Биотехнология синбиотических продуктов на молочной основе с использованием растительных бифидогенных волокон
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
На правах рукописи
Багдасарян Ашхен Сейрановна
БИОТЕХНОЛОГИЯ СИНБИОТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ НА МОЛОЧНОЙ ОСНОВЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАСТИТЕЛЬНЫХ БИФИДОГЕННЫХ ВОЛОКОН
Специальности 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов
(перерабатывающие отрасли АПК)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва 2007
Работа выполнена на кафедре технологии продуктов детского и функционального питания ГОУ ВПО Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ)
Научный руководитель:
Доктор технических наук,
профессор Э.С. Токаев
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Г.А. Донская
Кандидат технических наук,
доцент А.Н. Габараев
Ведущая организация: ОАО «НУТРИНВЕСТХОЛДИНГ»
Защита диссертации состоится « 5 » марта 2007 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.
Автореферат разослан «___» ________ 2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат технических наук, профессор А.Г. Забашта
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Стабильность микробных ассоциаций в кишечнике имеет чрезвычайно важное значение для жизнедеятельности человека и является одним из показателей его здоровья. Это обусловлено тем, что нормальная микрофлора является обязательным и полноправным участником многих физиологических процессов, протекающих в органах и тканях хозяина: пищеварения, выделения, дыхания, дифференцировки клеток, регуляции газового состава полостей и жидкостей, водно-солевого обмена, физико-химического гомеостаза, метаболизма углеводов, белков, липидов, стероидов, желчных кислот, детоксикации экзо- и эндогенных субстратов и метаболитов, продукции биологически активных соединений. В этой связи особого внимания заслуживает вопрос о поддержании микроэкологического равновесия в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Наиболее эффективный путь нормализации дисбаланса кишечного микробиоценоза заключается в применении синбиотиков (комплекс пробиотиков и пребиотиков) и продуктов на их основе, так как при этом, не только имплантируются вводимые микроорганизмы, но и стимулируется собственная микрофлора. Значение подобной продукции весьма актуально для России, в которой значительные слои населения проживают в экологически неблагоприятных регионах, работают в условиях вредных физических, химических и прочих воздействий, недостаточно или несбалансированно питаются, что приводит к возникновению кишечных дисбактериозов.
Сегодня перспективным приемом в создании синбиотических функциональных продуктов является поиск и внедрение в производство субстанций природного происхождения, обладающих одновременно технологической и физиологической функциональностью. Такими являются пищевые волокна, необходимость восполнения которых в рационе питания современного человека существует. Способность пищевых волокон воздействовать на полезную микрофлору кишечника, усиливать бактериальную ферментацию, проявлять адсорбирующий эффект, оказывать трофическое действие на слизистую оболочку тонкого кишечника позволяет создавать эффективные синбиотики и продукты на их основе.
Научные представления и практические основы в вышеизложенных направлениях заложены в трудах Гончаровой Г.С., Шендерова Б.А., В.Ф. Семенихиной, Храмцова А.Г., Харитонова В.Д., Шевелевой С.А., Донской Г.А., Евдокимова И.А., Рябцевой С.А., Гавриловой Н.Б., Остроумова Л.А., И.А. Рогова, Титова Е.И., Токаева Э.С., Ганиной В.И., Хорольского В.В., Sanders M.E., Fuller R., Tannock G.W., Gibson G.R., Shin H.S., Arai S., Morinaga Y.
Продукты функционального питания (ПФП) на молочной основе с пищевыми волокнами на отечественном рынке являются востребованными. Ограниченность сведений о создании синбиотических продуктов, потребность в которых существует, затрудняет производство подобной продукции. В этой связи разработка технологий синбиотических продуктов на молочной основе является актуальной.
Цель диссертационной работы - разработка технологии новых видов синбиотических продуктов (далее синбиотик) содержащих высокий титр бифидобактерий и способствующих нормализации деятельности ЖКТ на молочной основе с использованием растительных бифидогенных волокон, в частности гуммиарабика и композиции гуммиарабика и фруктоолигосахаридов (ФОС).
В соответствии с поставленной целью предусматривалось решение следующих задач:
- обосновать состав синбиотических продуктов;
- исследовать комплекс технологических и физиолого-биохимических свойств новых штаммов бифидобактерий и создать консорциум данных штаммов;
- исследовать влияния гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС на развитие и активность бифидобактерий в молоке;
- определить рациональные концентрации гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС и разработать способ их внесения;
- изучить характеристики синбиотических продуктов в процессе хранения и обосновать сроки годности;
- изучить терапевтическую эффективность готового продукта;
- разработать нормативную документацию на новые виды синбиотических продуктов.
Научная новизна - Изучены физиолого-биохимические и технологические свойства четырех новых штаммов бифидобактерий.
Получены новые данные о влиянии гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС на технологические и пробиотические свойства моно- и мультипробиотиков в молоке.
Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден состав новых питательных сред для развития и поддержания жизнеспособности бифидобактерий.
Впервые получены данные о количественных и качественных изменениях представителей микробиоценоза кишечника крыс после операционной эндотоксемии и на этом фоне оценена терапевтическая эффективность синбиотического продукта.
Практическая значимость работы – Разработаны состав питательной среды и технология получения синбиотических продуктов.
Предложен способ внесения гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС в молоко, разработан состав питательной среды для повышения термоустойчивости молока с гуммиарабиком.
Разработан эффективный способ получения кисломолочного продукта с высоким содержанием и активностью бифидобактерий с пребиотиками - гуммиарабиком или композицией фруктоолигосахаридов и гуммиарабика. Обоснована технологическая схема производства синбиотических продуктов.
На состав синбиотической композиции и способ ее получения подана заявка на патент (№ 2006143117 от 06.12.06).
На новые виды синбиотических продуктов разработан проект нормативной документации.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены в период 2004-2006 г.г. на Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания» (Москва 2004), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2004, 2005), Международной конференции «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2005), научных чтений «Кафедре технологии молока и молочных продуктов МГУПБ 60 лет» (Москва, 2005), Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 10 печатных работ и подана одна заявка на патент.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, содержащего 187 источников, 17 приложений.
Основная часть работы изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 37 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследований диссертационной работы.
Глава 1. Обзор литературы. Освещены современные сведения о роли и составе нормального микробиоценоза человека, характеристики его патологического состояния.
Проанализирован российский рынок функциональных продуктов на молочной основе, в частности продуктов, содержащих пробиотические культуры. Приведены современные сведения о роли пробиотиков, в частности бифидобактерий, в жизнедеятельности организма. Показан высокий потребительский спрос на продукты, содержащие пробиотики и необходимость целенаправленного подхода к разработке и производству бифидосодержащих продуктов.
Освещены понятия пребиотиков и спектр бифидогенных факторов, нормализующих микроэкологический статус толстой кишки. Приведены сведения о «in vivo» бифидогенном действии гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС. В доступных литературных источниках не обнаружено данных о бифидогенном действии гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС в условиях «in vitro».
Глава 2. Организация эксперимента, объекты и методы исследований. Исследование проводили на кафедре «Технология продуктов детского и функционального питания», отдельные фрагменты в лаборатории ПНИЛЭФМОПП, на кафедре «Технология молока и молочных продуктов» и в аккредитованном испытательном лабораторном центре «Биотест» Московского государственного университета прикладной биотехнологии. Исследование на лабораторных животных по изучению профилактических свойств синбиотических продуктов проводили в отделе экспериментальной патологии Московского городского НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского (зав. лабораторией, лауреат Государственной премии СССР, д.б.н., профессор Попова Т.С).
Схема проведения исследований представлена на рис.1.
В работе использовали культуры В. adolescentis В-1 ВКПМ В-2944, B. bifidum ГCБ-15 ВКПМ S-1539, B. longum BГБ-21 ВКПМ S-1540 из коллекции микроорганизмов кафедры «Технология молока и молочных продуктов» МГУПБ, Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 (идентифицированы как бифидобактерии, пока наименованы в коллекции по численной последовательности) из коллекции, поддерживаемой в Управлении технологий ОАО «Вимм-Билль-Данн», Streptococcus thermophilus (сухой бактериальный концентрат ТУ 9220-201-00419785-00). При изучении антагонистической активности использовали штаммы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов E. сoli 259-22, Staphylococcus aureus 6538-P, Proteus vulgaris F-30, Proteus mirabilis 46, Shigella sonnei 5063, Klebsiella pneumoniae 5057, Citrobacter freundii 101/57, Bacillus subtilis 6633, полученные из коллекции Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.
Объектами исследований являлись гуммиарабик марки Fibregum AS, композиция гуммиарабика и ФОС под торговой маркой Floracia™, синбиотики состоящие из бифидобактерий В. adolescentis В-1 и гуммиарабика (а), Bifidobacterium 667 и гуммиарабика (б), В. adolescentis В-1, B. bifidum ГCБ-15, B. longum BГБ-21 и гуммиарабика (в), В. adolescentis В-1, B. bifidum ГCБ-15, B. longum BГБ-21 и Floracia™ (г), также, исследовались синбиотические композиции консорциума штаммов Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 с гуммиарабиком и Floracia™ (д, е), синбиотические композиции «в» с Streptococcus thermophilus.
При изучении терапевтических свойств готовых синбиотических продуктов были проведены эксперименты на белых лабораторных крысах-самцах линии «Вистар».
Готовые продукты контролировали согласно МУК 2.3.2.721 – 98. Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы определяли в соответствии с СанПин 2.3.21078-01 по ГОСТ 30519-97; Staph. aureus – по ГОСТ 30347-97.
Определение титруемой кислотности проводили по ГОСТ 3624-92. Определение активной кислотности проводили потенциометрическим методом в соответствии с ГОСТ 3224-84. Синеретическую способность продуктов устанавливали методом центрифугирования.
Сочетаемость штаммов бифидобактерий определяли по продолжительности свёртывания молока комбинацией по сравнению с продолжительностью свёртывания с каждой культурой (штаммов), входящей в их состав (при равных органолептических показателях). Органолептические показатели оценивали через день, после выдерживания проб при 3-50С в течение 16-18ч.
Антагонистическую активность штаммов определяли методом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест – культур в монокультуре.
| Изучение и анализ научно-технической и патентной литературы |
| Исследование свойств бифидобактерий и их взаимоотношений, создание консорциума 1-11 |
| Разработка технологий синбиотика на основе молока с бифидобактериями, гуммиарабиком, композиции гуммиарабика и ФОС | ||||||||||
| ||||||||||
Исследование свойств синбиотика на молочной основе 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 | ||||||||||
Титруемая и активная кислотность, выживаемость бифидобактерий, Синеретическая способность 1, 8, 9, 12 | Антагонистическая активность пробиотической микрофлоры синбиотика к патогенным и условно патогенным микроорганизмам 7 | - Органолептические показатели; - микробиологические показатели безопасности 10, 13 | ||||||||
| Обоснование срока годности синбиотических продуктов 1, 8, 9, 10, 12, 13 |
| Изучение терапевтической эффективности готовых синбиотических продуктов на животных 14 |
| Разработка нормативной документации |
Рис.1 Схема проведения исследований
Определяемые параметры : 1 – количество клеток бифидобактерий; 2 - скорость роста; 3 - устойчивость к фенолу; 4 - устойчивость к NaCl; 5 - устойчивость к различным значениям рН; 6 – устойчивость к желчи; 7 - антагонистическая активность; 8 – активная кислотность; 9 – титруемая кислотность; 10 - органолептические показатели; 11 – микроскопический препарат; 12 – синеретическая способность; 13 – количество клеток мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов; бактерии группы кишечных палочек, патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонеллы; Staphylococcus aureus; дрожжи и плесени; 14 – количественные и качественные характеристики микробиоценоза слепой кишки белых лабораторных крыс линии Вистар.
Определение бифидобактерий проводили в соответствии с МУК 4.2.999-00, определение бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах - в соответствии с МУК 4.2.577-96. Определение молочнокислых бактерий проводили в соответствии с ГОСТ 10444.11 и ГОСТ Р 51331-99. Количественный учёт дрожжей и плесеней проводили в соответствии с ГОСТ 10444.12-88. Учёт бактерий группы кишечных палочек осуществляли согласно ГОСТ 30518-97 (ГОСТ Р 50474-93).
Изучение видового состава микрофлоры крыс проводили бактериологическим методом (определяли количественную и качественную характеристику микробиоценоза кишечника). Из 1г содержимого слепой кишки готовили ряд десятикратных разведений в тиогликолевом буфере и проводили соответствующие посевы на дифференциальные среды. Исследовались 8 групп микроорганизмов (бифидобактерии, лактобактерии, энтеробактерии, энтерококки, стафилококки, клостридии, в том числе гемолитические и цитрат - ассимилирующие бактерии). Гемолиз эритроцитов наблюдали на кровяном агаре. Приготовление микроскопического препарата проводили по МУК 577.999, ГОСТ 9225.
Скорость роста исследуемых штаммов микроорганизмов рассчитывали по формуле. Результаты исследований по данным 3 - 5 кратных повторностей обрабатывали с помощью методов статистического анализа с определением среднего арифметического значения изучаемого признака и средней квадратичной ошибки. Для аппроксимации данных были использованы методы регрессионного анализа с применением линейных и статических полиноминальных аппроксимирующих зависимостей (регрессионные модели).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Характеристика пробиотической биомассы синбиотического продукта. Промышленный выпуск стартовых культур бифидобактерий и их применение в производственных процессах стали возможными в результате большой работы по селекции бифидобактерий и изучению их биохимических и культуральных свойств, так как одним из важных направлений при создании продуктов с пробиотическими культурами, является поиск микроорганизмов со стабильным заданным комплексом свойств. Основываясь на имеющихся данных о видовом составе микрофлоры ЖКТ человека, а также опыте использования чистых культур в производстве продуктов специального назначения для создания синбиотических систем были отобраны штаммы B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21. В состав одного синбиотического продукта был включен штамм B.adolescentis B -1, а при создании многокомпонентного синбиотика применяли консорциум вышеуказанных штаммов. Ранее в МГУПБ была изучена их сочетаемость и выявлено, что исследуемые штаммы проявляют симбиотические взаимодействия.
Были проведены опыты по изучению характеристик новых штаммов бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 для их применения в дальнейшем в составе синбиотических продуктов.
Выявлено, что штаммы бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 не образовывали каталазу, сероводород, не восстанавливали нитраты в нитриты, не разжижали желатин. Они обладали устойчивостью к высокой концентрации (20% и 40%) желчи; к 0,4% раствору фенола; 2, 4, 6,5% NaCl и развивались в среде с низкими и высокими показателями рН (4,0; 4,5; 8,3; 9,2).
Важнейшей характеристикой штаммов пробиотических бактерий, применяемых в производстве функциональных продуктов, является антагонистическое действие на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. В этой связи в условиях «in vitro» исследовали антагонистическую активность Bifidobacterium 667, 668, 669, 670.
Антагонистическая активность в исследованиях выражали индексом ингибирования роста, Ри (%), который вычисляли по формуле:
Ри = ——— 100 %,
См
где См – количество клеток патогенной и условно-патогенной микрофлоры (lg КОЕ/см3), выросших в монокультуре;
Сс – количество клеток (lg КОЕ/см3) условно-патогенной и патогенной микрофлоры, выросших в смешанной с бифидобактериями.
Как установлено, все штаммы обладали выраженной антагонистической активностью. Индекс ингибирования роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры в наибольшей степени зависел от вида тест-культуры, нежели от штамма. Так, степень подавления (%) Е.соli 259-22 составила 10,4; 6,4; 6,8; 10,4; Staph. аureus 6538-P – 30,4; 0,2; 22,9; 32,5; Pr. mirabilis 46 – 23,5; 49,3; 49,3; 25,7; Kleb. pneumoniae 5057 – 24,8; 48,7; 20,2; 17,7; Shig. sonnei 5063 – 76,2; 76,2; 69; 65,5; Pr. vulgaris F-30 – 27; 26,5; 34,4; 29,2; Citr. freundii 101/57 – 54; 73,5; 54; 65,5; Bac. subtilis 6633 – 51; 77,2; 77,2; 60,4.
Исследование технологических свойств исследуемых штаммов бифидобактерий проводили по четырем показателям: активности ферментации молока, энергии кислотообразования и активной кислотности после ферментации, количеству жизнеспособных клеток сгустка (табл. 1).
Результаты экспериментов показали, что все изучаемые культуры плохо ферментировали молоко, образовывали неплотные сгустки с отделением сыворотки. Консистенция сгустков была хлопьевидная.
См-Сс
Полученные экспериментальные данные служат основой для прогнозирования способности бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 к сохранению ими ферментативной активности по мере прохождения через ЖКТ и приживаемости в кишечнике, а также прогнозирования выживаемости живых бифидобактерий в составе пищевых продуктов в процессе холодильного хранения последних. Следует отметить, что физиолого-биохимические и антагонистические свойства данных штаммов обосновывают их применение в качестве пробиотиков в производстве синбиотических продуктов, хотя их технологические показатели, явно, не удовлетворительны для производственных целей. В связи с этим, представлялось интересным исследовать взаимоотношения данных штаммов в консорциуме.
| № штамма | Активность ферментации, час | Активная кислотность, рH | Энергия кислотообразования за время ферментации, 0Т | Количество жизнеспособных клеток в сгустке, lg КОЕ/см3 |
| 667 | 45±7 | 4,74±0,2 | 63±5 | 8,0±0,2 |
| 668 | 47 ±5 | 4,76±0,2 | 62±5 | 7,8±0,2 |
| 669 | 46±6 | 4,82±0,1 | 60±5 | 8,0±0,2 |
| 670 | 50±5 | 4,75±0,2 | 63±5 | 8,1±0,2 |
| Консорциум | 33±5 | 4,76±0,2 | 64±5 | 8,47±0,1 |
Таблица 1. Технологические показатели штаммов бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670
Было выявлено, что исследуемые штаммы стимулируют рост друг друга, в сравнении с контрольным образцом. Исследования также показали, что образуемые сочетания микроорганизмов по свойствам превосходят исходные свойства культур. Если сгустки у отдельных культур образовывались через 37-51ч, у данной комбинации штаммов время образования сгустка сокращалось до 28-38ч, а количество клеток повысилось в среднем 3-4 раза (табл. 1). Органолептические показатели не изменялись.
Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что изученные штаммы бифидобактерий сочетаются между собой и по своей эффективности дополняют друг друга, а созданный консорциум целесообразно использовать при получении синбиотических продуктов.
Глава 4. Разработка технологии синбиотических продуктов.
Поскольку бифидобактерии плохо растут на коровьем молоке, для их роста требуется внесение различных стимуляторов с целью создания кисломолочных продуктов, содержащих высокий титр бифидобактерий. В этой связи представлялось целесообразным в условиях «in vitro» изучить бифидогенные свойства пищевых волокон гуммиарабика и композиции гуммиарабика и ФОС.
Для приготовления ферментированного продукта, заквасок и БАД к пище с бифидобактериями, важным фактором является именно микробиологически стерильная среда обитания, так как при использовании бифидогенных факторов остаточная флора, присутствующая в молоке, активно развивается, подавляя рост бифидобактерий. Особенно это важно для слабых штаммов бифидобактерий, но обладающих выраженными пробиотическими свойствами. Молоко не всегда сохраняет термоустойчивость в процессе стерилизации или пастеризации с большинством пребиотиков, особенно с полисахаридами и олигосахаридами.
На первом этапе проведены исследования по обоснованию рациональной концентрации Fibrеgum AS, благотворно влияющей на развитие бифидобактерий. На основании анализа литературы и учитывая вышеизложенное было предложено исследовать четыре концентрации гуммиарабика. В обезжиренное молоко добавляли 0,5%, 1%, 1,5%, 2% Fibrеgum AS, перемешивали и стерилизовали. Удалось получить стерильную питательную смесь при концентрации Fibrеgum AS 0,5%. Кислотность молока увеличивалась при добавлении Fibregum, что привело к заметному уменьшению величины рН молока и дестабилизации системы. Для поддержания pH на оптимальном уровне, повышали буферную емкость молока с гуммиарабиком, путем добавления соли стабилизатора - лимоннокислого трехзамещенного натрия. Наибольшая концентрация Fibregum в молоке с буферной солью, при которой оно сохраняло термоустойчивость, составляла 1,5%, при этом, была отработана и наименьшая концентрация вносимого цитрата (0,06%).
В разработанные составы, содержащие 0,5%, 1%, 1,5% Fibregum и соль стабилизатор вносили 5% инокулята, после чего инкубировали при температуре (37±1)°С до появления сгустка. Результаты исследования влияния разных концентраций Fibregum AS на динамику роста В. adolescentis В-1(а) приведены на рис. 2.
Рис. 2. Динамика изменения количества клеток бифидобактерий (B.adolescentis В-1) в процессе ферментации в питательной среде с разными концентрациями Fibregum
Анализ полученных результатов показал, что гуммиарабик активизировал развитие бифидобактерий в процессе ферментации, доводя количество клеток до уровня 109 KOE/см3 за 18-22 часа. Более того, количество клеток B.adolescentis В-1 в присутствии 1,5% Fibregum в среднем превышало их количество в 7,5 раз в сравнении с контрольным образцом. Картина получилась более выраженной по отношению к слабым штаммам бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670. Количество клеток Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 в питательной среде с 1,5% Fibregum превышало их количество в среднем в 10, 4, 10 и 15 раз соответственно в сравнении с контрольным образцом.
Это послужило основанием для проведения дальнейших исследований по увеличению концентрации волокна акации. Для повышения концентрации Fibregum на 0,5%, с целью увеличения питательного субстрата для бифидобактерий, представлялось целесообразным использовать аминокислоту с щелочной реакцией. В связи с этим в питательную смесь с содержанием 2% гуммиарабика добавляли разные массовые доли L – аргинина (от 0,05 до 1%) и отработанную концентрацию цитрата, перемешивали, стерилизовали. Диапазон концентрации аргинина выбрали исходя из анализа литературы и с учетом экономической целесообразности. В ходе экспериментов установлено, что при стерилизации образцов с концентрацией аргинина выше 0,1%, молоко не сохраняло термоустойчивость.
Таким образом, по результатам серии экспериментов была составлена и предложена новая питательная среда для получения синбиотических продуктов, состоящая из обезжиренного молока с массовой долей сухих веществ 10-12%, 2% Fibregum, 0,1% аргинина и 0,06% соли стабилизатора. Наибольшее количество клеток бифидобактерии достигали именно на этой среде, а главные физико-химические показатели, влияющие на их жизнеспособность, не являлись лимитирующим.
На первом этапе по разработке способа внесения композиции ФОС и гуммиарабика в обезжиренное молоко, выявлено, что при стерилизации образцов с концентрацией Floracia выше 0,1 % имела место реакция Майяра. Для обоснования рациональной концентрации пребиотика, благотворно влияющей на развитие бифидобактерий, в стерильное молоко добавляли 2,5%, 3,5%, 4,5% Floracia (диапазон концентрации выбрали исходя из анализа данных литературы), вносили 5% консорциума бифидобактерий B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21, после чего инкубировали при температуре (37±1)°С до появления сгустка. Динамика количества клеток представлена на рис. 3.
Рис. 3. Количество клеток бифидобактерий (B. adolescentis B-1, B. bifidum
ГБС-15, B. longum ВГБ-21) до и после ферментации в питательной среде с разными концентрациями Floracia
Исследования процесса развития бифидобактерий на обезжиренном стерильном молоке показали, что количество клеток бифидобактерий через 6 часов культивирования в среднем составляло 2,5108 КОЕ/см3. В синбиотических композициях, содержащих 2,5%, 3,5%, 4,5% Floracia, их количество достигало среднем 3,5108, 6108, 2,5109 КОЕ/см3 соответственно.
По результатам экспериментов было установлено, что консорциум B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21 обладал наибольшей активностью в питательной среде с содержанием 4,5% Floracia, так как количество клеток в среднем в 10 раз превышало их количество в сравнении с контрольным образцом. Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что разработанный состав целесообразно использовать при производстве синбиотических продуктов.
На следующем этапе изучали показатели синбиотических систем. С консорциумом бифидобактерий B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21 определяли количество клеток микроорганизмов, активную и титруемую кислотность после внесения бактерий (0 ч), через 2, 4 часа культивирования и на момент образования сгустка (5,5 - 6ч), а с другим консорциумом в момент заквашивания, через 6, 9, 14, 18, 24, 28, 33 и 36 часа. Также определяли синеретическую способность и антагонистическую активность синбиотических продуктов.
Рис. 4. Динамика развития консорциума бифидобактерий B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21 в присутствии бифидогенных волокон
Динамика развития пробиотических консорциумов в присутствии Firegum и Floracia представлена на рис. 4 и 5. Несмотря на то, что скорость развития и, следовательно, время образования сгустка консорциума бифидобактерий B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21 для всех образцов одинаково, количество клеток в синбиотиках с Fibregum и Floracia было в среднем в 13 и 8,3 раз больше, чем в контроле.
Бифидогенные волокна сократили время образования сгустка консорциума штаммов Bifidobacterium 667, 668, 669, 670. В присутствии Floraciа, время образования сгустка сократилось в среднем на 47%, в присутствии Fibregum - на 18%. В обезжиренном молоке время образования сгустка в среднем составляло 33-36ч, а содержание КОЕ бифидобактерий в 1см3 - в среднем на 5,3 и 3,3 раз меньше, чем в синбиотиках с Fibregum и Floracia соответственно.
Рис. 5. Динамика развития консорциума бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 в присутствии бифидогенных волокон
Титруемая кислотность в синбиотиках с консорциумом B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-21 и контрольном образце увеличивалась с одинаковой скоростью. В сгустке синбиотиков значение титруемой кислотности в среднем составляло (63-65) 0Т, что на 2-5 0Т ниже, чем в контроле. В целом, по физико - химическим параметрам синбиотики и контрольный образец с консорциумом Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 не различались (Таблица 2 и 3).
| Время фермен-тации | Показатели | |||||
| Титруемая кислотность, 0Т | Активная кислотность, рН | |||||
| Контроль | Синбиотик с Fibregum | Синбиотик с Floracia | Контроль | Синбиотик с Fibregum | Синбиотик с Floracia | |
| 0 ч | 19±3 | 18±3 | 22±2 | 6,40±0,2 | 6,48±0,2 | 6,35±0,2 |
| 2 ч | 20±3 | 20±3 | 24±2 | 6,22±0,2 | 6,32±0,2 | 6,1±0,2 |
| 4 ч | 34±3 | 31±3 | 32±3 | 5,64±0,2 | 5,70±0,2 | 5,68±0,2 |
| 6 ч | 67±2 | 65±3 | 63±3 | 4,83±0,2 | 4,82±0,2 | 4,85±0,1 |
Таблица 2. Динамика физико-химических показателей в процессе ферментации синбиотических продуктов с консорциумом штаммов
B. adolescentis, B. bifidum, B. longum
Несмотря на то, что Fibregum способствовал быстрому снижению активной кислотности (рН), в сгустке величина рН составляла от 4,80-4,98. Нужно отметить, что для бифидобактерий составляющих большую часть микрофлоры кишечника здорового человека, отмечено значительное увеличение адгезивности на слизистых оболочках именно при рН 4,0-5,0.
Таблица 3. Динамика физико-химических показателей в процессе ферментации синбиотических продуктов с консорциумом штаммов Bifidobacterium 667, 668, 669, 670
| Время фермен-тации | Показатели | |||||
| Титруемая кислотность, 0Т | Активная кислотность, рН | |||||
| Контроль | Синбиотик с Fibregum | Синбиотик с Floracia | Контроль | Синбиотик с Fibregum | Синбиотик с Floracia | |
| 0ч | 22±2 | 19±3 | 23±2 | 6,27±0,2 | 6,40±0,2 | 6,17±0,3 |
| 6ч | 24±3 | 23±3 | 29±3 | 6,12±0,2 | 6,2±0,2 | 5,89±0,2 |
| 9ч | 26±3 | 26±3 | 32±3 | 6,07±0,2 | 6,16±0,2 | 5,81±0,2 |
| 14ч | 27±3 | 31±3 | 43±3 | 6,03±0,4 | 6,01±0,2 | 5,42±0,2 |
| 18ч | 30±3 | 34±3 | 55±3 | 5,82±0,2 | 5,79±0,2 | 4,98±0,2 |
| 24ч | 32±3 | 44±2 | 100±5 | 5,75±0,2 | 5,51±0,3 | 4,65±0,1 |
| 28ч | 43±3 | 60±5 | 114±5 | 5,12±0,2 | 4,95±0,2 | 4,55±0,1 |
| 33ч | 56±5 | 71±3 | 136±5 | 4,96±0,2 | 4,88±0,3 | 4,52±0,1 |
| 36ч | 66±5 | 80±4 | 140±4 | 4,89±0,2 | 4,78±0,1 | 4,49±0,1 |
Как установлено, синеретическая способность синбиотиков с гуммиарабиком и консорциумом бифидобактерий B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-2 и Bifidobacterium 667, 668, 669, 670, снизилась в среднем на 7% и 9% по сравнению с контролем. Синбиотические системы с Floracia обладали более низкой синеретической способностью (на 14% и 10%). Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Синеретическая способность синбиотических продуктов
| Синерезис, см3 | |||||
| Образцы с консорциумом бифидобактерий B. adolescentis, B. bifidum, B. longum | Образцы с консорциумом бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 | ||||
| контроль | Синбиотик с Fibregum | Синбиотик с Floracia | контроль | Синбиотик с Fibregum | Синбиотик с Floracia |
| 5,2±0,2 | 4,8±0,2 | 4,5±0,2 | 6,3±0,2 | 5,8±0,2 | 5,7±0,2 |
Экспериментально выявлено, что антагонизм бифидобактерий в присутствии гуммиарабика и ФОС усиливаются. Результаты исследования данной серии опытов представлены на рис. 6 и 7.
Так, количество клеток Staphylococcus aureus под действием консорциума бифидобактерий B. adolescentis B-1, B. bifidum ГБС-15, B. longum ВГБ-2 в продукте уменьшалось в среднем 11 раз (Ри =13%), в синбиотике с гуммиарабиком - в 71 раз (Ри=22,1%), а в синбиотике с Floracia в 65 раз (Ри=21,7%). Индекс ингибирования Proteus vulgaris в этом же продукте составил 13,3%, в синбиотике с гуммиарабиком - 22,8%, а в синбиотике с Floracia - 17,7%. Степень подавления Е.coli составил 31,2%; 50% и 42,5% в вышеперечисленных образцах соответственно.
Рис. 6. Антагонистическая активность консорциума бифидобактерий B. adolescentis,
B. bifidum, B. longum в синбиотических продуктах с бифидогенными волокнами
Ярко выраженную антагонистическую активность проявлял консорциум, состоящий из Bifidobacterium 667, 668, 669, 670. Индекс подавления роста Е.соli составил 13%; 25%; 28,6%. Количество клеток Staph. aureus под действием консорциума бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 в продукте уменьшалось на 41,2%, в синбиотике с гуммиарабиком на 53%, а в синбиотике с Floracia - 55%. Степень ингибирования у Pr. vulgaris в контрольном образце составила 38%, в синбиотике с гуммиарабиком - 46,8%, а с Floracia - 43%. Количество клеток Citr. freundii уменьшалось на 33,3%; 40%; 41,7% в соответствии с вышеуказанными образцами.
Рис. 7. Антагонистическая активность консорциума бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 в синбиотических продуктах с бифидогенными волокнами
Сопоставляя результаты экспериментов по изучению характеристик синбиотических продуктов с моно- и многовидовыми составами пробиотических культур, следует отметить, что по своим свойствам синбиотические продукты с консорциумом превосходили единые моноштаммовые системы. В первую очередь, это проявлялось в технологических характеристиках, таких как время образования сгустка и синеретическая способность продуктов, а также в микробиологических показателях (количество клеток). По физико-химическим показателям системы почти не отличались. Антагонистическое действие пробиотических культур синбиотических продуктов на условно-патогенную и патогенную микрофлору наиболее выражено проявлялось у консорциумов.
Сравнительный анализ указанных систем приведен в таблице 5 и 6.
Таблица 5. Сравнительные характеристики синбиотических продуктов с моноштаммом B. adolescentis и консорциумом бифидобактерий
B. adolescentis, B. bifidum, B. longum
| Показатель | Синбиотический продукт с моноштаммом и Fibregum | Синбиотический продукт с консорциумом и Fibregum |
| Время образования сгустка, ч | 18-23 | 5,5-6 |
| Количество клеток, КОЕ/см3 | 9,34±0,10 | 9,6±0,15 |
| Синерезис, см3 | 5,6±0,2 | 4,8±0,2 |
| Активная кислотность, рН | 4,98-4,86 | 4,95-4,75 |
| Титруемая кислотность, 0Т | 63±3 | 65±3 |
Таблица 6. Сравнительные характеристики синбиотических продуктов с моноштаммом Bifidobacterium 667 и консорциумом бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670
| Показатель | Синбиотический продукт с моноштаммом и Fibregum | Синбиотический продукт с консорциумом и Fibregum |
| Время образования сгустка, ч | 31-36 | 28-32 |
| Количество клеток, КОЕ/см3 | 9,10±0,05 | 9,20±0,04 |
| Синерезис, см3 | 5,9±0,2 | 5,8±0,2 |
| Активная кислотность, рН | 4,97-4,77 | 4,95-4,78 |
| Титруемая кислотность, 0Т | 61±5 | 60±5 |
В лабораторных условиях проводили совместное культивирование бифидобактерий B. adolescentis B-1 и термофильных молочнокислых стрептококков при соотношении штаммов 2:1 соответственно (для устранения слегка ощущаемого щиплющего вкуса бифидобактерий). Результаты эксперимента представлены в таблице 7. Установлено, что потребительские свойства готовых синбиотических продуктов, при совместном использовании с слабо кислотообразующими штаммами термофильного стрептококка, не ухудшились. Полученный сгусток синбиотического продукта плотный, консистенция - однородная, нежная, в меру вязкая, вкус чистый кисломолочный, приятный, без наличия посторонних привкусов и запахов.
Таблица 7. Микробиологические и физико-химические показатели синбиотического продукта с термофильным стрептококком
| Показатель | Образец | |
| Бифидобактерии + термофильный стрептококк | Бифидобактерии + термофильный стрептококк + Fibregum | |
| Титруемая кислотность, 0Т | 70 | 73 |
| Активная кислотность, ед. рН | 4,86 | 4,85 |
| Количество клеток бифидобактерий, lg КОЕ/см3 | 8,7 | 9,2 |
| Количество клеток термофильного стрептококка, lg КОЕ/см3 | 9,90 | 9,65 |
| Синерезис, см3 | 7,8 | 7,65 |
| Активность сквашивания, ч | 8 | 8,5 |
Технологический процесс производства синбиотического продукта с гуммиарабиком состоит из следующих операций: приемка и подготовка сырья и материалов, восстановление сухого обезжиренного молока, приготовление питательной среды, перемешивание не менее 15 мин., стерилизация, охлаждение до температуры заквашивания (40-42) °С, заквашивание, ферментация при температуре (38±1)°С до рН 4,8±0,4, охлаждение до (20-25)°С, розлив, упаковка, маркировка и хранение. Асептически расфасованные продукты охлаждают с температуры (20-25) °С до 6°С в течение 8-10 часов в холодильной камере.
Для получения синбиотического продукта с композицией гуммиарабика и фруктоолигосахаридов, Floracia вносят в молоко после стерилизации. Технологический процесс осуществляют в соответствии с вышеуказанной последовательностью.
Глава 5. Изучение показателей качества в процессе хранения синбиотических продуктов. Пробиотические микроорганизмы не способны влиять на окружающую среду в кишечнике, если их популяция не достигает определенного минимального уровня – 107 КОЕ/см3, т.е. клетки бифидобактерий должны оставаться живыми во время хранения, чтобы обеспечить потребителю адекватное количество клеток. Для подтверждения вышеуказанного по отношению изученных штаммов бифидобактерий, исследовались основные показатели качества в процессе хранения. Полученные синбиотические продукты хранили при температуре (4±2)0С в течение 30 дней. В процессе хранения синбиотические продукты контролировали согласно МУК 2.32.721-98 «Определение безопасности и эффективности БАД к пище» (так как исследуемые синбиотические композиции можно использовать также в качестве закваски, БАД к пище) по таким показателям как количество клеток микроорганизмов, активная и титруемая кислотность питательной среды, органолептические показатели и микробиологические показатели безопасности. Значения числа жизнеспособных клеток бифидобактерий, титруемой и активной кислотности, а также синеретическую способность синбиотических продуктов с консорциумом определяли на момент образования сгустка и через 10, 20 и 30 дней. Полученные результаты представлены в таблице 8.
Таблица 8. Физико-химические показатели синбиотического продукта в процессе хранения
а) консорциум бифидобактерий B. adolescentis, B. bifidum, B. longum
| Срок хранения продукта Образцы | Показатель | |||
| Активная кислотность, ед. рН | Титруемая кислотность, 0Т | Синерезис, см3 | ||
| 0 сут. | Контроль | 4,84±0,2 | 64±5 | 5,2±0,2 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,82±0,3 | 62±5 | 4,8±0,2 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,80±0,3 | 56±5 | 4,5±0,2 | |
| 10 сут. | Контроль | 4,94±0,1 | 73±5 | 5,3±0,2 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,91±0,1 | 75±5 | 5,0±0,1 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,86±0,2 | 70±3 | 4,8±0,2 | |
| 20 сут. | Контроль | 4,81±0,2 | 83±5 | 5,3±0,2 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,78±0,2 | 85±5 | 5,2±0,2 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,70±0,3 | 80±5 | 5,0±0,2 | |
| 30 сут. | Контроль | 4,67±0,3 | 85±5 | 5,6±0,1 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,63±0,3 | 86±5 | 5,4±0,1 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,60±0,3 | 80±5 | 5,1±0,2 | |
| Срок хранения продукта Образцы | Показатель | |||
| Активная кислотность, ед. рН | Титруемая кислотность, 0Т | Синерезис, см3 | ||
| 0 сут. | Контроль | 4,96±0,1 | 56±±5 | 6,3±0,2 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,90±0,2 | 56±5 | 5,8±0,2 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,85±0,3 | 55±5 | 5,7±0,2 | |
| 10 сут. | Контроль | 5,01±0,2 | 64±5 | 6,6±0,1 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,96±0,2 | 65±5 | 6,2±0,2 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,88±0,3 | 67±5 | 6,0±0,1 | |
| 20 сут. | Контроль | 5,03±0,1 | 65±5 | 6,9±0,1 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,99±0,2 | 65±5 | 6,4±0,2 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,88±0,2 | 69±5 | 6,0±0,1 | |
| 30 сут. | Контроль | 5,09±0,1 | 66±5 | 7,2±0,1 |
| Синбиотик с Fibregum | 4,99±0,2 | 67±5 | 6,8±0,1 | |
| Синбиотик с Floracia | 4,91±0,3 | 69±5 | 6,5±0,1 | |
б) консорциум бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670
В процессе хранения наблюдалось незначительное увеличение уровня рН, что можно объяснить присоединением молекул воды с гидрофильным центром белков, в результате чего в продукте содержание свободных ионов водорода сокращалось.
Fibregum и Floracia снижали синеретическую способность сгустков продуктов, а, следовательно, привели к снижению активности воды и увеличению продолжительности хранения полученной продукции без снижения качества.
Анализ полученных результатов для синбиотических продуктов с консорциумом бифидобактерий показал, что в процессе 30 дневного хранения при температуре (4±2)0С, популяция бифидобактерий в 1 см3 не менее 1108 КОЕ и в среднем в 12-30 раз превышала их количество по сравнению с контрольными образцами. Результаты изменения количества клеток бифидобактерий в синбиотических продуктах с гуммиарабиком и Floracia представлены на рисунке 8.
В процессе хранения синбиотических продуктов с моноштаммами уже через 10 суток клетки начинали отмирать и количество жизнеспособных клеток бифидобактерий уменьшалось в несколько раз, тогда как при добавлении гуммиарабика содержание клеток оставалось практически на том же уровне. В синбиотических продуктах через 30 суток насчитывалось миллион клеток, а в образце без добавок – десятки тысяч. Сравнительный анализ количества клеток бифидобактерий в моноштаммовых и многовидовых синбиотиках в процессе хранения выявляет превосходство последних.
а) б)
Рис. 8. Изменение количества клеток бифидобактерий в процессе хранения синбиотического продукта с бифидогенными волокнами:
а – консорциум бифидобактерий B. adolescentis, B. bifidum, B. longum
б - консорциум бифидобактерий Bifidobacterium 667, 668, 669, 670
В течение 30 суток органолептические показатели продуктов не ухудшались.
Все синбиотические продукты сохраняли основные свои показатели и отвечали требованиям МУК и разработанной нормативной документации. По показателям безопасности, выработанные синбиотические продукты отвечали требованиям СанПин 2.3.2.1078-01.
Глава 6. Изучение терапевтической эффективности готового синбиотического продукта. Для оценки терапевтической эффективности синбиотического продукта (в), в отделе экспериментальной патологии НИИ скорой помощи им. Склифосовского на белых крысах линии Вистар провели исследования по изучению микробиоценоза слепой кишки в период послеоперационной эндотоксемии. Животным вводили синбиотик в ранние сроки послеоперационного периода (1-7 сутки). Сравнительный анализ осуществлялся по отношению к группам животных, не принимавших синбиотик в указанный период. Также исследовали микробиоценоз здоровых крыс.
Операция заключалась во вживлении зонда в начальный участок тощей кишки. В бедренную вену вводили липополисахарид E. coli 055:B5 в дозе 200 мкг/кг. Животные были разделены на две серии: контрольная и опытная. Крысам каждой серии ежедневно, начиная с первых суток, внутрикишечно через зонд болюсно вводили физиологический раствор (контрольная группа) или синбиотический продукт (опытная группа) в объеме 1 мл. Забой животных контрольной группы проводили декапитацией на 1, 3, 5 и 7 сутки после операции. Забой животных опытной группы осуществляли на 3, 5 и 7 сутки.
Изучение видового состава микрофлоры крыс проводили бактериологическим методом. Результаты средних значений количества клеток исследуемых микроорганизмов при изучении содержимого слепой кишки крыс контрольных и опытных групп, представлены на рисунке 9 и таблице 9.
Выявлено, что на первые сутки после операции полезная микрофлора не изменилась. Содержание бифидо- и лактобактерий составляло в среднем lg(8,8±0,45) и lg(9,08±0,46) КОЕ/г соответственно. Значительное уменьшение их уровня наблюдалось на третьи и пятые сутки. Лактофлора слабо реагировала на послеоперационную эндотоксемию. На седьмые сутки уже намечалось ее полное восстановление. У крыс, получавших синбиотический продукт бифидо- и лактобактерии соответствовали физиологической норме первые 7 суток после операции (рис. 9(а, б)).
С первых суток у крыс контрольной группы резко увеличивалось количество энтерококков, стафилококков, энтеробактерий, цитрат ассимилирующих и гемолитических бактерий (рис. 9 (в, г) и табл. 9). Причем некоторые виды микроорганизмов, относящихся к различным группам одного семейства, изменяли свои биологические свойства. Это является типичным признаком дисбиотической кишечной флоры. Отмечалось выраженное увеличение цитрат ассимилирующих и лактозонегативных форм энтеробактерий (50-90%), относящихся к остаточной флоре (Klebsiella, Citrobacter, Proteus)(табл. 9). Несмотря на то, что число выявлявшихся энтеробактерий было повышенное и у крыс опытной группы, в них остаточная флора обнаруживалась только на пятые сутки в незначительных количествах (0,06-4,84%).
Количество энтерококков и стафилококков в течение семи суток осталось повышенным у контрольной группы. В микрофлоре слепой кишки двух крыс на первые и пятые сутки обнаруживались плазмокоагулирующие и гемолитические стафилококки в количестве lg 1,87 и lg 6,7 КОЕ/г. В микробиоценозе здоровых крыс, а также у крыс опытной группы последних не было выявлено. Более того, стафилококковая флора опытной группы, исходя из анализов средних значений их количества, на весь период послеоперационной эндотоксемии, не претерпела заметных изменений.
а)
б)
в)
г)
Рис. 9. Изменения групп микроорганизмов в кишечнике животных в период послеоперационной эндотоксемии
Гемолитические бактерии у контрольной группы были обнаружены в течение всего послеоперационного периода (табл. 9).
Уровень клостридий в течение послеоперационной эндотоксемии не изменился.
На седьмые сутки, все исследуемые группы микробиоценоза соответствовали физиологическим нормам у опытной группы. В контрольной группе не восстанавливалась бифидо- и стафилококковая и энтерококковая флора, преобладали гемолитические бактерии, лактозонегативные энтеробактерии. Повышенное количество стафилококков у контрольной группы, вероятно, связано, с процессами восстановления соотношения анаэробных и аэробных представителей микрофлоры.
Таблица 9. Изменения групп микроорганизмов в кишечнике животных в период послеоперационной эндотоксемии
| Время группы | Количество клеток энтеробактерий, lg КОЕ/г | Цитрат ассимилирующие бактерии, lg КОЕ/г | Гемолитические бактерии, lg КОЕ/г | |||
| Контрольная | Опытная | Контрольная | Опытная | Контрольная | Опытная | |
| 3 сутки | 7,76±0,25 | 8,36±0,36 | 6,23±0,64 | 6,12±1,13 | 3,21±2,3 | 3,39±3,91 |
| 5 сутки | 7,93±0,48 | 8,06±0,37 | 7,23±1,05 | 5,50±1,29 | 4,95±2,96 | 0 |
| 7 сутки | 7,12±0,58 | 6,87±0,53 | 5,67±0,85 | 3,83±0,32 | 5,84±1,93 | 0 |
Оценивая результаты бактериологических исследований, следует отметить высокую терапевтическую эффективность синбиотического продукта. Положительное влияние синбиотика на микробиоценоз кишечника заключается в более быстром восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта и сокращению послеоперационного периода адаптации.
ВЫВОДЫ
1. Изучены физиолого-биохимические и технологические свойства четырех новых штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium 667, 668, 669, 670 и обоснована перспективность их применения в качестве пробиотических культур в производстве синбиотических продуктов. Исследована сочетаемость вышеуказанных штаммов и создан консорциум по технологическим свойствам (время ферментации молока, антагонистическая активность, количество клеток) превосходящий исходные свойства культур.
2. Обоснован выбор бифидогенных волокон для введения в единые синбиотические системы. Разработаны рациональные концентрации и способы внесения Fibregum AS (2%) и Floracia (4,5%) в состав синбиотических композиций.
3. Предложен новый состав питательной среды для кисломолочного продукта, повышающий содержание и активность бифидобактерий в готовом продукте, термоустойчивость молока с гуммиарабиком: гуммиарабик - 2%, аргинин - 0,1%, лимоннокислый натрий - 0,06%.
4. Исследованы показатели синбиотических продуктов с моноштаммом и консорциумом бифидобактерий. По своим свойствам синбиотические продукты с консорциумом превосходили единые моноштаммовые системы по времени образования сгустка, синеретической способности продуктов, микробиологическим показателям и антагонистическому действию пробиотических культур синбиотических продуктов на условно-патогенную и патогенную микрофлору.
5. Исследованы показатели качества и безопасности разработанных видов синбиотических продуктов и выявлено, что они отвечают требованиям МУК и нормативной документации в течение 30 суток хранения при температуре (4±2)0С. Показано, что бифидогенные волокна повышают жизнеспособность бифидобактерий, снижают синеретическую способность сгустков продуктов в процессе хранения.
6. Результаты бактериологических исследований микробиоценоза крыс в период послеоперационной эндотоксемии показал высокую терапевтическую эффективность синбиотического продукта. На седьмые сутки послеоперационной эндотоксемии все исследуемые группы микробиоценоза соответствовали физиологическим нормам у крыс, принимавших синбиотик по сравнении с животными контрольной группы, у которых не восстанавливалась бифидо- и стафилококковая флора, преобладали гемолитические бактерии, лактозонегативные энтеробактерии.
7. Разработаны технология производства синбиотических продуктов с использованием бифидогенных волокон и проект нормативной документации.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Багдасарян А.С. Исследование антагонистической активности бифидобактерий в синбиотическом продукте, содержащем ФОС и гуммиарабик / A.C. Багдасарян // Материалы Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов», – Улан-Уде 2006. – С. 45.
2. Багдасарян А.С. Утилизация поли- и олигосахаридов бифидобактериями в условиях «in vitro» и «in vivo» / A.C. Багдасарян // Материалы Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов», – Улан-Уде 2006. – С. 8.
3. Токаев Э.С. Биотехнология новых синбиотических комплексов бифидобактерий с Floracia для функционального питания / Э.С. Токаев, А.С. Багдасарян // Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», – Москва 2004. – С. 13-15.
4. Токаев Э.С. Влияние волокна акации на жизнеспособность пробиотических культур / Э.С. Токаев, А.С. Багдасарян // Материалы международной конференции «Технологии и продукты здорового питания», Москва 2005. – С. 251-258.
5. Токаев Э.С. Научные основы разработки нового синбиотика / Э.С. Токаев, А.С. Багдасарян // Материалы III Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва 2004. – С. 66-68.
6. Токаев Э.С. Новые синбиотические комплексы бифидобактерий с гуммиарабиком / Э.С. Токаев, В.И. Ганина, А.С. Багдасарян // Молочная промышленность. – 2006. – № 3. – С. 40-42.
7. Токаев Э.С. Перспективы разработки новой синбиотической добавки / Э.С. Токаев, В.И. Ганина, А.С. Багдасарян / Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», – Москва 2004. – С. 118-119.
8. Токаев Э.С. Поведение антагонистически активных штаммов бифидобактерий в процессе хранения синбиотического комплекса / Э.С. Токаев, В.И. Ганина, А.С. Багдасарян, С.И. Перминов, Т.Ф. Вустина, И.Н. Мозговая // Молочная промышленность. – 2006. – № 9. – С. 33-34.
9. Токаев Э.С. Смола акации как бифидогенное диетическое волокно / Э.С. Токаев, А.С. Багдасарян // Сборник материалов научных чтений «Кафедре технологии молока и молочных продуктов МГУПБ 60 лет», – Москва 2005. –С. 156-158.
10. Токаев Э.С. Свойства единой синбиотической системы бифидобактерий с пребиотиком Fibregum / Э.С. Токаев, В.И. Ганина, А.С. Багдасарян, Ю.Г. Григорова, С.И. Перминов, Т.Ф. Вустина, И.Н. Мозговая, В.В. Макаров // Биотехнология. – 2006. – №.6. – С. 51-62.
Подписано в печать Усл. печ. л. 1,5.
Тираж 100 экз. Заказ
ООО «Полисувенир». 109316, Москва, ул. Талалихина, 33
Тел. 677-03-86
