов PNRSV и PDV, включив в состав среды салициловую и сиреневую кислоты. Высокое ингибиторное действие по отношению к вирусу PDV проявляли феруловая кислота и тиоурацил.
На рябине сортов Гранатная и Титан салициловая кислота в концентрации 6х10-4 М способствовала получению 100 % регенерантов, свободных от иларвирусов PNRSV и PDV (таблица 18). Более низкие концентрации салициловой кислоты были менее эффективными в отношении вируса PDV у обоих сортов рябины и вируса PNRSV на сорте Гранатная. У сорта Титан высокая антивирусная активность в отношении вируса PNRSV достигнута и при более низких концентрациях салициловой кислоты – 1х10-4 – 3х10-4 М.
Таблица 18 – Эффективность оздоровления (%) растений рябины разных сортов от иларвирусов в зависимости от концентрации салициловой кислоты в питательной среде
| Салициловая кислота, М | PDV | PNRSV | ||||
| Гранатная | Титан | Среднее | Гранатная | Титан | Среднее | |
| 0 (контроль) | 0,0 | 20,0 | 10,0 аб | 0,0 | 50,0 | 25,0 а |
| 1 х 10-5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 а | 50,0 | 0,0 | 25,0 а |
| 1 х 10-4 | 40,0 | 66,7 | 53,4 в | 60,0 | 100 | 80,0 бв |
| 3 х 10-4 | 0,0 | 60,0 | 30,0 б | 50,0 | 100 | 75,0 б |
| 6 х 10-4 | 100 | 100 | 100 г | 100 | 100 | 100 в |
В целом в процессе хемотерапии плодовых культур от иларвирусов вирус PDV подавлялся в более сильной степени, чем PNRSV. Наибольшая антивирусная активность на плодовых культурах отмечена у салициловой кислоты.
Все испытанные соединения в той или иной степени ингибировали вирусы SLRSV, ArMV и TBRV у растений ежевики сортов Смутстем и Торнфри и малино-ежевичного гибрида сорта Логанберри (таблица 19).
Таблица 19 – Эффективность оздоровления (%) микрорастений ежевики и малино-ежевичного гибрида от неповирусов и вируса SLRSV в процессе хемотерапии in vitro в зависимости от вида фенолкарбоновой кислоты
| Препарат | Смутстем | Торнфри | Логанберри | |||
| ArMV | TBRV | TBRV | SLRSV | TBRV | SLRSV | |
| Без препарата (контроль) | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а |
| Тиоурацил (эталон) | 100 в | 100 г | 90,0 г | 100 б | 75,0 бв | 100 в |
| Салициловая кислота | 100 в | 25,0 б | 100 г | 100 б | 75,0 бв | 100 в |
| Галловая кислота | 100 в | 100 г | 60,0 в | 100 б | 50,0 б | 100 в |
| Сиреневая кислота | 100 в | 100 г | 60,0 в | 100 б | 66,7 б | 66,7 б |
| п-Кумаровая кислота | 100 в | 75,0 в | 20,0 аб | 100 б | 50,0 б | 100 в |
| Кофейная кислота | 100 в | 75,0 в | 40,0 бв | 100 б | 100 в | 100 в |
| Феруловая кислота | 75,0 б | 100 г | 40,0 бв | 100 б | 100 в | 100 в |
Способ оздоровления растений от вирусов с использованием салициловой, галловой или сиреневой кислот позволяет повысить эффективность оздоровления растений от вирусов в среднем на 28-30 % и снизить стоимость процесса оздоровления. С учётом оптимальных концентраций фенольных соединений их использование обходится примерно в 25 раз дешевле, чем 2-тиоурацила.
Высокая эффективность салициловой кислоты установлена при оздоровлении малино-ежевичного гибрида сорта Логанберри от вируса кустистой карликовости малины (RBDV) (таблица 20). Выход оздоровленных от вирусов TBRV и SLRSV растений Логанберри варьировал в пределах 50-100 % и 50-67 % соответственно.
Таблица 20 – Эффективность оздоровления малино-ежевичного гибрида сорта Логанберри от вирусов на среде с салициловой кислотой*
| Салициловая кислота, М | RBDV | SLRSV | TBRV | |||
| Ао/Ак | Оздоров- ление, % | Ао/Ак | Оздоров-ление, % | Ао/Ак | Оздоров- ление, % | |
| 0 (контроль) | 7,4 в | 0 а | 1,8 а | 33,3 а | 2,4 в | 0 а |
| 1 х 10-5 | 2,0 б | 75,0 б | 1,8 а | 50,0 аб | 1,2 а | 100 г |
| 4 х 10-5 | 2,5 б | 66,7 б | 1,8 а | 66,7 б | 1,6 аб | 75,0 в |
| 6 х 10-5 | 1,1 а | 100 в | 2,1 а | 50,0 аб | 1,8 б | 50,0 б |
*Тестирование растений осуществляли через 2 года после высадки в нестерильные условия.
На ежевике сорта Торнфри при оздоровлении от вируса SLRSV на среде с салициловой кислотой удалось получить до 100 % свободных от данного вируса регенерантов, на ежевике сорта Агавам – до 75 %. При этом имела место тенденция повышения эффективности оздоровления при увеличении концентрации салициловой кислоты, а также улучшения развития эксплантов на среде с данным соединением. Салициловая кислота в концентрациях 1х10-4 М и 3х10-4 М обеспечивала надёжную элиминацию неповируса TBRV у малино-ежевичного гибрида сорта Санберри – 100 % безвирусных эксплантов.
6.5. Разработка метода магнитотерапии in vitro для оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов
Как перспективный метод оздоровления зараженных вирусами растений нами предложена магнитотерапия. В основе метода – способность магнитного поля модифицировать метаболизм растений и влиять на их иммунные реакции. К преимуществам применения магнитно-импульсной обработки (МИО) относятся высокая технологичность, возможность автоматизации процесса, низкая энергоемкость, безопасность для человека.
Эффективность оздоровления малино-ежевичного гибрида сорта Краснодарская зависела от частоты импульсов магнитной индукции (ИМИ) и вида вируса (таблица 21).
Таблица 21 – Эффективность оздоровления малино-ежевичного гибрида сорта Краснодарская от вирусов в зависимости от частоты импульсов магнитной индукции и этапа культивирования, в % к числу тестированных растений
| Частота импульсов, Гц | Вирус RBDV | Вирус TBRV | ||
| Микро- растения | Растения через 1 год после адаптации | Микро- растения | Растения через 1 год после адаптации | |
| Без обработки | 0,0 а | 28,6 а | 0,0 а | 50,0 аб |
| 0,2 | 66,7 в | 75,0 б-д | 0,0 а | 33,3 а |
| 0,4 | 0,0 а | 50,0 аб | 0,0 а | 66,7 бв |
| 1,6 | 0,0 а | 75,0 б-д | 33,3 б | 66,7 бв |
| 3,2 | 0,0 а | 58,3 бв | 66,7 в | 83,3 вг |
| 6,4 | 100 г | 91,7 гд | 100 г | 100 г |
| 12,8 | 66,7 в | 66,7 б-г | 66,7 в | 83,3 вг |
| 25,6 | 33,3 б | 83,3 в-д | 100 г | 100 г |
| 51,2 | 33,3 б | 100 д | 100 г | 83,3 вг |
Наиболее перспективным режимом в отношении ингибирования вируса RBDV оказалась обработка магнитным полем с частотой 6,4 Гц, позволившая оздоровить все растения. При этой же частоте отмечали и минимальный индекс зараженности – 1,1, тогда как в контроле он составил 4,0.
Для вируса TBRV установлен широкий диапазон частот ИМИ, обеспечивающих хорошие результаты по оздоровлению: от 3,2 до 51,2 Гц. При этих частотах индекс зараженности был низким (1,2-1,5).
МИО стимулировала у микрорастений сорта Краснодарская увеличение длины побегов на 30-50 %, числа почек и побегов – на 15-30 %, укореняемости побегов – на 11-30 % по сравнению с контролем. Наилучшим развитием характеризовались адаптированные растения после обработки импульсами с частотой 6,4 Гц: длина побегов возросла в 2,9 раза, их число – в 1,2 раза. Слабое развитие растений в контроле связано с тем, что вирус RBDV существенно угнетает фотосинтетическую продуктивность и ростовые процессы у растений.
Эффективность оздоровления эксплантов груши сорта Лада, зараженных латентными вирусами, зависела от частоты и направления импульсов магнитной индукции (таблица 22).
Таблица 22 – Эффективность оздоровления микрорастений груши сорта Лада от вирусов в зависимости от частоты и направления вектора магнитной индукции, в % к числу тестированных растений
| Частота импульсов, Гц | Вирус ApMV | Вирус ACLSV | ||
| Направление вектора магнитной индукции | ||||
| Параллельное | Перпендикулярное | Параллельное | Перпендикулярное | |
| Без обработки | 20,0 б | 20,0 а | 40,0 а | 40,0 а |
| 0,8 | 60,0 г | 40,0 б | 60,0 б | 40,0 а |
| 1,6 | 0,0 а | 20,0 а | 33,3 а | 80,0 б |
| 3,2 | 0,0 а | 20,0 а | 40,0 а | 100 в |
| 6,4 | 40,0 в | 20,0 а | 80,0 в | 40,0 а |
| 12,8 | 20,0 б | 40,0 б | 40,0 а | 100 в |
Наиболее высокий процент оздоровленных от вируса ApMV растений получен после обработки параллельными импульсами с частотой 0,8 Гц. При оздоровлении эксплантов груши от вируса ACLSV предпочтительней оказалось перпендикулярное к оси экспланта направление вектора магнитной индукции: при трех частотах (1,6; 3,2; 12,8 Гц) было получено 80-100 % оздоровленных от указанного вируса растений. Параллельные импульсы значительно ингибировали вирус ACLSV при частоте 6,4 Гц.
Длина побегов у эксплантов груши, обработанных перпендикулярно направленными к оси побега импульсами магнитной индукции, увеличивалась в 2,4 раза, а в случае обработки параллельными импульсами – в 1,8 раза. Число побегов соответственно возрастало в 2,4 и 2,1 раза. Побеги наибольшей длины формировались после обработки перпендикулярно направленными импульсами с частотой 6,4-12,8 Гц (патент РФ № 2277771).
Ценность магнитотерапии как нового способа оздоровления растений от вирусов in vitro заключается в отсутствии фитотоксического эффекта в организме хозяина в отличие от применения многих химических препаратов. К тому же использование МИО приводит к активизации ростовых процессов и повышению коэффициента размножения.
Таким образом, в качестве основных высокоэффективных технологий оздоровления применяют хемотерапию или магнитотерапию in vitro (рисунок 8). Для хемотерапии как экологически безопасные антивирусные препараты используют салициловую, галловую или сиреневую кислоты в концентрации 3х10-4– 6х10-4 М, что обеспечивает получение от 80 до 100 % здоровых растений. Магнитно-импульсная обработка с частотой импульсов 3,2-12,8 Гц способствует освобождению от вирусов 60-100 % эксплантов.
Возможно использование для целей оздоровления комплекса суховоздушной термотерапии и культуры апексов размером 0,3-1 мм. Однако при относительно высоком выходе оздоровленных растений (от 60 до 100 %) данная технология требует большего количества затрат труда и материальных средств по сравнению с хемотерапией или магнитотерапией.
На этапе микроразмножения осуществляют предварительное тестирование эксплантов методами ИФА и ПЦР, после которого растения с положительной реакцией выбраковывают, а растения с отрицательной реакцией продолжают культивировать на среде и помещают на хранение или укореняют и адаптируют к нестерильным условиям с использованием разработанных приемов. Адаптированные растения подвергают комплексному тестированию методами ИФА, ПЦР и на древесных индикаторах. Растения без вирусов проверяют на соответствие сортотипу и в случае отсутствия отклонений переводят в категорию исходных растений. От исходных растений получают базисные, от базисных – сертифицированные растения.
Теория оздоровления от вирусов. На основе анализа известных научных достижений и собственных результатов предложена теория оздоровления растений от вирусов, в которой рассмотрены обусловливающие вирусный патогенез факторы окружающей среды и основные принципы защиты плодовых и ягодных культур от вирусов, дано подразделение методов оздоровления, показан сложный характер процесса оздоровления. В основе теории лежит постулат о тесном взаимодействии вируса, растения-хозяина и окружающей среды. Факторы окружающей среды могут оказывать ингибирующее или стимулирующее действие на вирусный патогенез. Теория оздоровления базируется на существовании в условиях объективной реальности различных механизмов оздоровления. Оздоровление растений от вирусов происходит в результате действия комплекса факторов и одновременного или последовательного запуска нескольких механизмов оздоровления. Методы оздоровления подразделяются на 3 основные группы: биологические (культура меристем), физические (суховоздушная термотерапия, криотерапия, магнитотерапия, СВЧ, УФ-излучение) и химические (хемотерапия). Эффективность оздоровительных мероприятий обусловливается выбором метода оздоровления (комплекса методов), его параметрами (длительность обработки, физические и химические параметры), видовыми и сортовыми особенностями растений и их реакцией на процесс оздоровления, видом вирусного патогена.
Рисунок 8 – Технологическая схема оздоровления плодовых и
ягодных культур от вирусов.
Глава 7. УСКОРЕННОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ОЗДОРОВЛЕННЫХ
РАСТЕНИЙ IN VITRO
С целью ускоренного размножения оздоровленных растений in vitro оптимизированы состав питательной среды и физические факторы культивирования.
7.1. Совершенствование минерального состава питательной среды
Оптимизацию минерального состава среды осуществляли на примере ежевики сорта Торнфри. На начальном этапе оптимизации подбирали лучшие формы макроэлементов и варьировали концентрацию каждого из них (либо двух компонентов) при неизменных уровнях остальных солей. Затем с применением компьютерной программы получили уравнение регрессии, которое представляло собой полином следующего вида:
у = 13,1987 – 46,2156 · х1 + 104,1263 · х2 – 127,4976 · х3 – 103,3835 · х4 + 127,6737 · х5 + 36,5167 · х12 – 29,2496 · х22 + 62,7479 · х32 + 62,3021 · х42 – 29,1671 · х52 + 16,6505 · х1 · х2 + 11,6513 · х1· х3 – 12,9154 · х1· х4 – 21,6161· х1· х5 + 21,5301· х2 · х3 – 41,6136 · х2 · х4 – 114,875· х2 · х5 + 83,0083 · х3 · х4 – 35,0364 · х3 · х5 + 20,3532 · х4 · х5, где у – число почек и побегов, х1 – уровень аммония азотнокислого, х2 – уровень калия азотнокислого, х3 – уровень кальция азотнокислого, х4 – уровень калия фосфорнокислого, х5 – уровень магния сернокислого. Значения частных функций изображены на рисунке 9, представляющем собой поверхность и показывающем число почек и побегов, образованных эксплантами ежевики, в зависимости от уровня каждого компонента в составе питательной среды для размножения.
Рисунок 9 – Число почек и побегов у эксплантов ежевики сорта Торнфри в зависимости от компонента питательной среды и его концентрации
(Р 1 – Р 5 соответствуют уровням каждого компонента).
Разработан эффективный состав среды, увеличивающий коэффициент размножения многих культур (рисунок 10, патент № 2063682). Выявлено, что для оптимизации состава среды необходимо использовать комплексный подход, сочетающий анализ функциональных зависимостей по уравнению регрессии, таблице частных функций и точечным графикам.
Чередование сред разного минерального состава оказывало благоприятное влияние на рост и развитие эксплантов вследствие вероятного усиления ювенилизации, увеличения в тканях пула активно делящихся клеток, изменений биохимического и морфологического характера. Ростовые показатели у эксплантов зависели от месяца культивирования и времени года.
Рисунок 10 – Число почек и побегов у разных культур на среде Мурасиге и Скуга и разработанной среде на фоне гомополисахарида и 6-БАП (1 мг/л).
На основании листовой диагностики NPK и анализа корреляционных зависимостей оптимизирован минеральный состав среды, что способствовало увеличению укореняемости побегов ежевики в 1,9 раза и длины корней в 1,8 раза.
7.2. Совершенствование органического состава питательной среды
Заменители агар-агара. Около 53 % стоимости питательной среды приходится на агар-агар. Поэтому значительно снизить себестоимость получаемых растений позволяет замена агар-агара на более дешевые аналоги. Наиболее перспективны, на наш взгляд, в качестве заменителей агар-агара вещества, приводящие к желатинизации среды. Предложенный нами гомополисахарид (патент № 2039428) положительно влиял на накопление сахаров в побегах растений и улучшал ростовые процессы. Применение гомополисахарида в составе среды для размножения способствовало увеличению числа образуемых почек и побегов у груши в 1,3 раза, рябины – в 1,2-1,4 раза, малино-ежевичных гибридов в 1,5-2,0 раза, малины красной – в 1,2-1,3 раза, малины черной сорта Кумберленд – в 1,3 раза, ежевики сорта Торнфри – в 2,3 раза по сравнению с агаризованной средой. При этом на среде с заменителем существенно снижалась витрификация побегов.
Регуляторы роста. На этапе размножения высокую цитокининовую активность на груше, ирге, рябине, ежевике, малине черной, жимолости проявил тидиазурон, обеспечивший увеличение числа побегов в 1,3-3,1 раза по сравнению с 6-БАП.
В отличие от узкоспецифического действия ауксинов и цитокининов, этрел стимулировал и пролиферацию побегов, и ризогенез (патенты РФ № 2095972 и № 2099935).
Препарат рибав-экстра улучшал ризогенез у микропобегов груши, ирги, рябины, ежевики, малино-ежевичного гибрида, жимолости (повышение укореняемости в 1,3-2,5 раза, увеличение числа корней в 1,5-10, 4 раза) и обеспечивал высокую приживаемость в нестерильных условиях. Выявлена эффективность препарата амбиол в сочетании с ИМК при укоренении побегов рябины, ирги, ежевики и жимолости (повышение укореняемости в 1,2-1,5 раза, увеличение числа корней в 1,2-1,6 раза).
Эффект от применения фенольных соединений зависел от их структуры, направленности органогенеза, взаимодействия с регуляторами роста, генотипа растений. На этапе размножения фенолкарбоновые кислоты, содержащие в своей структуре одну гидроксильную группу (сиреневая, феруловая, п-кумаровая) положительно влияли на пролиферацию побегов у груши, рябины, ежевики, увеличивая коэффициент размножения в 1,5-2,6 раза. Фенолкарбоновые кислоты с несколькими ОН-группами (галловая, хлорогеновая), реже – с одной ОН-группой (салициловая кислота), стимулировали ризогенез у побегов, что связано с ингибированием ауксиноксидазы и усилением действия ауксинов на процесс корнеобразования. Показана высокая эффективность применения флоридзина на этапе укоренения микропобегов груши, рябины, жимолости, ежевики, малино-ежевичных гибридов.
7.3. Изучение действия физических факторов на ускорение
микроразмножения растений
Спектральный состав света. Увеличение выхода оздоровленных растений достигается и за счет оптимизации условий освещения, в том числе подбора спектрального состава света. На этапе размножения выявлено преимущество красного (640-660 нм) и зеленого (520-550 нм) света, на этапе укоренения – красного и белого света. При культивировании на красном свету у малины черной укореняемость побегов через 20 суток превысила 70 %, что сократило период укоренения по сравнению со стандартной технологией.
Магнитно-импульсное воздействие. Магнитное поле оказывает разнообразные физиологические эффекты на растения, влияет на активность ферментов и проницаемость клеточных мембран, что приводит к повышению регенерационной способности. На этапе размножения хороший эффект обеспечивала МИО с направлением вектора магнитной индукции вдоль оси экспланта и к его основанию. При этом происходила стимуляция базального доминирования и увеличение коэффициента размножения в 1,2-1,6 раза вследствие вероятного усиления накопления цитокининов в основании эксплантов. Сочетание магнитной обработки разнонаправленными импульсами с последующим культивированием побегов на свету с долями излучения 87,5 % в красной области и 12,5 % – в синей улучшало ризогенез у ежевики и некоторых сортов жимолости.
7.4. Повышение адаптационной способности микрорастений в
нестерильных условиях и получение стандартных саженцев
Нами разработан эффективный способ адаптации, включающий культивирование побегов на среде для укоренения, содержащей оксибензойную кислоту, с последующей обработкой растений борной кислотой (патент РФ № 2160002, таблица 23). При этом наряду с повышением приживаемости улучшались ростовые процессы, что подтверждает важную роль бора в процессах лигнификации клеточных стенок, увеличении засухоустойчивости растений, обмене ауксинов и фенольных соединений.
На ягодных культурах выход стандартных саженцев в год высадки микрорастений на адаптацию составил 36-88 %, тогда как для получения стандартных саженцев плодовых культур требовалось доращивание в течение двух лет.
Таблица 23 – Приживаемость микрорастений после высадки в нестерильные условия в зависимости от концентрации борной кислоты, в %
| Концентрация борной кислоты, М | Груша Лада | Ежевика Торнфри | Малина черная Кумберленд | Малино-ежевичный гибрид Логанберри | Жимолость Нимфа |
| 0 (контроль) | 14,5 а | 64,3 аб | 80,0 а | 33,3 аб | 90,0 а |
| 1,0 х 10-4 | 12,6 а | 61,5 а | 80,0 а | 28,5 а | 90,0 а |
| 1,5 х 10-4 | 40,4 б | 78,6 б | 93,3 б | 50,0 бв | 100 а |
| 7,5 х 10-4 | 63,5 в | 100 в | 100 б | 73,3 г | 100 а |
| 1,5 х 10-3 | 45,6 б | 100 в | 97,5 б | 65,4 вг | 100 а |
| 2,0 х 10-3 | 14,3 а | 60,6 а | 78,7 а | 30,6 а | 85,0 а |
В результате проведенных исследований разработана современная научно обоснованная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов, включающая в себя усовершенствованные методы диагностики, экологически безопасные вирусологические и биотехнологические приемы производства оздоровленного посадочного материала.
Первичным этапом технологии является диагностика вирусной инфекции, осуществляемая методами ИФА, ПЦР и тестами на индикаторах. Для повышения достоверности результатов диагностики вирусологического статуса растений необходимо использовать, как минимум, 2 метода, причем желательно высокочувствительные – ИФА и ПЦР.
При получении результатов комплексного тестирования, подтверждающих безвирусный статус растений, их переводят в категорию исходных растений, от которых путем вегетативного размножения получают базисные растения.
Глава 8. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОВРЕМЕННЫХ СПОСОБОВ
ТЕСТИРОВАНИЯ И ОЗДОРОВЛЕНИЯ САДОВЫХ РАСТЕНИЙ
В системе производства сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур наиболее затратным является процесс получения базисных растений. На вирусологическую диагностику растений приходится 55-70 % трудовых и 73-91 % общих материальных затрат, требующихся для получения здоровых растений.
Себестоимость одного тест-образца при тестировании методом ИФА на 1 вирус составила 546 руб., методом ОТ-ПЦР – 631-720 руб., ОТ-ПЦР в реальном времени – 656-750 руб., на древесных индикаторах – 968 руб.
При сочетании термотерапии и культуры тканей по разработанной технологии себестоимость одного базисного растения груши снизилась в 1,6 раза по сравнению с одной термотерапией (стандарт) и в 1,4 раза по сравнению с сочетанием термотерапии и культуры тканей по традиционной технологии (таблица 24).
Таблица 24 – Экономическая оценка получения базисных растений плодовых культур в зависимости от способа оздоровления (на примере груши)
| Показатель | Способ оздоровления | |||||
| Термо-терапия (стандарт) | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей + хемотерапия | Культура тканей + магнито-терапия (разрабо-танная) | |||
| Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | |||
| Выход растений после оздоровления, шт. | 20 | 35 | 131 | 35 | 131 | 94 |
| Выход здоровых растений, % | 55,6 | 66,7 | 88,9 | 77,5 | 100 | 100 |
| Выход здоровых растений, шт. | 11 | 23 | 117 | 27 | 131 | 94 |
| Всего затрат, тыс. руб. | 169,7 | 261,3 | 901,6 | 244,8 | 884,5 | 638,5 |
| Себестоимость 1 ба-зисного растения, руб. | 12355,2 | 11215,7 | 7739,1 | 9033,8 | 6751,6 | 6792,3 |
| Затраты труда, чел.-ч./1 растение | 12,6 | 11,0 | 6,2 | 8,9 | 5,4 | 5,7 |
С учетом выхода здоровых растений, который колебался от 80 % при стандартной технологии до 98-100 % по разработанным технологиям, себестоимость одного базисного растения ежевики, полученного по предложенным технологиям, оказалась на 28-31 % ниже, чем по стандартной технологии (таблица 25). При этом снизились на 28-30 % и трудовые затраты.
Таблица 25 – Экономическая оценка получения базисных растений ягодных культур в зависимости от способа оздоровления (на примере ежевики)
| Показатель | Способ оздоровления | |||||
| Культура тканей (стандарт) | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей + хемотерапия | Культура тканей + магнито-терапия (разрабо-танная) | |||
| Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | |||
| Выход растений после оздоровления, шт. | 1121 | 1121 | 1905 | 1121 | 1905 | 1513 |
| Выход здоровых растений, % | 80,0 | 87,9 | 98,0 | 93,3 | 100 | 100 |
| Выход здоровых растений, шт. | 897 | 985 | 1867 | 1046 | 1905 | 1513 |
| Всего затрат, тыс. руб. | 3498,7 | 3502,6 | 5691,7 | 3498,7 | 5687,8 | 4514,2 |
| Себестоимость 1 ба-зисного растения, руб. | 3901,3 | 3554,5 | 3048,8 | 3345,2 | 2985,7 | 2983,6 |
| Затраты труда, чел.-ч./1 растение | 7,4 | 6,8 | 5,8 | 6,4 | 5,7 | 5,7 |
Наиболее эффективными технологиями оздоровления плодовых культур и ягодных кустарников являются предложенные технологии, сочетающие культуру апексов и хемотерапию, культуру апексов и магнитотерапию.
ВЫВОДЫ
1. В результате многолетних исследований впервые разработана современная научно обоснованная технология оздоровления ряда плодовых и ягодных культур от вредоносных вирусов, включающая эффективные методы диагностики, экологически безопасные вирусологические и биотехнологические приемы получения здорового посадочного материала.
2. На основании серомониторинга в Нечерноземной зоне России установлено широкое распространение вирусов различной этиологии: в насаждениях груши – высокая зараженность латентными вирусами (28-45 %); на рябине – вирусом PNRSV (51 %); на ежевике – вирусами ArMV (25 %) и TBRV (22 %); на малине черной и жимолости – вирусом TBRV (21 и 33 %); на малино-ежевичном гибриде – вирусами RpRSV (31 %), SLRSV (28 %) и TBRV (25 %); на актинидии и лимоннике – вирусом ArMV (43 и 40 %).
3. Распространенность вирусов зависела от местоположения и возраста насаждения, происхождения сорта, способа размножения растений и условий их выращивания. С возрастом растений увеличивались концентрация вирусов в растительных тканях и количество зараженных растений в насаждении. Коэффициенты вариации зараженности вирусами PNRSV, ASPV и ACLSV были более высокими по сравнению с вирусом ASGV.
4. Вредоносность вирусных болезней обусловливалась видом вирусного патогена и сортовыми особенностями. Латентные вирусы приводили к снижению генеративной продуктивности деревьев груши на 20 %, содержания хлорофилла на 14 % и увеличению активности пероксидазы на 58 %. Вредоносность вирусов ArMV, RpRSV и SLRSV на растениях рода Rubus выражалась в снижении урожая на 71 %, длины побегов – на 40 %. Доказано ингибирующее действие вирусов на процессы органогенеза при микроразмножении растений на этапах пролиферации и укоренения побегов, а также при размножении стеблевыми черенками.
5. Оптимизация современных методов диагностики обеспечила выявляемость вирусов до 90-100 %. Способ диагностики вирусов на травянистых индикаторах с включением фенольных соединений в состав буфера для заражения повышал накопление вирусов в тканях индикаторов и увеличивал число растений с симптомами (патент РФ № 2147173). Путем добавления в буфер гидроксипроизводного бензойной кислоты улучшена экстракция вирусной РНК и повышена эффективность выявления вирусов при выполнении ИФА, ПЦР и ПЦР в реальном времени (патент РФ № 2389795).
6. Эффективность оздоровления плодовых и ягодных культур зависит от вида вируса, биологических особенностей растений, способа оздоровления, величины инициального экспланта. Высокий выход оздоровленных растений (83 % на рябине, 80 % на жимолости, 60-100 % на ежевике) достигается при сочетании суховоздушной термотерапии и культуры апикальных и латеральных меристем. Установлена закономерность по снижению эффективности оздоровления интактных растений от вирусов при увеличении размера изолируемого апекса более 1 мм. На примере культур рода Rubus доказана перспективность использования метода оздоровления микрорастений от неповирусов и вируса SLRSV.
7. Применение гидроксибензойных кислот при хемотерапии обеспечивает получение 80-100 % здоровых регенерантов груши, рябины и ежевики (патент РФ № 2233579). Эффект хемотерапии определяется структурой фенольного соединения, его концентрацией, сортовыми и видовыми особенностями, видом вирусного патогена. Наибольшую антивирусную активность проявляли салициловая, галловая и сиреневая кислоты.
8. Впервые установлено антивирусное действие импульсного магнитного поля. Разработанный метод магнитотерапии вирусов позволил оздоровить 60 % регенерантов груши от вируса ApMV, 80-100 % – от вируса ACLSV и до 100 % растений малино-ежевичного гибрида от вирусов RBDV и TBRV (патенты РФ № 2277771, 2310318). Выход здоровых растений зависел от частоты импульсов и направления вектора магнитной индукции, этиологии вируса.
9. Повышению выхода оздоровленных растений при ускоренном размножении способствовали оптимизированные состав среды, физические факторы (свет и магнитная обработка) и разработанные способы адаптации. Чередование питательных сред разного минерального состава оказывало положительное влияние на пролиферативную способность эксплантов. Использование гомополисахарида в качестве заменителя агар-агара обеспечивало повышение коэффициента размножения в 1,2-2,3 раза и выхода пригодных для укоренения побегов – в 1,9-6,5 раза (патент РФ № 2039428).
10. Фенольные соединения повышали эффективность размножения растений на этапах пролиферации, укоренения и адаптации. Фенолкарбоновые кислоты с одной гидроксильной группой (сиреневая, феруловая, п-кумаровая) стимулировали побегообразование, кислоты с несколькими гидроксильными группами (галловая, хлорогеновая) и флоридзин – ризогенез (А. с. № 1706481, патент РФ № 2111653).
11. Выявлена специфичность действия спектрального состава света и магнитно-импульсной обработки на органогенез и ускорение микроразмножения оздоровленных растений. Магнитная обработка импульсами, направленными к основанию экспланта, способствует увеличению числа побегов и их длины (патент РФ № 2222933). Обработка импульсами с чередованием векторов в двух направлениях и культивированием эксплантов на свету с долями излучения 87,5 % в красной области и 12,5 % в синей обеспечивает улучшение развития побегов и корней (патенты РФ № 2253222, 2279209).
12. Себестоимость здорового посадочного материала зависит от способа оздоровления и выхода здоровых растений. Наиболее эффективными являются технологии, сочетающие культуру апексов и хемотерапию, культуру апексов и магнитотерапию: их применение обеспечивает снижение себестоимости базисного растения в 1,2-1,8 раза по сравнению с использованием суховоздушной термотерапии или её комплекса с культурой апексов.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ
1. Разработанная технология получения оздоровленных от вирусов растений плодовых и ягодных культур рекомендуется к применению в научно-исследовательских учреждениях, лабораториях вирусологии, биотехнологических центрах, базовых хозяйствах.
2. Для закладки маточных и промышленных насаждений ягодных и плодовых культур необходимо использовать оздоровленный от основных вредоносных вирусов или тестированный посадочный материал, что обеспечит повышение вегетативной продуктивности маточников и увеличение урожайности садов и ягодников.
3. Диагностику вирусов на плодовых и ягодных культурах следует осуществлять путем биотестов, ИФА и ПЦР с преимущественным использованием современных инновационных методов. Для повышения чувствительности метода при тестировании на травянистых индикаторах в состав буфера для инокуляции в качестве антиоксиданта необходимо включать гидроксипроизводное бензойной кислоты (ГПБК) в концентрации 1х10-5 – 5х10-4 М, при выполнении ИФА в экстрагирующий буфер – ГПБК в концентрации 1х10-2 М.
4. Для повышения достоверности диагностики рекомендуется использовать оптимизированную методику отбора образцов для ИФА. При тестировании на вирусы в условиях открытого грунта в мае – начале июня следует отбирать на груше образцы листьев у основания побегов и лепестки цветков; на рябине, ежевике, малино-ежевичном гибриде, жимолости – верхушечные листья.
5. ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени рекомендуется выполнять по модифицированной нами методике экстракции РНК с добавлением в лизирующий буфер на этапе гомогенизации растительного материала ГПБК в количестве 20-30 мг/образец и последующей сорбцией вирусных частиц на препарате силика.
6. Для повышения эффективности оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов следует сочетать суховоздушную термотерапию в течение 30 суток с культурой апексов величиной 0,3-1 мм; при хемотерапии in vitro в качестве антивирусных препаратов использовать салициловую, галловую или сиреневую кислоты в концентрации 3х10-4 – 6х10-4 М. С целью оздоровления от вирусов ApMV и ACLSV на груше, от вирусов RBDV и TBRV на растениях рода Rubus предлагается осуществлять магнитно-импульсную обработку с частотой импульсов 3,2-12,8 Гц.
7. При ускоренном размножении оздоровленных растений рекомендуется использовать разработанный минеральный состав питательной среды для пролиферации, практиковать чередование питательных сред разного минерального состава, на этапах пролиферации и укоренения применять в качестве заменителя агар-агара гомополисахарид. Для улучшения побегообразования и ризогенеза следует вводить в состав среды фенольные соединения (фенолкарбоновые кислоты, флоридзин), применять магнитную обработку эксплантов и освещение с долями излучения 87,5 % в красной области и 12,5 % – в синей. На этапе адаптации к нестерильным условиям микрорастения для улучшения приживаемости следует обрабатывать в растворе борной кислоты в концентрации от 1,5х10-4 до 1,5х10-3 М.
Список основных публикаций по теме диссертации
Книги, монографии:
- Упадышев, М.Т. Роль фенольных соединений в процессах жизнедеятельности садовых растений / М.Т. Упадышев.– М.: Изд. Дом МСП, 2008.– 320 с.
- Упадышев, М.Т. Хемотерапия вирусов плодовых и ягодных культур in vitro / М.Т. Упадышев, Ю.Н. Приходько, А.Д. Петрова, Л.В. Цубера, Н.Н. Мельникова, О.Ю. Суркова // М.: ФГНУ “Росинформагротех”, 2009.– 72 с.
- Система производства, хранения и доведения до потребителя плодов в Нечерноземной зоне России / Коллектив авторов // М.: ВСТИСП, 2006.– 195 с.
- Система ведения садоводства в сельскохозяйственных предприятиях (под общей ред. И.Ф. Хицкова и И.М. Куликова) / Коллектив авторов // Воронеж: Центр духовного возрождения Черноземного края, 2007.– 296 с.
Методические указания:
- Методические указания по экспресс-диагностике вирусов на ягодных культурах / Ю.Н. Приходько, О.Ю. Суркова, М.Т. Упадышев, М.П. Лапинская.– М.: ВСТИСП, 2002.– 36 с.
- Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур: методические указания / В.И. Кашин, А.А. Борисова, Ю.Н. Приходько, О.Ю. Суркова, М.Т. Упадышев, М.П. Лапинская и др.– М.: ВСТИСП, 2001.– 108 с.
- Технология получения сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур: методические указания / А.А. Борисова, М.Т. Упадышев, Н.Н. Мельникова, О.Ю. Суркова, А.Д. Петрова, К.В. Метлицкая и др.– М.: ФГНУ «Росинформагротех».– 2009.– 84 с.
- Упадышев, М.Т. Диагностика вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР / М.Т. Упадышев, Н.Н. Мельникова, А.Д. Петрова, О.Ю. Суркова, К.В. Метлицкая, П.А. Походенко, И.И. Саунина.– М.: ВСТИСП, 2008.– 35 с.
- Производство и сертификация посадочного материала ягодных культур и винограда в России. Контроль качества. Ягодные культуры (методические указания) / Коллектив авторов // М.: ВСТИСП, 2005.– Ч. 1.– 156 с.
- Производство и сертификация посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда в России. Контроль качества. Ягодные культуры (методические указания) / А.А. Борисова, Т.А. Грачева, О.З. Метлицкий, Ф.Я. Поликарпова, М.Т. Упадышев, С.Е. Головин, Н.Н. Мельникова, Т.И. Романченко, А.С. Зейналов, К.В. Метлицкая // М.: ВСТИСП, 2009.– Ч. 1.– 164 с.
Авторские свидетельства и патенты:
- А. с. СССР № 1685323, МПК А01Н 4/00. Способ выращивания растений in vitro / В.А. Высоцкий, М.Т. Упадышев, заявл. 04.05.1989, опубл. 23.10.1991, Бюл. № 39.– 4 с.
- А. с. СССР № 1706481, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для укоренения побегов ежевики / М.Т. Упадышев, В.А. Высоцкий, заявл. 15.05.1990, опубл. 23.01.1992, Бюл. № 3.– 4 с.
- А. с. СССР № 1720597, МПК А01Н 5/00. Способ подготовки растений-регенерантов к посадке в нестерильные условия / М.Т. Упадышев, В.А. Высоцкий, заявл. 26.12.1989, опубл. 23.03.1992, Бюл. № 11.– 8 с.
- Патент РФ № 2039428, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для выращивания растений in vitro / М.Т. Упадышев, заявл. 02.06.1992, опубл. 20.07.1995, Бюл. № 20.– 14 с.
- Патент РФ № 2063682, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для размножения ягодных и плодовых культур / М.Т. Упадышев, заявл. 10.05.1993, опубл. 20.07.1996, Бюл. № 20.– 18 с.
- Патент РФ № 2076482, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для хранения растений in vitro / М.Т. Упадышев, заявл. 11.04.1994, опубл. 27.03.1997, Бюл. № 9.– 6 с.
- Патент РФ № 2095972, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для микроразмножения растений / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов, В.Ю. Ракитин, заявл. 28.02.1996, опубл. 20.11.1997, Бюл. № 32.– 8 с.
- Патент РФ № 2099935, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для укоренения растений / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов, В.Ю. Ракитин, заявл. 28.02.1996, опубл. 27.12.1997, Бюл. № 36.– 10 с.
- Патент РФ № 2111653, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для укоренения растений in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов, заявл. 26.12.1996, опубл. 27.05.1998, Бюл. № 15.– 10 с.
- Патент РФ № 2130252, МПК А01Н 4/00. Питательная среда для укоренения растений / М.Т. Упадышев, заявл. 30.12.1997, опубл. 20.05.1999, Бюл. № 14.– 10 с.
- Патент РФ № 2147173, МПК А01Н 1/04. Способ тестирования растений на вирусы / М.Т. Упадышев, А.Д. Петрова, заявл. 02.12.1998, опубл. 10.04.2000, Бюл. № 10.– 10 с.
- Патент РФ № 2160002, МПК А01Н 4/00. Способ выращивания растений in vitro / М.Т. Упадышев, заявл. 24.12.1999, опубл. 10.12.2000, Бюл. № 34.– 12 с.
- Патент РФ № 2183057, МПК A01G 7/04. Способ размножения садовых растений / Г.В. Бешнов, В.И. Донецких, М.Т. Упадышев, Г.Ю. Упадышева, А.А. Цымбал, заявл. 25.02.2000, опубл. 10.06.2002, Бюл. № 16.– 16 с.
- Патент РФ № 2222933, МПК A01G 7/04. Способ размножения садовых растений, выращиваемых in vitro / М.Т. Упадышев, Г.В. Бешнов, В.И. Донецких, А.А. Цымбал, заявл. 26.04.2002, опубл. 10.02.2004, Бюл. № 4.– 10 с.
- Патент РФ № 2233579, МПК А01 Н. Способ оздоровления растений от вирусов / М.Т. Упадышев, А.Д. Петрова, заявл. 13.02.2002, опубл. 10.08.2004, Бюл. № 22.– 12 с.
- Патент РФ № 2253222, МПК А01 G7/04. Устройство для магнитно-импульсной обработки растений / В.И. Донецких, Г.В. Бешнов, А.А. Цымбал, М.Т. Упадышев, заявл. 29.12.2003, опубл. 10.06.2005, Бюл. № 16.– 13 с.
- Патент РФ № 2277771, МПК А01 G7/04, А01 С1/00. Способ оздоровления от вирусов растений, выращиваемых in vitro / Г.В. Бешнов, В.И. Донецких, М.Т. Упадышев, заявл. 22.10.2004, опубл. 20.06.2006, Бюл. № 17.– 5 с.
- Патент РФ № 2279209, МПК А01 G7/04. Способ размножения садовых культур in vitro / М.Т. Упадышев, Г.В. Бешнов, В.И. Донецких, заявл. 22.12.2004, опубл. 10.07.2006, Бюл. № 19.– 4 с.
- Патент РФ № 2310318, МПК А01 G7/04. Способ оздоровления от вирусов плодовых культур, выращиваемых in vitro / М.Т. Упадышев, Г.В. Бешнов, В.И. Донецких, заявл. 28.12.2005, опубл. 10.07.2007, Бюл. № 32.– 4 с.
- Патент РФ № 2389795, МПК С12N 15/10. Способ экстракции РНК из растительных образцов / М.Т. Упадышев, П.А. Походенко, И.И. Саунина, заявл. 30.12.2008, опубл. 20.05.2010, Бюл. № 14.– 7 с.
Статьи:
- Томилин, А.А. К вопросу об эффективности оздоровления растений малины красной от вируса мозаики резухи с использованием метода культуры меристем / А.А. Томилин, М.Т. Упадышев // Ягодоводство в Нечерноземье: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 1993.– С. 25–29.
- *Упадышев, М.Т. Адаптация пробирочных растений: новые подходы к решению проблемы / М.Т. Упадышев, В.А. Медведев // Вестник РАСХН.– 1993.– № 3.– С. 27–28.
- Упадышев, М.Т. Проблемы оздоровления и размножения in vitro растений рябины обыкновенной / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб. – М.: ВСТИСП, 1994.– С. 72–77.
- Упадышев, М.Т. Аспекты оздоровления пробирочных растений ежевики от вируса мозаики резухи / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М., ВСТИСП, 1995.– Т. II.– С. 215–219.
- *Упадышев, М.Т. Регенерационная способность эксплантов рода Rubus в зависимости от длительности культивирования in vitro / М.Т. Упадышев, В.А. Высоцкий // Сельскохозяйственная биология.– 1995.– № 1.– С. 85– 89.
- *Упадышев, М.Т. Ризогенез и активность пероксидазы у черенков растений рода Rubus при различных способах размножения / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Доклады РАСХН.– 1995.– № 4.– С. 11–13.
- *Упадышев, М.Т. Оздоровление и размножение нетрадиционных ягодных и плодовых культур/ М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.– 1996.– № 4.– С. 15–17.
- *Упадышев, М.Т. Ауксины и фенолкарбоновые кислоты как регуляторы ризогенеза растений рода Rubus in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Сельскохозяйственная биология.– 1996.– № 1.– С. 92–98.
- Упадышев, М.Т. Вирусные болезни и оздоровление нетрадиционных ягодных и плодовых культур / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 1996.– Т. III.– С. 102–108.
- Упадышев, М.Т. Аспекты оздоровления и размножения ягодных и плодовых культур с использованием фенольных соединений / М.Т. Упадышев, А.Д. Петрова // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М., ВСТИСП, 1998.– Т. V.– С. 50–54.
- *Упадышев, М.Т. Салициловая кислота как регулятор ризогенеза у плодовых и ягодных культур in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Сельскохозяйственная биология.– 1998.– № 5.– С. 63–68.
- *Петрова, А.Д. Оздоровление и размножение садовых культур in vitro / А.Д. Петрова, М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.– 2000.– № 4.– С. 12–13.
- *Упадышев, М.Т. Клональное микроразмножение садовых культур на безагаровой среде / М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.– 2000.– № 5–6.– С. 20–21.
- Упадышев, М.Т. Использование фенольных соединений при тестировании садовых растений на вирусы / М.Т. Упадышев, А.Д. Петрова // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 2001.– Т. VIII.– С. 282–286.
- *Бешнов, Г.В. Магнитно-импульсная обработка посадочного материала садовых растений / Г.В. Бешнов, М.Т. Упадышев, В.И. Донецких, А.А. Цымбал // Садоводство и виноградарство.– 2002. – № 1.– С. 15–18.
- Упадышев, М.Т. К вопросу о вредоносности неповирусов на растениях рода Rubus / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 2002.– Т. IX.– С. 292–296.
- *Упадышев, М.Т. Спектральный состав света при микроразмножении растений родов Rubus и Sorbus / М.Т. Упадышев // Доклады РАСХН.– 2002.– № 6.– С. 16–19.
- Упадышев, М.Т. Диагностика вирусов на груше методом ИФА / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 2003.– Т. Х.– С. 268–274.
- *Упадышев, М.Т. Модификационная изменчивость ягодных и плодовых культур в зависимости от способа размножения / М.Т. Упадышев // Сельскохозяйственная биология.– 2003.– № 3.– С. 64–71.
- *Упадышев, М.Т. Об использовании флоридзина при микроразмножении садовых растений / М.Т. Упадышев, Э.М. Дроздовский // Сельскохозяйственная биология.– 2003.– № 1.– С. 87–92.
- Упадышев, М.Т. Мониторинг вирусных болезней ягодных и плодовых культур / М.Т. Упадышев // Мобилизация адаптационного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды: матер. межд. науч.-практ. конф.– М.: ВСТИСП, 2004.– С. 215–219.
- *Упадышев, М.Т. Использование магнитно-импульсной обработки при размножении садовых культур / М.Т. Упадышев, Г.В. Бешнов, В.И. Донецких, Г.Ю. Упадышева // Доклады РАСХН.– 2005.– № 3.– С. 40–44.
- Упадышев, М.Т. Вирусные болезни груши: распространенность, вредоносность и диагностика / М.Т. Упадышев // Мiжвiдомчий тематичний науковий збiрник «Садiвництво».– Киiв: Серж, 2005.– Т. 57.– С. 514–517.
- Упадышев, М.Т. Серомониторинг вирусных болезней в насаждениях ягодных и плодовых культур / М.Т. Упадышев // Оптимизация фитосанитарного состояния садов в условиях погодных стрессов: сб. науч. тр.– Краснодар, 2005.– С. 90–94.
- *Упадышев, М.Т. Модификационная изменчивость при микроразмножении и зеленом черенковании ягодных и плодовых культур / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 2005. – Т. XIV.– С. 215–224.
- Упадышев, М.Т. Вирусные болезни ягодных и плодовых культур, методы диагностики и оздоровления / М.Т. Упадышев // Второй «Форум возрождения китайской северо-восточной старой промышленной базы: научно-техническое сотрудничество Китая и СНГ» («Форум-2006»): сб. докл.– Китай: Харбин, 2006.– С. 601–608.
- *Туть, Е.А. Диагностика вирусов на актинидии и лимоннике методом ИФА / Е.А. Туть, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М., 2005.– Т. XII.– С. 606–611.
- *Туть, Е.А. Распространенность вирусов на актинидии и лимоннике / Е.А. Туть, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: ВСТИСП, 2006. – Т. XIII.– С. 380–390.
- *Туть, Е.А. Серомониторинг и диагностика вирусов на актинидии и лимоннике / Е.А. Туть, М.Т. Упадышев // Защита и карантин растений.– 2007.– № 8.– С. 49–50.
- *Туть, Е.А. Особенности микроразмножения актинидии и лимонника китайского / Е.А. Туть, М.Т. Упадышев // Сельскохозяйственная биология.– 2008.– № 3.– С. 96–101.
- *Упадышев, М.Т. Вирусные болезни на груше / М.Т. Упадышев // Защита и карантин растений.– 2008.– № 4.– С. 55–56.
- Упадышев, М.Т. Роль вирусологии в получении сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур / М.Т. Упадышев //Аграрная наука Евро-Северо-Востока.– 2008.– № 11.– С. 62–66.
- *Походенко, П.А. Вирусные болезни на сливе и их диагностика методами ИФА и ПЦР / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.– 2008.– № 5.– С. 22–24.
- *Походенко, П.А. Диагностика вируса шарки сливы на косточковых культурах / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев // Защита и карантин растений.– 2008.– № 7.– С. 25–26.
- *Походенко, П.А. Диагностика вирусов и бактерий на плодовых культурах методом полимеразной цепной реакции / П.А. Походенко, И.И. Кочетова, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: Изд. Дом МСП, 2008. – Т. XIX.– С. 112–116.
- *Походенко, П.А. Псевдошарка на сливе и алыче – новое заболевание для Нечерноземья / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев // Агро XXI.– 2008.– № 7–9.– С. 11–12.
- *Походенко, П.А. Распространенность вирусов на косточковых культурах в Подмосковье / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев, Н.Н. Мельникова // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М., 2008.– Т. XX.– С. 211–218.
- *Саунина, И.И. Распространенность и вредоносность вирусов на груше в условиях Московской области / И.И. Саунина, М.Т. Упадышев, Е.В. Гребнева // Садоводство и виноградарство.– 2008.– № 3.– С. 16–19.
- *Упадышев, М.Т. Новый способ оздоровления ягодных и плодовых культур от вирусов методом магнитотерапии / М.Т. Упадышев, В.И. Донецких // Доклады РАСХН.– 2008.– № 4.– С. 12–15.
- Упадышев, М.Т. Сравнительная оценка методов ИФА и ОТ-ПЦР при тестировании латентных вирусов на груше / М.Т. Упадышев, И.И. Саунина // Инновационные технологии в питомниководстве: матер. межд. науч.-практ. конф., 15 июня – 31 июля 2009 г.– Самохваловичи, 2009.– С. 118–123.
- Упадышев, М.Т. Вирусные болезни у жимолости / М.Т. Упадышев // Состояние и перспективы развития культуры жимолости в современных условиях: матер. межд. науч.-метод. конф., 23 марта – 23 апреля 2009 г.– Мичуринск-наукоград РФ, 2009.– С. 200-202.
- *Упадышев, М.Т. Эффективность оздоровления растений рода Rubus от вирусов в процессе хемотерапии in vitro с применением салициловой кислоты / М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– М.: Изд. Дом МСП, 2009.– Т. XXII, ч. 2.– С. 326–334.
- *Куликов, И.М. Экономическая оценка современных способов тестирования и оздоровления ягодных и плодовых культур / И.М. Куликов, М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.– 2010.– № 6.– С. 20–24.
- *Упадышева, Г.Ю. Зараженность клоновых подвоев косточковых культур вирусами и их влияние на эффективность размножения зеленым черенкованием / Г.Ю. Упадышева, М.Т. Упадышев, П.А. Походенко // Плодоводство и ягодоводство: сб. науч. раб.– 2010.– Т. XXIV, ч. 2.– С. 127–132.
- *Суркова, О.Ю. Применение полимеразной цепной реакции для диагностики реверсии на черной и красной смородине / О.Ю. Суркова, М.Т. Упадышев, Н.Н. Мельникова, П.А. Походенко // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. раб.– 2010.– Т. XXIV, ч. 2.– С. 113–118.
- Упадышев, М.Т. Эффективность оздоровления ягодных культур от вирусов с использованием методов культуры тканей и термотерапии / М.Т. Упадышев // Актуальные проблемы размножения садовых культур и пути их решения: матер. межд. науч.-метод. дистанц. конф., 15-26 февраля 2010 г.– Мичуринск-наукоград, 2010.– С. 290–293.
- *Упадышев, М.Т. Современная классификация вирусов плодовых, ягодных культур и винограда / М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.– 2010.– № 2.– С. 40–44.
- Упадышев, М.Т. Оздоровление плодовых и ягодных культур от вирусов с применением термотерапии и биотехнологических приемов / М.Т. Упадышев // Сб. науч. тр. Юбилейной конф.– Новосибирск.– 2010.– С. 135–138.
* – Публикации в периодических изданиях списка ВАК.
