Патоморфология экспериментального туберкулеза у белых крыс
На правах рукописи
КАНДЫБИНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА
ПАТОМОРФОЛОГИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
У БЕЛЫХ КРЫС
06.02.01. – диагностика болезней и терапия животных, патология,
онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Благовещенск – 2011
Работа выполнена в ГНУ «Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» Россельхозакадемии
Научный руководитель: доктор медицинских наук
Макаров Игорь Юрьевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Хибхенов Лопсондоржо Владимирович
кандидат биологических наук, доцент
Остякова Марина Евгеньевна
Ведущая организация:
ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»
Защита состоится 14 декабря 2011 года в 13-00 на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» по адресу: 675005, Амурская область, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» (675005, Амурская область, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86).
Автореферат разослан «___» ноября 2011 г.
Автореферат размещен на сайте: www.dalgau.ru
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук, доцент Самусенко О.Л.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Туберкулез – одно из самых распространенных инфекционных заболеваний, принадлежащее к числу межвидовых инфекций, возбудители которых склонны к циркуляции среди многих видов животных и человека (А.М. Колычев с соавт., 1991; А.С. Донченко, В.Н. Донченко, 1994; В.В. Селиверстов с соавт., 2000; Удальцов Е.А., 2001; Н.П. Овдиенко с соавт., 2002, 2003; Боганец Н.С. с соавт., 2006; Найманов А.Х. с соавт., 2009; Кассич Ю.Я. с соавт., 2010; Iivanainen Е.К., et al, 1997; Fine P.E.M. et al, 2001; Cook K.L. et al., 2010; Schiller I. et al., 2010).
В настоящее время все более отчетливо проявляются изменения в характере этого заболевания. В результате эволюции происходит адаптация микобактерий туберкулеза к меняющимся условиям окружающей среды, формирование высоковирулентных и лекарственно-устойчивых штаммов, изменение патогенных свойств и диагностически значимых признаков. В результате специфичные для туберкулезного воспаления признаки претерпевают изменения – патоморфоз (Земскова З.С., Дорожкова И.Р.,1984; Чернушенко Е.Ф. и др., 1984; Ерохин В.В., Земскова З.С., 2003; В.В. Кутырев, 2008; Бехтер М.Г., 2010; Cassidi J.P. et al.,1999; Gavier-Widen D., Chambers M.A. et al., 2001; Khvitia H., Kheshinashvili T., 2002). Кроме того, возрастает роль различных видов нетуберкулезных микобактерий в инфекционной патологии человека и животных (А.М. Кадочкин с соавт., 1984; В.П. Шишков с соавт., 1986; А.В. Сибирный, 1997; Н.П. Овдиенко, 1999; Т.Ф. Оттен, 1994, 2003; А.Л. Лазовская с соавт., 2002, 2006; В.В. Шумская, 2006; J.A. Newton et al., 1993; H. Kentrup et al., 1997; T.B. Veklgaard et al., 1997; L. Mtlova et al., 1998; А. Knippel et al., 2004).
Учитывая изложенное выше, а также небольшое количество морфологических работ, посвященных сравнительному изучению изменений в организме животных под действием микобактерий разных видов и с разными биологическими свойствами, проведенное исследование представляется актуальным.
Цель исследования.
Изучить в сравнительном аспекте морфологические реакции при экспериментальном заражении белых крыс микобактериями туберкулеза M. bovis, M. tuberculosis и атипичными микобактериями M. smegmatis и M. fortuitum при различной длительности эксперимента.
Задачи исследования.
1. Изучить культурально-морфологические свойства микобактерий, использованных в эксперименте.
2. Выявить макроскопические изменения в паренхиматозных органах белых крыс, зараженных микобактериями разных видов, при различной длительности эксперимента.
3. Изучить микроскопические изменения в органах белых крыс, зараженных туберкулезными и атипичными микобактериями, при различной длительности эксперимента.
4. Изучить цитологические особенности паренхиматозных органов и лимфоузлов белых крыс, зараженных разными видами микобактерий, при различной длительности эксперимента.
Научная новизна.
Впервые изучены клеточные и тканевые реакции у белых крыс при инфицировании их микобактериями туберкулеза бычьего и человеческого видов и быстрорастущими атипичными микобактериями в сравнительном аспекте при различной длительности эксперимента.
Теоретическая и практическая значимость.
Разработан комплекс морфометрических параметров для оценки состояния органов белых крыс при заражении туберкулезными микобактериями с типичными и измененными свойствами и атипичными быстрорастущими микобактериями. Проведена сравнительная оценка морфологического состояния паренхиматозных органов крыс при заражении разными видами микобактерий. Предложена методика воспроизведения экспериментального туберкулеза легких на крысах, позволяющая длительное время (3,5 месяца) изучать биологические свойства микобактерий разных видов. По результатам морфологических исследований подготовлены методические рекомендации «Морфологические реакции при экспериментальном заражении белых крыс микобактериями туберкулеза M. bovis, M. tuberculosis и атипичными микобактериями M. smegmatis и M. fortuitum».
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ДальЗНИВИ (2003-2011); на научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 27-28 апреля, 2005); на научно-практической конференции «Болезни животных Дальнего Востока» (Благовещенск, 2006); на общеуниверситетской тематической конференции, посвященной 150-летию Амурской области и 15-летию преобразования БСХИ в ДальГАУ (Благовещенск, 2008); на научно-практической конференции «Современные проблемы исследований в биологии» (Благовещенск, 2009).
Основные положения и выводы, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании сотрудников ГУ ДальЗНИВИ (2009).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Заражение животных микобактериями M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и лабораторным штаммом M. tuberculosis H37Rv сопровождалось наибольшим объемом поражения легочной ткани с преобладанием альтеративно-экссудативных реакций. Микобактерии M. smegmatis и M. fortuitum вызвали неспецифическое воспаление в легочной ткани белых крыс во все сроки исследования.
2. Микобактерии M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью обладали наибольшей жизнеспособностью во все сроки эксперимента по сравнению с M. bovis и M. tuberculosis H37Rv. M. smegmatis и M. fortuitum в мазках-отпечатках и посевах из органов крыс не обнаружены.
3. Наиболее выраженные морфофункциональные изменения наблюдались в иммунных органах животных, зараженных микобактериями туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. Заражение атипичными микобактериями M. smegmatis и M. fortuitum не вызвало достоверно значительных морфофункциональных изменений в иммунных органах.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, выводов и списка литературы, включающего 293 источника, в том числе 78 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 42 рисунками, содержит 14 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Распределение экспериментального материала
Эксперимент проводили на 100 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г, прошедших адаптацию к условиям вивария в течение двух недель перед заражением. Животных содержали на стандартном рационе со свободным доступом к воде.
Крыс разделили на 5 групп по 20 животных в каждой в зависимости от видов микобактерий, отобранных для заражения. Контролем служила одна группа интактных животных (n=20). Длительность эксперимента составила 1,5 и 3,5 месяца (таблица 1).
Культура M. bovis была выделена от крупного рогатого скота из неблагополучного по туберкулезу пункта; мультирезистентная культура M. tuberculosis получена от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом; атипичные микобактерии M. smegmatis и M. fortuitum изолированы из объектов внешней среды оздоровленного и неблагополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств.
На каждом этапе исследований животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом и проводили бактериоскопические, культуральные и патоморфологические исследования.
Таблица 1
Распределение животных в зависимости от вида вводимых микобактерий и длительности эксперимента
| № группы | Вид микобактерий | Количество животных в разные сроки эксперимента | |
| 1,5 месяца | 3,5 месяца | ||
| 1 | M. bovis | 10 | 10 |
| 2 | M. tuberculosis МЛУ | 10 | 10 |
| 3 | M. tuberculosis H37Rv | 10 | 10 |
| 4 | M. smegmatis | 10 | 10 |
| 5 | M. fortuitum | 10 | 10 |
2. Моделирование туберкулеза легких у белых крыс
Суспензии из культур микобактерий, выращенных на плотной питательной среде ФАСТ-3Л, готовили по навеске на торсионных весах ВТ-500.
Туберкулез легких моделировали введением в легкое 1 мг микробной массы в 0,2 мл физиологического раствора натрия хлорида каждому животному (Чернышев В.Ф., Бондарев И.М., Новоселова В.П., 1967).
Суспензии микобактерий M. smegmatis и M. fortuitum вводили тем же способом и в тех же дозах.
3. Патологоанатомические исследования
Определяя макроскопические патологоанатомические изменения в органах крыс, в первую очередь обращали внимание на вид легочной паренхимы. Комплексную количественную оценку степени поражения легких проводили по методике Н.А. Александровой и Б.М. Ариэль (1993), определяя в баллах выраженность экссудативных и продуктивных изменений.
Оценивали воздушность (В) легочной паренхимы, окружающей видимые невооруженным глазом очаговые продуктивные изменения, и степень выраженности продуктивной реакции (Р), т.е. количество четко сформированных очагов.
4. Бактериоскопические исследования
Для оценки состояния микобактериальной популяции в паренхиматозных органах крыс готовили мазки-отпечатки из легких, печени, селезенки и почек, высушивали при комнатной температуре, фиксировали над пламенем спиртовки, окрашивали по методу Циля-Нильсена и подвергали бактериоскопии.
Микроскопию окрашенных препаратов производили в световом бинокулярном микроскопе Micros (Австрия) с иммерсионным объективом х100 и окулярами х10.
При небольшом количестве бацилл в мазках их количество подсчитывали в 100 полях зрения, если же бацилл было достаточно много, то просматривали 20-30 полей в разных местах и выводили средний показатель на одно поле зрения. Оценивали количество микобактерий в мазках-отпечатках следующим образом:
от 1 на 100 полей зрения до 1 на 10 полей зрения ±
от 1 на 9 полей зрения до 1 на 1 поле зрения +
2-10 на одно поле зрения ++
11-50 на одно поле зрения +++
свыше 50 в 1 поле зрения ++++
Затем выводили индекс количества микобактерий, принимая + за единицу, а ± за 0,5 (Першин Г.Н., 1971).
5. Культуральные исследования
Для культурального исследования отбирали лимфоузлы и кусочки легких, печени, почек, селезенки. Каждый образец материала обрабатывали по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши. Затем центрифугировали в течение 10-15 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок дважды отмывали стерильным физиологическим раствором натрия хлорида, центрифугируя при том же режиме. Подготовленный материал высевали на 10 пробирок плотной питательной среды ФАСТ-3Л. Посевы инкубировали при 37оС. Для выявления начального роста пробирки с посевами просматривали не реже одного раза в неделю “Наставление по диагностике туберкулеза животных” (2002).
У полученных культур микобактерий определяли скорость (длительность роста в сутках со дня посева) и массивность роста (количество выросших колоний во всех пробирках) как показатели одного из биологических свойств – жизнеспособности (Вишневский Б.И. с соавт., 1991). Появление колоний микобактерий в срок до 30 дней оценивали как быстрый рост, более 30 дней – как замедленный. Оценка массивности роста: до 20 колоний – скудный, 20-100 – умеренный, свыше 100 – обильный (А.Г. Хоменко, 1996).
Кроме того, у полученных культур определяли характер роста и характеристики колоний (величину, форму, поверхность, рельеф, консистенцию, пигментообразование), а также морфологию микобактериальных клеток “Наставление по диагностике туберкулеза животных” (2002).
6. Гистологические и морфометрические исследования
Для гистологических исследований лимфоузлы и кусочки легких, тимуса, селезенки, печени, почек фиксировали в 10%-ном забуференном формалине. Фиксированные кусочки органов промывали в проточной воде в течение 24 часов, затем обезвоживали в спиртах восходящей крепости, последовательно переносили в две порции касторового масла, две порции хлороформа, затем – в смесь парафина с хлороформом, после выдерживали в двух порциях чистого парафина при температуре 56оС и, наконец, заливали смесью парафина с воском. Полученные парафиновые блоки наклеивали на деревянные колодки и делали срезы толщиной 5-6 мкм на санном микротоме МС-2. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, Цилю-Нильсену и заключали в канадский бальзам (Меркулов Г.А., 1969).
Для морфометрического исследования использовали окулярный микрометр МОВ-1-15 и окулярную сетку для цитогистостереоскопических исследований со 100 и 25 равноудаленными точками нулевой толщины (Автандилов Г.Г., 1990).
В легких определяли площадь пораженной легочной ткани в процентах и количество лимфонодулей в поле зрения. В тимусе определяли относительный объем паренхимы, подсчитывали количество тимических телец в дольке, вычисляли среднюю площадь дольки и лимфоэпителиальный коэффициент (Барсуков В.С., 1993). В селезенке и лимфоузлах определяли удельную площадь, занимаемую фолликулами, диаметр фолликулов с последующим вычислением площади, ширину Т-зон, процентное содержание лимфобластов в фолликулах селезенки и плазматических клеток в красной пульпе. В лимфоузлах определяли количество лимфоцитов тимусзависимых зон на 1000 мкм2.
7. Статистическая обработка материала
Цифровой материал подвергнут проверке выборочного распределения на нормальность по критериям Колмогорова-Смирнова и омега квадрат (2). При нормальном (гауссовом) распределении данных применялись параметрические методы с вычислением выборочного среднего (М), ошибки среднего (m), выборочной дисперсии и стандартного отклонения. Статистическую значимость различий сравниваемых величин определяли на основании t-критерия Стьюдента. Различия между средними величинами считали статистически значимыми при р<0,05. Статистическую компьютерную обработку проводили с использованием программ «Microsoft Office Excel» и «Статистика».
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Макроскопические изменения в органах белых крыс, зараженных разными видами микобактерий
Внутрилегочное заражение белых крыс микобактериями туберкулеза вызывало специфические макроскопические изменения только в легких на всем протяжении эксперимента.
В легких животных 2-й и 3-й групп, обнаружены многочисленные субмилиарные и милиарные очажки серого цвета, иногда сливающиеся между собой. В легочной паренхиме – многочисленные безвоздушные участки. В 1-й группе макроскопические изменения в легких были представлены единичными безвоздушными участками и многочисленными субмилиарными очажками. Кроме того, у крыс этих групп отмечали гиперплазию лимфатических узлов, а также застойную гиперемию в паренхиматозных органах.
У животных, зараженных микобактериями M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и лабораторным штаммом H37Rv, морфологические изменения характеризовались большим объемом поражения с интенсивным увеличением альтеративно-экссудативных реакций к 3,5 месяцам. У крыс, зараженных микобактериями вида M. bovis, специфические реакции в легочной ткани были менее выражены во все сроки эксперимента (таблица 2).
Культуры быстрорастущих микобактерий M. smegmatis и M. fortuitum не вызвали видимых изменений в органах крыс.
Таблица 2
Степень выраженности макроскопических изменений в легких белых крыс, зараженных микобактериями туберкулеза, балл (M±m)
| № группы | Вид микобактерий | Срок исследования | |
| 1,5 месяца | 3,5 месяца | ||
| 1 | M. bovis | 1,5±0,10 Р<0,001 | 1,7±0,10 Р<0,001 |
| 2 | M. tuberculosis МЛУ | 2,5±0,15 Р1<0,01 | 3,2±0,14 Р1<0,01 |
| 3 | M. tuberculosis H37Rv | 1,7±0,13 | 2,3±0,16 Р2<0,01 |
Примечание: Р – достоверность различий между 1-й и 2-й группами, Р1 – между 2-й и 3-й группами, Р2 – между 3-й и 1-й группами.
- Микробиологические показатели паренхиматозных органов и лимфоузлов белых крыс, зараженных разными видами микобактерий.
Микобактерии M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью обладали наибольшей жизнеспособностью во все сроки эксперимента по сравнению с M. bovis и M. tuberculosis H37Rv.
Через 1,5 и 3,5 месяца от начала эксперимента при бактериоскопическом исследовании мазков-отпечатков из легких крыс 2-й и 3-й групп, обнаружено достоверно (Р<0,01, Р<0,001) большее количество микобактерий по сравнению с 1-й группой. Микобактерии имели преимущественно внутриклеточную локализацию, располагаясь в цитоплазме макрофагов в виде скоплений. У животных 2-й группы через 1,5 месяца бактериоскопические показатели селезенки, печени и почек были больше, чем в 1-й группе (Р<0,01) и 3-й группе (Р<0,05). В 3,5 месяца достоверность различий между показателями 1-й и 2-й групп сохранялась (таблица 3). В этих органах микобактерии туберкулеза обнаруживались в виде небольших скоплений или поодиночке.
Через 1,5 месяца от начала эксперимента в пробирках с посевами из легких и лимфатических узлов крыс 2-й группы первичный рост микобактерий обнаружен достоверно (Р<0,001) раньше, чем в группах сравнения. Через 3,5 месяца в посевах из легких крыс 2-й группы первичный рост появился в среднем через 19,3 суток. Это на 1 сутки раньше, чем в группах сравнения (Р>0,05). Отмечено, что скорость роста микобактерий из легких животных 1-й и 3-й групп увеличилась в среднем на 2 суток, а во 2-й группе снизилась на 6,5 суток по сравнению с 1,5 месяцами от начала эксперимента. Достоверная разница (Р<0,001) в скорости появления первичного роста колоний обнаружена только в посевах из почек животных 2-й и 3-й групп в сравнении с 1-й группой.
Количество выросших колоний из органов крыс 2-й группы было больше, чем в группах сравнения, во все сроки эксперимента. В пробирках с посевами из легких животных 2-й группы выросло в 1,5 раза больше колоний, чем в 1-й группе (Р<0,01), и в 1,2 раза больше, чем в группе 3 (Р>0,05). Кроме того, обнаружена статистически значимая разница (Р<0,05, Р<0,001) в количестве колоний, выросших из печени и селезенки животных 1-й, 2-й и 3-й групп (таблица 4).
Таблица 3
Результаты бактериоскопического исследования мазков-отпечатков паренхиматозных органов белых крыс в разные сроки эксперимента, Ед. (M±m)
| Объект исследования | Группа | ||
| 1 | 2 | 3 | |
| 1,5 месяца | |||
| легкие | 0,8±0,15 | 2,5±0,34 Р<0,001 | 1,9±0,31 Р1<0,01 |
| селезенка | 0,4±0,08 | 0,8±0,08 Р<0,01 | 0,5±0,11 |
| печень | 0,3±0,08 | 0,7±0,11 Р<0,01, Р2<0,05 | 0,4±0,08 |
| почки | 0,3±0,08 | 0,6±0,05 Р<0,01 | 0,5±0,09 |
| 3,5 месяца | |||
| легкие | 1,2±0,19 | 2,9±0,32 Р<0,001 | 2,1±0,28 Р1<0,05 |
| селезенка | 0,5±0,12 | 0,9±0,08 Р<0,05, Р2<0,05 | 0,6±0,07 |
| печень | 0,4±0,08 | 0,8±0,08 Р<0,01 | 0,8±0,08 Р1<0,01 |
| почки | 0,4±0,08 | 0,7±0,08 Р<0,01 | 0,7±0,08 Р1<0,05 |
Примечание: Р – достоверная разница между 2 и 1 группами, Р1 – между 3 и 1 группами, Р2 – между 2 и 3 группами.
Результаты бактериоскопического и культуральньного исследований подтвердили наличие гематогенной дессиминации у животных, зараженных микобактериями туберкулеза: через 1,5 месяца после заражения микобактерии обнаруживали во всех паренхиматозных органах крыс. Через 1,5 и 3,5 месяца микобактерии туберкулеза всех видов обладали быстрым ростом.
Таблица 4
Количество колоний микобактерий туберкулеза, выросших из органов крыс через 1,5 и 3,5 месяца от начала эксперимента (M±m)
| Объект исследования | Группы | ||
| 1 | 2 | 3 | |
| 1,5 месяца | |||
| лимфоузлы | 50,5±6,48 | 61,9±8,83 | 50,8±4,65 |
| легкие | 85,2±3,73 | 95,1±9,74 | 88,2±7,26 |
| селезенка | 34,9±3,77 | 61,0±8,71 Р<0,05, Р1<0,05 | 35,1±4,74 |
| печень | 42,8±3,37 | 76,5±4,55 Р<0,001, Р1<0,001 | 73,8±5,44 |
| почки | 21,1±2,91 | 27,0±2,66 | 27,0±3,34 |
| 3,5 месяца | |||
| лимфоузлы | 37,3±6,48 | 47,4±4,15 | 41,7±3,79 |
| легкие | 85,4±7,09 | 123,7±0,29 Р<0,01 | 100,2±10,81 |
| селезенка | 31,5±2,22 | 54,3±3,76 Р<0,001, Р2<0,05 | 38,4±4,32 |
| печень | 37,3±3,34 | 93,8±5,67 Р<0,001, Р2<0,05 | 42,1±4,50 Р1<0,001 |
| почки | 21,8±2,04 | 28,1±2,98 | 25,0±3,34 |
Примечание: Р – достоверная разница между 2 и 1 группами, Р1 – между 2 и 3 группами, Р2 – между 2 и 3 группами.
Массивность роста через 1,5 месяца определялась как умеренная у всех культур. В 3,5 месяца у микобактерий M. tuberculosis с МЛУ и M. tuberculosis H37Rv регистрировали обильный рост колоний, что свидетельствовало о повышении их жизнеспособности. По данным Т.А. Вассимирской с соавт. (2008) существуют полирезистентные штаммы микобактерий, обладающие пониженной жизнеспособностью, которые дают очень скудный рост или вовсе не растут на существующих питательных средах. Однако, есть сообщения, что биологическая активность лекарственно-устойчивых микобактерий туберкулеза по сравнению с их чувствительными видами характеризуется более массивным ростом и более медленной скоростью роста на плотных питательных средах (В.И. Голышевская с соавт., 1995, J. Timm et al., 2006). Нами установлено, что клинический изолят микобактерий M. tuberculosis с МЛУ обладал наибольшей жизнеспособностью во все сроки эксперимента по сравнению с M. bovis и M. tuberculosis H37Rv (Р<0,001; Р<0,01; Р<0,05), что характеризовалось массивным и быстрым ростом колоний на питательной среде.
В мазках-отпечатках и посевах из органов крыс, зараженных M. smegmatis и M. fortuitum, во все сроки эксперимента микобактерии не обнаружены.
- Патоморфологические изменения в органах белых крыс, зараженных разными видами микобактерий
- 3.1 Морфологические изменения в легких
Внутрилегочное введение крысам микобактерий туберкулеза вызвало развитие прогрессирующего специфического воспаления в обоих легких с тенденцией к гематогенной диссеминации. При гистологическом исследовании через 1,5 месяца от начала эксперимента в легких определялась субтотальная интерстициальная пневмония с эпителиоидно-клеточными гранулемами, состоящими из светлых пенистых макрофагов, лимфоцитов и единичных многоядерных клеток. Воздушность легочной паренхимы была резко снижена. В строме легкого – перибронхиальная и периваскулярная лимфоидная инфильтрация, межальвеолярные перегородки обильно инфильтрированы лимфоцитами, гистиоцитами и нейтрофилами.
У крыс 2-й группы площадь пораженной легочной ткани была достоверно больше (Р<0,001), чем в 1 и 3 группах в 1,6 и 1,5 раза соответственно. В препаратах из легких, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживали скопления типичных палочковидных микобактерий туберкулеза.
К 3,5 месяцам от начала эксперимента в легочной ткани крыс 1-й, 2-й и 3-й групп сохранялась субтотальная интерстициальная пневмония. Объемная плотность очагов поражения легочной ткани у крыс 2-й группы была в 1,6 и 1,4 раза больше, чем в 1-й и 3-й группах соответственно (Р<0,001). В легких определялись сливающиеся между собой туберкулезные гранулемы с очаговыми явлениями кариопикноза и кариорексиса в центре и обильной лимфоидно-макрофагальной инфильтрацией по периферии, в интерстиции и межальвеолярных перегородках – единичные лимфонодули. По данным В.И. Брауде (1981, 1982) при становлении хронического туберкулеза в легком происходит массовое формирование новых, правильно построенных лимфоидных фолликулов, которые сосредотачиваются главным образом вокруг очага деструкции и хронического воспаления. Эти фолликулы играют важную роль в иммунной защите легких. Количество лимфонодулей в легких крыс 2-й и 3-й групп достоверно (Р<0,01, Р<0,05) превышало показатели в 1-й группе. Результаты гистологического исследования легких представлены в таблице 5.
Таким образом, гистологические исследования выявили однотипные изменения в легких крыс, зараженных микобактериями туберкулеза. Однако при инокуляции экспериментальным животным M. tuberculosis с МЛУ определялся наибольший объем поражения легочной ткани с преобладанием альтеративно-экссудативных процессов во все сроки эксперимента. Учитывая то, что объем пораженной легочной ткани прямо пропорционален дозе заражения и вирулентности той или иной культуры микобактерий туберкулеза (С.Н. Васильева с соавт., 2003), можно говорить о более высоких вирулентных свойствах клинического штамма по сравнению с M. bovis и M. tuberculosis H37Rv.
Таблица 5
Морфометрические показатели туберкулезного процесса в легких белых крыс при различной длительности эксперимента (M±m)
| Показатели | Группы | ||
| 1 | 2 | 3 | |
| 1,5 месяца | |||
| площадь пораженной легочной ткани, % | 44,9±0,61 Р2<0,05 | 72,4±2,77 Р<0,001 | 48,9±1,31 Р1<0,001 |
| количество лимфонодулей в поле зрения | 1,3±0,05 | 1,5±0,09 | 1,5±0,06 |
| 3,5 месяца | |||
| площадь пораженной легочной ткани, % | 47,7±0,33 Р2<0,001 | 77,1±1,69 Р<0,001 | 54,4±1,21 Р1<0,001 |
| количество лимфонодулей в поле зрения | 1,4±0,08 Р2<0,05 | 1,9±0,14 Р<0,01 | 1,7±0,11 |
Примечание: Р – разница между 1 и 2 группами, Р1 – между 2 и 3 группами, Р2 – между 1 и 3 группами.
В легких крыс, зараженных микобактериями M. smegmatis и M. fortuitum, воздушность была сохранена. Во все сроки эксперимента находили участки неспецифического воспаления (небольшие перибронхиальные и периваскулярные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов). Полученные нами данные согласуются с результатами исследований А.В. Акулова с соавт. (1967), Э.Л. Колосковой (2007), которые через 3-3,5 месяца после заражения морских свинок и кроликов кислотоустойчивыми сапрофитами наблюдали неспецифические реакции в легких в виде диффузной лейкоцитарной инфильтрации и неспецифических бронхитов, а также лимфоидных и лимфоидно-гистиоцитарных узелков, содержащих плазматические клетки и светлые крупные макрофаги.
3.2 Морфофункциональные изменения в лимфатических узлах
Через 1,5 месяца от начала эксперимента в лимфоузлах у крыс 1-й, 2-й и 3-й групп, зараженных микобактериями туберкулеза, отмечалась умеренная атрофия фолликулов. Это выражалось в достоверном уменьшении их относительного объема и диаметра по сравнению с интактным контролем (Р<0,001) и группами, зараженными атипичными микобактериями (Р<0,001, Р<0,01, Р<0,05) (рисунок 1).
Рис. 1 Средний диаметр фолликулов лимфоузлов у белых крыс, зараженных различными видами микобактерий, при длительности эксперимента 1,5 месяца
Наблюдали увеличение количества плазматических клеток в синусах и мякотных тяжах и тучных клеток вокруг сосудов капсулы лимфатических узлов, а также пролиферацию макрофагальных элементов.
Через 3,5 месяца в группах, зараженных микобактериями туберкулеза, сохранялось нарушение структуры лимфоузлов. Относительный объем и средний диаметр фолликулов были достоверно (Р<0,001) меньше аналогичных показателей интактного контроля и групп, зараженных атипичными микобактериями. Отмечалось сужение паракортикальной зоны, ее объемная плотность была достоверно (Р<0,001) меньше по сравнению с интактным контролем и группами, зараженными атипичными микобактериями. Клеточное опустошение этой зоны сопровождалось миграцией лимфоцитов в посткапиллярные венулы. Количество лимфоцитов Т-зоны в условной единице площади достоверно (Р<0,001, Р<0,01) снизилось по отношению к группам сравнения.
Морфофункциональные показатели лимфатических узлов крыс 4-й и 5-й групп через 1,5 и 3,5 месяца были приближены к таковым в интактном контроле. В лимфатических узлах граница между корковым и мозговым слоями была хорошо различимой. Большая часть фолликулов содержала светлые центры. Отмечалась гиперемия ткани органа, в светлых центрах определялись единичные свободные макрофаги с мелкими гранулами-включениями.
3.3 Морфофункциональные изменения в селезенке
Через 1,5 месяца от начала эксперимента у крыс 1-й, 2-й и 3-й групп отмечали умеренную атрофию лимфоидных фолликулов. Достоверно (Р<0,001) снизились относительный объем, площадь фолликулов и средняя ширина периартериальных Т-зон по сравнению с интактными животными. Количество лимфобластов в фолликулах увеличилось, однако достоверной разницы с аналогичным показателем интактных крыс не обнаружено. В маргинальных зонах присутствовали единичные мегакариоцитоподобные клетки. Определялось достоверное (Р<0,05, Р<0,001) увеличение количества плазматических клеток в красной пульпе по сравнению с интактным контролем.
Через 3,5 месяца от начала эксперимента в 1-й, 2-й и 3-й группах сохранялись признаки истощения белой пульпы. В красной пульпе появилось значительное количество плазматических клеток. У крыс 2-й группы к 3,5 месяцам тимусзависимые зоны лимфоидных фолликулов опустошались вплоть до обнажения сети ретикулярных волокон. Это сопровождалось достоверным (Р<0,001) снижением относительного объема, площади фолликулов, ширины Т-зон и плазматизацией красной пульпы по сравнению с интактным контролем и группами, зараженными микобактериями туберкулеза M. bovis и M. tuberculosis H37Rv.
У крыс 4-й и 5-й групп через 1,5 и 3,5 месяца относительный объем фолликулов, их площадь и ширина Т-зон достоверно отличаются (Р<0,05, Р<0,01) от показателей интактного контроля (рисунок 2).
Рис. 2 Ширина периартериальной Т-зоны у белых крыс, зараженных разными видами микобактерий, через 3,5 месяца от начала эксперимента
Таким образом, туберкулезный процесс сопровождался изменениями в иммунокомпетентных органах белых крыс. Известно, что туберкулез является классическим примером воспаления на иммунной основе. Многочисленными клиническими и экспериментальными исследованиями доказано наличие иммунной недостаточности при туберкулезе (М.М. Авербах с соавт., 1989; В.Ю. Мишин, 1995; Б.М. Малиев с соавт., 2005; B. Abel, 2002; T. Cagatay et al., 2005; G. Delogu et al., 2006). Ведущая роль в сопротивляемости организма туберкулезу отводится клеточному иммунитету в основе которого лежит активация макрофагов и эффекторное воздействие их на Т- и В-лимфоциты. Определенное значение имеют и гуморальные факторы (Г.Ф. Коромыслов, В.Л. Солодовников, 1982; В.И. Литвинов с соавт., 1988; В.С. Власенко с соавт., 2008; A.M. Dannenberg, 1989; H.H. Maes et al., 1999; H.E. Kennedy et al., 2002; R. Zhang et al., 2006).
Сравнительный анализ динамики показателей органов иммуногенеза свидетельствует о более выраженных однонаправленных изменениях у крыс, зараженных клиническим штаммом микобактерий туберкулеза с МЛУ, во все сроки эксперимента. Морфофункциональное состояние лимфатических узлов и селезенки у этих животных указывало на то, что реакции клеточного иммунитета снижались на фоне сохранения и усиления гуморального звена.
3.4 Морфофункциональные изменения в тимусе
Через 1,5 и 3,5 месяца у животных 1-й, 2-й и 3-й групп, зараженных микобактериями туберкулеза, в тимусе проявлялись морфологические признаки истощения его структур. Дольки уменьшились в размере, граница между корковым и мозговым слоями нечеткая. Определялось достоверное (Р<0,05, Р<0,001) уменьшение относительного объема паренхимы (рисунок 3), средней площади дольки, количества тимических телец и лимфоидно-эпителиального соотношения по сравнению с интактным контролем (рисунок 4). Тельца Гассаля были представлены мелкими кистоподобными образованиями со стенками из атрофичных удлиненных эпителиальных клеток с нечеткими ядрами. В результате убыли лимфоцитов в мозговом слое отмечалось увеличение удельного веса ретикуло-эпителиальных клеток. Иногда в дольках тимуса крыс 2-й группы определялись очаговые скопления эпителиоидных клеток. Полученные нами результаты согласуются с экспериментальными данными И.Л. Егоровой с соавт. (1994), которые свидетельствуют о значительном уменьшении объемной плотности коркового вещества тимуса у крыс, зараженных внутрилегочно микобактериями туберкулеза.
Морфометрические показатели тимуса крыс 4-й и 5-й групп, зараженных атипичными микобактериями, не имели достоверных отличий от аналогичных показателей незараженных животных во все сроки эксперимента.
Рис. 3 Относительный объем паренхимы тимуса крыс, зараженных различными видами микобактерий, через 1,5 месяца от начала эксперимента
Рис. 4 Лимфоэпителиальное соотношение в тимусе крыс, зараженных разными видами микобактерий, при длительности эксперимента 3,5 месяца
Морфофункциональные изменения в тимусе у крыс, зараженных микобактериями туберкулеза, свидетельствуют о развитии акцидентальной инволюции, которая сохранялась и усиливалась к 3,5 месяцам. Наиболее отчетливо этот процесс определялся в вилочковой железе животных, зараженных клиническим изолятом микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью.
3.5 Патоморфологические изменения в печени и почках
Через 1,5 и 3,5 месяца от начала эксперимента у животных, зараженных микобактериями туберкулеза, в печени отмечали застойную гиперемию. В некоторых участках паренхимы гепатоциты окрашивались однородно и более интенсивно, в них обнаруживали пикнотичные ядра или их тени. В портальных трактах и между печеночными трабекулами определялись очаговые инфильтраты из лимфоцитов, гистиоцитов и единичных плазматических клеток. Специфические изменения были представлены небольшими туберкулезными бугорками, состоящими из эпителиоидных клеток.
Через 1,5 и 3,5 месяца от начала эксперимента в почках животных 1-й, 2-й и 3-й групп, зараженных микобактериями туберкулеза, отмечали резкое полнокровие вен и капилляров, кровоизлияния в корковом и мозговом веществах. В почечных тельцах определялись отек и сужение просвета между сосудистым клубочком и капсулой. В некоторых участках эпителий канальцев был набухшим, с пикнотичными ядрами или вовсе без них. В цитоплазме эпителиоцитов определялись круглые включения разных размеров, интенсивно окрашивающиеся эозином, или вакуоли. Часто в просвете канальцев находили гомогенные или сетчатые оксифильные массы или отделившиеся от базальной мембраны пласты эпителиальных клеток. У крыс 2-й группы в некоторых участках паренхимы находили только контуры канальцев. Их просвет был заполнен аморфными массами или крупными гиалиновыми каплями. Вокруг клубочков и между канальцами определялись небольшие лимфогистиоцитарные инфильтраты и единичные эпителиоидные и плазматические клетки. У крыс, зараженных атипичными микобактериями, морфологическая картина почек не отличалась от интактного контроля.
Таким образом, в печени и почках крыс, зараженных микобактериями туберкулеза, морфологические изменения были представлены глубокими дистрофическими нарушениями и некробиотическими процессами во все сроки эксперимента. У крыс 2-й группы эти нарушения были наиболее выраженными. У животных 4-й и 5-й групп, зараженных атипичными микобактериями, морфологических изменений в печени и почках не обнаружено.
ВЫВОДЫ
1. У животных, зараженных микобактериями M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и лабораторным штаммом M. tuberculosis H37Rv, изменения характеризовались наибольшим объемом поражения легочной ткани с преобладанием альтеративно-экссудативных реакций во все сроки исследования.
2. Быстрорастущие нетуберкулезные микобактерии M. smegmatis и M. fortuitum вызвали очаговые неспецифические воспаленные изменения в легочной ткани белых крыс, проявляющееся в виде небольших перибронхиальных и периваскулярных лимфоидных инфильтратов через 1,5 месяца и очажков неспецифической пневмонии к 3,5 месяцам.
3. Микобактерии M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью обладали наибольшей жизнеспособностью во все сроки эксперимента по сравнению с M. bovis и M. tuberculosis H37Rv, что характеризовалось массивным и быстрым ростом колоний на питательной среде. Через 1,5 и 3,5 месяца от начала эксперимента в мазках-отпечатках и посевах из органов крыс, зараженных M. smegmatis и M. fortuitum, микобактерии не обнаружены.
4. Морфофункциональное состояние лимфоузлов, селезенки белых крыс, зараженных микобактериями туберкулеза, через 1,5 месяца от начала эксперимента свидетельствует о снижении клеточного иммунитета и усилении его гуморального звена. В тимусе определялись морфологические признаки акцидентальной инволюции. Через 3,5 месяца изменения в иммунных органах сохранялись и становились более отчетливыми. Наиболее выраженные морфофункциональные изменения наблюдались в иммунных органах животных, зараженных микобактериями туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.
5. Введение белым крысам атипичных микобактерий M. smegmatis и M. fortuitum не вызвало значительных изменений в иммунных органах. На всем протяжении эксперимента их морфофункциональные показатели были приближены к аналогичным показателям интактного контроля.
6. В печени и почках крыс, зараженных микобактериями туберкулеза, морфологические изменения были представлены глубокими дистрофическими нарушениями и некробиотическими процессами во все сроки эксперимента. У животных, зараженных атипичными микобактериями, морфологических изменений в печени и почках не обнаружено.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Макаров, И.Ю. Патоморфология экспериментального лекарственно-устойчивого туберкулеза / И.Ю. Макаров, Ю.А. Макаров, Т.В. Кандыбина // Ветеринарная патология. – 2004. – №1-2 (9). – С. 77–79.
2. Кандыбина, Т.В. Патоморфологические реакции при экспериментальном лекарственно-устойчивом туберкулезе / Т.В. Кандыбина, И.Ю. Макаров // Молодежь ХХI века: шаг в будущее : материалы шестой регион. науч.-практ. конф. / АмурНЦ ДВО РАН [и др.]. – Благовещенск, 2005. – Т. 3. – С. 146–148.
3. Кандыбина, Т.В. Патоморфологические реакции при экспериментальном заражении различными видами микобактерий / Т.В. Кандыбина // Болезни животных Дальнего Востока : сб. науч. тр. / ДальГАУ. – Благовещенск, 2006. – Вып. 2. – С. 28–32.
4. Кандыбина, Т.В. Микробиологические показатели внутренних органов белых крыс при экспериментальном заражении различными видами микобактерий / Т.В. Кандыбина // Проблемы зоотехнии, ветеринарии и биологии сельскохозяйственных животных на Дальнем Востоке : сб. науч. тр. / ДальГАУ. – Благовещенск, 2008. – Вып. 15. – С. 99–103.
5. Кандыбина, Т.В. Оценка морфологических изменений в легких и иммунных органах белых крыс при заражении различными видами микобактерий / Т.В. Кандыбина // Проблемы зоотехнии, ветеринарии и биологии сельскохозяйственных животных на Дальнем Востоке : сб. науч. тр. / ДальГАУ. – Благовещенск, 2008. – Вып. 15. – С. 104–111.
6. Кандыбина, Т.В. Морфофункциональная характеристика лимфатических узлов у белых крыс, зараженных разными видами микобактерий / Т.В. Кандыбина, И.Ю. Макаров // Современные проблемы исследований в биологии: сб. науч. тр. / РАСХН, ДВНЦ, ГНУ ВНИИ сои. – Благовещенск, 2009. – С. 55–58.
Кандыбина Татьяна Викторовна
ПАТОМОРФОЛОГИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
У БЕЛЫХ КРЫС
Автореферат
Подписано в печать 01.11.2011 г.
Усл. печ. листов 1,0. Тираж 100. Зак. № 673-2
Отпечатано в ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95
