Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах ленинградской области

На правах рукописи

КРЮКОВА ВЕРА ВАЛЕНТИНОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕННЫХ СТРЕПТОКОККОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАСТИТА КОРОВ В ХОЗЯЙСТВАХ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Научный руководитель:

Сухинин Александр Александрович,

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Борисенкова Адель Наумовна,

доктор ветеринарных наук, профессор;

Макавчик Анатолий Анатольевич;

кандидат ветеринарных наук

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет».

Защита диссертации состоится “03“ февраля 2011 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5, тел./факс (812) 3883631.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан “28“ декабря 2010 г. и размещён на сайте академии (http://spbgavm.ru)

Учёный секретарь

диссертационного совета Л.М.Белова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одним из факторов, ухудшающих качество молока и снижаю­щих продуктивность молочного скотоводства, является мастит коров. Несмотря на проводимые профилактические мероприятия, данная патология отмечается у 60 - 75 % коров (Париков В.А., 1990; Батраков А.Я., 2001; Андреев А.В., 2003; Васильев В.Г., 2003; Кузьмин Г.Н., 2004; Архипов А.А., 2008; Акназаров Б.К., 2009; Sartory R., 2002; Tanja Lehtolainen 2004; Maarit Haverti 2008; Submer I., Valerian F., 2010).

Мастит возникает в результате сочетанного воздействия на организм микробного и пред­располагающих факторов, главнейшими из которых являются, нару­шение правил кормления, содержания и доения коров, неудовле­творительное проведение на фермах профилактических мероприя­тий, нарушение техники доения (недодаивание или передой, перевод на машин­ное доение неподобранного стада коров; неисправные доильные аппараты и установки, не обеспечивающие необходимый уровень вакуума, изношенная резина до­ильных стаканов и т.д.). Это приводит к раздражению, травмированию слизистой оболочки сосков и паренхимы вымени, а проникновение в поврежденные ткани вымени различных видов микроорганизмов вызывает ее воспаление (Болгов А.Е., Карманов Е.П., Муравья Л.П., 1996; Рубцов В.И., 2006; Васильев В.В., 2008; Горлов И.Ф., 2008; Chaves C.J., Tirante L., Pol M., 2001). Данный процесс вызывают микроорганизмы рода Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, также представители сем. Enterobacteriaceae, дрожжеподобные грибы и т.д. ( Ивашура А.И., Карташова В.М., 1988; Батраков А.Я., 2001; Erskine R.J. et al., 2002 ).

Развитие современной микробиологии неразрывно связано с совершенствованием методов идентификации патогенных микроорганизмов. Успехи в этой области, достигнутые в последние десятилетия, обеспечены в первую очередь фундаментальными исследованиями в области химии, иммунологии и генетики. На смену серологическим методам, выявляющим специфические антитела и антигены, приходят методы, позволяющие проводить исследование генетического аппарата микроорганизмов. Использование молекуляpно-генетических методов объясняется необходимостью расшифровки последовательностей генов-вирулентности, кодирующих факторы-патогенности с последующим созданием на их основе перспективных методов внутривидовой идентификации патогенных стрептококков (Гинцбург А.Л., 1998; Бондаренко В.М., 1999; Дмитриев А.В., 2004).

Очевидно, что изучение особенностей организации генома патогенных стрептококков и разработка на этой основе комплекса стандартизированных молекулярных методов может лечь в основу их комплексной диагностики, дать более полную картину вирулентных свойств и помочь усовершенствовать способы лечения и профилактики стрептококкозов.

Учитывая вышеизложенное цель работы: провести молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров и определить антибактериальную эффективность препарата «Тимукотин».

Задачи исследований:

• Провести анализ заболеваемости коров маститом в хозяйствах Ленинградской области;
• Изучить видовой состав, морфологические и культурально-биохимические свойства патогенных микроорганизмов;
• Подобрать праймеры, изучить распространенность генов вирулентности cfb, bac, scpB, lmb, cylE и определить гетерогенность популяции стрептококков группы В, выделенных от коров больных маститом;
• На клиническом материале апробировать метод ПЦР – для экспресс-диагностики S.agalactiae;
• Определить антимикробную активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков.

Научная новизна: Впервые проведено исследование клинических изолятов Streptococcus agalactiae, выделенных от больных маститом коров в хозяйствах Ленинградской области, на наличие генов-вирулентности (cfb, bac, scpB, lmb, cylE). Получены новые данные о гетерогенности популяции данного возбудителя на территории Ленинградской области. Определена антимикробная активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков и эффективность при лечении коров больных маститом кокковой этиологии.

Практическая значимость исследований: Предложенный метод экспресс-диагностики мастита коров стрептококковой этиологии с помощью ПЦР, основанной на использовании в качестве специфических маркеров сконструированные праймеры на гены-вирулентности cfb и cylE, позволяет ветеринарным специалистам в короткие сроки определить спектр выделяемой микрофлоры. Полученные данные вошли в методические рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков (одобрены и утверждены научным координационным Советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии). Результаты производственных испытаний нового антибактериального препарата «Тимукотин» были использованы фирмой-производителем ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.» (ООО «Ареал - Медикал») для расширения инструкции по применению препарата. Основные положения диссертации используются в качестве информационного материала в учебном процессе курса «Ветеринарная микробиологии и иммунология» на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГАВМ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков, выделенных от больных маститом коров в хозяйствах Ленинградской области;

- Антимикробная активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков и при лечении коров больных маститом кокковой этиологии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на конференции профессорско-преподавательсвого состава СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2008-2010), на 64-й научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009); на международной конференции посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии (Самара, 2009); на международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию кафедры органической и биологической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009); на научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии и 45-летию подготовки биологов-охотоведов (Вятка, 2010); на международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина-теория, практика, обучение» (Санкт-Петербург, 2010).

Проведено производственное испытание применения препарата «Тимукотин» в 2-х хозяйствах Ленинградской области. От ветеринарной службы хозяйств получены акты, подтверждающие его эффективность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 работы в журнале, рекомендованном ВАК для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций. В них изложены основные положения диссертации.

Внедрение. Материалы исследований вошли в «Рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков» (одобрены и утверждены научным координационным Советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии). Результаты исследований и испытания препарата «Тимукотин» используют в практической работе ветеринарные врачи в хозяйствах Ленинградской области при диагностике и этиотропном лечении коров, больных маститом.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 155 источника, в том числе 77 зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 15 таблицами и 5 рисунками.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в течение 2008 -2010 г. на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.

Обследовано 598 коров айширо-фризской и голштино-фризской породы. Для лабораторного исследования были отобраны пробы молока от коров больных маститом из хозяйств Ленинградской области: ЗАО «Племенное хозяйство им.Тельмана» (Тосненский район), СПК ПЗ «Детскосельский» (Пушкинский район), ферма «Старо-Паново» ЗАО «Предпортовый» (Красносельский район), ЗАО «Заречье» (Кировский район), СПК «Дальняя Поляна» (Волховский район), ФГУП « Племхоз Мыслинский» (Волховский район), СПК «Матросово» (Выборгский район).

При выполнении работы были использованы эпизоотологический, клинический и лабораторный методы исследования.

Анализ уровня заболеваемости коров маститами и процент их выбраковки в хозяйствах и в целом по Ленинградской области проводили на основании отчетов хозяйств и Управления ветеринарии по Ленинградской области за период 2002-2009 гг.

Диагностику маститов проводили согласно «Наставления по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров» (Утверждено Департаментом ветеринарии РФ от 30. 03.2000 г.).

Бактериологические исследования видового состава микрофлоры молока проводили согласно методического указания по диагностики стрептококкоза животных и методических рекомендации по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени коров для диагностики мастита.

Серологическое типирование стрептококков проводили в реакции коагглютинации с использованием наборов НПП « АКВАПАСТ» согласно прилагаемой инструкции.

Антибиотикочувствительность стрептококков определяли методом диффузии антибиотика в агар с использованием стандартных бумажных дисков (производства «НИЦФ», Санкт-Петербург), согласно инструкции по применению.

Молекулярно-генетический анализ стрептококков.

А). Выделение ДНК из чистой культуры Streptococcus spp (экспресс-анализ). Несколько колоний (8-15) культуры переносили в пробирку, содержащую 50 мкл стерильной воды. Ресуспендировали в 100 мкл 1%- раствора Triton X-100. Суспензию инкубировали при 98° С в течение 10-15 мин. Центрифугировали при 2500 оборотах в течение 10 минут.

Б). Выделение ДНК Streptococcus spp. непосредственно из молока проводили по методу предложенному R. Boom, et al., 1990 г. для выделения ДНК Гр+ микрофлоры.

При постановке полимеразной цепной реакции учитывали рекомендации Дмитриева А.В. (2004). К 0,1-0,5 мкг геномной ДНК добавляли 5-10 пикомолей каждого из специфических праймеров, фланкирующих исследуемую последовательность (10 мМ р-р) - 0,5+0,5 мкл; 10буфер для Taq ДНК полимеразы-2,5мкл и по 1 мкл рабочего раствора дезокси-рибонуклеотидтрифосфатов ( dNTP).

Затем добавляли 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы (5 еа/мкл) и 0,5 мкл MgCl2 (100 мМ р-р). Объем реакционной смеси доводили стерильной дистиллированной водой до 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию проводили, начиная с предварительной инкубации проб при 95 С - 3 мин, а затем повторяли следующие этапы в течение 34 циклов ( амплификация): денатурация 95 С – 30 сек; отжиг ( 50-60 С в зависимости от Г-Ц состава праймеров) – 30 сек; синтез новых цепей 72 С – 1 мин и 72 С - 10 мин.

Праймер AGA использовали в качестве основного контроля групповой принадлежности (Дмитриев А.В. и соавт., 2000).

Сравнительный анализ остальных нуклеотидных последовательностей ДНК (генов-вирулентности) проводили с использованием программы “BLAST” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Последовательности праймеров для ПЦР были сконструированы с помощью этой же программы на основании соответствующих нуклеотидных последовательностей, доступных через базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/).

Электрофорез ПЦР - продуктов проводили в 1,5 % агарозном геле с добавлением 0,5 буфера ТВЕ при условиях: 110 В, 105 мА. Бромистый этидий добавляли уже после завершения разделения (0,5 мкг/мл).

Результаты электрофореза учитывали в ультрафиолетовом свете с различной длиной волны (длина зависит от используемого праймера) на приборе «Трансиллюминатор».

Для апробации метода ПЦР брали молоко в количестве 50 мл. В качестве положительного контроля вносили музейный штаммом S. agalactiae из коллекции отдела молекулярной микробиологии ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАН», из расчета 1105 мк.кл/мл (по оптическому стандарту мутности). Проводили серию десятикратных разведений пробы молока до минимальной концентрации S. agalactiae 1102 мк.кл/мл. Далее с каждым разведением ставили ПЦР, используя в качестве специфических-нуклеотидных последовательностей сконструированные праймеры на гены-вирулентности cylE и cfb.

Антимикробную активность чистого действующего вещества препарата «Тимукотин» - тиамулина фумарата, изучали методом серийных разведений для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) (Ковалев Ф.М. и соавт., 1988) в отношении изолятов стрептококков, выделенных от коров в ходе основного микробиологического исследования, и музейного штамма Staphylococcus aureus 209-P. Изоляты были типированы по морфологическим, культурально - биохимическим, серологическим и молекулярно-генетическим свойствам.

Производственное испытание антибактериального препарата «Тимукотин» проводили в хозяйствах Ленинградской области. Препарат инъецировался внутримышечно 1 раз в день в течение 4-х дней. Животным делали новокаиновую блокаду наружных срамных нервов по А.Я. Башкирову, массаж вымени и частое сдаивание. Состояние молочной железы определяли с помощью клинического обследования и лабораторных методов исследования.

В динамике на 3, 5, 7,10 дни после окончания курса применения препарата проводили клиническое обследование животных; подсчет соматических клеток в пробах молока (с помощью вискозиметрического анализатора); микробиологическое исследование, в молоке определяли количество ингибирующих веществ (остаточное количество антибиотиков) согласно (ГОСТ 51600-2000) с индикатором бромкрезолпурпуром / «Delvotest SP-NT.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом математической статистики, предложенную Лакиным Г.Ф. (1990), с помощью программы OpenOffice Calc. Цифровой материал диссертации обработан по Стьюденту для проверки достоверности различий.

2.2. Результаты исследований

Для выяснения распространенности мастита коров в хозяйствах Ленинградской области были проанализированы данные отчетов Управления ветеринарии агропромышленного и рыбохозяйственного комплекса Ленинградской области за период 2002 - 2009 гг.

Согласно проведенного анализа на протяжении последних лет заболеваемость маститами в Ленинградской области составляет в среднем 13% в год. Выбраковка коров по причине мастита - 1% от общего поголовья. Учитывая, что в отчете фиксируются только клинические формы мастита, а сведения по субклиническим формам мастита отсутствуют, эти цифры должны быть значительно выше.

2.2.1. Диагностика мастита коров

Обследовано 598 коров в основном 2-3 отелов в 7 хозяйствах Ленинградской области. Выявлено 100 случаев мастита (16,7%). Из которых, 40 клинической формы (5,7%) и 60 субклинической (11%). Субклинических форм мастита в 1,5 раза больше чем клинических (Таблица 1). Животных находящихся на лечении или больных хроническим маститом для исследования не использовали.

Таблица 1

Результаты диагностирования маститов в хозяйствах Ленинградской области.

№ п/п	Наименование хозяйства	Количество обследованных коров	Выявлено больных маститом		Всего
			Клиническая форма	Субклиническая форма
1	ЗАО «Плем.хоз.им. Тельмана»	90	5	10	15
2	СПК ПЗ «Детскосельский»	84	8	10	18
3	ЗАО «Предпортовый»	63	4	2	6
4	ЗАО «Заречье»	90	10	9	19
5	СПК «Дальняя Поляна»	85	3	6	9
6	ФГУП « Племхоз Мыслинский»	89	5	8	13
7	СПК «Матросово»	97	5	15	20
Всего:		598	40	60	100

Все пробы молока исследовали на наличие маститогенной микрофлоры. Было отобрано 106 проб из пораженных четвертей вымени. Воспаление наблюдалось, как правило, в одной четверти вымени. Лишь у нескольких животных были поражены 2 четверти и более.

2.2.2. Видовой состав и антибиотикочувствительность

патогенной микрофлоры

В рамках проведенного обследования коров в хозяйствах Ленинградской области на заболеваемость маститом было определено следующее соотношение микроорганизмов: Staphylococcus spp.,- 43%; Streptococcus gr.А,B,C,Е - 29 %; Escherichia coli – 22% ; Streptococcus gr. D ( Streptococcus faecalis) – 0,1 %; род Bacillus – 3%; дрожжеподобные грибы - 2%.

Полученные нами данные согласуются с официальными данными бактериологических исследований молока коров больных маститом по Ленинградской области.

30% выделенных нами патогенных микроорганизмов по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам было отнесено к роду Streptococcus и Enterococcus.

Установлено, что в большинстве случаев выделяется S.agalactiae (32%). S.faecalis причиной мастита является у 19% коров, S.dysgalactiae – 10%, S. uberis – 7%, S.pyogenes – 3%. 29% отнесены к нетипируемым.

При определении антибиотикочувствительности установлено, что патогенные стрептококки наиболее чувствительны к ампициллину – 87 %, бензилпенициллину - 87%, амоксициклину – 100 % и эритромицину - 93 %, то есть к b-лактамам (класс: пенициллины) и аминогликозидам.

2.2.3.Результаты ПЦР на наличие генов– вирулентности S. agalactiae и апробация предложенного метода на клиническом материале

Изоляты Streptococcus spp., были происследованы с помощью ПЦР на наличие видоспецифичных генов, потенциально участвующих в формировании вирулентного фенотипа стрептококков группы В. В качестве таких генов у микроорганизмов в настоящее время известны следующие: bca - кодирующий – антиген; bac -кодирующий - антиген; scpB- кодирующий С5а пептидазу; lmb - кодирующий ламинин, связывающий белок; cyl E - -гемолизин; hylB-гиалуронидазу; cfb-CAMPфактор; scaB-фактор адгезии; glnA-глутаминсинтетазу (Lachenauer C.S., Creti R., Michel J.L., 2000; Madoff L.C., Paoletti L.C., Tai J.Y., 1992; Beckmann C. et al., 2002; Gase K., Ozegowski J., Malke., 1998; Hassan A. et al., 2000). В нашей работе мы определяли наличие 5 потенциальных генов вирулентности scpB, cfb, lmb, bac, cyl E, так как в литературе сообщается о их наличии у штаммов стрептококков группы В, выделенных от животных (Jensen. N.E., Aarestrup F.M., 1996; Estuninguish S., 2002; Дмитриев А.В., Ткачикова M., Bhide I., 2000). Подобранные праймеры, используемые в нашей работе, приведены в таблице 3. Таблица 3

Гены и праймеры, использованные в работе.

№ п/п	Гены	Последовательность праймера, ориентация(5’ -3’ )	Т пл.,С
1	AGA(капсульный белок С )	-CGTCGTGGTATTGAAACAGCTGTT -   GGATATACGGATTCTCAAGTTCAGAG-	50
2	scpB	-CACGGCACACACGTGTCAGGA- -CCGCTGCAGGTGTCCCAACC-	57,4
3	cfb	-TGGAACTCTAGTGGCTGGTGCAT- -ACTGTCTCAGAGTTGGCACGCA-	56,0
4	lmb	-TGTGGCAGCTATTTATGACGCGGA- -TGCCGTGTGTTGCGTCACGA-	57,4
5	bac	-ACACCGCAGGCTCCAGACAC- -GAACACGCGGTGCTTCTGGG-	57,4
6	cylE	-TCGAAAAGTCGTAGTGGACAGGCA- -AGGCTAGGGTGAGCCCTCGT-	56,0

Для подтверждения бактериологического и серологического типизирования изоляты проверяли на наличие капсульного белка стрептококков группы В с помощью праймера AGA (Рис. 1).

10 11 12 13 14 15 16 17 М 18 19 20 21 22 23 24 25 - +

Рисунок 1. ПЦР анализ Streptococcus spp., на наличие группового гена СГВ AGA.

М - Маркер молекулярного веса 100bp ladder; нужный фрагмент должен быть размером порядка 310 п.н.; трек «-» - отрицательный контроль (изолят E.Coli); трек «+» - положительный контроль (музейный штамм S. agalactiae из коллекции ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАН»); треки 20,23,24,25- изоляты S. agalactiae; треки 10,11,12,14 - сомнительные; треки 13,16,17,18,19,21,22 - изоляты стрептококков иных серологических групп. Изоляты № 1,3,4,5,6,7 не вошедшие в рисунок 1 были также специфичны по гену AGA.

Общая картина распространенности генов вирулентности следующая: cfb присутствовал у 90% изолятов; cylE присутствовал у всех изолятов (100%); гены scpB, lmb не были обнаружены; ген bac присутствовал у 30 % изолятов, а в 10 % случаев реакция была - сомнительной.

Полученные данные формируют картину о гетерогенности популяции стрептококков группы В, возбудителей мастита коров Ленинградской области.

Апробацию метода ПЦР основанного на использовании в качестве специфических маркеров стрептококков группы В праймеров на гены вирулентности cfb и cyl E проводили на молоке содержащем S.agalactiae. Результаты были положительными. Предложенный метод является экспресс-методом диагностики S. agalactiae, позволяющим обнаружить возбудитель в течение короткого времени.

2.2.4. Антимикробная активность и эффективность препарата «Тимукотин» при лечении коров больных маститом

«Тимукотин» это комплексный препарат, в его состав которого входят 2 действующих антибактериальных вещества: тиамулина фумарат, действующий против грамположительной микрофлоры и колистина сульфат – против грамотрицательной микрофлоры.

В качестве критерия оценки антимикробной активности тиамулина фумарата рассматривали величину его минимальной ингибирующей концентрации в отношении изолятов стрептококков, выделенных из секрета вымени коров больных маститом в ходе основного исследования, и музейного штамма Staphylococcus aureus- 209 P.

Эффективность применения препарата испытывали в хозяйствах ЗАО «Племхоз. им. Тельмана» (родильное отделение) и СПК «Матросово» (дойное стадо). Были сформированы подопытная и контрольная группы из коров больных маститом в основном 2-3 отела. Здоровые животные служили в качестве чистого контроля.

На момент испытания препарата были выявлены животные с клиническим маститом серозной формы и субклиническим. Воспалительный процесс наблюдался в основном в одной - двух долях железы у каждой коровы.

Препарат инъецировали внутримышечно в течение 4-х дней. В качестве патогенетической терапии проводили новокаиновую блокаду наружных срамных нервов по Б.А. Башкирову, молоко из всех четвертей вымени коров сдаивали 3 раза в день. В первые три дня инъекций проводили массаж вымени. Контрольную группу лечили по схеме принятой в хозяйствах.

Установлено, что температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений, сокращение рубца в динамике во время лечения у животных подопытной и контрольной групп оставались в пределах физиологической нормы.

После окончания лечения был проведен подробный клинический и лабораторный осмотр животных подопытной и контрольной групп.

У коров подопытной группы с клинически выраженным воспалением молочной железы местная температура симметричных четвертей вымени нормализовалась; надвыменные лимфатические узлы по консистенции, подвижности и величине соответствовали норме.

Реакция с 5 % димастином была отрицательной как у коров с клиническим, так и с субклиническим маститом. Количество соматических клеток у этих животных было на уроне 450 000±250,8 на мл молока. При бактериологическом посеве молока роста патогенной кокковой микрофлоры не наблюдалось.

ВЫВОДЫ

1. Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах Ленинградской области проведен методом полимеразной цепной реакции, включающей использование праймеров на диагностически значимые гены вирулентности scpB, cfb, lmb, bac, cyl E.
2. Распространенность мастита у коров в хозяйствах Ленинградской области в последние годы остается в среднем 13 %. Среди выделяемой патогенной микрофлоры Staphylococcus spp. составляют 43%; Streptococcus gr. А,B, C, Е - 29 %; Escherichia coli – 22%; Streptococcus gr. D – 0,1 %; род Bacillus – 3%; дрожжеподобные грибы - 2%.
3. Род Streptococcus представлен следующими возбудителями: S.agalactiae – 32%; S.faecalis – 19%; S.dysgalactiae -10%; S.uberis – 7 %; S. pyogenes – 3 %. К нетипируемым микроорганизмам отнесено 29 % изолятов.
4. Подобраны, сконструированы и синтезированы праймеры на анализируемые гены вирулентности scpB, cfb, lmb, bac, cyl E. Определена гетерогенность популяции стрептококков группы В. Ген вирулентности cfb содержат 90% изолятов; ген cylE - 100% изолятов; гены scpB, lmb отсутствуют; ген bac присутствовал у 30% изолятов, давал сомнительную реакцию в 10 % случаев.
5. Апробирован метод прямого обнаружения S. agalactiae в молоке с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических нуклеотидных последовательностей генов вирулентности, рекомендуемый в качестве экспресс-диагностики мастита коров стрептококкой этиологии с целью видовой идентификации возбудителя.
6. Установлена высокая эффективность антибактериального препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов стрептококков и при лечении коров, больных маститом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен метод экспресс-диагностики мастита коров стрептококковой этиологии с помощью полимеразной цепной реакции, основанной на использовании в качестве специфических маркеров сконструированных праймеров на гены-вирулентности cfb и cylE.
2. Разработаны методические рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков (одобрены и утверждены научным координационным Советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии).
3. Результаты производственных испытаний нового антибактериального препарата «Тимукотин» при лечении коров больных субклиническим и серозным маститом кокковой этиологии были использованы фирмой- производителем ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.» (ООО «Ареал–Медикал») для расширения инструкции по применению препарата.
4. Материалы диссертационной работы используются в практической работе ветеринарными врачами Ленинградской области при диагностике и комплексном лечении мастита коров.
5. Результаты молекулярно-генетического анализа патогенных стрептококков используются в качестве информационного материала в учебном процессе курса «Ветеринарная микробиология и иммунология» на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГАВ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крюкова В.В. Выделение и определение антибиотикочувствительности патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров/ В.В. Крюкова// Материалы международной конференции посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. - Самара, 2009.-С.239-242.
2. Крюкова В.В. Состояние молочного скотоводства Ленинградской области по заболеваемости маститами/В.В.Крюкова//Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии.- СПб.-2009.-№ 3.-С.78-80.
3. Крюкова В.В. Патогенные стрептококки, возбудители мастита коров, и их анитбиотикочувствительность/В.В.Крюкова//Материалы международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ-С-Пб., Изд-во: ФГОУ ВПО «СПбГАВМ», 2010.-С.55-56.
4. Крюкова В.В. Идентификация стрептококков гр. В по генам-вирулентности/ В.В. Крюкова// Материалы ежегодной научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ № 64.-С-Пб., Изд-во: ФГОУ ВПО «СПбГАВМ»,- 2010.- С.54-56.
5. Сухинин А.А., Крюкова В.В. Использование ПЦР для идентификации патогенных стрептококков/А.А.Сухинин, В.В.Крюкова//Вопросы нормативно -правового регулирования в ветеринарии.- С-Пб.- 2010.-№2.- С.13-15.
6. Крюкова В.В. Новое в диагностике патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров/ В.В. Крюкова// Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии и 45-летию подготовки биологов-охотоведов. - Вятка, 2010.- С.148-149.
7. Крюкова В.В. Изучение активности препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков/ В.В. Крюкова// Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии.- С-Пб.-2010.- № 4.-С.107-110.

Отпечатано в ООО « Анонс»

С-Пб.ул. Розенштейна,21 Тел: 445-27-41

Подписано в печать: 27.12.2010

Тираж 100 экз.