Этиологическая структура, морфофункциональная характеристика эшерихиоза телят
На правах рукописи
МОТОРЫГИН АНТОН ВАЛЕРЬЕВИЧ
ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА,
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ЭШЕРИХИОЗА ТЕЛЯТ
06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией
и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
МОСКВА 2011
Работа выполнена на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП»), Министерства образования и науки РФ.
| Научный руководитель: | доктор ветеринарных наук, профессор Ленченко Екатерина Михайловна (ФГБОУ ВПО «МГУПП») |
| Официальные оппоненты: | доктор ветеринарных наук, профессор Скородумов Дмитрий Иванович (ФГБОУ ВПО «МГУПП») |
| кандидат ветеринарных наук, доцент Крупальник Виктор Леонидович (ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина) | |
| Ведущая организация: | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) |
Защита состоится « » 2011 г. в « » часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.09 в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».
Автореферат разослан 2011 г.
Автореферат размещен на сайте www.mgupp.ru 2011 г.
Автореферат отправлен для размещения на сайте
Министерства образования и науки РФ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук, доцент И.М. Нитяга
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В структуре неонатальной патологии крупного рогатого скота существенное место занимают болезни, клинически проявляющиеся диареей, дегидратацией, токсемией, в частности, в неблагополучных хозяйствах промышленного типа эшерихиозом заболевают до 80,0 % телят, отход животных колеблется в пределах от 28,0 до 65,0 % (Коляков Я.Е., 1970; Зароза В.Г., 1971; Сидоров М.А., 1972; Гительсон С.С., 1974; Пирожков М.К., 1986, 2002; Вартанян Г.Г., 1991; Воронин Е.С., Джупина С.И., 1991; Шишков В.П., Ставцева Л.Я. с соавт., 1991; Светоч Э.А., 1994; Черневская О.М., 1995; Субботин В.В., 1997; Тугаринов О.А., 1999; Девришов Д.А., 2000; Ленченко Е.М., 2000; Гаффаров Х.З., 2002; Сулейманов С.М., 2002; Паршин П.А., 2003; Довбыш В.С., 2004; Золотухин С.Н., 2005; Грязнева Т.Н., 2005; Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Пименов Н.В., 2005; Сусский Е.В., 2006; Шпонько Ю.Б., 2007; Онищенко И.С., 2008; Konowalchuk J. et al., 1977; Kunkel S.L. et al.,1979; Mlkelsaar M. et al., 1981; Hacker J. et al., 1983; Levine M. et al.,1983; Krieg N.R. et al., 1984; Pal C.H. et al. 1984; Allen S.D. et al., 1985; Levy S.P., 1986; Kraft H., 1987; Chapman P.A., 1989; Sanderson M.W. et al., 1999; Gerardin J. et al., 2000; Kang S.J. et al., 2004).
Циркулирующие в животноводческих объектах патогенные штаммы E.coli различаются антигенной структурой, включающей соматические О-антигены, капсульные полисахаридные К-антигены, жгутиковые Н-антигены (Светоч Э.А., 1994; Головко А.Н., 1996; Скородумов Д.И. и соавт., 2005; Пирожков М.К., 2011; Badouei M.A., 2009). Вариабельность антигенных свойств, множественность факторов патогенности, возникновение устойчивых форм бактерий за счет наличия плазмид резистентности значительно снижают эффективность антибактериальных препаратов. В этой связи для практической реализации научных достижений, в том числе и внедрения вакцин нового поколения, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью с широким спектром защитного действия, приоритетной задачей является изучение антигенных, вирулентных и токсигенных свойств изолятов Escherichia coli, вызывающих массовые желудочно-кишечные болезни телят и циркулирующих в репродукторных помещениях животноводческих хозяйств. Учитывая малоисследованность вопросов влияния токсинов эшерихий на инициацию, развитие и исход инфекционного процесса, целесообразным является дальнейшее изучение этиологической структуры и морфофункциональной характеристики эшерихиоза телят на основе подбора адекватных лабораторных моделей и тест-систем для оценки токсигенности, эффективных диагностических сред с селективными свойствами, микротест-систем для идентификации бактерий по ферментативным признакам, что и определило актуальность темы диссертационной работы.
Цель исследований: изучить этиологическую структуру и морфофункциональную характеристику эшерихиоза телят.
Задачи исследований:
- изучить распространенность и морфофункциональную характеристику желудочно-кишечных болезней телят в животноводческих хозяйствах Рязанской области;
- определить видовой и количественный состав энтеробактерий, доминирующих в микробиоценозах кишечника при желудочно-кишечных болезнях телят;
- определить чувствительность энтеробактерий к антибиотикам;
- изучить антигенную структуру изолятов Escherichia coli, выделенных от телят»;
- изучить патогенные, вирулентные и токсигенные свойства изолятов энтеробактерий, циркулирующих в животноводческих хозяйствах;
- изучить на восприимчивых лабораторных моделях динамику изменений морфологических, гематологических и иммунологических показателей при моделировании инфекционного процесса, обусловленного токсигенными энтеробактериями.
Научная новизна. В животноводческих хозяйствах Рязанской области при желудочно-кишечных болезнях телят из общего числа бактерий семейства Enterobacteriaceae в 74,0 % случаев выделены культуры микроорганизмов Escherichia coli. Среди изученных 64 изолятов наиболее распространены эшерихии 7 серологических групп: О8 (16,0 %), О28 (6,9 %), О35 (18,0 %), О66 (4,0 %); О110 (1,7 %), О115 (8,0 %), О126 (4,0 %). При оценке токсигенных свойств Escherichia coli, выделенных при желудочно-кишечных болезнях телят с применением лабораторных моделей, умереннотоксигенными и слаботоксигенными свойствами характеризовались 15,4 и 38,5 % изолятов соответственно, с применением тест-систем «VET-RPLA» и «VTEC-RPLA» было выявлено наличие энтеротоксина у 59,86 % эшерихий. При воспроизведении инфекционного процесса на лабораторных моделях установлена коррелятивная зависимость индекса колонизации от степени адгезивности изолятов Escherichia coli: у высокоадгезивных штаммов индекс колонизации – 0,65±0,10 %, у низкоадгезивных штаммов – 0,63±0,30 %. При экспериментальной токсемии, обусловленной токсином Escherichia coli, динамика патологических процессов характеризовалась развитием гидропической дистрофии эпителиоцитов ворсинок тонкого отдела кишечника и развитием общей сосудистой реакции микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка, тонкого и толстого отделов кишечника животных.
Практическая значимость работы. На основе экспериментального воспроизведения инфекционного процесса на лабораторных моделях разработаны «Методические рекомендации по количественно-качественному учету энтеробактерий», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 8 от 22 июня 2010 года). Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплинам: «Патологическая физиология» и «Эпизоотология».
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2008-2011 гг.); на Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (М., 2009); на VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2010); на III Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях» (М., 2011), работа удостоена медали «Лауреат ВВЦ» (удостоверение № 267 от 30.06.2011).
Основные положения, выносимые на защиту:
- количественный и видовой состав, чувствительность к антибиотикам энтеробактерий, доминирующим в микробиоценозах кишечника при желудочно-кишечных болезнях телят;
- антигенная структура изолятов Escherichia coli;
- патогенные, вирулентные и токсигенные свойства изолятов энтеробактерий, циркулирующих в животноводческих хозяйствах;
- эффективность тест-систем «VET-RPLA» и «VTEC-RPLA» для индикации энтеротоксинов и вероцитотоксинов Escherichia coli;
- динамика изменений гематологических, иммунологических и морфологических показателей при эшерихиозе телят
Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, в т.ч. 4 – в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, 2 приложений. Работа изложена на 154 страницах компьютерного текста, содержит 20 таблиц, 22 рисунка. Библиографический список включает 145 источников, из них 70 иностранных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена с 2008 по 2011 гг. на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП». Часть исследований проводилась в отделе качества и стандартизации иммунобиологических лекарственных средств для животных ФГБУ «ВГНКИ», на экспериментальной базе ОПХ ФГБУ «ВГНКИ» «Манихино». В опытах были использованы паспортизированные штаммы: Escherichia coli О9 №388; Escherichia coli О78 №320; Escherichia coli О115 №723; Klebsiella pneumonia №24; Salmonella typhimurium № 5715; Staphylococcus aureus № 123; Yersinia pseudotuberculosis № 290; Yersinia enterocolitica S- и R-формы №383, полученные из коллекции ФГБУ «ВГНКИ».
Диагноз «эшерихиоз» устанавливали на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и бактериологического исследования, в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных (2000); «Методическими рекомендациями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (М., 1999).
С целью выделения патогенных энтеробактерий исследовали патологический материал от телят (n=9), пробы feces больных телят (n=70); смывы со слизистых оболочек полости рта и носовой полости больных телят (n=26); смывы с объектов репродукторных помещений (n=20) животноводческих хозяйств Рязанской области (ООО «Колхоз имени Пряхина В.Г.», ООО «Семион-агро», ОАО АПК «Золотая Нива», колхоз «Шелковской»). Для изучения динамики инфекционного процесса, обусловленного патогенными энтеробактериями, были проведены исследования на лабораторных моделях: белые беспородные мыши (n=150); кролики породы «Chinchilla» (n=23); морские свинки породы «Self» (n=20).
Для определения количественного состава энтеробактерий в микробиоценозе кишечника животных определяли КОЕ микроорганизмов (lg/г) в 1 г методом разведения feces животных (Эпштейн-Литвак Р.В., 1969; Субботин В.В., 1999) и методом серийных разведений в 0,7 % -ном растворе МПА (Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 1999). Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили в соответствии с классификационной системой «Bergy s manual, 1984-1989». Биологические свойства микроорганизмов изучали, используя общепринятые методы (Герхардт Ф. и соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса и набора для ускоренной идентификации энтеробактерий «ENTERO-Rapid-24» («Lachema», Чехия).
Динамику изменений гематологических и биохимических показателей крови и сыворотки крови животных определяли на анализаторе крови «ВС-2800 vet», «BA-88a Mindray» (Китай). Концентрацию иммуноглобулинов класса G и С-реактивного белка определяли с помощью иммуноферментных наборов производства «Хема-Медика». Для определения антилизоцимной активности сыворотки крови в опыте использовали Micrococcus lysodeicticus, для определения бактерицидной активности – Е.сoli.
Серогрупповую принадлежность Е.сoli определяли в реакции агглютинации с диагностическими О-коли агглютинирующими сыворотками ФГУП «Армавирская биофабрика». Определение серогрупповой принадлежности изолятов E.coli, нетипирующихся стандартным набором сывороток, проводили методом получения агглютинирующих диагностических кроличьих сывороток с последующей идентификацией эталонными штаммами эшерихий.
Гемолитическую активность изолятов оценивали качественно, учитывая зоны просветления a- и -гемолиза вокруг колоний. Определение чувствительности изолированных микроорганизмов к антибиотикам изучали диско-диффузионным методом в агар (Навашин С.М., Фомина И.П., 1984).
Вирулентность культур микроорганизмов определяли путем внутри-брюшинного заражения белых мышей массой 14-16 г и выражали в LD50.
Индекс колонизации (ИК) микроорганизмов определяли общепринятыми методами (Скородумов Д.И. и соавт., 2008). Адгезивные свойства микроорганизмов изучали на эритроцитах барана, рассчитывая средний показатель адгезии (СПА) с использованием методики В.И. Брилис и соавт. (1986) в модификации И.Б. Павловой, Е.М. Ленченко (1999).
Для гистологического исследования материал от павших и вынужденно убитых животных фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, жидкости Карнуа, Кайзерлинга, Ценкера. Срезы окрашивали для общих целей гематоксилином и эозином; на соединительную и мышечную ткани – по Ван Гизону, по Маллори; на фибрин – по Шуенинову; на жир – суданом-3; на микроорганизмы – по Крантцу. Гистологические исследования проводили согласно методическим указаниям «Основы гистологии с гистологической техникой» (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971).
Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием методического руководства «Теория статистики» и программы «Statgraphics» (Шмойлова Р.А., 2006).
Выражаем благодарность д-ру вет. наук Склярову О.Д., д-ру вет. наук Пирожкову М.К. и канд. вет. наук Капустину А.В. за оказание консультативной помощи при определении антигенной структуры изолятов Escherichia coli, нетипирующихся набором стандартных «О-коли сывороток».
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Эпизоотологические данные и клинико-морфологическая характеристика желудочно-кишечных болезней телят
В период с 2008 по 2011 годы были проведены исследования в животноводческих хозяйствах Рязанской области (ООО «Колхоз имени Пряхина В.Г.», ООО «Семион-агро», ОАО АПК «Золотая Нива», колхоз «Шелковской»).
Диагноз на наличие болезней, вызываемых патогенными энтеробактериями, устанавливали на основании анализа эпизоотических данных, клинико-морфологических и бактериологических исследований. При проведении ретроспективного анализа эпизоотологической ситуации по инфекционным болезням крупного рогатого скота учитывали первичные данные ветеринарной отчетности с 2007 по 2010 гг.: «Журнал для записи противоэпизоотических мероприятий» форма № 2; «Журнал для записи эпизоотического состояния района» форма № 3; «Журнал серологического исследования крови» форма № 16. При анализе первичных данных установлено, что смертность телят 2–3-суточного возраста за период 2007-2010 гг. составила - 2,6–3,5 %: 2,6 % в 2007 году; 3,5 % в 2008 году; 2,9 % в 2009 году; 2,6 % в 2010 году. Летальность за период 2007-2010 гг. находилась в пределах от 2,9 до 5,2 %, из них 2,9 % в 2007 году; 4,2 % в 2008 году; 3,2 % в 2009 году; 5,2 % в 2010 году.
При анализе данных по структуре заболеваемости молодняка крупного рогатого скота установлено, что в Кораблинском и Старожиловском районах Рязанской области в 2007 году было зарегистрировано 34 больных теленка в возрасте до 5 суток, в 2008 году – 45, в 2009 году – 41, в 2010 году – 62.
Установлено, что из общего числа больных животных в возрасте до 5 суток в 2007 году случаев падежа животных с подтвержденным бактериологическим исследованиями диагнозом эшерихиоз было зарегистрировано – 21, что составило 61,7 % от общего числа болезней; в 2008 году – 26 (55,3 %); в 2009 году – 23 (54,7 %); в 2010 году – 35 (56,4 %). Из общего числа больных животных в возрасте до 5 суток в 2007 году было зарегистрировано 13 случаев падежа животных, с подтвержденным бактериологическими исследованиями диагнозом стрептококкоз, что составило 38,2 % от общего числа болезней, в 2008 году – 21 (44,6 %), в 2009 году – 18 (58,0 %), в 2010 году – 27 (43,5 %).
Удельный вес желудочно-кишечных болезней доминировал у телят в возрасте до 5 суток, при этом основным клиническим признаком являлась диарея, приводящая при подостром течении к развитию дегидратации и истощению.
3.2. Сравнительная характеристика дифференциально-диагностических сред и тест систем для индикации и идентификации возбудителя
эшерихиоза телят
В опытах с референтными штаммами энтеробактерий при изучении ростообеспечивающих свойств сред Эндо, Левина, «Cefixime Tellurite Sorbitol Macconkey agar» («SMAC agar»), «Crystal violet-neutral red-bile agar» («VRB agar»), «Brilliance E.coli coliform agar» установлено, что количество микроорганизмов E. coli, S. typhimurium, K. pneumoniae существенно не отличалось. В частности, при посеве суспензии, содержащей 100 клеток микроорганизмов, среднее количество колоний E.coli, выросших на среде Эндо, составило: 79,33+0,32; Левина – 83,33+0,18; на «SMAC agar» – 86,00+0,66; на «VRB agar» – 84,33+0,24; на «Brilliance E.coli coliform agar» – 84,43+0,27. Среднее количество колоний S. typhimurium составило: на среде Эндо 64,67+0,89; Левина – 61,33+0,43; «SMAC agar» – 68,00+0,36; «VRB agar» – 66,33+0,12, на «Brilliance E.coli coliform agar» – 62,67+0,89. Среднее количество колоний K. pneumoniae составило: на среде Эндо 64,33+0,29; Левина – 62,33+0,31; «SMAC agar» – 67,33+0,37; «VRB agar» – 76,33+0,46, на «Brilliance E.coli coliform agar» – 69,67+0,78.
Микроорганизмы E.coli через 18 ч на среде «SMAC agar» образовывали темно-красные колонии диаметром 1,0-2,0 мм; на «VRB agar» – темно-красного цвета колонии диаметром 1,5-2,5 мм с изменением цвета среды на малиновый. Микроорганизмы S.typhimurium на среде «SMAC agar» формировали бесцветные колонии диаметром 1,0-4,0 мм; на «VRB agar» – бледно-серые колонии диаметром 1,0-2,0 мм. Микроорганизмы K. pneumoniae через 18 ч на среде «SMAC agar» образовывали красно-розовые колонии диаметром 2,0-3,0 мм; на «VRB agar» – бело-розового цвета колони диаметром 1,5-2,5 мм.
При оценке дифференциально-диагностических свойств хромогенных сред «Brilliance E.coli coliform agar» и «TBX medium agar» установлено, что через 18 часов культивирования бактериальные клетки E. coli формировали темно-фиолетового цвета колонии диаметром 1,0-3,0 мм и сине-зленого цвета колонии диаметром 1,0-2,0 мм, соответственно.
Микроорганизмы S.typhimurium на средах «Brilliance E.coli coliform agar» и «TBX medium agar» формировали молочного цвета колонии диаметром 2,0-3,0 мм; микроорганизмы K. pneumoniae – лилового цвета колонии диаметром 2,0-3,0 мм и молочного цвета колонии диаметром 2,0-3,0 мм соответственно.
Преимущество хромогенных сред заключается в том, что за счет наличия субстратов «Rose-Gal» и «X-Glu» при первичной идентификации микроорганизмов колонии E.coli можно было дифференцировать от колоний таксономически сходных видов энтеробактерий.
В качестве дополнительного теста для подтверждения принадлежности выделенных культур микроорганизмов к семейству Enterobacteriaceae применяли тест-полоски «OXI-test» и «COLI-test». При определении оксидазы с помощью «OXI-test» при наличии энтеробактерий зона индикации тест-полоски приобретала синий цвет. При постановке «COLI-test» в пробирках с E.coli наблюдали голубое свечение при просмотре в ультрафиолетовых лучах, при добавлении 4-5 капель реактива для теста «индол» проявлялось красное окрашивание суспензии.
На основании изучения сравнительных характеристик диагностических питательных сред можно сделать вывод о том, что дифференциально-диагностические среды «Brilliance E.coli coliform agar» и «TBX medium agar» позволяют при подтверждении «COLI-test» «OXI-test» в течение 24 ч идентифицировать и дифференцировать Escherichia coli от таксономически сходных видов энтеробактерий.
3.3. Определение количественного и видового состава энтеробактерий,
доминирующих в микробиоценозах кишечника
при желудочно-кишечных болезнях телят
Для выявления изменений экологического равновесия в биотопе желудочно-кишечного тракта проводили бактериологические исследования feces телят, учитывая количественный и качественный состав энтеробактерий. Среднее арифметическое числа выросших колоний в 1,0 г с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды составило: МПА – 49,0±1,5; Эндо – 57,0±1,2; «Brilliance E.coli coliform agar» – 55,0±1,4; «SMAC agar» – 48,0±1,4; «VRB agar» – 45±1.
При выделении чистой культуры микроорганизмов, наряду с применением сред Гисса, биохимическую идентификацию выделенных энтеробактерий проводили с использованием тест-системы «ENTERO – Rapid - 24», состоящей из планшетов с высушенными питательными средами и субстратами для 24 тестов по 3 ряда. Суспензию бактерий вносили во все лунки планшета по 0,1 мл, инкубировали термостате 4 ч при 37 °C. После чего в соответствующие лунки добавляли реактивы. После повторной инкубации в термостате через 30 мин учитывали результаты реакций. Идентификацию проводили с помощью «Идентификационной таблицы» и книги кодов «ENTERO-Rapid».
При изучении видового состава из патологического материала и feces телят было выделено 86 культур микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, из которых 64 были идентифицированы как E.coli, 3 – S.typhimurium, 9 – K.pneumoniae, 10 – P.mirabilis (табл. 1).
Таблица 1
Видовой состав изолятов энтеробактерий,
выделенных в животноводческих хозяйствах
| Виды бактерий | Патологи-ческий материал | Feces | Смывы со слизистых оболочек | Смывы с объектов помещений | Всего | |||||
| Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | |
| E.coli | 6 | 27,83 | 30 | 36,14 | 15 | 9,59 | 13 | 8,24 | 64 | 81,17 |
| S.typhimurium | - | - | - | - | - | - | 3 | 2,36 | 3 | 2,36 |
| K.pneumoniae | 1 | 0,61 | 4 | 3,25 | 4 | 4,24 | - | - | 9 | 6,13 |
| P.mirabilis | 1 | 0,35 | - | - | 5 | 5,42 | 4 | 4,01 | 10 | 10,13 |
| Всего | 8 | 28,79 | 34 | 39,39 | 24 | 19,25 | 20 | 15,61 | 86 | 100 |
При определении гемолитической активности изолятов E.coli учитывали по степени образования на 5,0%-м кровяном агаре зон просветления среды. Установлено, что характерной -гемолитической активностью обладали 8,0 % изученных изолятов эшерихий. При изучении чувствительности к антибиотикам изолятов E.coli установлено, что из 64 изученных культур микроорганизмов 32 были чувствительными к антибиотикам группы фторхинолонов, 8 – к гентамицину, неомицину, канамицину, мономицину; 10 – к цефотаксиму; 5 – к цефазолину; 9 – к полимиксину. Только 2 изолята E. coli были умеренно чувствительными к тетрациклину. Особенностью эпизоотических изолятов эшерихий являлась устойчивость к антибиотикам группы природных и полусинтетических пенициллинов, олеандомицину, линкомицину, ристомицину.
3.4. Этиологическая структура эшерихиоза телят в животноводческих
хозяйствах Рязанской области
3.4.1. Определение серогрупповой принадлежности
и адгезивных антигенов E.coli
При определении серогрупповой принадлежности эшерихий диагностическими О-коли агглютинирующими поливалентными и моновалентными сыворотками было идентифицировано 30 изолятов (46,87 %). Из числа типированных изолятов 17 (56,7 %) положительно реагировали в РА с поливалентной сывороткой «группы №1», 11 (36,6 %) – «группы №3» и 2 (6,6 %) антигена были активны в отношении всех комплексных сывороток. Среди изолятов, реагирующих с поливалентной сывороткой «группы №1», обнаружены серогруппы О8, О115, О126. К серогруппе О8 отнесены 10 изолятов (55,5 %), к О115 – 5 (27,7 %), к О126 – 3 (16,6 %). Все 11 антигенов, реагировавших с третьей поливалентной сывороткой, были отнесены к серогруппе О35 (табл. 2).
Таблица 2
Результаты исследования серогрупповой принадлежности изолятов
E. coli, выделенных при желудочно-кишечных болезнях телят
| Поливалентные сыворотки | Моновалентные сыворотки | Кол-во изолятов | |||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | О157 | О1 | О2 | О4 | О8 | О78 | О111 | О115 | О127 | |
| ++++ | - | - | - | - | - | - | - | ++++ | - | - | - | - | 10 |
| - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ++++ | - | 5 |
| - | +++ | - | - | О157 | О9 | О35 | О18 | О20 | О26 | О119 | 11 | ||
| - | - | +++ | - | - | - | - | |||||||
| - | - | - | ++++ | О157 | О55 | О126 | О138 | О139 | О141 | О142 | О147 | О149 | 2 |
| - | - | - | - | ++++ | - | - | - | - | |||||
| - | - | - | ++++ | - | - | ++++ | - | - | - | - | - | - | 4 |
| - | - | - | - | ++ | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Всего | 30 | ||||||||||||
Примечание: «++++» - полная агглютинация, «+++» - почти полная, «++» - не полная, «+» - незначительная, «–» - отсутствие агглютинации
Для определения серогрупповой принадлежности изолятов, активных в отношении всех комплексных сывороток, проводили РА с 31 моновалентной сывороткой. При этом антигены реагировали с рядом гетерологичных сывороток: О4, О8, О15, О18, О35, О115, О117, О119, О139. При постановке развернутой реакции агглютинации титры антител к сывороткам О4, О8, О15, О35, О115, О117, О119 перестали реагировать в разведении 1:200, к сывороткам О18 – 1:1600, и отнесены нами к серогруппе О139, с которой они реагировали с неполной агглютинацией «++» в разведении 1:3200. При типировании 64 изолятов E.coli: 18,0 % были отнесены к серогруппе О35; 16,0 % – О8; 8,0 % – О115 и 4,0 % – О126; 54,0 % изолятов не удалось типировать набором стандартным «О-коли сывороток».
3.4.2. Определение серогрупповой принадлежности E.coli,
нетипирующихся набором стандартных «О-коли сывороток»
Для определения серогрупповой принадлежности E.coli, нетипирующихся набором стандартных «О-коли сывороток», применяли метод получения гипериммунных кроличьих сывороток с последующей идентификацией в РА с эталонными антигенами эшерихий. Антигены нетипирующихся эшерихий готовили, прогревая смывы агаровых культур микроорганизмов в течение часа при 100 оС, а затем консервировали и использовали для иммунизации кроликов, предварительно проверив на стерильность и безвредность.
Гипериммунизацию животных проводили по схеме, состоящей из 5 внутривенных инъекций антигена с установленной концентрацией 2 млрд/см3 в нарастающих дозах: 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 и 3,0 см3 с интервалом пять суток, после чего проводили забор крови и определяли титр антител в пробирочной РА с гомологичной культурой. При титре антител ниже 1:3200 дополнительно инъецировали по 3,0 см3 антигена и обескровливали кроликов через 10 суток без предварительного исследования сывороток. Сыворотку выдерживали 48 ч при температуре 4-5 оС, после чего центрифугировали при 3000 об./мин в течение 20 мин и консервировали. В результате гипериммунизации животных были получены 11 сывороток с титрами антител от 1:400 до 1:6400, пригодных для постановки РА. Сыворотки отстаивали в течение месяца, после чего использовали для постановки РА с 126 антигенами эталонных штаммов E.coli для определения серогрупповой принадлежности. Среди 11 полученных после гипериммунизации сывороток 6 относились к серогруппе О28, 4 – О66 и 1 – О110.
3.5. Характеристика факторов патогенности изолятов энтеробактерий выделенных при желудочно-кишечных болезнях телят
3.5.1. Патогенные и вирулентные свойства энтеробактерий
Патогенные свойства определяли при идентификации микроорганизмов, не типируемых по О-антигену, заражая внутрибрюшинно белых беспородных мышей массой 14-16 г по 0,5 см3 взвесью микроорганизмов в концентрации 1 млрд/см3 бактериальных клеток. Установлено, что из числа изученных культур микроорганизмов 35,0 % изолятов энтеробактерий являлись патогенными и 65,0 % – непатогенными. При экспериментальном заражении Y.pseudotuberculosis у животных отмечались мелкоточечные кровоизлияния в легких, полнокровие печени и почек, селезенка и лимфоузлы увеличивались. Вирулентность бактерий определяли на лабораторных мышах массой 14-16 г, которых заражали внутрибрюшинно в дозах 2 млрд.; 400; 80; 16 - 32 млн. микробных тел, используя по 5 мышей на дозу. Установлено, что средняя величина LD50 варьировала в пределах от 490,5 млн. до 1,560 млрд. микробных клеток. Наиболее выраженной вирулентностью характеризовались изоляты E.coli серогруппы О8 и О115 LD50 – 490,5 и 570 млн. микробных клеток, соответственно. Для исследования местных изменений в слизистых оболочках в конъюнктивальную полость глаза морских свинок вводили взвесь микроорганизмов в концентрации 110–11010. Установлено, что изолят E.coli О8, выделенный из feces от теленка с клиническими признаками диареи, вызывал прогрессирующий конъюнктивит и кератит, характеризующийся склеиванием изъязвленных век, обильным гнойным экссудатом, интенсивным помутнением роговицы. Референтный штамм Y.enterocolitica О9 S-формы №383 вызывал выраженный и прогрессирующий к 5-7 суткам конъюнктивит при незначительном помутнении роговицы. В то время как референтные штаммы Y.enterocolitica О9 R-формы №383 и Y.pseudotuberculosis № 290 вызывали незначительную выраженность конъюнктивита через 2-3 суток после заражения, слабую выраженность кератита через 2-3 суток, без прогрессирования помутнения роговицы через 5-7 суток.
3.5.2. Токсигенные свойства энтеробактерий
При определении токсигенности энтеробактерий с использованием лабораторной модели «тест расширения кишечника» белым мышам-сосункам 2 – 3-суточного возраста per rectum вводили надосадочную жидкость в объеме 0,2 мл. Средние показатели коэффициента (К) расширения тонкого кишечника находились в пределах от 0,070±0,009 до 0,116±0,005. Из общего числа изученных культур микроорганизмов 27,7 % были токсигенными; 18,1 % – слаботоксигенными; 54,5 % – нетоксигенными. Для оценки продукции токсина с применением «плантарного теста» надосадочную жидкость микроорганизмов вводили 3 мышам в область плантарной поверхности лапы в дозе 0,1 мл. В качестве контроля использовали исходную среду. Средняя разность массы лапок мышей через 24 ч колебалась в пределах от 6,66±4,41 до 48,33+3,54 мг.
При изучении токсигенных свойств E.coli, выделенных при желудочно-кишечных болезнях телят с применением лабораторных моделей «теста расширения кишечника» и «плантарный тест», умереннотоксигенными свойствами характеризовались 38,5 % культур микроорганизмов, слаботоксигенными – 15,4 %, нетоксигенными – 46,1 %. Данные по результатам исследований «теста расширения кишечника» согласовывались с результатами «плантарного теста» и имели степень корреляции r=0,96. Вместе с тем, недостатком «теста расширения кишечника» является гибель животных при транспортировке, содержании и травмах кишечника во время введения материала.
Для оценки способности Е.coli к продукции термолабильных энтеротоксинов и вероцитотоксинов применяли тест-системы «VET-RPLA» и «VTEC-RPLA» (OXOID, Англия), основанные на методе обратной пассивной латексной агглютинации: лунка микропланшета (ряды по 8 лунок)
