Оценка физиологического состояния рыб – объектов аквакультуры при различных стрессорных воздействиях и поиск адаптогенов

На правах рукописи

КОРОТЕНКО АННА ВИКТОРОВНА

ОЦЕНКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ

РЫБ – ОБЪЕКТОВ АКВАКУЛЬТУРЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СТРЕССОРНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ И ПОИСК АДАПТОГЕНОВ

Специальность 06.04.01 – рыбное хозяйство и аквакультура

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Астрахань – 2012

Работа выполнена в Астраханском государственном университете (АГУ) и в Каспийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (ФГУП «КаспНИРХ»)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Лазько Марина Владимировна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор, заслуженный

деятель науки РФ Воробьев Владимир Иванович

Доктор биологических наук,

Почётный работник

рыбного хозяйства России Сокольский Аркадий Федорович

Ведущая организация: Волгоградское отделение федерального государственного научного учреждения

«Государственный научно-исследовательский институт

озерного и речного рыбного хозяйства»

(Волгоградское отделение ФГНУ «ГосНИОРХ»)

Защита диссертации состоится 28 февраля 2012 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 212.009.13 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1. С авторефератом можно ознакомиться на сайте ВАК: http://vak.ed.gov.ru/ru/

Автореферат разослан « 27 » января 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А.С. Дулина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. Изучение влияния стрессорных факторов различного происхождения на гомеостатические и рыбоводные показатели рыб филогенетически- и –экологически различных групп является современной актуальной проблемой как для оценки репродуктивного потенциала, так и для разработки мер по устранению негативных последствий этих воздействий.

Неблагоприятная ситуация в Волго-Каспийском и других бассейнах, созданная в результате иррационального развития хозяйственной деятельности человека, отрицательно влияет на естественное воспроизводство ценных аборигенных видов рыб, в том числе осетровых и лососевых. Результатом бесконтрольного вылова этих рыб является катастрофическое снижение их численности, и это обстоятельство способствует интенсивному развитию аквакультуры.

Особо следует отметить проблему негативных последствий стресса различного генеза у ценных в хозяйственном отношении видов рыб, принадлежащих к различным филогенетическим и экологическим группам.

В условиях интенсивной аквакультуры необходимо знать степень влияния на организм производителей и молоди повреждающих факторов внешней среды, в том числе, хэндлинг-стресса, возникающего в ходе различных манипуляций с рыбой в процессе искусственного разведения, краудинг-стресса – стресса, связанного с высокой плотностью посадки, голодания (Скопичев, Максимюк 2009; Сеин, Жеребилов, 2009; Силкина, Микряков, Микряков, 2009; Моисеенко, 2010).

Снижение величины рН в искусственных пресноводных водоёмах вследствие усиленного поступления СО2 органического происхождения, сброса кислых стоков ведёт к развитию разнообразных по направленности, длительности, выраженности и обратимости физиолого–биохимических изменений в организме рыб (Лукьяненко, 1983, 1987; Рыжков, Кучко, Дзюбук, 2010; Thomas, 1982; Bhaskar et al.,1985; Hbe et al, 1983; Haya et al., 1985; Iwama et al., 1992).

Сохранение генофонда ценной ихтиофауны Каспийского моря на оптимальном уровне является важной проблемой современного искусственного воспроизводства (Летичевский, Мещеряков, Сокольский, 1983; Лукьяненко, Касимов, Кокоза, 1984; Баранникова, Никоноров, Белоусов,2000; Иванов, 2000; Васильченко, 2003; Абдусамадов, 2003; Бурцев, 2009; Багров с соавт., 2010; Матишов с соавт., 2010; Васильева, Абдрахова, 2010; Matishov, 2010).

Для решения данной проблемы необходимо разработать раннюю диагностику функционального состояния и репродуктивного потенциала производителей различных рыб в условиях отрицательного воздействия природных и антропогенных факторов, а также предложить и апробировать эффективные адаптогены для купирования негативных последствий стресса в условиях интенсивной аквакультуры.

Цель исследования. Выявить влияние стрессоров различного генеза на гомеостатические показатели рыб, принадлежащих к различным филогенетическим и экологическим группам, для оценки репродуктивного потенциала и разработки мер по купированию негативных последствий адаптационного синдрома.

В ходе работы предстояло решить следующие задачи:

1. 1. Выявить особенности функционального состояния тиляпии как модельного тест-объекта в условиях кислотного стресса и при действии синтетического метилтестостерона (МТ).
2. 2. Изучить биологические параметры и репродуктивный потенциал самок русского осетра с различными рыбоводными характеристиками в стрессорных условиях интенсивной аквакультуры.
3. 3. Оценить протекторное действие раствора поваренной соли в стрессирующих условиях на организм молоди каспийской кумжи.
4. 4. Охарактеризовать действие Цитохрома–С на анадромных производителей севрюги позднего хода и на полученную от них заводскую молодь в условиях стресса голодания.
5. 5. Изучить функциональное состояние самок белорыбицы в различные периоды прерванной анадромной миграции, установив связь уровня интегрального физиологического параметра - скорости оседания эритроцитов (СОЭ) с температурой водной среды, гонадо-соматическим индексом, фертильностью и физиолого-биохимическими показателями (уровнями общего сывороточного белка, коллоидоустойчивостью сывороточных белков, концентрацией общего гемоглобина).

Научная новизна. Впервые у анадромных и заводских самок белорыбицы изучены такие биологические особенности как связь уровня интегрального физиологического параметра СОЭ с экзо- и эндогенными факторами и определено влияние кислотного стресса на уровне тканевой глюкозы и креатинина.

В целях индукции реверсии пола для эффективного товарного рыбоводства изучено влияние гормональной диеты, содержащей синтетический метилтестостерон, на примере тиляпии.

Для определения воспроизводительных качеств самок русского осетра с помощью регрессионного и корреляционного анализов впервые выявлена тесная связь уровня фертильности самок русского осетра с относительным содержанием - и – глобулинов.

Обнаружено выраженное протекторное действие 5‰ раствора поваренной соли в стрессирующих условиях на организм молоди каспийской кумжи. Впервые в аквариальных условиях в результате данного воздействия достигнуто серебрение пестряток кумжи, связанное с готовностью обитания в морской воде.

Проведенный анализ действия на функциональное состояние производителей и молоди севрюги Цитохрома-С, показал его высокую эффективность как нового адаптогена в аквакультуре.

Практическая значимость работы. На основании исследований и полученных данных разработаны рекомендации по тестированию функционального состояния самок ценных проходных видов рыб, позволяющих прогнозировать их репродуктивный потенциал.

В условиях интенсивной аквакультуры для купирования хэндлинг- и термо-стрессов возможно рекомендовать в качестве эффективных биопротекторов растворы поваренной соли барьерной солёности и растворы Цитохрома-С.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Содержание тиляпий в подкисленной воде приводит к тяжёлым нарушениям функционального состояния и, как следствие, к торможению роста и повышенному отходу рыб.

2. Использование гормональной диеты на основе тестостерона при выращивании молоди тиляпии модифицирует биологические показатели (рост, отход) и обусловливает формирование половой принадлежности преимущественно мужского типа.

3. Экспериментальные исследования указывают на возможность практического применения при заводском воспроизводстве ценных видов рыб в качестве биопротекторов растворов воды барьерной солёности и растворов препарата «Цитохром-С».

4. Физиолого-биохимические и рыбоводные исследования самок русского осетра позволили обнаружить наличие тесных корреляционных связей уровня их фертильности с относительным содержанием важнейших белковых фракций сыворотки крови.

5. На основании изучения физиологического состояния анадромных самок белорыбицы в различные сезоны года показано, что уровень СОЭ обусловливается температурой водной среды и стадиями зрелости гонад. Выявлено, что уровень СОЭ обратно пропорционален фертильности.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждались на II Международной конференции «Комплексные исследования биологических ресурсов южных морей и рек» (Астрахань, 2007), на Международной научно-практической конференции, посвящённой 110-летию КаспНИРХа «Проблемы изучения, сохранения и восстановления водных биологических ресурсов в ХХI веке» (Астрахань, 2007), Международном симпозиуме «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоёмов аридного климата» (Астрахань, 2007), Международной научно-практической конференции, посвящённой 450-летнему юбилею г. Астрахани «Комплексный подход к проблеме сохранения и восстановления биоресурсов Каспийского бассейна» (Астрахань, 2008), Международной конференции «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010).

Публикации. По теме диссертации издана 1 монография и опубликовано 9 научных статей, 3 из которых в рецензируемых журналах списка ВАК РФ.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 234 источника, в том числе 94 на иностранных языках. Диссертация изложена на 132 страницах текста, содержит 7 таблиц и 15 рисунков.

1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования в данной работе были выбраны: Тиляпия мозамбикская (Oreochromis mosambikus); Каспийский лосось (Salmo trutta caspius Kessler), являющийся подвидом кумжи; Севрюга( Acipenser stellatus Pallas); Русский осетр (Acipenser gldenstadti Brandt); Белорыбица (Stenodus leucichthys) (Gldenstdt, 1772).

Тиляпия мозамбикская.

Выбор объекта исследования – Тиляпии мозамбикской, как модельного лабораторного тест-объекта, определен относительной простотой получения потомства в аквариальных условиях, возможностью подращивания до товарной массы в вырастных прудах и высокой биологической лабильностью.

Экспериментальные работы по характеристике влияния кислотного стресса на функциональное состояние тиляпии проводились в аквариальных условиях. Опытных и контрольных особей содержали в аквариумах объёмом 50 л. Плотность посадки личинок составляла 0,1 - 0, 2 г/м3. Она изменялась по мере их роста и достигала у мальков 0,4-1,3 г/м3. Вода в аквариумах постоянно аэрировалась с помощью воздушных компрессоров. На протяжении всех экспериментов выдерживали оптимальный для молоди тиляпии  температурный режим (25-27С0). Отстоянная  вода имела рН 7,0 – 7,2. Для её подкисления до рН 4,5- 5,0 использовали маточный раствор серной кислоты в разведении 1:100. Рыб постоянно содержали  при пониженной рН воды, начиная с возраста, равного 8 суткам. Повторность опытов двукратная. Полную замену воды проводили по утрам (в 1000) до начала первого кормления рыб. В конце светового дня из аквариумов удаляли остатки корма, что позволило добиваться большей стабильности рН в ночное время. С целью корректировки рН воды, как в опыте, так и в контроле проводили регулярное измерение рН с помощью прибора Ecoscan. Содержание кислорода в воде измеряли с помощью термооксиметра.

В качестве стрессорного воздействия на гормональный статус, реверсию пола, темп роста и выживаемость молоди тиляпии применялся синтетический андроген – метилтестостерон (метилтестостерон-17-метиландростен-4ол-17--он-3) (МT) (Goldline, U.S.), вводимый per os. Его добавляли в корм из расчета 5 мг (первй вариант), 10 мг (второй вариант), 15 мг (третий вариант) на килограмм корма. Так как МТ практически не растворим в воде, таблетки МТ измельчали и смешивали с небольшим количеством растительного масла. Полученную суспензию добавляли в килечный фарш и сухой гранулированный корм, разработанный М.В.Михайловой с соавт., 2001 (КаспНИРХ). Однодневных личинок помещали в аквариумы объёмом 30 л по 100 особей в каждый и при переходе на активное питание начинали кормить смесью с добавлением гормона (I, II, III вариант) и обычным кормом (контроль) в течение 4 недель. В дальнейшем молодь тиляпии кормили обычным кормом. Половую принадлежность у экспериментальных рыб определяли на 8 месяце жизни по строению полового сосочка.

Молодь кумжи в количестве 20 особей средней длиной 55 мм подверглась следующим стрессирующим условиям:

1. Транспортировка рыбы. Проводилась в пакетах с кислородом, водой и льдом с высокогорной вырастной базы на реке Терек (Дагестан) в аквариальный комплекс ФГУП «КаспНИРХ»; длительность перевозки составила около 8 часов.
2. Пересадка. Осуществлялась в аквариум объемом 200 л.
3. Повышенное значение температуры воды в аквариуме колебалось в пределах 25-260С.

Экспериментальные работы с производителями севрюги проводились на Кизанском ОРЗ при повышенной температуре (26-27С) речной воды (термо-стресс). После транспортировки в течение 5 часов в живорыбной прорези (краудинг-стресс) все выжившие производители севрюги (8 из 10 особей) были проинъецированы коммерческим Цитохромом-С (САМСОН-МЕД) из расчета 0,29 мл на 1 кг массы рыбы (0,725 мг чистого препарата).

Для проведения экспериментальных работ по повышению адаптационных возможностей молодь севрюги подращивали в течение 10 дней в воде, содержащей малые (0,0125 мг/м3) концентрации Цитохрома-С, в условиях стресса голодания.

Полевые работы с самками русского осетра проводились в 2008, 2009 годах на Кизанском и Лебяжьем осетровых рыбоводных заводах (КОРЗ, ЛОРЗ) в условиях хэндлинг-стресса. В общей сложности исследовано 57 особей. Они были разделены на 3 группы по показателям фертильности: первая группа – фертильность 0%, вторая группа – фертильность 1,4% и третья группа – фертильность 94,1%.

Самки белорыбицы (семейство лососёвые)

Рыбы отлавливались при заходе из моря в Волгу и далее через каждые 1,5 месяца в предплотинной зоне Волгоградской ГЭС (прерванная нерестовая миграция), вплоть до нереста (ноябрь месяц). Данные были систематизированы, подверглись статистическому, регрессионному и дифференциальному анализам. Особое внимание было уделено выявлению тесноты связи уровня интегрального физиологического параметра СОЭ с температурой окружающей среды и физиолого-биологическими показателями (гонадо-соматический индекс, уровень общего сывороточного белка, коллоидоустойчивость сывороточного белка (КСБ), концентрация гемоглобина).

В общей сложности анализу подверглись около 400 самок белорыбицы в период нерестовой миграции и в условиях Александровского рыбоводного завода.

Таблица 1

Виды стрессорных воздействий и применяемые методики

на различных видах рыб

	Вид рыбы	Количество исследуемых рыб	Вид стрессорного воздействия	Используемые методики
	Тиляпия	520	Кислотный стресс; Гормональный стресс	Определение глюкозы в водных вытяжках из мышечной ткани проводили с помощью цветной реакции с орто-толуидином (Кондрахин с соавт., 1985). Измерение содержания креатини-на в супернатанте мышц осу-ществляли цветной реакцией Яффе (Кондрахин с соавт., 1985). Концентрацию ионов аммония определяли колориметрически с использованием реактива Несслера (Агатова, Зубаревич, 1991).
	Каспийская кумжа	20	Длительная транспортировка хэндлинг-стресс	Вода барьерной солёности в 5‰.
	Севрюга	122 (из них 80 молодь)	Термо-краудинг-стрессы; стресс голодания	Содержание свободнореагирую-щих сульфгидрильных групп в водных мышечных вытяжках определяли фотоколориметричес-ким ультра-микрометодом по В.Ф. Фоломееву (1981) в модификации В.М. Кычанова с соавт., (1986). Концентрацию триглицеридов в сыворотке крови и мышечном супернатанте определяли энзимати-ческим колориметрическим способом (Trinder, 1969).
Русский осетр		57	Хэндлинг-стресс	Белковые фракции сыворотки крови определяли турбидиметри-ческим методом (Кондрахин, 1985). Уровень -липопротеидов оценивали по Бурштейну (Кычанов, Попов, 1974) Расчетный параметр Т/ОСБ измеряли по схеме, предложенной В.М. Кычановым (2003). Количественный анализ холестерина в сыворотке крови и мышечном супернатанта проводили по методу Мрскоса и Товарека (Тодоров, 1963).
Белорыбица		400	Миграция (стресс голодания)	Концентрацию общего сывороточного белка (ОСБ) определяли рефрактометрически с помощью рефрактометра – ИРФ-22; ИРФ 454 Б (Шелухин, 1974; Кычанов, 2003). Уровень коллоидоустойчивости сывороточных белков (КСБ) устанавливали по Вельтману (Тодоров, 1963) и по способам Гераскина, Кычанова, (1997); Кычанова, (2003). Концентрацию гемоглобина измеряли фотометрическим методом. СОЭ оценивали по методу Панченкова Стадию зрелости ооцитов определяли на основании гистологического анализа (Кычанов, Володина, 1985). Определение уровня фертильности – относительного содержания оплодотворённой икры на 3 – 4 сутки после искусственного осеменения.

Математический анализ результатов исследований проведён в информационно-вычислительном центре КаспНИРХа по программам «OREGAN», «REGRESS-30».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Тестирование функционального состояния рыб (на примере тиляпии) в условиях закисления водной среды

Выдерживание молоди тиляпии в воде с pH 4,5-5,0 достоверно (р < 0,05) замедляло интенсивность их роста. После завершения серии опытов (возраст молоди - 60 суток) средняя масса тела у этих рыб была в два с лишним раза меньше, чем у контрольных особей (табл. 2).

Таблица 2

Изменение средней массы тела тиляпии в течение опыта (M±m, мг)

Возраст (сутки)	8	20	30	45	60
Контроль	13,0 ± 0,40	83,0 ± 3,00	105,0 ± 9,00	595,0 ± 27,00	1830,0 ± 77,00
Опыт	13,0 ± 0,40	44,0 ± 2,00	58,0 ± 4,00	172,0 ± 34,00	860,0 ± 43,00

Анализ прироста массы тела молоди тиляпии позволяет судить о негативном влиянии пониженных величин рН воды (4,5-5,0 в эксперименте и pH 7,0 – 7,2 в контроле) на этот показатель.

Изменение концентрации глюкозы в водных вытяжках из мышечной ткани довольно тесно коррелирует со временем содержания молоди тиляпии в подкисленной воде (рис. 1).

Рис. 1. Изменение концентрации глюкозы в мышцах тиляпии в условиях кислотного стресса (pH 4,5-5,0).

Уравнение регрессии: У = 13,66 + 0, 405 Х – 0, 0079Х2; = 0, 71.

Изменение концентрации глюкозы в супренатанте мышц носит фазовый характер. В фазу тревоги, когда в крови повышается концентрация катехоламинов, глюкортикоидов и инсулина, активизируется углеводный обмен, за счёт усиления гликогенолиза. Усиление активности фосфорилазы в печени приводит к распаду гликогена и возрастает уровень глюкозы в крови. Она под влиянием инсулина направляется в переферические ткани, преимущественно в мышцы. Одновременно повышается жиромобилизирующий эффект. Происходит переключение энергетического обмена с углеводного на липидный. В этот период источник углеводов гликонеогенез (расходуются на энергетические нужды аминокислоты). При длительном содержании в воде с pH 4,5-5,0 концентрация креатинина в водных вытяжках из мышечной ткани постоянно возрастает (рис.2). Повышение содержания креатинина в водных вытяжках из мышц является прямым отражением повышения креатинфосфата. Это компенсирует острый дефицит глюкозы (конец фазы резистентности и начало фазы истощения). Базой энергетического обмена становится гликонеогенез.

Рис. 2. Изменение содержания креатинина в мышечной ткани молоди тиляпии в условиях кислотного стресса (pH 4,5-5,0).

Уравнение регрессии: У= 7, 56 – 0, 0062Х + 0, 0017Х2 = 0,93

Таким образом, закисление водной среды в результате эколого-техногенного стресса может привести к серьёзным изменениям в организме рыб и даже к элиминации целых популяций. Это особенно актуально в условиях Астраханской области, где на её территории располагается и интенсивно эксплуатируется крупное газоконденсатное месторождение углеводородов. Выбрасывающиеся в атмосферу окислы серы (SO2) при соединении с парами воды могут превратиться в серную кислоту.

Гормональная реверсия пола у рыб (на примере тиляпии)

Повышение эффективности рыбоводных процессов является основой экономического процветания отрасли. В этом аспекте следует упомянуть о гормональном регулировании полового соотношения как аборигенной ихтиофауны, так и акклиматизантов. Одним из них является тиляпия.

В начале эксперимента темп роста молоди тиляпии был замедлен в первом варианте (I) и в контроле; во втором варианте (II), получавшем 10 мг МТ/1кг корма, привыкание к корму произошло довольно в короткие сроки (3-5 дней), что сказалось на увеличении их массы тела (табл. 3).

При использовании гормональной диеты, у тиляпии во втором (II) и третьем (III) вариантах опыта отмечался статистически достоверный (р < 0,05) ускоренный рост, что может свидетельствовать о возможном положительном воздействии гормонального препарата на её линейно-соматические характеристики.

Выживание в течение всего периода эксперимента во всех его вариантах существенно не отличались от контроля.

Таблица 3

Выживаемость и темп роста тиляпии в период экспериментального кормления рыб МТ

	Варианты опыта
	I	II	III	контроль
2 неделя длина (мм)	11,8 ± 0,30	14,0 ±0,25	13,5 ±0,21	10,6 ± 0,26
масса (г)	0,023 ±0,002	0,042±0,001	0,036±0,002	0,021 ±0,002
Выживаемость, %	100	99	100	100
3 неделя длина (мм)	13,7± 0,40	19,1± 0,83	15,6 ± 0,72	13,8 ± 0,60
масса (г)	0,039 ±0,004	0,096±0,012	0,059±0,005	0,041 ± 0,005
Выживаемость, %	90	89	94	97
4 неделя длина (мм)	14,4 ± 0,48	19,7 ± 0,62	16,8 ± 0,31	14,4 ± 0,57
масса (г)	0,045 ±0,004	0,010 ± 0,001	0,063±0,002	0,044 ± 0,004
Выживаемость, %	80	71	74	91
8 месяцев длина (мм)	13,0 ± 0,71	14,7 ± 0,30	15,6 ± 0,14	11,6 ± 0,72
масса (г)	36,3 ± 3,74	55,5 ± 2,67	60,7 ± 3,62	27,1± 1,67
Выживаемость, %	56	51	59	60

В результате проведённых опытов выявлено характерное влияние МТ на половую детерминацию рыб. В III варианте, количество самцов достигало 97%, против 31% в контроле (табл. 4).

Таблица 4

6. Половой состав тиляпии при воздействии МТ, (%)

Половая принадлежность	Варианты опыта
	I	II	III	контроль
	95	95	97	31
	5	5	3	69

Опыты по её культивированию в прудовых условиях Астраханской области имели обнадёживающие результаты (Казанцева и др., 2007). Надо отметить, что самцы тиляпии имеют более высокий темп роста, чем самки, и это обстоятельство делает их экономически более предпочтительными для товарного рыбоводства. В зарубежной и отечественной литературе имеются сведения о реверсии пола в культуре лососёвых и окунёвых рыб (Simpson, Johnston, Youngson, 1976; Johnston, Simpson, Youngson, 1978; Гомельский, 1980; Nakamura, 1981; Nagy et al., 1981;Yamazuki, 1983) нами же были предприняты успешные попытки реверсии пола у тиляпии. Это позволит решить проблему массового получения посадочного материала, состоящего из самцов.

Таким образом, гормональное регулирование полового соотношения у тиляпии, в пользу самцов, может дать возможность получить в аридных условиях Астраханской области товарную продукцию высоких качества уже на первом году жизни.

Протекторное действие отдельных химических соединений

на организм рыб.

Влияние протопорфирина (Цитохрома-С)

на физиологическое состояние самок севрюги

Результаты проведенных работ показали, что из всех отловленных при критической температуре воды (26-270С) производителей севрюги, подвергшихся во время транспортировки (в течение 5 часов) в живорыбных прорезях жёсткому хэндлинг- и краудинг-стрессу, выжило 80%. Спустя сутки после предварительной инъекции Цитохромом-С (0,29 мл чистого препарата на 1 кг массы рыбы, что соответствует 0,725 мг чистого препарата) и последующей гипофизарной инъекции самок половые продукты (со средним уровнем фертильности равным 45%) удалось получить от 50% рыб.

Сравнение физиолого-биохимических показателей самок севрюги после гипофизарной инъекции выявило у благополучных самок (первая группа) пониженный уровень -глобулинов. Что, по-видимому, связано с влиянием Цитохрома-С на процесс завершения созревания и перехода в пограничное состояние между V и VI стадиями зрелости гонад. У второй группы рыб не произошло заметных изменений, что может быть следствием их незрелости. Таким образом, действие препарата оказалось более эффективным для первой группы самок.

Влияние воды барьерной солёности на функциональное состояние пестряток каспийской кумжи

Молодь кумжи в количестве 20 экземпляров средней длиной 55 мм транспортировали в пакетах с кислородом, водой и льдом с высокогорной вырастной базы на реке Терек (Дагестан) в аквариальный комплекс ФГУП «КаспНИРХ». Перевозка заняла около 8 часов. При пересадке в 200-литровый аквариум с водой температурой 25 – 260С в течение короткого времени (14-20 мин.) погибло 50% особей кумжи. У оставшихся в живых рыбок почти полностью отсутствовала тактильная чувствительность и координация движений. Они спонтанно переносились током воды. После быстрого доведения поваренной солью солёности в аквариумах до 5‰ картина поведения молоди кардинально изменилась: пестрятки приобрели характерное для них поведение. Отход полностью прекратился. Через неделю пестрятки стали превращаться в серебрянок, которые отличались высокой двигательной активностью, острой реакцией на внешние раздражители, эффективным потреблением сухих и живых кормов

Молодь севрюги

Анализ физиологического состояния молоди севрюги, полученной от опытных самок, позволил отметить у рыб, содержащихся в воде с малым количеством метилтестостерона (0,0125 мг/л), более высокие уровни холестерина, глюкозы и альбуминов. Все эти вещества активно участвуют в метаболических процессах и свидетельствуют о стрессовой устойчивости организма. В опытах с голоданием в течение одной недели у рыб, предварительно подвергавшихся воздействию Цитохрома-С, значительно снизился уровень альбуминовой фракции в супернатанте. Их функциональную роль по переносу различных веществ взяли на себя -глобулины. У контрольной группы рыб компенсаторные функции водорастворимых белков мышечных вытяжек не активизировались.

Функциональное состояние самок русского осетра с различными рыбоводными характеристиками

Анализ относительного содержания альбуминов у исследованных самок русского осетра показал, что первая группа рыб достоверно отличается от второй и третьей более низким его уровнем (табл. 5, 6). Вместе с этим, следует отметить, что по концентрации общего сывороточного белка все группы самок осетра не имели достоверных различий. Такая ситуация может сложиться в результате перераспределения физиологической нагрузки сывороточных белков.

Таблица 5

Физиолого-биохимические показатели сыворотки крови самок осетра с различной фертильностью (М ± m)

Показатели	Группа 1. Фертильность 0 %	Группа 2. Фертильность 1,4%	Группа 3. Фертильность 94,1 %
Общий сывороточный белок (г %)	2,5 ± 0,2	2,5 ± 0,2*	2,6 ± 0,1*
Относительный уровень альбуминов, %	20,9 ± 2,6	27,6 ± 1,1**	29,0 ± 2,1**
Относительный уровень –глобулинов, %	18,5 ± 2,2	29,3 ± 2,0*	23,4 ± 2,7*
Относительный уровень – глобулинов, %	35,0 ± 1,7	23,9 ± 1,9**	26,4 ± 2,1**
Относительный уровень –глобулинов, %	25,6 ± 2,6	25,2 ± 2,0*	22,2 ± 2,9*

Примечание: *P>0,05; ** P<0,05 относительно Группы 1.

При вскрытии у рыб первой группы в абдоминальной полости практически не обнаружено овариальной жидкости. У самок второй и третьей групп овариальная жидкость присутствовала в достаточном количестве. В результате анализа отмечена достоверная тесная связь уровня фертильности самок осетра с относительным содержанием сывороточных -глобулинов (рис. 3). У самок русского осетра в преднерестовый период уровень -глобулинов достигает своего минимума.

Рис. 3. Зависимость уровня фертильности самок осетра от относительного содержания -глобулинов в сыворотке крови

Уравнение регрессии: У = 2911, 9 - 277,0 Х + 6, 66 Х2 ;

Снижение сывороточных – и -глобулинов являющихся переносчиками жиров, углеводов, жирорастворимых витаминов, гормонов, холестерина, свидетельствует о голодании самок в преднерестовый период. Таким образом, содержание альбумина в крови тесно связано с функцией питания, интенсивностью обмена, с темпом роста и половой зрелостью рыб.

Другим показателем, тесно коррелирующим с уровнем фертильности самок осетра, является относительное содержание сывороточных –глобулинов (рис.4). Высокомолекулярные белки -глобулиновой фракции имеют низкую анодную подвижность и выполняют иммунную роль в организме, являясь антителами ко многим антигенам.

Установлено, что количество и соотношение белков сыворотки крови является динамическим, оно создаётся в результате постоянного обмена белков между печенью и кровью за счёт распада старых белков и синтеза новых. По данным О. М. Валедской (2005) существует связь некоторых параметров иммунитета самок севрюги (в частности иммуноглобулиноов) с процентом оплодотворения полученной от них икры. Это хорошо согласуется с полученными нами данными.

Сдвиги в белковом составе сыворотки крови часто наступают гораздо раньше других физиологических изменений. Это позволяет использовать различные методы идентификации фракционного состава сывороточных белков для оценки функционального состояния производителей различных видов рыб, используемых для целей искусственного воспроизводства.

Рис. 4. Зависимость уровня фертильности самок осетра от относительного содержания -глобулинов сыворотки крови

Уравнение регрессии: У= 470, 72 – 23, 43 Х + 0, 29 Х2 ;

К. Ф. Сорвачёв (1957, 1982) в своих работах показал, что голодание карпа в течение длительного времени способно снизить концентрацию общего сывороточного белка более чем в два раза. В наших исследованиях регрессионный анализ позволил выявить достаточно тесную связь между фертильностью и концентрацией сывороточного холестерина у самок русского осетра R2 = 0,75; Р<0,05. Для того, чтобы понять более тонкие особенности белкового обмена у рыб, мы исследовали не только содержание общего сывороточного белка, но и его основные фракции.

Физиолого-биохимические особенности скорости оседания эритроцитов у белорыбицы

В. И. Лукьяненко, В. С. Гапонов (1968), В. С. Гапонов (1974 а, б, в), Г. Ф. Металлов, П. П. Гераскин, В. П. Аксёнов (1997) показали, что уровень СОЭ является высоко лабильным тестом, тонко отражающим особенности функционального состояния осетровых рыб. В отношении белорыбицы по этому показателю имеются лишь две работы, в которых отмечены различия уровня СОЭ у рыб весенней, осенней заготовок и у производителей содержавшихся в бассейнах различных рыбоводных заводов (Кычанов, Соколова, Остроухова, 1974; Кычанов, 1975).

В нашем исследовании обнаружена тесная корреляционная связь величины СОЭ с гонадосоматическим индексом (ГСИ) (рис.5). Прослеживается связь со стадиями зрелости гонад. При переходе от 2-3 стадии к 3 стадии наблюдается повышение содержания -глобулинов. 3 - 4 стадии испытывают снижение из-за их дефицита в крови.

Рис.5. Связь величины СОЭ и гонадо-соматического индекса у белорыбицы.

Уравнение регрессии: у = 0,9996 +0,5553х – 0,0459х2 + 0,0011х3

Таким образом, уровень СОЭ – 2,8 мм/ч сигнализирует о завершении накопления белково-липидных компонентов в гонадах белорыбицы.

В этой связи целесообразно рассмотреть связь изменений концентрации общего сывороточного белка (ОСБ) и СОЭ (рис. 6).

Рис. 6. Динамика уровня СОЭ у белорыбицы в зависимости от ОСБ

Уравнение регрессии: у = – 8,137 + 5,2108 х – 0,7029х2 + 0,0278х3;

Уровень СОЭ закономерно понижается. Это связано с полным истощением в крови пластических материалов, какими являются сывороточные белки, в связи с дефицитом экзогенного питания. Происходит изменение спектра сывороточных белков из-за снижения относительного уровня наиболее подвижных и лёгких альбуминов.

Рис. 7. Зависимость величины СОЭ от концентрации гемоглобина

в крови самок белорыбицы

Уравнение регрессии: у = 16,88 – 7,302х + 1,325х2 – 0,0833х3 ;

В связи с тем, что СОЭ является гематологическим показателем, вполне определённый интерес представляет его связь с уровнем содержания в крови общего гемоглобина. Данная математическая зависимость представлена на рисунке 7.

Повышение концентрации гемоглобина связано с низкими величинами СОЭ. Это, прежде всего, связано с голоданием и переходом на эндогенное питание. Чем выше вязкость крови, тем ниже скорость оседания эритроцитов.

В результате анализа материалов полевых исследований выявлена достоверная тесная связь уровня фертильности самок белорыбицы с величиной СОЭ (рис. 8).

Используя данную зависимость, можно оценить уровни фертильности самок при максимальной (4,5 мм/ч ~ 16%) и минимальной величине СОЭ (1,5 мм/час ~ 92%), что соответствует нашим эмпирическим наблюдениям.

СОЭ обратно пропорционально фертильности. Рыбы с низкими показателями величины СОЭ обладают более высокими пластическими веществами, они менее истощены. Полноценно во время нерестовой компании развиты половые продукты, большое количество овариальной жидкости.

Рис. 8. Связь уровня фертильности самок белорыбицы с величиной СОЭ

Уравнение регрессии: у = 57 + 39,25х – 10,75х2

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оценка негативных последствий стресса различного генеза, их купирование у ценных в хозяйственном отношении видов рыб, принадлежащих к различным филогенетическим и экологическим группам (лососевые, осетровые, цихловые виды рыб) является важной актуальной проблемой. В условиях интенсивной аквакультуры наиболее часто встречающимися стрессорами антропогенной природы являются: хэндлинг (различные манипуляции с рыбой в процессе искусственного разведения), краудинг- стресс (стресс перенаселения), голодание, негативное воздействие факторов внешней среды (Скопичев, Максимюк 2009; Сеин, Жеребилов, 2009; Силкина, Микряков, Микряков, 2009; Моисеенко, 2010).

В качестве универсального тест-объекта при кислотном стрессе у рыб была использована тиляпия. Её отличает относительная простота получения потомства в аквариальных условиях, возможность подращивания до товарной массы в вырастных прудах, высокая физиологическая и биологическая лабильность.

В результате проведенных исследований по моделированию кислотного стресса у тиляпии обнаружено специфическое нарушение метаболических процессов.

При низком уровне рН воды возрастает сопротивление транспорту аммония. Его концентрация в воде снижается. В таких случаях расстройство ионной регуляции выражается в торможении роста рыб и может закончиться летальным исходом, что согласуется с данными МсDonald et al., 1980; 1983. В этих условиях изменение концентрации глюкозы в супернатанте мышц носит по Г. Селье фазовый характер. В конце эксперимента наблюдается резкое снижение содержания глюкозы в водных вытяжках из мышц. Это характерно для выраженной фазы истощения и летального исхода. При содержании тиляпии в подкисленной среде концентрация креатинина в водных вытяжках из мышечной ткани постоянно возрастает, отражая нарушение энергетического обмена.

Введение в рацион синтетического андрогена оказало выраженное влияние на половую детерминацию индифферентной молоди тиляпии, что проявлялось увеличением доли самцов в опыте 97%. Это обстоятельство открывает широкую перспективу гормональной индукции половой принадлежности рыб при ведении интенсивной товарной аквакультуры.

Анализ результатов проведённых исследований показал, что применение метилтестостерона способствует формированию у подавляющего большинства рыб обратно пропорциональной зависимости СОЭ от фертильности. Рыбы с низкими показателями величины СОЭ обладают более высокими пластическими веществами, они менее истощены. Полноценно во время нерестовой компании развиты половые продукты, большое количество овариальной жидкости. Рыбы, содержащиеся в аквариальных условиях, в значительно меньшей стадии расходуют резервные пластические и энергетические материалы на поддержание жизнедеятельности, чем рыбы обитающие в нестабильных естественных гидролого- гидрохимических условиях.

В области аквакультуры любой вид деятельности сопряжён с различными негативными воздействиями на организм культивируемых гидробионтов. Наиболее «жёсткими» из них являются хэндлинг- и краудинг-стрессы, являющиеся обычным явлением при транспортировке молоди и взрослых рыб. Он угнетает способность рыб поддерживать гомеостаз и снижает уровень физиологических реакций, необходимых для выживания, роста и воспроизводства. Испытания раствора поваренной соли барьерной солёности (концентрацией 5‰) в качестве адаптогена вызвало полное прекращение отхода у пестряток каспийской кумжи в условиях острого хэндлинг- и краудинг стресса. Уже через неделю пестрятки каспийской кумжи стали превращаться в серебрянок, которые отличались высокой двигательной активностью, острой реакцией на внешние раздражители, эффективным потреблением сухих и живых кормов, проявляя эффект биопротекции и акселерации. Можно полагать, что 5‰-ный раствор поваренной соли эффективен в качестве биопротектора при подращивании и транспортировке молоди.

Физиолого-биохимические параметры сыворотки крови самок русского осетра с различной фертильностью в условиях хэндлинг-стресса у рыб с незрелыми половыми продуктами достоверно отличались от созревших самок более низким относительным уровнем альбуминов. Исследование белкового обмена самок русского осетра с различной фертильностью: с нулевой, низкой и высокой фертильностью показало, что первая группа рыб достоверно отличалась от второй и третьей групп самок осетра по относительному уровню белковых фракций. Снижение содержания альбуминов в крови, в первую очередь, зависит от снижения интенсивности их синтеза в печени. Основной белковой фракцией, расходуемой при голодании, являются альбумины. Проходные осетровые Волго-Каспийского региона после захода на нерест в Волгу практически не питаются. Целый ряд исследователей отмечают, что соотношение отдельных фракций крови рыб отражает состояние зрелости их половых продуктов (Шатуновский, 1967; Thurston, 1967; Pesch, 1970; Карпюк, 2006). Однако характер изменений уровня этих фракций сывороточных белков индивидуален для каждого вида.

В результате физиолого-биохимического корреляционного и регрессионного анализов выявлено, что из всех исследованных тестов наиболее тесно с уровнем фертильности самок русского осетра коррелирует относительное содержание сывороточных -глобулинов (г=0,98 при Р<0,05). В -глобулиновую фракцию белков входят различные антитела, играющие защитную роль. Их высокое содержание характеризует повышенную резистентность организма самок русского осетра к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам. Показатель уровня сывороточных -глобулинов может использоваться для оценки потенциальной фертильности самок русского осетра.

В качестве нового адаптогена в аквакультуре испытано действие на функциональное состояние производителей и молоди севрюги Цитохрома-С. Он является одним из основных окислительно-восстановительных ферментов дыхательной цепи. Железо простетической группы Цитохрома-С обратимо переходит из окисленной в восстановленную форму. В медицинской практике препарат используется для ликвидации последствий и предупреждения различных форм тканевой гипоксии при развитии общего адаптационного синдрома по Г. Селье (1982). Цитохром-С позволяет купировать негативные последствия термо- и краудинг-стрессов у производителей севрюги и повышает стрессовую устойчивость ее молоди. В результате воздействия Цитохрома-С при экстремально высокой температуре воды (27-28°С) удалось получить половые продукты от 50% самок. У молоди севрюги, которая находится в воде с содержанием малых концентраций Цитохрома-С, обнаружено более высокое, в сравнении с контролем, содержание глюкозы, холестерина, альбумина, что отражает повышенный уровень обменных процессов.

Нерестовая миграция проходных рыб и, в частности белорыбицы, является стресс фактором (Поленов, 1983; Лукьяненко, Дубинин, Сухопарова, 1990). В этом случае общий адаптационный синдром протекает по классической трёхфазовой схеме. Он, в первую очередь, обусловлен комплексом лимитирующих гидролого-гидрохимических факторов, из которых решающую роль играет температурный режим водной среды. Его повышенный уровень особенно негативно сказывается на физиологическом состоянии арктического по происхождению вида -белорыбицы (у неё прерванная нерестовая миграция длится с ранней весны до конца октября) и севрюги поздних сроков захода в Волгу на нерест. В этой связи, наблюдается резкое ухудшение рыбоводного качества заготавливаемых производителей. Особое внимание было уделено выявлению тесноты связи уровня интегрального физиологического параметра СОЭ с температурой окружающей среды и физиолого-биологическими показателями (гонадо-соматический индекс, уровень общего сывороточного белка, коллоидоустойчивость сывороточного белка, концентрация гемоглобина). Именно этот анализ явился предпосылкой для разработки в условиях осетрового рыбоводного завода (АОРЗ) относительно простого в исполнении и надёжного биологического теста прогнозирования репродуктивного потенциала самок белорыбицы (уровня СОЭ).

ВЫВОДЫ

1. В экспериментальных условиях кислотного стресса обнаружено специфическое нарушение метаболических процессов у тиляпии, которое стало причиной торможения роста и повышенного отхода рыб. При длительном содержании в воде с пониженными значениями рН (4,5-5,0) концентрация креатинина в супернатанте мышц тиляпии постоянно возрастает, отражая особенности обменных процессов в период гликонеогенеза.

2. Введение в рацион синтетического андрогена влияет на половую детерминацию молоди тиляпии. В вариантах с использованием гормональной диеты количество самцов достигало 97% против контроля – 31%.

3. Испытанный в качестве адаптогена раствор поваренной соли концентрацией 5‰ сыграл роль эффективного акселератора роста у пестряток каспийской кумжи и вызвал их досрочное серебрение.

4. Инъецирование производителей севрюги Цитохромом-С (из расчета 0,29 мл препарата на 1 кг массы рыбы) позволяет купировать негативные последствия термо- и краудинг-стрессов. В результате этого удалось получить половые продукты от 50% самок севрюги при экстремально высокой (26-270С) температуре водной среды (без предварительной адаптации).

5. У молоди севрюги, содержавшейся в воде с малыми концентрациями Цитохрома-С (0,0125 мг/м3) отмечена повышенная стрессовая устойчивость, что позволяет рекомендовать использовать Цитохром-С в качестве эффективного адаптогена.

6. Исследование физиолого-биохимических параметров сыворотки крови самок русского осетра с различной фертильностью в условиях хэндлинг-стресса показало, что рыбы с незрелыми половыми продуктами достоверно отличались от созревших самок более низким относительным уровнем альбуминов.

7. У заводских самок белорыбицы в период нерестовой кампании уровень СОЭ обратно пропорционален фертильности. Снижение коллоидоустойчивости связано с изменением структуры сывороточных белков и зависит от соотношения альбуминов и глобулинов. Значение СОЭ сигнализирует о процессе завершения накопления белково-липидных компонентов. В результате регрессионного и корреляционного анализов удалось выявить тесную связь величины фертильности самок русского осетра с относительным уровнем - ( = 0, 89; Р < 0,05) и -глобулинов ( =0, 98 ; P < 0,05 ).

Практические рекомендации

1. В заводском воспроизводстве ценных видов рыб использовать интегральный показатель функционального состояния (СОЭ) и относительное содержание -глобулинов, позволяющих эффективно прогнозировать репродуктивный потенциал производителей.

2. Добавлять в рацион метилтестостерон из расчёта 15 мг на 1 кг корма для гормональной индукции половой принадлежности молоди тиляпии с повышенным выходом самцов.

3. Воздействовать Цитохромом-С (из расчёта 0,29 мл препарата на 1 кг массы производителей севрюги и концентрацией препарата 0,0125 мг/м3 на её молодь) с целью повышения их резистентности к различным видам стресса.

4. Перед выпуском подрощенной в заводских условиях молоди каспийского лосося выдерживать её в солоноватой воде для завершения процесса смолтификации и повышения промыслового возврата.

Список публикаций по теме диссертации

1. Кычанова, А.В. Эффект влияния воды барьерной солености при хэндлинге и подращивании гидробионтов / А.В. Кычанова // Комплексные исследования биологических ресурсов южных морей и рек: материалы II Международной конф. (11-13 апреля 2007 г., г. Астрахань). – Астрахань, 2007. – С. 56-58.

2. Кычанова, А.В. Реакция ацидофикации водной среды / А.В.Кычанова, Е.С. Казанцева, В.М. Кычанов // Проблемы изучения, сохранения и восстановления водных биологических ресурсов в XXI веке: материалы докл. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 110-летию КаспНИРХ, 16-18 октября 2007 г., Астрахань, Россия. – Астрахань: КаспНИРХ, 2007. – С. 310-313.

3. Кычанова, А.В. Тиляпия как перспективный объект разведения в условиях Астраханской области / Е.С. Казанцева, Г.П. Даудова, П.В. Чернова, А.В. Кычанова, М.Е. Шишова // Тепловодная Аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата: материалы и доклады Междунар. Симпозиума, 16-18 апреля 2007 г. – Астрахань: АГТУ, 2007. – С. 115-117.

4. Кычанова, А.В. Гормональная реверсия пола у тиляпии (Tilapia) / Е.С. Казанцева, А.В. Кычанова // Проблемы изучения, сохранения и восстановления водных биологических ресурсов в XXI веке: Материалы докл. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 110-летию КаспНИРХа, 16-18 октября 2007 г., Астрахань, Россия. – Астрахань: КаспНИРХ, 2007. – С. 297-299.

5. Кычанова, А. В. Морфологический статус потомства осетровых на ранних стадиях онтогенеза / А.В. Кычанова, Е.С. Казанцева // Комплексный подход к проблеме сохранения и восстановления биоресурсов каспийского бассейна: материалы докл. Междунар. науч.- практ. конф., посвящ. 450-летию г. Астрахани, 13-16 октября 2008 г., Астрахань, Россия. – Астрахань: КаспНИРХ, 2008. – С. 369-371.

6. Кычанова, А.В. Влияние кислотного стресса на функциональное состояние рыб (на примере тиляпии) / В.Ф. Зайцев, А.В. Кычанова // Юг России: экология, развитие. – №3. – 2008. – С. 71-74.

7. Кычанова, А.В. Эколого-физиологическая оценка состояния объектов аквакультуры / Кычанов В.М., Кычанова А. В. // Астрахань, 2008. – 84 с. (монография)

8. Коротенко, А.В. Белковый обмен самок русского осетра с различными рыбоводными характеристиками / А.В. Коротенко, М.В. Лазько, В.М. Кычанов // Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии: материалы Международной конференции с элементами научной щколы для молодёжи (7-10 декабря 2010 г., г. Астрахань). – Астрахань, 2010. – С. 218-220.

9. Коротенко, А.В. Самки русского осетра с различными физиолого-рыбоводными характеристиками / А.В. Коротенко // Журнал фундаментальных и прикладных исследований. – Естественные науки, №1. – 2011. – с. 157-161.

10. Коротенко, А.В. Физиолого-биохимические аспекты тестирования репродукционного потенциала самок русского осетра в условиях аквакультуры / А.В. Коротенко, В.М. Кычанов // Журнал фундаментальных и прикладных исследований. – Естественные науки. – №1. – 2011. – С. 161-165.