Механизмы внутриклеточной сигнализации при реинициации мейоза в ооцитах сельскохозяйственных животных
На правах рукописи
ДЕНИСЕНКО ВИТАЛИЙ ЮРЬЕВИЧ
МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ ПРИ РЕИНИЦИАЦИИ МЕЙОЗА В ООЦИТАХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
06.02.07 – Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Пушкин
2013
Работа выполнена в лаборатории биологии развития во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельско-хозяйственных животных.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Кузьмина Татьяна Ивановна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Свиридов Борис Евгеньевич,
ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии,
вед. н. сотрудник.
доктор медицинских наук, профессор
Никитин Анатолий Илларионович,
Балтийский институт репродуктологии
человека, директор.
доктор биологических наук
Гончаров Николай Васильевич,
НИИ гигиены, профпатологии и экологии
человека Федерального медико-биологи-
ческого агентства, вед. н. сотрудник.
Ведущее учреждение: ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии
Защита состоится 19 апреля 2013 года, в 10 часов, на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.012.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии.
Адрес института: 196601 г. Санкт-Петербург, Пушкин, Московское шоссе, 55а, ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН, т/факс (812) 465-99-89.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН.
Автореферат разослан « » ___________________2013 года.
Ученый секретарь Совета Сердюк Г.Н.
д.б.н., профессор
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из важнейших и актуальных проблем современной биологии развития является выяснение механизмов активации и ингибирования мейоза в ооцитах животных. Основным подходом к решению этой проблемы является изучение механизмов внутриклеточной сигнализации в клетках при активации и ингибировании мейоза. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и большую практическую значимость, так как интенсификация внедрения клеточных репродуктивных технологий в животноводство, биомедицину, фармакологию вызывает необходимость детального изучения механизмов формирования зрелой яйцеклетки. В настоящее время разработаны методы, позволяющие получать высокий процент яйцеклеток коров (Bols et al., 2012) и свиней (Coy et al., 2005) при созревании ооцитов in vitro, однако, при последующем оплодотворении лишь треть из них развивается до стадии морулы и бластоцисты. Успех культивирования зависит от многих факторов, важнейшим из которых является создание системы культивирования, обеспечивающей полноценное дозревание ооцитов, компетентных к оплодотворению и дальнейшему развитию из них эмбрионов (Kuzmina et al., 2007; 2010). Моделирование процессов ядерного и цитоплазматического созревания основывается на детальном знании процессов, детерминирующих реинициацию и ингибирование мейоза. Для прохождения процессов мейоза необходима передача сигналов внутрь клетки. В плазматической мебране проходят процессы, преобразующие внешние сигналы во внутриклеточные. Восприятие клеткой внешних сигналов происходит в основном благодаря взаимодействию различных веществ с рецепторами, расположенными на поверхностной мембране клетки. С помощью рецепторов распознаются приходящие сигналы и приводятся в действие внутриклеточные пути передачи сигналов, которые, в конечном счете, приводят к запуску и регуляции различных клеточных процессов. Несмотря на огромное разнообразие стимулов, существует всего несколько универсальных сигнальных систем, передающих при взаимодействии стимула с рецептором информацию различным клеточным органеллам и запускающих определенные физиологические процессы в клетке. В настоящее время установлено, что важным моментом внутриклеточной передачи сигналов является изменение транспорта и внутриклеточной концентрации различных ионов. Доказано, что изменение внутриклеточной концентрации Ca2+, Na+, K+, H+, Cl- играет существенную роль в процессах активации и регуляции различных общих и специализированных клеточных функций. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Ca2+. Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации Ca2+ играют ключевую роль в запуске и регуляции общих и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокращение и т.д. (Berridge, 1995; 1998). Увеличение концентрации цитоплазматического кальция происходит за счет освобождения Ca2+ из внутриклеточных депо и входа в клетку внеклеточного кальция. К внутриклеточным депо относятся такие внутриклеточные органеллы, как шероховатый эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи и кальциосомы (Galione, Churchill, 2002). При всех значительных успехах, достигнутых в познании механизмов формирования зрелой яйцеклетки, до сих пор не выяснены многие вопросы, касающиеся регуляторных механизмов мейоза и раннего эмбриогенеза. Необходимость в получении углубленных знаний, связанных с изучением механизмов внутриклеточной сигнализации, детерминирующих реинициацию мейоза в женских гаметах овариальных фолликулов животных обусловили направление наших исследований.
Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось исследование механизмов регуляции Са2+ сигналов и, в первую очередь, освобождение Са2+ из внутриклеточных депо (ВД) в соматических (клетки гранулезы) и половых (ооциты) клетках овариальных фолликулов свиней и коров при реинициации мейоза. В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:
1. Идентифицировать типы ВД кальция, детерминирующих освобождение Са2+ в ооцитах свиней при действии активаторов обмена Са2+ и активаторов увеличения концентрации цАМФ.
2. Изучить эффект хлортетрациклина на возможность проникновения низкомолекулярных соединений в клетки гранулезы свиней.
3. Изучить взаимодействие между различными (IP3(инозитолтрифосфат)- и рианодинчувствительными) ВД Са2+ при воздействии активаторов обмена Са2+ и увеличении концентрации цАМФ.
4. Исследовать влияние стероидных гормонов на взаимодействие между различными ВД Са2+ (IP3- и рианодинчувствительными) после добавления активаторов обмена Са2+ и увеличения концентрации цАМФ.
5. Выявить особенности кальциевой сигнализации из ВД растущих и завершивших фазу роста ооцитов свиней.
6. Охарактеризовать интрацеллюлярные процессы, детерминирующие механизмы воздействия соматотропина (СТГ) на мобилизацию кальция при реинициации мейоза в ооцитах свиней.
7. Изучить взаимодействие между IP3- и рианодинчувствительными ВД в ооцитах свиней, выделенных из яичников в лютеальной фазе.
8. Исследовать совместное действие IP3- и рианодинчувствительных ВД клеток гранулезы и влияние стероидных гормонов на их взаимодействие.
9. Охарактеризовать взаимодействие ВД в ооцитах коров, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста при действии активаторов обмена Са2+.
Научная новизна. Диссертационная работа является первым комплексным исследованием механизмов регуляции Са2+ сигналов и, в первую очередь, освобождения Са2+ из ВД в соматических (клетки гранулезы) и половых (ооциты) клетках овариальных фолликулов свиней и коров. При выполнении работы впервые были получены следующие результаты:
Определены типы ВД и рецепторов на поверхности этих депо, стимулируемые активаторами обмена Са2+ и увеличения концентрации цАМФ в ооцитах свиней. Изучено взаимодействие между IP3- и рианодин-чувствительными ВД кальция при использовании активаторов обмена Са2+ и увеличения концентрации цАМФ в ооцитах свиней. Показано влияние стероидных гормонов (эстрадиол, тестостерон и прогестерон) на взаимодействие между IP3- и рианодинчувствительными ВД кальция, стимулированное активаторами обмена Са2+ и увеличения концентрации цАМФ в ооцитах свиней. Обнаружены различия в механизмах освобождения Са2+ в ооцитах свиней, находящихся на разных стадиях роста – растущих и завершивших фазу роста. Идентифицированы во ВД (IP3- и рианодинчувствительных) типы внутриклеточных рецепторов и показано взаимодействие этих ВД в ооцитах свиней, выделенных из яичников в лютеальную фазу. В клетках гранулезы обнаружено взаимодействие между IP3- и рианодинчувствительными ВД и охарактеризовано влияние стероидных гормонов на взаимодействие между ними. Показано влияние хлортетрациклина на перенос во внутриклеточное пространство низкомолекулярных соединений в ооцитах и клетках гранулезы свиней. В ооцитах коров установлены типы внутриклеточных рецепторов на поверхности IP3- и рианодинчувствительных ВД и изучено взаимодействие этих ВД.
Теоретическая и практическая значимость работы. Основной конструктивной характеристикой работы является полученная информация, необходимая для понимания фундаментальных механизмов внутриклеточной сигнализации и, в первую очередь, освобождения Са2+ из ВД в соматических (клетки гранулезы) и половых (ооциты) клетках овариальных фолликулов свиней и коров при реинициации мейоза, которая может быть использована при оптимизации методов клеточных репродуктивных технологий. На основании полученных данных высказано предположение о возможности образования связи и перехода Са2+ между различными ВД кальция (IP3- и рианодинчувствительными). Представлена гипотеза, согласно которой реинициация мейоза зависит от перехода Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД, а ингибирование мейоза связано с переходом Са2+ из IP3- в рианодинчувствительные ВД. Показано участие стероидных гормонов в регуляции процессов реинициации и ингибирования мейоза, детерминированное перемещением Са2+ между рианодин- и IP3-чувствительными ВД. Разработана тест-система оценки качества донорских ооцитов, используемых в клеточных репродуктивных технологиях, позволяющая определить фазу роста ооцитов для предварительной селекции донорских ооцитов перед культивированием. Предложен способ прижизненной оценки целостности цитоскелета, основанный на оценке изменения концентрации внутриклеточного кальция в интактных и имеющих повреждение структурных элементов цитоскелета клетках. Предложен способ доставки биологически активных веществ в клетки животных, основанный на способности антибиотика хлортетрациклина образовывать на поверхности клеток поры небольшого диаметра, которые обеспечивают перенос в клетки млекопитающих низкомолекулярных соединений, не проникающих внутрь клеток.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Переход и освобождение Са2+ из ВД ооцитов приводит к увеличению концентрации цитоплазматического Са2+ и активации клеток. Реинициация мейоза в ооцитах свиней детерминируется переходом Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД, перемещение Са2+ в обратном направлении – из IP3- в рианодинчувствительные ВД ингибирует реинициацию мейоза.
2. В завершивших фазу роста ооцитах свиней обмен Са2+ между рианодин- и IP3-чувствительными ВД осуществляется в обоих направлениях, в растущих ооцитах Са2+ переходит только в одном направлении – из IP3- в рианодинчувствительные ВД.
3. В ооцитах свиньи, выделенных из яичников на стадии желтого тела, в отличии от ооцитов, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста, отсутствует переход Са2+ между рианодин- и IP3-чувствительными ВД кальция.
4. Стероидные гормоны оказывают различное влияние на переход Са2+ между рианодин- и IP3-чувствительными ВД кальция. Эстрадиол стимулирует переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД, тестостерон – в обратном направлении (из IP3- в рианодинчувствительные), прогестерон ингибирует переход Са2+ между внутриклеточными депо.
5. В ооцитах свиней переход Са2+ между ВД (рианодин - в IP3-чувствительными) происходит в обоих направлениях, в клетках гранулезы Са2+ перемещается между ВД только в одном направлении – из рианодин- в IP3-чувствительные ВД.
6. В ооцитах свиней Са2+ перемещается между рианодин- и IP3-чувствительными ВД, в ооцитах коров отсутствует переход Са2+ между внутриклеточными депо.
7. В трансдукцию Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД вовлекаются микротрубочки, в перемещении Са2+ в обратном направлении – из IP3- в рианодинчувствительные ВД участвуют микрофиламенты.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 25 международных научных конференциях: «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 1995; 2000), «Проблемы индивидуального развития с.-х. животных» (Киев, 1997), «Селекционно-генетические и биотехнологические методы консолидации новообразованных пород и типов сельскохозяйственных животных» (Киев, 1999), «Повышение эффективности ведения свиноводства» (Быково, 2000), «Современные проблемы развития животноводства» (Жодино, 2000), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2007; 2009; 2011), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2002; 2003; 2004; 2006), «Современные проблемы селекции и племенного дела в животноводстве» (С.-Петербург–Пушкин, 2002), «Актуальные проблемы интенсификации производства продукции животноводства» (Жодино, 2005), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 2006), II Съезд общества клеточной биологии (С.-Петербург, 2007), «Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции» (Жодино, 2008), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (Дубровицы, 2008; 2009), «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург–Пушкин, 2009), «Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ» (Гродно, 2009), «Биологические ресурсы» (Киров, 2010), «Инновационные технологии в животноводстве» (Жодино, 2010), «Современные технологии сельскохозяйственного производства» (Гродно, 2011), «Повышение интенсивности и конкурентноспособности отраслей животноводства» (Жодино, 2011), «Теоретические и практические аспекты оологии в современной зоологии» (Киев, 2011), Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре», «Клеточная биология на пороге XXI века», «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» и «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (С.-Петербург, 1999, 2001; 2003; 2004; 2006; 2007; 2009; 2012).
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 117 научных работ, из них 20 – в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Онтогенез», «Цитология», «Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Theriogenology», «J. Repr. Dev.»).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 251 странице, содержит 56 таблиц, 29 рисунков и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических предложений и библиографического списка, включающего 390 цитируемых источников.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа была выполнена в период с 1995 по 2012 гг. Экспериментальные исследования проводились в лаборатории биологии развития Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельско-хозяйственных животных. Схема исследований представлена на рис. 1.
Рис. 1 Общая схема исследований.
Объектом исследований служили половые (ооциты) и соматические (гранулеза) клетки овариальных фолликулов свиней породы ландрас и ооциты коров черно-пестрой породы. В экспериментах использовали половозрелых животных, яичники для опытов отбирались на стадии фолликулярного роста и стадии желтого тела. ОКК выделяли из фолликулов диаметром 3-6 мм. В экспериментах использовали ооциты округлой формы с тонкогранулированной ооплазмой, зоной пеллюцида, равномерной по ширине и окруженной пятью и более слоями клеток кумулюса. Инкубацию выделенных ооцитов производили в модифицированной инкубационной среде Дюльбекко, содержащей 36 мкг/мл пирувата Na, 100 мкг/мл MgCl2х6H2O и 1 мг/мл глюкозы, в присутствии (133 мкг/мл) или в отсутствии CaCl2.
Клетки гранулезы аспирировали из фолликулов диаметром 3-6 мм. Конечную концентрацию клеток подсчитывали в гемоцитометре, долю живых клеток оценивали путем их окрашивания трипановым синим (0,1 % раствор). Процент клеток с пикнотическими ядрами определяли после их фиксации смесью метанол : уксусная кислота (3:1) и окрашивали азур-эозином. В экспериментах использовали популяцию клеток гранулезы с пикнотическим индексом, не превышающим 20 %. Ресуспендирование гранулезы осуществляли в модифицированной среде Дюльбекко, содержащей 1 % бычий сывороточный альбумин. Осаждение клеток после 30 мин инкубации производили центрифугированием при 250 g в течение 10 мин и затем ресуспендировали в инкубационной среде с БСА в концентрации, уменьшенной до 0,1 %.
Цитогенетические препараты ооцитов готовили по методу Тарковского (Tarkowski, 1966). Ооциты, предназначенные для анализа, очищали от клеток кумулюса с помощью препаровальной иглы и на 10 минут помещали в гипотонический раствор 0,9 % цитрата натрия. Яйцеклетки переносили на сухое, обезжиренное стекло и фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1. При окрашивании высохших препаратов использовали азур-эозин по методу Гимза в модификации Романовского.
Для изготовления маточного раствора ВСВ (бриллиантового голубого кристаллического) 1 мг ВСВ растворяли в 10 мл среды Дюльбекко и БСА до конечной концентрации 0,4 % ( маточный раствор №1). Концентрация ВСВ в маточном растворе составляла 260 мкМ. 0,5 мл раствора №1 добавляли к 9,5 мл среды Дюльбекко, содержащей БСА в конечной концентрации 0,4 % (раствор №2). Окрашивание ооцитов свиней проводили совместно с клетками кумулюса в растворе №2 с концентрацией ВСВ 13 мкМ. Продолжительность инкубации ооцитов свиней в присутствии красителя - 60 мин при температуре 37о С. Объем раствора красителя, необходимого для окраски одного ооцита - 200 мкл. По окраске ооплазмы ооциты распределяли на две группы – окрашенные (завершившие стадию роста) и неокрашенные (растущие). Выбор концентрации и времении экспозиции основывался на данных, полученных Roca (Roca et al., 1998).
ОКК свиней выделяли из фолликулов яичников аспирацией или рассечением стенки фолликула, затем промывали 3 раза в среде ТС-199 (“Sigma”, США), содержащей 5 мкг/мл гепарина и 50 мкг/мл гентамицина. В экспериментах использовали ооциты, выделенные из фолликулов 3-6 мм, окруженные не менее, чем 5-6 слоями кумулюсных клеток, с гомогенной ооплазмой и равномерной по ширине зоной пеллюцида. Фолликулярную жидкость аспирировали из фолликулов диаметром 3-6 мм, с последующим центрифугированием при 250 g в течение 30 мин. Жидкость фолликулов фильтровали через фильтр диаметром 1,2-1 мм и инактивировали при температуре 56C в течение 30 мин. Средой для культивирования служила NCSU 23, в которую добавляли 10 М.Е. хорионического гонадотропина человека ("Sigma", США), 10% фолликулярной жидкости (диаметр фолликулов 3-6 мм). Время культивирования ооцитов 23 часа.
ОКК коров выделяли аспирацией фолликулов, трижды промывали в среде ТС-199, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки («Sigma», США) и 50 мкг/мл гентамицина («Sigma», США). Клетки гранулезы получали путем аспирации жидкости из фолликулов диаметром 3-5 мм с обширной васкуляризацией и высоким тургором. Суспензию центрифугировали при 250 g 10 мин. После удаления супернатанта клетки дважды отмывали путем ресуспендирования в среде ТС-199, содержащей 3 % фетальной бычьей сыворотки («Sigma», США). Конечную концентрацию клеток подсчитывали в гемоцитометре, долю живых клеток определяли с помощью трипанового синего (0,1 %-й раствор) («Serva», Германия). Для культивирования использовали суспензию клеток в концентрации 1x106 в 1 мл среды, при этом доля живых клеток составляла не менее 80 %. Базовой средой для культивирования служила ТС-199 с 20% бычьей сыворотки (Думмерсторф, Германия), 0,55 мг/мл лактата кальция («Sigma», США), 0,23 мг/мл пирувата натрия («Serva», Германия) и 50 мкг/мл гентамицина. ОКК культивировали совместно с клетками гранулезы в чашках Петри при 38,5°С в атмосфере 5% СО2 под минеральным маслом («Sigma», США) в течение 24 часов. В экспериментах использовали рекомбинантный бычий СТГ («Monsanto», США). В отборе концентраций руководствовались данными, полученными нами ранее (Kuzmina et al., 1996). Оплодотворение ооцитов, культивирование эмбрионов проводили в соответствии с методическими рекомендациями, разработанными в лаборатории биологии развития (Кузьмина и др., 2009). Капацитацию спермы и оплодотворение ооцитов проводили в следующей последовательности. Сперму размораживали в течение 3-х мин при температуре 37С. Подслаивали в пробирки со средой для капацитации без гепарина и инкубировали 50-60 минут при 38,5°С для процедуры – «swim up». Верхнюю фракцию среды со «всплывшими» сперматозоидами центрифугировали при 3000 об/мин в течении 10 мин. Супернатант удаляли, ресуспендировали осадок, к оставшейся суспензии добавляли равное количество среды капацитации с гепарином («Sigma», США) (10 мкг/мл) и инкубировали в течении 15 минут в СО2-инкубаторе при стандартных условиях. В капли объемом 200 мкл со средой оплодотворения помещали по 7-10 ооцитов и суспензию спермы в конечной концентрации 1,0–1,5x106 кл/мл. После 18 часов культивирования ооциты отмывали от спермы и переносили в среду SOF (“Sigma”, США) для дальнейшего культивирования.
Для измерения цитоплазматического кальция и Са2+, связанного с ВД, использовали различные флуоресцентные зонды. Свободный цитозольный кальций измеряли с помощью Фура-2АМ, мобилизацию кальция ВД изучали с помощью хлортетрациклина (ХТЦ). Для нагрузки клеток гранулезы зондом Фура-2АМ использовали инкубационную среду с добавлением 0,1 % БСА. Время инкубации составляло 30 мин при температуре 37оС. Концентрация зонда составляла 5 мкМ. ХТЦ в клетки нагружали в течение 30 мин при комнатной температуре с использованием зонда в концентрации 100 мкМ. Окрашенные клетки отмывали в инкубационной среде с добавлением 0,1 % БСА и затем центрифугировали при 250 g в течение 10 мин. Процедуру отмывания повторяли три раза. Для экспериментов использовали концентрацию клеток - 5х105 кл/мл. Концентрацию кальция ВД в ооцитах измеряли с помощью флуоресцентного зонда ХТЦ. Перед проведением измерений ооциты очищали от клеток кумулюса. Ооциты инкубировали в течение 5 мин при 37оС в инкубационной среде, содержащей 40 мкМ ХТЦ. После этого нагруженные клетки три раза отмывали в инкубационной среде и переносили на специальное кварцевое стекло с ячейками объемом 0,05 мл. Зависимую от Са2+ флуоресценцию ХТЦ регистрировали в ооцитах в среде Дюльбекко.
Измерение в клетках гранулезы интенсивности флуоресценции свободного цитозольного кальция и кальция ВД проводили на спектрофлуориметре "Hitachi". Величина длины волны возбуждения и излучения для Фура-2АМ - 340/380 и 520 нм, а для ХТЦ - 390 и 530 нм, соответственно, при ширине щели 10 нм. Интенсивность флуоресценции при использовании ХТЦ и Фура-2АМ измерялась в усл. единицах. Измерение кальция во ВД ооцитов проводили на люминесцентном микроскопе Люмам И1, снабженном необходимым набором светофильтров. Интенсивность флуоресценции зонда ХТЦ измеряли флуориметрической установкой, состоящей из люминесцентного микроскопа, снабженного ртутной лампой постоянного тока ДРШ-250-2, необходимыми светофильтрами и фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Комплекс ХТЦ-Са2+-мембрана возбуждали светом 380-400 нм, флуоресценцию регистрировали в области 530 нм. Интенсивность флуоресценции измеряли в усл. ед. Длительность воздействия ультрафиолетового излучения на ооциты при проведении измерений не превышала 5 сек.
Морфологическое состояние ооцитов и клеточных культур клеток гранулезы, их цитогенетические препараты исследовали под микроскопом "Olimpus" с необходимым увеличением. Материал документировали микрофотографиями.
Для сравнения результатов 4-5 независимых экспериментов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерий 2 (Лакин, 1990) или t-критерий
Стьюдента, данные обрабатывали с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: P<0,05; P<0,01; P<0,001.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изучение механизмов высвобождения внутриклеточного Са2+ в ооцитах свиней, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста. В ооцитах свиней имеются два типа ВД кальция – рианодин- и IP3-чувствительные (Machaty et al., 1997). Мобилизация Са2+ из внутриклеточных депо – универсальный механизм выхода Са2+ в цитоплазму клетки, однако, освобождение кальция из разных ВД осуществляется различными путями внутриклеточной сигнализации.
3.1.1. Активация пролактином, теофиллином, дбцАМФ и гуаниновыми нуклеотидами кальциевых каналов внутриклеточных депо в ооцитах свиней. Одним из необходимых условий перемещения Са2+ между различными ВД является их активация. Активация внутриклеточных депо осуществляется при взаимодействии различных соединений с рецепторами, расположенными на поверхности внутриклеточных депо, в результате чего происходит освобождение Са2+ из внутриклеточных депо. Изменение уровня содержания Са2+ в клетках изучали в бескальциевой среде, в присутствии хелатора внеклеточного кальция ЭГТА в концентрации 0,5 мМ. Для активации рианодин- и IP3-чувствительных ВД кальция, использовали соединения, стимулирующие эти ВД: пролактин, теофиллин, дбцАМФ и гуаниновые нуклеотиды, активирующие освобождение Са2+ из ВД. Для определения типа ВД использовали тапсигаргин. Применение тапсигаргина, который является специфическим ингибитором для фермента Са2+-АТФаза эндоплазматического ретикулума, приводит к опустошению IP3-чувствительных ВД и последующее добавление реагентов, стимулирующих эти ВД, не приводит к освобождению Са2+ из ВД (Thastrup et al., 1990). После воздействия тапсигаргина ингибирование освобождения Са2+ из ВД отмечалось только при действии ПРЛ в концентрации 50 нг/мл и ГДФ в концентрации 100 мкМ (табл. 1). В нагруженных хлортетрациклином клетках интенсивность флуоресценции мембрансвязанного кальция, запасенного во внутриклеточных депо, измеряется в усл. единицах и снижение этого показателя при воздействии различных соединений свидетельствует об освобождении Са2+ из внутриклеточных депо. При использовании теофиллина в концентрации 10 мМ и ГТФ в концентрации 10 мкМ добавление тапсигаргина не влияло на освобождение Са2+ из ВД.
Таким образом, в ооцитах свиньи ПРЛ и ГДФ стимулируют освобождение Са2+ из IP3-чувствительных ВД, а теофиллин, дбцАМФ и ГТФ вызывают выход Са2+ из других, не IP3-чувствительных ВД.
Таблица 1. Влияние тапсигаргина на стимулированное гуаниновыми нуклеотидами, теофиллином (дбцАМФ) и пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||||
| Контроль | ГДФ, 100 мкМ | Теофиллин, 10 мМ | ГТФ, 10 мкМ | ПРЛ, 50 нг/мл | |
| Контроль | 0,72±0,022a | 0,39±0,015а | 0,45±0,023 | 0,39±0,035 | 0,41±0,019а |
| Тапсигаргин, 10 мкМ | 0,48±0,036b | 0,46±0,022c | 0,44±0,028 | 0,45±0,027 | 0,50±0,040d |
Примечание. Число ооцитов: 27-35. Достоверные различия: а,dp < 0,05; а,cp < 0,01; а,bp < 0,001.
3.1.2. Эффект хлортетрациклина на проникающую способность низкомолекулярных соединений в клетки гранулезы свиней. Известно, что действие некоторых антибиотиков направлено на нарушение целостности мембраны или образование ионных каналов (Borisov et al., 1994). Используемый в наших экспериментах флуоресцентный зонд хлортетрациклин также является антибиотиком. Было предположено, что ХТЦ также способен образовывать на поверхности клеток каналы, через которые можно транспортировать в клетки различные вещества, самостоятельный вход которых затруднен. Вход веществ в клетки гранулезы свиньи регистрировали по изменению флуоресценции мембрансвязанного кальция. Обнаружено, что соединения, не проникающие самостоятельно в клетки (ГТФ, ГДФ), в нагруженных ХТЦ клетках гранулезы входят внутрь клеток (табл. 2). Это отмечалось как в отсутствии дигитонина, так и в присутствии. Таким образом, ХТЦ образует поры на поверхности клеток гранулезы и способствует транспортировке в клетки веществ, самостоятельно не способных в нее проникнуть.
Таблнца 2. Влияние дигитонина на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо в нагруженных хлортетрациклином клетках гранулезы свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | |
| В отсутствии дигитонина | В присутствии дигитонина | |
| Контроль | 1,67±0,074а | 2,01±0,078а |
| ГТФ, 10 мкМ | 0,97±0,091b | 1,34±0,053b |
| ГДФ, 100 мкМ | 1,12±0,080c | 1,35±0,101b |
| Пролактин, 50 нг/мл | 0,94±0,095b | 1,20±0,123b |
| Гепарин, 1 мг/мл | 1,80±0,084 | 2,25±0,134 |
| Пролактин+Гепарин | 1,48±0,105 | 1,95±0,143 |
Примечание. Достоверные различия: а,cp < 0,01; а,bp < 0,001.
Известно, что Фура-2АМ не делает поры на поверхности клеток, однако, он способен регистрировать вхождение в клетки ГТФ и ГДФ. В нагруженных Фура-2АМ клетках гранулезы свиней добавление ГТФ или ГДФ не оказывало влияние на концентрацию цитоплазматического кальция (табл. 3). После обработки клеток дигитонином, образующим поры в наружной мембране, отмечали изменение концентрации цитоплазматического кальция при добавлении вышеперечисленных соединений. Этот дополнительный эксперимент ясно свидетельствует, что для проникновения некоторых (ГТФ, ГДФ) соединений в клетки необходимо наличие пор на поверхности клеток, а также подтверждает предположение, что ХТЦ образует поры на поверхности клеток. Обработка ХТЦ в используемых концентрациях не оказывала влияние на жизнеспособность клеток, так как нагруженные ХТЦ ооциты были способны к дальнейшему созреванию (Кузьмина, Малышев, 1992).
Таблица 3. Влияние дигитонина на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо в нагруженных Фура-2АМ клетках гранулезы свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции Фура-2АМ в ооцитах (усл. ед.) | |
| В отсутствие дигитонина | В присутствии дигитонина | |
| Контроль | 1,26±0,020а | 1,29±0,022а |
| ГТФ, 10 мкМ | 1,31±0,038 | 1,51±0,025b |
| ГДФ, 100 мкМ | 1,22±0,045 | 1,55±0,038b |
| Пролактин, 50 нг/мл | 1,38±0,030c | 1,53±0,023b |
| Гепарин, 1 мг/мл | 1,28±0,032 | 1,35±0,066 |
| Пролактин+Гепарин | 1,37±0,041 | 1,30±0,038 |
Примечание. Достоверные различия: а,cp < 0,01; а,bp < 0,001.
3.1.3. Взаимодействие IP3- и рианодинчувствительных внутриклеточных депо, активируемых пролактином и ГТФ в ооцитах свиней. Так как целью нашей работы явилось изучение взаимодействия двух различных типов ВД – IP3- и рианодинчувствительных, для их активации использовались различные соединения. На различных клетках показано, что действие ПРЛ связано с активацией протеинкиназы С (Mitev et al., 1996). Протеинкиназа С участвует в регуляции многих внутриклеточных процессов, в том числе Са2+-сигнализации. В связи с этим исследовали влияние ингибирования протеинкиназы С на стимулированное ПРЛ освобождение Са2+ из ВД ооцитов свиней. В среде без Са2+ ингибитор протеинкиназы С соединение Ro 31-8220 не оказывало влияние на стимулированное ПРЛ освобождение Са2+ из ВД (табл. 4). При совместном действии ПРЛ и ГТФ отмечается дополнительное освобождение Са2+ из ВД, которое прекращалось в присутствии ингибитора протеинкиназы С. Существует гипотеза, согласно которой ГTФ образует связь между двумя ВД кальция – рианодин– и IP3-чувствительными и обеспечивает переход Са2+ из рианодин– в IP3-чувствительные ВД, в результате чего происходит дополнительное освобождение Са2+ из ВД при активации клеток IP3. Дополнительное освобождение Са2+ из ВД является одним из признаков перехода Са2+ между различными ВД. (Mullaney et al., 1987; Ghosh et al., 1989). Как и IP3, ПРЛ освобождает Са2+ из IP3-чувствительных депо, также при взаимодействии ПРЛ и ГТФ присутствует дополнительное освобождение Са2+ из ВД. Исходя из этого, можно предположить, что при совместном действии ПРЛ и ГТФ происходит переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД. Протеинкиназа С оказывает стимулирующее влияние на переход Са2+ между ВД в направлении из рианодин– в IP3-чувствительные.
Таблица 4. Влияние ингибирования протеинкиназы С (ИПС) на вызванное пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||
| Контроль (К) | К + ГТФ | К + ГДФ | |
| Контроль (К) | 0,84±0,069а | 0,58±0,058d | 0,54±0,060а |
| Пролактин, 50 нг/мл | 0,59±0,071d | 0,43±0,020а | 0,48±0,041 |
| К + ИПС, 10 нг/мл | 0,54±0,043b | 0,50±0,067 | 0,40±0,014d |
| Пролактин + ИПС | 0,45±0,053 | 0,55±0,049d | 0,41±0,022 |
Примечание. Число ооцитов: 30-35. Достоверные различия: а,dp < 0,05; а,bp < 0,001.
Действие одного ГТФ на освобождение Са2+ из ВД, или ГТФ совместно с СТГ может осуществляться путем активации различных внутриклеточных механизмов. Для проверки этого предположения использовали негидролизуемый аналог ГТФ – ГТФS. Добавление ГТФS в концентрации 100 мкМ к ооцитам не стимулировало освобождение Са2+ из ВД. ГТФ в концентрации 10 мкМ стимулировал освобождение Са2+ из ВД, однако при совместном действии ГТФ и ГТФS не отмечали выход Са2+ из ВД, что свидетельствует о необходимости гидролиза фосфатного остатка при активации выхода Са2+ из ВД. В то же время добавление ГТФS не оказывало влияние на дополнительное освобождение Са2+ из ВД, стимулированное совместным действием СТГ и ГТФ. Таким образом, стимулированное ГТФ освобождение Са2+ из ВД связано с гидролизом терминального остатка ГТФ, в то время как совместное действие ГТФ и СТГ не зависит от гидролиза ГТФ.
3.1.4. Взаимодействие IP3- и рианодинчувствительных внутриклеточных депо, активируемых теофиллином (дбцАМФ) и ГДФ в ооцитах свиней. Так как ГТФ активирует освобождение Са2+ из рианодинчувствительных и образует связь с IP3-чувствительными ВД, логично предположить наличие соединения, активирующего освобождение Са2+ из IP3-чувствительные ВД и образующего связь с рианодинчувствительными депо. ГДФ стимулирует освобождение Са2+ из IP3-чувствительных ВД ооцитов свиней. Теофиллин и дбцАМФ активируют в ооцитах свиней выход Са2+ из рианодинчувствительных ВД. Совместное действие теофиллина и ГДФ, а также дбцАМФ и ГДФ активировало в ооцитах свиней дополнительный выход Са2+ из ВД (табл. 5). Таким образом, ГДФ освобождает Са2+ из IP3-чувствительных ВД и, вероятно, образует связь с рианодинчувствительными ВД. При совместном действии теофиллина (или дбцАМФ) и ГДФ происходит переход Са2+ между ВД и направление этого перехода – из IP3-чувствительных внутриклеточных депо в рианодинчувствительные.
Таблица 5. Влияние гуаниновых нуклеотидов на вызванное теофиллином и дбцАМФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||
| Контроль (К) | К + ГТФ | К + ГДФ | |
| Контроль (К) | 0,81±0,093a | 0,59±0,084а | 0,56±0,063а |
| Теофиллин, 10 мМ | 0,46±0,061c | 0,46±0,043 | 0,34±0,014c |
| дбцАМР, 5 мМ | 0,35±0,044b | 0,31±0,030c | 0,24±0,012b |
Примечание. Число ооцитов: 28-35. Достоверные различия: а,dp < 0,05; а,cp < 0,01; а,bp < 0,001.
Действие теофиллина и дбцАМФ в клетках приводит к увеличению концентрации цАМФ, которая является активатором протеинкиназы А. В связи с этим было исследовано влияние ингибитора протеинкиназы А соединения Н-89 на освобождение Са2+, стимулированное совместным действием теофиллина (или дбцАМФ) и ГДФ. В ооцитах добавление отдельно теофиллина, дбцАМФ или ГДФ вызывает выход Са2+ из ВД. Совместное действие теофиллина (или дбцАМФ) и ГДФ активирует в ооцитах свиней дополнительное освобождение Са2+ из ВД. Обработка клеток ингибитором протеинкиназы А вызывала прекращение дополнительного освобождения Са2+ из ВД, стимулированного совместным действием теофиллина (или дбцАМФ) и ГДФ. Таким образом, протеинкиназа А стимулирует возможный переход Са2+ между ВД в направлении из IP3- в рианодинчувствительные.
Для ответа на вопрос – отличается ли механизм действия одного ГДФ от совместного действия ГДФ и теофиллина, изучали влияние АДФ на стимулированное ГДФ освобождение Са2+ из ВД ооцитов свиньи. ГДФ может превращаться в ГТФ при действии фермента нуклеозид дифосфокиназа (NDPK) и таким образом опосредовать свое действие на выход Са2+ из ВД (Ueda et al., 1986). Переход ГДФ в ГТФ блокируется добавлением АДФ, который более эффективно конкурирует с ГДФ при соединении к NDPK (Kimura, Shimada, 1983). На освобождение Са2+, стимулированное теофиллином, АДФ не оказывала влияние; добавление ГДФ в присутствии АДФ не приводило к освобождению Са2+ из ВД. В то же время, в присутствии АДФ совместное действие теофиллина и ГДФ стимулирует дополнительное освобождение Са2+ из ВД. Следовательно, при действии одного ГДФ и совместном действии ГДФ и теофиллина активируются различные внутриклеточные механизмы. Стимулированное ГДФ освобождение Са2+ из ВД связано с превращением ГДФ в ГТФ, в то время как образование связи между различными ВД с помощью ГДФ не требует присутствия ГТФ.
Таким образом, исходя из собственных результатов и анализа данных литературы, формулируем гипотезу, согласно которой в клетках возможен переход Са2+ между ВД не только в направлении из рианодинчувствительных в IP3-чувствительные депо, но и в обратном направлении (в частности, в ооцитах свиньи) – из IP3-чувствительных в рианодинчувствительные ВД. Для перехода Са2+ между ВД необходимо, чтобы эти ВД были связаны между собой. Переход Са2+ из рианодинчувствительных в IP3-чувствительные депо регулируется протеинкиназой С, переход Са2+ в обратном направлении – протеинкиназой А.
Известно, что ГТФ образует связь с цитоскелетом, участвуя в синтезе микротрубочек (Hajnoczky et al., 1994). В связи с этим, мы исследовали вовлечение элементов цитоскелета, в частности микротрубочек, в регуляцию перехода Са2+ между различными ВД, стимулированное совместным действием СТГ и ГТФ. Совместное действие СТГ и ГТФ стимулировало дополнительное освобождение Са2+ из ВД, которое отсутствовало после добавления ингибитора полимеризации микротрубочек нокодазола.
Микрофиламенты также участвуют в регуляции перехода Са2+ между различными ВД, стимулированного совместным действием теофиллина (или дбцАМФ) и ГДФ. В отсутствие ингибитора полимеризации микрофиламентов цитохалазина Д дополнительное освобождение Са2+ из ВД отмечали как при совместном действии теофиллина и ГДФ, так и дбцАМФ и ГДФ (табл. 6). После воздействия цитохалазина Д дополнительный выход Са2+ из ВД отсутствовал при совместном действии теофиллина (или дбцАМФ) и ГДФ. Эти данные показывают, что при возможном переходе Са2+ между IP3- и рианодин-чувствительными ВД участвуют микротрубочки и микрофиламенты.
Обнаружение нарушений в функционировании системы микротрубочек и микрофиламентов можно прозводить с помощью прижизненной оценки целостности цитоскелета, основанной на определении изменения концентрации внутриклеточного кальция. Для определения целостности системы микротрубочек к любому выбранному ооциту последовательно добавляется СТГ в концентрации 10 нг/мл и ГТФ в концентрации 10 мкМ. Когда в ооците присутствует дополнительное освобождение Са2+ из ВД при действии этих соединений, система микротрубочек в этом ооците функционирует исправно. Если дополнительное освобождение Са2+ отсутствует, это свидетельствует о нарушениях целостности микротрубочек. Аналогично, для определения целостности системы микрофиламентов к любому ооциту последовательно добавляется теофиллин в концентрации 10 мМ и ГДФ в концентрации 100 мкМ. Если после этого в ооците отмечается дополнительное освобождение Са2+ из ВД, то система микрофиламентов в данном ооците функционирует исправно. Отсутствие дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточных депо свидетельствует о нарушении в функционировании микрофиламентов.
Таблица 6. Влияние ингибитора полимеризации микрофиламентов на стимулированное теофиллином (дбцАМФ) и ГДФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | |
| Контроль | Ингиб. микрофиламентов | |
| Контроль | 0,52±0,023а | 0,49±0,031g |
| Теофиллин, 10 мМ | 0,36±0,013b | 0,37±0,013h |
| дбцАМФ, 5 мМ | 0,40±0,011с | 0,42±0,014k |
| ГДФ, 100 мкМ | 0,36±0,011d | 0,34±0,008l |
| Теофиллин + ГДФ | 0,31±0,0087e | 0,36±0,012m |
| дбцАМФ + ГДФ | 0,30±0,011f | 0,42±0,012n |
Примечание. Число ооцитов: 31-35. Достоверные различия: b,e, d,e, e,m p < 0.01;
a,b, a,c, a,d, c,f, d,f, f,n – P <0.001
3.1.5. Влияние стероидных гормонов на взаимодействие IP3- и рианодинчувствительных ВД, активируемых пролактином, СТГ и теофиллином в ооцитах свиней. Для проверки предположения о том, что эстрадиол (или другие стероидные гормоны) способен образовывать связь между IP3- и рианодинчувствительными ВД, последние активировали ПРЛ, СТГ, теофиллином, стимулирующими освобождение Са2+ из ВД, но не способными образовывать связь между ВД. В разделе 3.1.3 и 3.1.4 было показано, что соединениями, образующими связь между ВД, являются ГТФ, и предположительно, ГДФ. В отсутствии эстрадиола ПРЛ, СТГ или теофиллин, добавленные самостоятельно, вызывают освобождение Са2+ из ВД ооцитов свиней. При совместном действии ПРЛ и теофиллина, или СТГ и теофиллина, дополнительного освобождения Са2+ из ВД не отмечено.
После обработки ооцитов свиней эстрадиолом концентрация запасенного во ВД кальция снижалась. Воздействие отдельно ПРЛ, СТГ или теофиллина не вызывало выход Са2+ из ВД, при совместном действии ПРЛ и теофиллина, а также СТГ и теофиллина отмечали освобождение Са2+ из ВД (табл. 7). Использование ингибитора протеинкиназы С отменяло освобождение Са2+ при совместном действии этих соединений. Участие протеинкиназы С в регуляции освобождения Са2+ из ВД свидетельствует о переходе Са2+ между различными ВД и наличии связи между ними, о чем говорилось в выдвинутом выше предположении. Также участие протеинкиназы С свидетельствует о направлении этого перехода – из рианодин- в IP3-чувствительные ВД кальция.
Таблица 7. Влияние ингибитора протеинкиназы С на стимулированное пролактином (СТГ) и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней в присутствии эстрадиола
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | |
| Контроль | Ингибитор протеинкиназы С | |
| Контроль | 0,37±0,019a | 0,26±0,025g |
| Пролактин, 50 нг/мл | 0,35±0,023b | 0,31±0,022h |
| СТГ, 10 нг/мл | 0,42±0,019c | 0,39±0,015k |
| Теофиллин, 10 мМ | 0,33±0,012d | 0,34±0,015l |
| Пролактин+Теофиллин | 0,29±0,010e | 0,36±0,018m |
| СТГ + Теофиллин | 0,27±0,015f | 0,37±0,013n |
Примечание. Число ооцитов: 30-35. Достоверные различия: b,e, d,ep < 0,05; d,f, e,mp < 0,01; c,f, f,np < 0,001.
Как и в случае использования эстрадиола, в обработанных тестостероном ооцитах свиньи освобождение Са2+ из ВД отмечалось только при совместном действии ПРЛ и теофиллина, а также СТГ и теофиллина (табл. 8). Добавленные отдельно ПРЛ, СТГ или теофиллин не влияли на освобождение Са2+ из ВД ооцитов. Обработка клеток ингибитором протеинкиназы А соединением Н-89 оказывала негативный эффект на стимулированное совместным действием ПРЛ (или СТГ) и теофиллина освобождение Са2+ из ВД. Регуляция с помощью протеинкиназы А освобождения Са2+ из ВД предполагает переход Са2+ между различными ВД. Также участие протеинкиназы А свидетельствует о направлении этого перехода – из IP3- в рианодинчувствительные ВД кальция. Так как у свиней использование эстрадиола для культивирования приводило к значительному росту числа ооцитов, созревших до стадии метафазы II (Kim et al., 2011), а тестостерон вызывал в ооцитах свиней ингибирование спонтанного созревания (Rice, McGaughey, 1981), было высказано предположение, согласно которому стимулированный эстрадиолом переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД стимулирует мейоз, а перемещение Са2+ в обратном направлении – из IP3- в рианодинчувствительные ВД, которое активируется тестостероном, приводит к ингибированию реинициации мейоза.
Таблица 8. Влияние ингибитора протеинкиназы А на стимулированное пролактином (СТГ) и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней в присутствии тестостерона
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | |
| Контроль (К) | К + Ингибитор протеинкиназы А | |
| Контроль (К) (обработка тестостероном) | 0,48±0,031a | 0,49±0,038g |
| К + ПРЛ, 50 нг/мл | 0,40±0,030b | 0,34±0,026h |
| К + СТГ, 10 нг/мл | 0,41±0,018c | 0,43±0,014k |
| К + теофиллин, 10 мМ | 0,39±0,029d | 0,47±0,032l |
| К + ПРЛ + теофиллин | 0,30±0,021e | 0,40±0,018m |
| К + СТГ + теофиллин | 0,32±0,012f | 0,43±0,032n |
Примечание. Число ооцитов: 33-38. Достоверные различия: e,d, d,fp < 0,05; b,e, f,np < 0,01; c,f, e,mp < 0,001.
После обработки прогестероном совместное действие ПРЛ и ГТФ, которые активируют различные ВД (рианодин- и IP3-чувствительные) не стимулировало дополнительный выход Са2+ из них. В то же время совместное действие теофиллина и ГТФ, которые освобождают Са2+ только из рианодинчувствительных ВД, активирует дополнительный выход Са2+ из депо. Также не отмечали дополнительного выхода Са2+ из ВД при совместном действии теофиллина и ГДФ, и выявлен такой выход при действии ПРЛ и ГДФ, которые освобождают Са2+ только из IP3-чувствительных ВД. Таким образом, в присутствии прогестерона отсутствует переход Са2+ между ВД.
3.1.6. Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо растущих и завершивших стадию роста ооцитов свиней. С помощью красителя ВСВ ооциты можно разделить на две группы – растущие и завершившие фазу роста. Использование для культивирования in vitro растущих ооцитов снижало количество ооцитов, развившихся при оплодотворении в эмбрионы, при культивировании завершивших фазу роста ооцитов количество и качество полученных из них эмбрионов было выше (Ericsson et al., 1993). В растущих ооцитах свиньи ВД кальция окончательно не сформированы, после завершения роста ооцитов отмечается увеличение размера ВД и количества запасенного в них кальция (Machaty et al., 1997). В связи с этим мы исследовали освобождение Са2+ из ВД растущих и завершивших фазу роста ооцитов свиней. В завершивших фазу роста ооцитах совместное действие ПРЛ (или СТГ) и ГТФ стимулировало дополнительное освобождение Са2+ из ВД (табл. 9). После обработки ооцитов ингибитором протеинкиназы С отсутствовало дополнительное освобождение Са2+ из ВД, стимулированное совместным действием ПРЛ (или СТГ) и ГТФ.
Таблица 9. Влияние ингибитора протеинкиназы С на стимулированное пролактином (СТГ) и ГТФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо завершивших стадию роста ооцитов свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | |
| Контроль | Ингиб. протеинкиназы С | |
| Контроль | 0,87±0,055а | 0,71±0,055g |
| Пролактин, 50 нг/мл | 0,62±0,047b | 0,66±0,040h |
| СТГ, 10 нг/мл | 0,66±0,057c | 0,61±0,021k |
| ГТФ, 10 мкМ | 0,64±0,035d | 0,59±0,069l |
| Пролактин + ГТФ | 0,39±0,023e | 0,55±0,032m |
| СТГ + ГТФ | 0,46±0,028f | 0,64±0,031n |
Примечание. Число ооцитов: 31-40. Достоверные различия: a,ep < 0,05; a,c, c,fp < 0,01; a,b, a,d, b,e, d,e, d,f – P <0.001.
В растущих ооцитах добавление ПРЛ, СТГ или ГТФ вызывает выход Са2+ из ВД. Однако при совместном действии ПРЛ (или СТГ) и ГТФ отсутствует дополнительное освобождение Са2+ из ВД. Основываясь на различии в механизмах внутриклеточной сигнализации, обнаруженных в растущих и завершивших фазу роста ооцитах, предлагаем тест-систему оценки качества донорских ооцитов, используемых в клеточных репродуктивных технологиях, позволяющую определить фазу роста ооцита и выбрать необходимые клетки для культивирования in vitro. С этой целью к донорскому ооциту последовательно добавляют ПРЛ (или СТГ) и ГТФ, ооциты, в которых фиксируют дополнительное освобождения Са2+ оценивают, как завершившие фазу роста, а ооциты, в которых дополнительное освобождение кальция отсутствует, как растущие.
3.1.7. Интрацеллюлярные процессы, детерминирующие механизмы воздействия соматотропина на мобилизацию кальция при реинициации мейоза в ооцитах коров и свиней. В проведенной нами серии экспериментов по выявлению эффектов рекомбинантного бычьего соматотропина (СТГ) на мейотическое созревание ооцитов коров in vitro в присутствии клеток гранулезы, были получены данные, свидетельствующие о положительном влиянии СТГ на показатели ядерного созревания (достижение ооцитами стадии метафазы-II, снижение уровня дегенерации хромосом) и последующего эмбрионального развития. Вид сыворотки (эстральной или бычьей) не изменял положительного влияния на контролируемые параметры ядерного созревания яйцеклеток и развитие эмбрионов. Положительный эффект соматотропина усиливался при наличии в системе культивирования клеток гранулезы. При экстракорпоральном дозревании ооцитов наблюдается флуктуация содержания кальция в них (Kuzmina et al., 2007). В связи с этим, в качестве маркера цитоплазматичесго созревания мы использовали уровень содержания кальция во ВД ооцитов. В результате экспериментов обнаружено достоверное снижение уровня депонированного кальция в ооцитах после 24 часов культивирования в среде совместно с СТГ и клетками гранулезы (0.97±0.03 и 0.85±0.02; P <0.05).
В следующей серии экспериментов нами исследовались пути сигнальной трансдукции при воздействии СТГ в ооцитах свиней. После 23 часов культивирования у 95% свиных ооцитов отмечают разрыв зародышевого пузырька - GVBD (germinal vesicle break down) (Inoue et al., 1998), что свидетельствует о реинициции мейоза в клетках. В контрольной группе ооцитов (без эстрадиола) добавление СТГ или теофиллина приводило к освобождению Са2+ из ВД (табл. 10). При совместном действии СТГ и теофиллина дополнительного освобождения Са2+ из ВД не отмечали. В ооцитах, прокультивированных в присутствии эстрадиола, при совместном действии СТГ и теофиллина наблюдали освобождение Са2+ из ВД, причем количество освобожденного Са2+ было выше, чем в ооцитах в отсутствии эстрадиола.
Таблица 10. Влияние СТГ и теофиллина на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней после культивирования
(время культивирования 23 часа)
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||
| Контроль | Эстрадиол | ||
| Контроль | 0,74±0,042a | 0,51±0,036e | |
| СТГ, 10 нг/мл | 0,49±0,025b | 0,47±0,024f | |
| Теофиллин, 10 мМ | 0,55±0,028c | 0,44±0,015g | |
| СТГ +Теофиллин | 0,48±0,020d | 0,31±0,018h | |
Примечание. Число ооцитов: 30-35. Достоверные различия: a,b, a,c, f,h, g,h, d,h - P<0.001.
Одним из возможных механизмов действия эстрадиола является образование связи между различными ВД кальция (IP3- и рианодин-чувствительными), в котором могут участвовать различные внутриклеточные структуры и ферменты. Значительное освобождение Са2+ из ВД, которое стимулировалось при совместном действии СТГ и теофиллина в присутствии эстрадиола отменялось при добавлении ингибитора полимеризации микротрубочек нокодазола и ингибитора протеинкиназы С соединения Ro 31-8220. Таким образом, опосредованная эстрадиолом реинициация мейоза в ооцитах свиней связана с изменением концентрации внутриклеточного Са2+, в регуляции которой участвуют микротрубочки и протеинкиназа С.
3.2. Изучение механизмов высвобождения внутриклеточного Са2+ в ооцитах свиней, выделенных из яичников на стадии желтого тела. В ооцитах, выделенных из яичников на стадии желтого тела, добавление ГТФ или ГДФ не стимулировало освобождение Са2+ из ВД (табл. 11). Применение одного ПРЛ стимулировало в ооцитах освобождение Са2+ из ВД, при совместном действии ПРЛ и ГТФ, а также ПРЛ и ГДФ отсутствовало дополнительное освобождение Са2+ из ВД. Добавленный отдельно теофиллин стимулировал освобождение Са2+ из ВД, однако дополнительного освобождения Са2+ не отмечали при совместном воздействии теофиллина и ГТФ, а также теофиллина и ГДФ. Таким образом, в ооцитах свиньи, выделенных из яичников на стадии желтого тела, отсутствует связь и переход Са2+ между рианодин- и IP3-чувствительными ВД
Таблица 11. Влияние гуаниновых нуклеотидов (ГТФ и ГДФ) на вызванное ПРЛ и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||
| Контроль (К) | К + ГТФ | К + ГДФ | |
| Контроль (К) | 0,62±0,045а | 0,64±0,044а | 0,63±0,052а |
| Пролактин, 50 нг/мл | 0,47±0,037d | 0,49±0,040d | 0,50±0,037d |
| Теофиллин, 10 мМ | 0,51±0,032d | 0,50±0,028d | 0,48±0,039d |
Примечание. Число ооцитов: 35-39. Достоверные различия: а,dp < 0,05.
3.3. Изучение механизмов высвобождения внутриклеточного Са2+ в клетках гранулезы свиней, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста. После обработки клеток гранулезы эстрадиолом при совместном действии ПРЛ и теофиллина отмечается дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо (табл. 12).
Таблица 12. Влияние ингибиторов протеинкиназы С и А на стимулированное пролактином и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо клеток гранулезы свиней в присутствии эстрадиола
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||
| Контроль | Ингибитор протеинкиназы С | Ингибитор протеинкиназы А | |
| Контроль | 1,54±0,047a | 1,25±0,020e | 1,26±0,023k |
| ПРЛ, 50 нг/мл | 1,11±0,034b | 1,20±0,059f | 1,17±0,033l |
| Теофиллин, 1мМ | 1,10±0,035c | 1,12±0,025g | 1,07±0,049m |
| ПРЛ+Теофиллин | 0,83±0,021d | 1,09±0,028h | 0,90±0,041n |
Примечание. Достоверные различия: m,n, d,hp < 0,05; a,b, a,c, a,e, a,k, b,d, c,d, k,n, l,np < 0,001.
Использование ингибиторов протеинкиназы С и А показало, что дополнительное освобождение Са2+ из ВД присутствовало при действии ингибитора протеинкиназы А, и отсутствовало при действии ингибитора протеинкиназы С. Таким образом, в присутствии эстрадиола между ВД образуется связь, о чем свидетельствует появление дополнительного освобождения Са2+ из ВД. Участие протеинкиназы С в этом процессе показывает, что движение Са2+ между ВД происходит из рианодин- в IP3-чувствительные ВД.
Обработка клеток гранулезы тестостероном стимулировала дополнительное освобождение Са2+ из ВД при совместном действии ПРЛ и теофиллина (табл. 13). Если в ооцитах свиньи дополнительное освобождение Са2+, стимулированное совместным действием ПРЛ и теофилллина, прекращалось при добавлении ингибитора протеинкиназы А, то в клетках гранулезы такое действие оказывало внесение ингибитора протеинкиназы С. Таким образом, в клетках гранулезы, по-видимому, нет перехода Са2+ из IP3- в рианодинчувствительные ВД, так как перемещение Са2+ в этом направлении стимулируется протеинкиназой А. Участие протеинкиназы С в регуляции дополнительного освобождения Са2+ из ВД позволяет предположить, что в присутствии тестостерона в клетках гранулезы происходит переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД
Таблица 13. Влияние ингибитора протеинкиназы С на стимулированное пролактином и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо клеток гранулезы свиней в присутствии тестостерона
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | |
| Контроль | Ингибитор протеинкиназы С | |
| Контроль | 1,55±0,066a | 1,35±0,088e |
| ПРЛ, 50 нг/мл | 1,18±0,082b | 1,23±0,095f |
| Теофиллин, 1 мМ | 1,23±0,114c | 1,25±0,091g |
| ПРЛ + Теофиллин | 0,90±0,068d | 1,13±0,075h |
Примечание. Достоверные различия: b,d, c,d, a,c, d,hp < 0,05; a,bp < 0,01.
3.4. Изучение механизмов высвобождения внутриклеточного Са2+ в ооцитах коров, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста. В ооцитах коров существуют два типа внутриклеточных рецепторов, способствующих освобождению Са2+ из ВД. Это рианодин- и IP3-чувствительные внутриклеточные рецепторы (Yue et al., 1995). В ооцитах коров кальций необходим для разрушения зародышевого пузырька, а также для прохождения стадий мейоза, так как показано, что добавление хелаторов Са2+ приводило к остановке мейоза (Homa, 1995). Предполагается, что для созревания ооцитов в основном используется Са2+, освобождаемый из IP3-чувствительных ВД, роль рианодинчувствительных ВД в ооцитах изучена в значительно меньшей степени (Carroll et al., 1994).
Для активации перехода Са2+ между ВД (рианодин- и IP3-чувствительными) необходимо стимулировать эти ВД. С этой целью использовали соединения ПРЛ, ГТФ и ГДФ. Добавленные отдельно ПРЛ, ГТФ или ГДФ стимулируют освобождение Са2+ из ВД ооцитов коров (табл. 14). ПРЛ и ГТФ активируют освобождение Са2+ из различных ВД – IP3- и рианодинчувствительных, однако, при их совместном действии нет дополнительного освобождения Са2+ из ВД. После совместного действия ПРЛ и ГДФ также нет дополнительного освобождения Са2+ из ВД ооцитов. Ингибирование протеинкиназы С не оказывало влияние на стимулированное ПРЛ, ГТФ или ГДФ, а также их совместным действием освобождение Са2+ из ВД. Из данных экспериментов следует, что в ооцитах коров нет перехода Са2+ между ВД, о чем свидетельствует отсутствие дополнительного выхода Са2+ из внутриклеточных депо при совместном действии ПРЛ и ГТФ.
Таблица 14. Влияние ингибирования протеинкиназы С (ИПС) на вызванное пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов коров
| Условия эксперимента (воздействующее вещество) | Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-Са2+ в ооцитах (усл. ед.) | ||
| Контроль (К) | К + ГТФ | К + ГДФ | |
| Контроль | 0,97±0,089а | 0,84±0,085а | 0,83±0,090а |
| Пролактин, 50 нг/мл | 0,58±0,050b | 0,62±0,042d | 0,60±0,041d |
| Контроль+ИПС,10нг/мл | 0,78±0,084 | 0,82±0,087 | 0,67±0,085 |
| Пролактин + ИПС | 0,52±0,027 | 0,64±0,062 | 0,56±0,039 |
Примечание. Число ооцитов: 32-35. Достоверные различия:а,d - P<0.05; а,c - P<0.01; а,b - P<0.001.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Реинициация мейотического созревания ооцитов – комплексный процесс, включающий в себя преобразования хроматина, цитоплазмы, мембран. Важную роль в механизмах реинициации мейоза играют ионы кальция. Концентрация ионов Са2+ в цитоплазме ооцитов и перемещение Са2+ между различными ВД (рианодин- и IP3-чувствительными) детерминируют судьбу женской гаметы – реинициацию или ингибирование мейоза. В работе на основании данных экспериментов высказано предположение и получены результаты, свидетельствующие о возможности образования связи и перехода Са2+ между различными ВД кальция (IP3- и рианодинчувствительными). Показано, что концентрация Са2+ в цитоплазме ооцита не является единственной детерминантной в дальнейшей судьбе ооцита: не менее важным для процессов реинициации или ингибирования мейоза, по-видимому, является процесс перемещения Са2+ между ВД (рианодин- и IP3-чувствительными). В определение направления перехода Са2+ между различными ВД вовлечены стероидные гормоны. Эстрадиол стимулирует реинициацию мейоза, тестостерон ингибирует реинициацию мейоза. Эти же гормоны активируют переход Са2+ между различными ВД: эстрадиол стимулирует переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД, тестостерон в обратном направлении – из IP3- в рианодинчувствительные. Эти данные послужили основанием для подтверждения гипотезы, согласно которой реинициация мейоза определяется переходом Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД, а ингибирование мейоза связано с переходом Са2+ из IP3- в рианодинчувствительные ВД.
Структурные элементы цитоскелета (микротрубочки и микрофиламенты) вовлекаются в регуляцию реиинициации мейотического созревания в ооцитах. Выявленные нарушения в функционировании системы микротрубочек и микрофиламентов на основе флуктуации содержания кальция во ВД, позволили разработать тест-систему прижизненной оценки целостности цитоскелета.
При проведении исследований получены данные, свидетельствующие о том, что хлортетрациклин обеспечивает проникновение ряда низкомолекулярных биологически активных веществ (ГТФ и ГДФ) в соматические и половые клетки овариальных фолликулов животных, что априори предполагает возможность модернизации систем дозревания ооцитов путем введения в среды для культивирования биологически активных веществ, вовлеченных в процесс формирования зрелой яйцеклетки in vivo.
В работе выявлены достоверные различия в изменении интенсивности флуоресценции Са2+-чувствительных зондов в растущих и завершивших фазу роста ооцитах, что позволило разработать тест-систему селекции ооцитов, перспективных для дальнейшего созревания in vitro с целью их использования в клеточных репродуктивных технологиях.
В целом, в настоящем исследовании на основе ингибиторного анализа с использованием флуоресцентных зондов для определения цитозольного и мембрансвязанного кальция идентифицированы пути сигнальной трансдукции при реинициации мейоза в женских гаметах коров и свиней из яичников на различных стадиях овариального цикла. Полученная информация способствует пониманию фундаментальных механизмов внутриклеточной сигнализации, вовлеченных в реинициацию мейоза ооцитов и представляет научный базис для оптимизации клеточных репродуктивных технологий.
ВЫВОДЫ
- Реинициация мейоза в ооцитах свиней детерминирована переходом Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД, а ингибирование реинициации мейоза – из IP3- в рианодин-чувствительные.
- Стимулированный совместным действием ПРЛ и ГТФ переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД ооцитов свиней активируется протеинкиназой С.
- Переход Са2+ из IP3- в рианодинчувствительные ВД ооцитов свиней, активированный совместным действием теофиллина (дбцАМФ) и ГДФ, стимулируется протеинкиназой А и зависит от целостности микрофиламентов.
- Хлортетрациклин обеспечивает проникновение низкомолекулярных сое-динений в соматические и половые клетки антральных овариальных фолликулов коров и свиней, в частности ГТФ и ГДФ, за счет образования пор на поверхности клеток.
- В растущих ооцитах свиней [ВСВ(-)] Са2+ перемещается только в одном направлении – из IP3-чувствительных ВД в рианодинчувствительные, в ооцитах, завершивших фазу роста [ВСВ(+)] Са2+ переходит в обоих направлениях, как из IP3-чувствительных ВД в рианодинчувствительные, так и из рианодин- в IP3-чувствительные.
- Выявлены различия во флуктуации ионов кальция при действии тестостерона в зависимости от типа клеток овариальных фолликулов: в ооцитах свиней тестостерон стимулирует переход Са2+ из IP3- в рианодинчувствительные ВД, в клетках гранулезы в обратном направлении – из рианодин- в IP3-чувствительные ВД.
- Эстрадиол в клетках гранулезы и ооцитах свиней стимулирует переход Са2+ между ВД только в одном направлении – из рианодин- в IP3-чувствительные. Прогестерон ингибирует переход Са2+ между ВД.
- Обнаружен дозозависимый эффект соматотропина на активацию протеинкиназы С в ооцитах свиней. Активируемая 10 нг/мл СТГ протеинкиназа С стимулирует вход в клетки внеклеточного Са2+, активация протеинкиназы С при воздействии 1 нг/мл или 100 нг/мл СТГ ингибирует вход внеклеточного Са2+ в ооциты свиней.
- Идентифицирована роль элементов цитоскелета в освобождении кальция из ВД ооцитов свиней. Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что стимулированный совместным действием СТГ и ГТФ переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД снижался в присутствии ингибитора синтеза микротрубочек нокодазола, а переход Са2+ в обратном направлении (из IP3- в рианодинчувствительные), стимулируемый взаимодействием теофиллина и ГДФ, снижался в присутствии ингибитора синтеза микрофиламентов цитохалазина Д.
- В ооцитах свиней, выделенных из яичников с формирующимся желтым телом, отсутствует взаимодействие и перемещение Са2+ между рианодин- и IP3-чувствительными ВД, при этом увеличения концентрации внутриклеточного Са2+, необходимого для реинициации мейоза не наблюдают.
- В клетках гранулезы свиней Са2+ перемещается только в одном направлении – из рианодин- в IP3-чувствительные ВД. Стероидные гормоны (эстрадиол, тестостерон) в клетках гранулезы вызывают переход Са2+ из рианодин- в IP3-чувствительные ВД.
- В ооцитах свиней Са2+ перемещается между рианодин- и IP3-чувствительными ВД, в ооцитах коров перемещение Са2+ между ними отсутствует, что указывает на различные пути трансдукции гормонального сигнала при воздействии пролактина на женские гаметы коров и свиней, обусловленные, по-видимому, особенностями внутриклеточных механизмов гормональной регуляции фолликулогенеза у животных этих видов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для отбора донорских ооцитов, компетентных к формированию зрелой яйцеклетки in vitro, в среду инкубации ооцитов последовательно добавлять 50 нг/мл ПРЛ или 10 нг/мл СТГ и 10 мкМ ГТФ. При отсутствии дополнительного освобождения Са2+ из ВД ооцит оценивается, как растущий, дополнительный выход Са2+ свидетельствует о завершении фазы роста ооцита.
2. Целостность структурных элементов цитоскелета (микротрубочек и микрофиламентов) оценивать по изменению концентрации внутриклеточного кальция. Дополнительное освобождения Са2+ из ВД ооцитов в присутствии 10 нг/мл СТГ и 10 мкМ ГТФ свидетельствует о целостности системы микротрубочек, дополнительное освобождения Са2+ из ВД ооцитов в присутствии 10 мМ теофиллина (или 5 мМ дбцАМФ) и 100 мкМ ГДФ - о целостности системы микрофиламентов.
3. Для доставки в клетки животных биологически активных веществ с низкой молекулярной массой, не проникающих внутрь клеток, применять хлортетрациклин в концентрациях 40 мкМ (ооциты) или 100 мкМ (клетки гранулезы), образующий поры на поверхности клеток, что приводит к возможности проникновения в клетки низкомолекулярных соединений.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 117 научных работ, основными из которых являются 68 работ.
Статьи в рецензируемых научных журналах и изданиях,
определенных ВАК РФ:
1. Lebedeva, I.Yu. Prolactin in follicular fluid and intracellular store calcium in follicular cells are related to morphological signs of ovarian follicle atresia in cows; work in progress / I.Yu. Lebedeva, V.Yu. Denisenko, V.A. Lebedev, T.I. Kuzmina // Theriogenology. – 1998. – Vol. 49, № 3. – P. 509-519.
2. Кузьмина, Т.И. Влияние ингибитора протеинкиназы С на вызванное соматотропином изменение Са2+ в клетках гранулезы свиньи / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, И.Ш. Шапиев // Цитология. – 1999. – Т. 41, № 11. – С. 992-996.
3. Kuzmina, T.I. Effect of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro / T.I. Kuzmina, I.Yu. Lebedeva, H. Torner, H. Alm, V.Yu. Denisenko // Theriogenology. – 1999. – Vol. 51, № 7. – P. 1363-1374.
4. Денисенко, В.Ю. Влияние ингибитора протеинкиназы С на вызванные пролактином изменения Са2+ в клетках гранулезы свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2000. – Т. 86, № 4. – С. 481-487.
5. Денисенко, В.Ю. Участие протеинкиназы С в регуляции стимулированного пролактином освобождения Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2002. – Т. 44, № 6. – С. 551-554.
6. Денисенко, В. Ю. Влияние гуаниновых нуклеотидов и протеинкиназы С на стимулированное теофиллином и цАМФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2004. – Т. 46, № 6. – С. 557-560.
7. Денисенко, В.Ю. Влияние прогестерона на стимулируемое теофиллином и пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2004. – Т. 46, № 3. – С. 244-248.
8. Денисенко, В.Ю. Влияние эстрадиола на активируемое теофиллином и пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2005. – Т. 47, № 4. – С. 344-347.
9. Денисенко, В.Ю. Эффект гуаниновых нуклеотидов и протеинкиназы С на стимулированное пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Онтогенез. – 2005. – Т. 36, № 3. – С. 1-6.
10. Денисенко, В. Ю. Особенности взаимодействия теофиллина и пролактина и флуктуация кальция внутриклеточных депо в ооцитах свиней в присутствии эстрадиола / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2005. – Т. 47, № 8. – С. 709-713.
11. Денисенко, В.Ю. Зависимость освобождения Са2+ из внутриклеточных депо от уровня NADH и FAD в оплодотворенных и неоплодотворенных яйцеклетках коров / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина, О.В. Шокин // Цитология. – 2005. – Т. 47, № 8. – С. 704-708.
12. Денисенко, В.Ю. Влияние ингибирования рианодиновых и IP3-чувствительных рецепторов, а также протеинкиназы С на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней при их активации пролактином и GTP / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 8. – С. 685-689.
13. Kuzmina, T.I. Effect of recombinant bovine somatotropin (rbST) on cytoplasmic maturation of bovine oocytes and their developmental competence in vitro / T.I. Kuzmina, H. Alm, V.U. Denisenko, A. Tuchscherer, W. Kanitz, H. Torner // J. Reprod. Dev. – 2007. – Vol. 53, № 2. – P. 309-316.
14. Денисенко, В.Ю. Влияние эстрадиола на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней, стимулированное пролактином, теофиллином и GTP / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Онтогенез. – 2008. – Т. 39, № 6. – С. 1-7.
15. Денисенко, В.Ю. Эффект ингибитора протеинкиназы А на стимулированное теофиллином, дибутирил-цАМФ и гуанозиндифосфатом освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Онтогенез. – 2009. – Т. 40, № 1. – C. 48-55.
16. Денисенко, В.Ю. Влияние эстрадиола на стимулированное пролактином и теофиллином изменение внутриклеточного кальция в клетках гранулезы свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2009. – Т. 95, № 8. – С. 873-886.
17. Денисенко, В.Ю. Влияние тестостерона на стимулированный пролактином и теофиллином обмен Са2+ в ооцитах и клетках гранулезы свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2010. – Т. 96, № 6. – С. 590-598.
18. Денисенко, В.Ю. Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней на разной стадии роста / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Онтогенез. – 2011. – Т. 42, № 1. – С. 1-5.
19. Денисенко, В.Ю. Идентификация путей сигнальной трансдукции в нативных и девитрифицированных ооцитах свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. – 2012. – Т. 54, № 4. – С. 329-333.
20. Денисенко, В.Ю. Влияние витрификации на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо в ооцитах свиней на разной стадии роста / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2012. – Т. 98, № 7. – С. 890-898.
Публикации в материалах международных
научных конференций и симпозиумов:
21. Кузьмина, Т.И. Оценка функционального состояния ооцитов и эмбрионов коров / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, Г.А. Шагиахметова // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: тр. 2-й междунар. науч. конф. / – Боровск, 1995. – С. 193.
22. Лебедева, И.Ю. Влияние тимерозала и экзогенных ионов кальция на мобилизацию кальция из внутриклеточных депо в ооцитах и соматических фолликулярных клетках коров / И.Ю. Лебедева, В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Проблемы индивидуального развития с.-х. животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киев, 1997. – С. 111-112.
23. Денисенко, В.Ю. Влияние пролактина на содержание кальция во внутриклеточных депо клеток гранулезы коров, культивируемых с ФСГ и эстрадиолом / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Проблемы индивидуального развития с.-х. животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киев, 1997. – С. 104-105.
24. Кузьмина, Т.И. Динамика содержания кальция во внутриклеточных депо клеток гранулезы коров, культивируемых в присутствии пролактина / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Проблемы индивидуального развития с.-х. животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киев, 1997. – С. 108.
25. Кузьмина, Т.И. Участие ионов кальция и протеинкиназы С в ответе клеток гранулезы на пролактин. / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, Е.Д. Федосков // Биология клетки в культуре: тр. всерос. симп. / Цитология. – 1999. Т. 41, № 3/4. – С. 285.
26. Шапиев, И.Ш. Влияние протеинкиназы С на выход кальция из внутриклеточных хранилищ при действии на клетки гранулезы свиньи пролактина / И.Ш. Шапиев, Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Селекционно-генетические и биотехнологические методы консолидации новообразованных пород и типов сельскохозяйственных животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киев, 1999. – С. 277-279.
27. Денисенко, В.Ю. Мобилизация кальция из внутриклеточных депо клеток гранулезы свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина, Т.Э. Позднякова // Селекционно-генетические и биотехнологические методы консолидации новообразованных пород и типов сельскохозяйственных животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киев, 1999. – С. 57-59.
28. Кузьмина, Т.И. Ингибитор протеинкиназы С ограничивает стимулированный пролактином выход кальция из внутриклеточных депо ооцитов свиньи / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Повышение эффективности ведения свиноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Быково, 1999. – С. 184-185.
29. Денисенко, В.Ю. Ингибитор протеинкиназы С стимулирует вызванный соматотропином выход кальция из внутриклеточных депо клеток гранулезы свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Повышение эффективности ведения свиноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Быково, 1999. – С. 188-189.
30. Кузьмина, Т.И. Отсутствие связи действия пролактина в ооцитах коров с активацией протеинкиназы С / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, Ю.В. Козлов // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: тр. междунар. науч. конф. / – Боровск, 2000. – С. 404-405.
31. Денисенко, В.Ю. Эффект циклического нуклеотида на стимулируемое пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина, Т.Э. Позднякова, И.А. Погорельский // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: тр. междунар. науч. конф. / – Боровск, 2000. – С. 396-397.
32. Кузьмина, Т.И. Влияние пролактина на выход кальция из внутриклеточных депо интактных и обработанных тимерозалом ооцитов свиней / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, Т.Э. Позднякова // Современные проблемы развития животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2000. – С. 52-53.
33. Денисенко, В.Ю. Воздействие циклического нуклеотида с участием протеинкиназы С на вызванный пролактином выход Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина, Т.Э. Позднякова // Современные проблемы развития животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2000. – С. 53-54.
34. Денисенко, В.Ю. Влияние циклического нуклеотида на вызванный пролактином выход Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина, Т.Э. Позднякова // Современные проблемы развития животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2000. – С. 54-55.
35. Денисенко, В.Ю. Влияние протеинкиназы С на стимулирпованное теофиллином и пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо в ооцитах свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Клеточная биология на пороге XXI века: тр. всерос. симп. / Цитология. – 2001. Т. 43, № 4. – С. 342-343.
36. Денисенко, В.Ю. Влияние гуаниновых нуклеотидов на стимулированное пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: тр. междунар. науч. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2002. – С. 124-125.
37. Денисенко, В.Ю. Воздействие эстрадиола на стимулированное теофиллином и пролактином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // 1-й съезд общества клеточной биологии / Цитология. 2003. Т. 45, № 9. – С. 868.
38. Кузьмина, Т.И. Влияние прогестерона и ингибитора протеинкиназы С на стимулированное пролактином и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2003. – С. 101.
39. Денисенко, В.Ю. Влияние пролактина на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо клеток гранулезы овариальных фолликулов коров / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки: тр. междунар. науч.-практич. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2004. – С. 196-200.
40. Денисенко, В.Ю. Влияние теофиллина и пролактина на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо обработанных прогестероном ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия: тр. всерос. симп. / Цитология. – 2004. Т. 46, № 10. – С. 913.
41. Денисенко, В.Ю. Участие протеинкиназы С в стимулированном пролактином и теофиллином освобождении Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тр. междунар. науч. конф. / ПНЦ РАН. – Пущино, 2005. – С. 43-45.
42. Денисенко, В.Ю. Стимулирование ингибитором протеинкиназы С вызванного соматотропином выхода кальция из внутриклеточных депо клеток гранулезы свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Актуальные проблемы интенсификации производства продукции животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2005. – С. 55.
43. Кузьмина, Т.И. Влияние соматотропного гормона на уровень содержания свободного цитозольного кальция в клетках гранулезы свиней / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Актуальные проблемы интенсификации производства продукции животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2005. – С. 61-62.
44. Денисенко, В.Ю. Влияние пролактина на инозитолтрифосфат-чувствительные рецепторы в ооцитах свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Биология клетки в культуре: тр. всерос. симп. / Цитология. – 2006. Т. 48, № 9. – С. 760.
45. Денисенко, В.Ю. Использование хлортетрациклина для транспортировки ГТФ и ГДФ через мембраны ооцитов свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: тр. IV межд. науч. конф. / – Боровск, 2006. – С. 235-236.
46. Кузьмина, Т.И. Изменение концентрации цитозольного кальция в клетках гранулезы под действием соматотропного гормона связано с активацией протеинкиназы С / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, Т.Э. Позднякова // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: тр. IV межд. науч. конф. / – Боровск, 2006. – С. 250-251.
47. Кузьмина, Т.И. Влияние хлортетрациклина на транспортировку в клетки гранулезы свиней соединений небольшой молекулярной массы / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: тр. VI межд. науч. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2006. – С. 114-115.
48. Денисенко, В.Ю. Влияние пролактина и ГТФ на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: тр. VI межд. науч. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2006. – С. 64-65.
49. Денисенко, В.Ю. Влияние эстрадиола на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиньи, стимулированное совместным действием пролактина и теофиллина / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина, Г.В. Мурза // II Съезд общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией: тр. межд. науч. конф. / Цитология. – 2007. Т. 49, № 9. – С. 739-740.
50. Кузьмина, Т.И. Интрацеллюлярные механизмы действия пролактина на ооциты коров / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Проблемы интенсификации производства продуктов животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2008. – С. 81-83.
51. Денисенко, В.Ю. Влияние пролактина на выход кальция из внутриклеточных депо клеток гранулезы свиньи / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Проблемы интенсификации производства продуктов животноводства: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2008. – С. 35-36.
52. Денисенко, В.Ю. Влияние тестостерона на стимулированное пролактином и теофиллином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии: тр. 7-й междунар. науч. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2008. – С. 152-154.
53. Денисенко, В.Ю. Влияние тестостерона на флуктуацию кальция в клетках гранулезы свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тр. междунар. науч. конф. / ПНЦ РАН. – Пущино, 2009. – С. 269-273.
54. Денисенко, В.Ю. Эффект эстрадиола на изменение внутриклеточного Са2+ в клетках гранулезы свиньи, стимулированное пролактином и теофиллином / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Культивируемые клетки как основа клеточных технологий: тр. всерос. симп. / Цитология. 2009. – Т. 51, № 9. – С. 761-762.
55. Денисенко, В.Ю. Использование флуоресцентных зондов для доставки веществ внутрь клеток / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии: тр. междунар. науч. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2009. – С. 81-83.
56. Денисенко, В.Ю. Влияние прогестерона на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии: тр. междунар. науч. конф. / ВИЖ. – Дубровицы, 2009. – С. 78-80.
57. Денисенко, В.Ю. Влияние протеинкиназы С и прогестерона на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Гродно, 2009. – С. 50-51.
58. Денисенко, В.Ю. Влияние тестостерона на выход Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Инновационные технологии в животноводстве: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Жодино, 2010. – С. 38-40.
59. Денисенко, В.Ю. Влияние пролактина на освобождение Са2+ из растущих и завершивших стадию роста ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Биологические ресурсы: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киров, 2010. – С. 150-151.
60. Денисенко, В.Ю. Влияние ингибитора IP3-чувствительных рецепторов на стимулированное соматотропином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Биологические ресурсы: тр. междунар. науч.-практич. конф. / – Киров, 2010. – С. 56-57.
61. Денисенко, В.Ю. Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо растущих и завершивших фазу роста ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тр. междунар. науч. конф. / ПНЦ РАН. – Пущино, 2011. – С. 345-348.
62. Кузьмина, Т.И. Участие элементов цитоскелета в освобождении Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тр. междунар. науч. конф. / ПНЦ РАН. – Пущино, 2011. – С. 364-368.
63. Денисенко, В.Ю. Кальций как индикатор функционального состояния ооцитов при созревании in vitro / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Теоретические и практические аспекты оологии в современной зоологии: тр. междунар. науч. конф. / – Киев, 2011. – С. 264-267.
64. Денисенко, В.Ю. Влияние нокодазола на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо витрифицированных ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Повышение интенсивности и конкурентноспособности отраслей животноводства: тр. междунар. науч. конф. / – Жодино, 2011. – С. 41-42.
65. Кузьмина, Т.И. Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо криоконсервированных ооцитов свиней, стимулированных СТГ / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко // Современные технологии сельскохозяйственного производства: тр. XIV междунар. науч. конф. / – Гродно, 2011. – С. 77-79.
66. Денисенко, В.Ю. Флуктуация кальция в витрифицированных ооцитах свиней при воздействии на них ингибитора протеинкиназы А / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Современные технологии сельскохозяйственного производства: тр. XIV междунар. науч. конф. / – Гродно, 2011. – С. 41-42.
67. Денисенко, В.Ю. Влияние негидролизуемого аналога ГТФ на стимулированное ГТФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней / В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет: тр. II Всерос. конф. / Цитология. 2012. – Т. 54, №. 1. – С. 91-92.
68. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И. Способ доставки биологически активных веществ в клетки. Патент № 2421226.
