Способовполучения имодификации рисовыхбелковых концентратов
На правахрукописи
ФАН КУИНЬЧАМ
РАЗРАБОТКА СПОСОБОВПОЛУЧЕНИЯ ИМОДИФИКАЦИИ РИСОВЫХБЕЛКОВЫХ КОНЦЕНТРАТОВ
| Специальность 05.18.01 | Технология обработки, хранения ипереработки злаковых, бобовых культур,крупяных продуктов, плодоовощной продукции ивиноградарства |
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации насоискание ученой степени
кандидата техническихнаук
Москва- 2013
Работа выполнена накафедре «Биотехнология ипищевая химия» ФГБОУ ВПО «Московскийгосударственный университет пищевыхпроизводств»
| Научныйруководитель: | доктор технических наук,профессор КолпаковаВалентина Васильевна |
| Официальные оппоненты: | Карпиленко Геннадий Петрович доктор техническихнаук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский государственныйуниверситет пищевых производств», профессор кафедры«Биотехнология и технологияпродуктов биоорганического синтеза» Иунихина ВераСергеевна доктор техническихнаук, профессор, НОУ ДПО «Международнаяпромышленная академия», заведующая кафедрой пищевых производств |
| Ведущая организация: | ГНУ НИИкондитерской промышленностиРоссельхозакадемии |
Защита диссертациисостоится « 19» декабря 2013 годав 10 часов на заседании Совета по защитедиссертаций на соискание ученой степеникандидата наук, на соискание ученойстепени доктора наук Д 212.148.03 при ФГБОУ ВПО«Московский государственный университетпищевых производств» по адресу: 125080, г.Москва, Волоколамское шоссе, д.11, ауд. 302, корп.А.
С диссертацией можноознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО«Московский государственный университетпищевых производств».
Авторефератразмещен насайте ВАКприМинобрнаукиРоссииhttp://vak.ed.gov.ru
Автореферат разослан « » ноября 2013 г.
Ученый секретарьСовета, к.т.н.,доц.Белявская И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТЫ
Актуальностьтемы. Рис являетсяважнейшей зерновой культурой,занимающей второе место пообъемупроизводства, после пшеницы.Рис - основной продукт питания для 2,5 млрд. человек в Азиии сотен миллионов людей на другихконтинентах. В Европе и России рис пользуетсябольшой популярностью, в 2007-2011 гг. валовой сбор его возрос на 63,8% и составил 1154,1 тыс. т. Даннуюкультуру употребляют в виде крупы, ее перерабатывают вмуку, спирт, пиво, целесообразно применять и в производстве хлеба(Богатырева Т.Г., Динь Тхи Хьен,2010). Несмотряна то, что существуетмного направлений использования риса, в мирепродолжается поиск перспективных путей егопереработки и получения компонентов сполезными питательными ифункциональными свойствами. Рисовый белок, вотличие от клейковины, являетсягипоаллергеннымбелком,что делает егоконкурентоспособнымдля производства диетических ифункциональных продуктов питания.
Известны способы переработки зерна рисана белки и крахмал (Моritа, Kiriyama, 1993; Shih, Daigle, 1997; Wang, 1999; Hamada, 1999; Tang, 2003; Lixia et al., 2010),но даже при обработке щелочью и энзимами белки трудно выделяются из сырья, ктому жетакиерастворы изменяют ихструктуру ипитательнуюценность, чтоотрицательно отражается на функциональныхсвойствах белковыхпродуктов. В литературе практически отсутствуют сведенияоб отличительных особенностях белков разных видов риса, их взаимосвязис функциональными свойствами, позволяющими экстрагироватькомпоненты с целенаправленно регулируемыми показателями в целяхнаучно обоснованного и более эффективногоприменения их при производстве пищевых продуктов. С учетом того, чтоизвестные коммерческие белковые продуктыимеют относительно невысокую массовуюдолю белка (60-65%) и мало сведений о его функциональных свойствах, торазработкановых способов переработки рисового сырья, предусматривающих эффективное извлечение компонента и модификацию, имеет актуальное значение дляпроизводства и расширенияассортимента пищевых продуктов сгипоаллергенным белком. Данная постановказадачи соответствует приоритетным направлениям развития мировойи отечественной науки повопросам глубокойпереработки растительного сырьяс получением ценных иполезных белковых и других ингредиентов вцеляхсовершенствования базы сырья ипроизводства продуктовпитания целевогоназначения.
Работа проводилась врамках НИР кафедры «Биотехнология и пищеваяхимия» МГУПП и Договора осотрудничестве с лабораторией биохимии азотфиксации иметаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Целью исследований являлась разработка способоввыделения,модификации функциональныхсвойств рисовых белковыхконцентратов методомограниченного протеолиза иизучение ихфизико-химических характеристик,ориентированных на расширение ассортимента гипоаллергенных идругих видов пищевых продуктов. В соответствии сцелью решались следующие задачи:
- исследовать показателихимического и биохимического состава муки,полученной из белозерного икраснозерного риса;
- изучитьпроцессы выделения белков с применениемферментныхпрепаратов (ФП) амилазного и ксиланазногодействия;
- разработать принципиальнуютехнологическую схему получения белковых(БК) ибелково-минеральных концентратов (БМК);
- охарактеризоватьпищевую и биологическую ценность рисовыхБК иБМК;
- разработатьтехнологические параметры получениямодифицированных белково-минеральных концентратовметодом ограниченногопротеолиза;
- изучитьфункциональные свойства БК, БМК ивлияние на них некоторыхтехнологическихфакторов;
- исследовать физико-химическиесвойства белковых концентратов и установить ихвзаимосвязь с функциональнымисвойствами;
- разработать способы приготовлениямучных кондитерскихизделий (кекс,бисквитный полуфабрикат)с модифицированным белково-минеральнымконцентратом;
- провести опытно-промышленную апробацию способов примененияБМК иразработать проектытехническойдокументациина концентрат, кекс и бисквитный полуфабрикат.
Научная новизна. Теоретически обоснованы параметрывыделения БК из белозерного икраснозерного риса сприменением кислотнойэкстракции, амилазного иксиланазногоФП, а также способов модификации функциональныхсвойств белков с эндо- и экзопротеиназами.Получены математические моделизависимости количества аминного азота оттемпературы, концентрациисубстрата и ФП, временигидролиза, рНсо степеньюпротеолиза 3,89-4,16 %.
Установленыособенности белков рисовых концентратов: молекулярная масса (ММ) иху белозерногориса ниже (1,3-199,5 кДа), чем у белков краснозерногориса (1,3-251,1кДа). Большая часть белков белозерногориса сосредоточена во фракциях с ММ 11,7 -27,5 кДа, краснозерного – вболее высокомолекулярнойфракции (ММ182 - 251,1 кДа).
Доказановзаимодействие белков сфлавоноидами, оказывающеевлияние на их функциональные свойства. У белозерного риса флавоноиды взаимодействуют с3-мя фракциями (ММ 131, 10 и 4 кДа), украснозерного – с одной, но болеевысокомолекулярной (ММ 216кДа). У концентратов избелозерного риса содержаниефлавоноидов ниже, чем уконцентратовиз краснозерного риса, апенообразующие свойства выше.
По данным инфракрасной (ИК) спектроскопии, взаимодействие белков с флавоноидами происходит приучастии ароматических, непредельных,сложноэфирных и СН2- группировок.
Методом кругового дихроизма(КД) вструктуре концентратов установленоналичие – спиралей,310 – спиралей, -структуры, -изгибов инеупорядоченной формы молекул. Протеолизбелков сопровождается нарушением -спиралей,формированием -структуры, нерегулярныхучастков,уменьшением количества SH – групп, но и увеличением S-S-связей.
Степень изменения фракционного состава белков, элементоввторичной и третичной ихструктуры впроцессе гидролизаэндопротеиназой у БКиз белозерного риса выше,чем у БК из краснозерного риса, что взаимосвязано с меньшим количеством в его составе флавоноидов.
Для пенообразующейспособности (ПОС) концентратов выявлена отрицательная корреляциясо значениями верхних границ ММ белков (r= -0,95), количеством высокомолекулярныхфракций (r= -0,80),количеством SH-групп (r= -0,8),константами начального(r= -1,0), конечного (r= -0,8) этаповагрегации, а также положительная (r=+0,8) – сколичеством S-S связей. Высокая ПОС композитов обусловлена наличием в их составе белков с ММ не более 120 кДа.
Практическаязначимость работы.Разработаны способы получения рисовых БК и БМК избелозерного и краснозерного риса с содержанием белка 78-85%, сучетом специфического расщепления крахмалаи гемицеллюлоз. Установлены параметры выделениябелков без применениящелочных растворов и хорошими высокими функциональнымисвойствами для приготовления мучных кондитерских изделий.
Определены условияферментативного гидролиза белков с эндо- иэкзопротеазами для получениямодифицированных рисовых БМК (времягидролиза, температура, концентрация ФП,субстрата, рН) с повышенной растворимостьюи пенообразующими свойствами.
Разработанапринципиальная технологическая схемаполучения БК, БМК и модифицированныхБМК, содержащих кальций в органической форме. Разработаны способы получения и рецептуры масляного кекса наоснове рисовой муки и модифицированногоБМК, не содержащегопшеничную клейковину, ибисквитного полуфабриката с сухой белоксодержащей смесью.
Проведенаопытно-промышленная проверкаиспользования модифицированного БМК дляполучениямасляного кекса без клейковины и бисквитного полуфабриката впроизводственных условиях ЗАО«Хлебокомбинат «ПЕКО», что подверженоактами испытаний. Разработаны проектыТИ, ТУ на модифицированныйБМК, масляныйкекс и бисквитный полуфабрикат.
Основные положения,выносимые на предзащиту:
- новые способы получения имодификации рисовыхбелковых концентратов без применениящелочных растворов и относительно высоким содержанием в них белка;
- технологическая схемаполучения белковых и белково-минеральныхконцентратов и ихгидролизатов;
- особенности структурырисовых белков и взаимосвязь ихфизико-химических и функциональных свойств;
- способы и рецептуры с рисовыммодифицированным белково-минеральнымконцентратом для получениябезглютеновых масляныхкексов и бисквитного полуфабриката.
Апробацияработы. Результатыисследований доложенына: 11-ойМеждународной НПК«Фундаментальные и прикладныеисследования, разработка и применениевысоких технологий впромышленности (Санкт-Петербург, 2011); 9-ой, 10-ой НПК с международным участием «Технологии ипродукты здорового питания.Функциональные пищевые продукты» (Москва,2011, 2012); 9 и 10-ой Международной НК студентов и молодых ученых «Живыесистемы и биологическаябезопасность населения» (Москва, 2011, 2012); 7-9-ойМеждународной НК«Техника и технологияпищевых производств» (Могилев, 2011-2013); в рамках конкурсов молодых ученыхна VII Московском международном конгрессе «Биотехнология:состояние и перспективыразвития» (Москва, 2013) и 8-ой Всероссийскойвыставке научно-технического творчествамолодежи (Москва, 2013), Международном научном форуме«Пищевые инновации и биотехнологии» (Кемерово, 2013). По итогам конкурсов, выставок иконференцийполучены 2 медали, 2 диплома, 1 грамота и 1 сертификат.
Публикации. Поматериаламдиссертации опубликовано 14 печатных работ,из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАКРФ.
Структура и объемдиссертации. Диссертация состоит из введения,обзора литературы, экспериментальнойчасти, выводов, списка использованных источников и приложений. Работаизложена на 138 страницах основного текста,включает 36таблиц и44 рисунка.Список литературы содержит 259 источника, из них 96 - наиностранномязыке.
1 ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ
В обзорелитературы приведены сведения обиологическом строении,морфологических особенностях и классификации зерна риса. Обобщены данные похимическому составу,пищевой,биологической ценности, физико-химическим, функциональнымсвойствам белков, путямрационального использования риса ипродуктов его переработки, атакже способамвыделения, модификациибелков и применения, в т.ч. в кондитерской ихлебопекарнойпромышленности. Приведены сведенияпо обогащениюмучных кондитерских изделий белком,минеральными веществами и другимиценными пищевыми компонентами.
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ
Исследованияпроводились на кафедре биотехнологии ипищевой химии МГУПП и в лаборатории биохимии азотфиксации иметаболизма азота Института биохимии им.А.Н. Баха РАН. Общая схемаисследований представлена на рисунке1.
Рисунок 1 – Общая схемаисследований
2.1 Сырье и материалыисследований
В качестве объекта использовалимуку из белозерного рисамарки «Гао там» и муку из краснозерногориса «Тхай Зыонг» (Вьетнам), полученную наоборудовании ГНУ ВНИИЗ РАСХН с проходомчерез сито № 43ПА-70 - ТУ 9293-010-00932169-96. Вкачестве реагентов применяли уксусную (ГОСТ 61-75), соляную (ГОСТ3118-77) кислоты, хлорид натрия (ГОСТ 13830-97), этанол(ГОСТ 18300-72),гидроксид натрия (ГОСТ 2263-79), лактаткальция (Е 327), трехзамещенный цитраткальция (Е 333) (Санитарные эпидемическиезаключения), в качестве энзимов - ФПгрибного происхождения от фирмы Novozymes (Дания): Фунгамил 2500с 2500 ед. АС/г, Шеарзим 500 Л с ГКА - 500 ед./гФунгамил Супер AX с 2500 ед. АС/г и ГКА - 500 ед./г. Гидролизбелков проводили с ферментными препаратами Protamex®,Neutrase 1,5MG и Flavourzyme 500 MG с ПС 125, 105 и 85 ед./г,соответственно.
Для приготовлениякекса и бисквитных полуфабрикатовиспользовали муку пшеничную высшего сорта– ГОСТР 52189-2003,рисовую муку – ГОСТ Р 53495-2009,сахар-песок ГОСТ 21-94, разрыхлитель«Цикория» –сертификат ISO-9001 (ТУ 9199-012-51217184), меланж – ГОСТ Р 53155-2008, вода– СанПиН2.1.4.559-96, масло подсолнечноерафинированное – ГОСТ Р 52465-2005,сухую смесь для бисквитногополуфабриката (Пат. №2316968).
2.2 Методыисследований
Массовую долю влаги вмуке и концентратах определяли по ГОСТ 9404-88, общегобелка - по методам Кьельдаля (ГОСТ10841-91) и Лоури, жира - в аппарате Сокслета(ГОСТ29033-01),зольность –методом сжигания (ГОСТ 27494-87). Содержаниекрахмала и восстанавливающих сахарованализировали методом Бертрана, клетчатки - по Кюршнеру и Ганеку,гемицеллюлоз - с гидролизом 2%-нойсоляной кислотой, массовуюдолю углеводов в БК – путем вычета из 100 г массовой долибелка, жира, золы, влаги.
Фракционный состав белков мукиопределяли последовательнымэкстрагированием дистиллированнойводой, 5% -нымраствором хлорида натрия, 70% -ным этанолом, 0,02M растворомедкого натра. Аминокислотный состав белкованализировали на хроматографе L-8800 фирмы “Hitachi” (Япония),содержание минеральныхвеществ –по ГОСТ 26929-94 и30178-96, перевариваемость белков - пометоду А.А. Покровского и И.Д. Ертанова,количество флавоноидов в БК - спектрофотометрическимметодом,в пересчете на галловуюкислоту.Степень гидролиза белков измеряли в %,по отношению к общему количеству аминногоазота, полученном при гидролизе ихс 6н НСl.
Молекулярно-весовоераспределение рисовых белков иих гидролизатов исследовали методамивысокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ) и гельхроматографии насефадексе G-150; спектры КД- надихрографе Chirascan фирмы Applied Photophysics (Англия), ИК спектры - на ИК-Фурьеспектрометре IFS 66 v/sBruker вобласти 400-4000 см-1.Восстановленные тиоловыегруппы определяли флуоресцентным методомс реактивом TioGlo1 (Calbiochem, USA),агрегациюбелков - на спектрофотометре ССП-715 при 350 нм. Функциональные свойства БК исследовали пометодикам, опубликованных вработах В. В. Колпаковой иА.П. Нечаева (1995).
Показатели качества теста,кексаи бисквитного полуфабриката анализировали стандартными иобщепринятыми методами (И.С. Лурье, 2003),микробиологические показатели готовыхизделий - всоответствии с СанПиН2.3.2.1078-01.
2.3 Результаты исследований и ихобсуждение
Химический состав ибиохимические свойства белков муки из белозерного и краснозерногориса исследовали для выбора растворителя иразработкиспособов выделения концентратов.При этом установлено, что основную массувеществрисовой мукисоставляеткрахмал (64-70%), меньшесодержитсябелков (9,08-14,16%) игемицеллюлоз (6,0-6,4%). Мука из белозерного риса имеет в своемсоставе в 1,6– 2 разаменьше белка, зольныхэлементов, но на 9,7 % больше крахмала и в 1,5-2раза - большежира и клетчатки, чем мука из краснозерногориса.
Основная масса белков представленаглютелинами (оризенином) – 72,80-79,64%, далее следуют альбумины (4,10-6,15%),глобулины (12,60-14,15%) ипроламины(3-6%). Мука из белозерного риса на65% меньше содержит проламинов, на 12-50% меньше глобулинов, альбуминов, но на 9% больше оризенина, что в конечномитоге положительно отразилось на выходе ифункциональных свойствах белковых концентратов. Изданных следует, что наиболее эффективным растворителемдля белков должен бытьраствор щелочи, однакоона, какизвестно, денатурируетбелки, вызывая образование новыхвидов связей, отрицательно влияющих нафизиологию млекопитающих. Поэтому растворимость белков исследовалась врастворах кислот. Показано, чтов 0,005-0,025н. уксусной кислотерастворимость белков мукииз белозерного рисаравнялась 10,1- 20,2%, в соляной кислоте такихже концентраций– 40 - 59%.Больше всегобелков переходило в раствор 0,01н. соляной кислоты. Сприменением элементов статистики выявленаболее точная взаимосвязь растворимости белковс гидромодулем, нормальностьюкислоты и временем экстрагирования. Получены уравнения регрессии, построены пространственные поверхностиотклика, отображающие изменениерастворимости от исследуемыхфакторов (рисунок 2) и выбраны оптимальные параметры.
Наибольшаярастворимость белков (60,5%) наблюдалась пригидромодуле мука:соляная кислота 1:9,концентрации кислоты – 0,01 н. и времениэкстрагирования - 135 мин.
В целях повышенияколичества рисовых белков муки в растворе изучена их растворимость сприменением ферментных препаратов, учитывая, что значительное количествокрахмала, гемицеллюлоз и белков находятсяво взаимодействии и тем самым затрудняетсяэкстрагирование последних. Растворимостьбелков определялась с применением гидролитическихФП: Фунгамила 2500 и Шеарзима 500Л, катализирующих, соответственно,гидролиз крахмала иксиланов, и Фунгамила Супер АХ, содержащегоодновременно амилазу и
 |  |
Рисунок 2 – Влияние различных факторов на растворимостьбелков муки
ксиланазу. Вначале исследовали влияниегидромодуля, температуры, рН, времени иконцентрации Фунгамила 2500 на выходвосстанавливающих сахаров (ВС) (рисунок3) иустановили условия длядействия амилазы: гидромодуль 1:7, рН 5,8-6,2, температура700С,концентрация 5,8-6,3 ед. АС/г муки, времягидролиза –60 мин.
Рисунок 3 – Влияние технологических факторов на выход сахаров
Опыты с Шеарзимом 500Л иФунгамилом Супер АХпроводили с 0,01 н. НСlпри значении рН - 4,8-5,0.Результаты определения влияниягидромодуля и температуры на выход белков из муки сШеарзимом 500Л и ФунгамиломCупер AХ (рисунок 4) показали, что собоими ФП максимальнымон полученпри гидромодуле 1:6, а с Фунгамилом Cупер AХ - на 3-8% выше, особенно это заметнопри гидромодуле 1:6 и температуре 65-700С.
 |  |
Рисунок 4 – Зависимостьвыхода белков от гидромодуля и температуры
Установлен наиболее рациональный диапазонконцентраций обоихФП: 70-75 ед. на 1г муки притемпературе 70°С,гидромодуле1:6, рН=4,8 и времени 120 -150мин (рисунок5).
 |  |
Рисунок 5 – Зависимость выхода белков от концентрации ивремени обработки мукиФП
В итоге, определеныэффективные условия для действияферментов:
А) для Фунгамила 2500:гидромодуль 1:7, рН 5,8-6,2,температура 70°С, концентрация 5,8-6,3 ед. АС/г муки,время гидролиза – 60 мин;
Б) для Шеарзима 500 Л и Фунгамила Супер АХ:гидромодуль 1:6, рН - 4,8-5,0;65-70°С,концентрация ФП 70-75 ед. ГКА/ г муки, времягидролиза –120 мин.
Выход белков с Шеарзимом 500Лсоставил 25-26%, с ФунгамиломСупер АХ –33-34%. Следовательно, комплексный ФП болееэффективный, чем один Шеарзим 500Л.
С учетом этих данных исследованы 4схемы экстрагирования белков в 0,01 н. растворе НСl содновременной обработкойФП дляполучения ихнаибольшего выхода. Контролем служил образец муки, обработанный 0,01н. соляной кислотой. Всоответствии со схемойI, передэкстрагированием белков кислотой мукуобрабатывали Фунгамилом 2500 (гидромодуль 1:7, рН - 5,8; 70°С, концентрация ФП - 6,2 ед. АС/ г крахмала, время -60 мин). По схеме II после обработки мукиШеарзимом 500Л в течение 2ч при концентрации 70 ед. ГКА /г муки, гидромодуле 1:6, 70°Си рН = 4,8белки экстрагировали 0,01н. раствором НСl. Посхеме III перед соляной кислотой мукуобрабатывали последовательноФунгамилом2500 и Шеарзимом 500 Л, после чего белкиэкстрагировали 0,01 н. солянойкислотой. Схема IV включала обработкумуки Фунгамилом Супер AX при концентрации70 ед. ГКА /г муки в течение 2ч при рН - 4,8 и 70°С.
СФунгамилом 2500 растворимостьбелков, по сравнению сконтролем, повышалась всего на 6%, с Шеарзимом 500Л - на 21%, сФунгамилом 2500 и Шеарзимом 500 Л, каки с Фунгамилом Супер AX, - на 34%. Наибольшая растворимостьбелков достигалась в схемах III иIV (таблица 1).
Таблица 1 - Растворимостьбелков при различных схемахэкстрагирования
| Варианты схем | Способобработки муки | Растворимость белков, % |
| Контроль | 0,01н. солянаякислота | 59 ± 1 |
| Схема I | Фунгамил 2500 +0,01н. HCl | 65 ± 1 |
| Схема II | Шеарзим 500 Л +0,01н. HCl | 80 ± 2 |
| Схема III | Фунгамил 2500 + Шеарзим 500 Л+ 0,01н. HCl | 92 ± 1 |
| Схема IV | Фунгамил Супер AX+0,01н. HCl | 92 ± 2 |
Исследования по выделениюбелков из краснозерного риса выполнены поописанным выше схемам стеми же режимами.Установлено, что белкирастворялись всего на 64-67%, против 90-92%для белозерного риса. Меньшая растворимостьбелков, несмотря на более высокое ихсодержание в муке, объясняется различиями в физико-химическихсвойствах, о чемсвидетельствуют ниже приведенные данные.
Для выделения белковиз раствора вначале использовали методизоэлектрического осаждения 0,01 н.NaOH приразличных значениях рН. Установлено, что при рН 7,3 белки выделяются вколичестве 87% от общего количества (рисунок 6). Различий визоэлектрической точке(ИЭТ) белков разных видовриса не обнаружено.
 Рисунок 6 - Влияние рН настепень осаждения белков рисовоймуки | Усвоение белков в организметребует присутствия минерального элементакальция, поэтому в целях созданиябелково-минерального композита иповышения выхода белков исследовано ихосаждение из растворадобавлениемтрехзамещенного цитрата и лактата кальция. Показано, чтомаксимальная степень осаждения белков(50%) достигалась с 10% цитратомкальция, меньшая (40%) - с 7,5% лактатом кальция (рисунок 7). Комбинированное осаждение белковв изоэлектрической точке(рН=7,3) с 2-3%-ным растворомцитрата кальция обеспечилоосаждение белков вколичестве 95-96% от общего его количества врастворе (рисунок 8). |
 Рисунок 7 – Влияние цитратакальция на степень осаждениябелков |  Рисунок 8 – Комбинированноеосаждение белка |
С использованием в схемахвыделения белков III или IV данного приема осажденияи установленныхтехнологических режимов (таблица 2),разработана схема получения БК и БМК,содержащих органическуюформу кальция (рисунок 9);проведена характеристика их пищевой ибиологической ценности.
Таблица 2 -Технологические режимы получения белковыхконцентратов
| Параметры | Вариант 1 | Вариант 2 | |||
| Фунгамил 2500+ Шеарзим 500 Л | Фунгамил Cупер AX | ||||
| Фунгамил2500 | Шеарзим 500Л | Концентра-ция цитрата кальция, % | Фунгамил Cупер AX | Концентра-ция цитрата кальция,% | |
| Гидромодуль | 1:7 | 1:6 | 2±0,2 | 1:6 | 2±0,2 |
| Температура,oC | 65-70oC | 65-70 oC | 65-70 oC | ||
| рН | 5,8-6,2 | 4,8-5,0 | 4,8-5,0 | ||
| КонцентрацияФП, ед/гсырья | 5,8-6,3 | 70-75 | 70-75 | ||
| Времяобработки, мин | 60 | 120 | 120 | ||
Выход БК и БМКбелозерного риса составил 7,8-8,1%, для концентратовиз краснозерного риса – 8,6-9,0 % от общего количествасырья.
и/без
Рисунок 9 – Принципиальнаятехнологическая схема выделения белковыхконцентратов
При определении пищевой ибиологической ценности концентратовпоказано, что содержаниебелка в БК и БМК из белозерного рисадостигает 83-85%, против 78-80% для краснозерного, крахмала – 9,0-11,0% и 14,1-16,1%, соответственно. Массовая доляжира и клетчатки – по0,3% при влажности 4-6%.
Содержание калия,магния, кобальта, марганца,хрома в концентрате из белозерного рисана 10-20% больше, чем в БК из краснозерного риса,тогда как массовая доля кальция, наоборот,меньше в2,3 раза.Содержание железа,меди, цинкатакже меньше в данном БК в 1,1 –2,5 раза.Белково-минеральныйконцентрат из белозерного рисаобогащен кальцием до 7,01 г/кг, из краснозерного – до 7,50 г/кг, против0,073 и 0,170 г/кг в белковыхконцентратах, полученныхбез кальция, цинком – до 34 -36 мг/кг ижелезом – до5,4-9,2 мг/кгпродукта.
Определениебиологической ценности концентратов наосновании анализа аминокислотного составаи перевариваемости in vitro показало, что иззаменимых аминокислот
| в БК изриса содержитсязначительное количество пролина, аргинина,аспарагиновой и глютаминовой кислот, изнезаменимых - треонина, валина, лейцина,серосодержащих и ароматических аминокислот (таблица 3). Первая лимитирующаяаминокислота – лизин (2,9-3,2 г/100 г), вторая – изолейцин. Значительных различий в составеаминокислот между БК из разных видов рисане обнаружено. | Таблица 3 -Аминокислотный составконцентратов
| |||||||||||||||||||||||||||
Исследования перевариваемости БК, проведенные invitro с системой ФП пепсин – панкреатин, всравнении с яичным альбумином, показали,что атакуемость белков с пепсином болеенизкая, чемс панкреатином(рисунок 10).
 Рисунок 10 -Перевариваемость БК in vitro БК белозерного риса: 1-негидролизованный, 2 - гидролизованный;БК краснозерного риса: 3 -негидролизованный, 4 - гидролизованный; 5- контроль | Гидролиз белковисследуемых концентратовпротекал болееинтенсивно, чем гидролиз яичногоальбумина: к концу процессау БК из белозерного зерна спепсином она была вышев 1,5 раза, с панкреатином– в 2,8раза, по сравнению с перевариваемостью контрольного яичного альбумина.Перевариваемость у БК из белозерного рисас пепсином на 38-66 %, а с панкреатином – на 28-50% больше, чем у БК изкраснозерного риса, следовательно, ибиологическая ценность его выше. |
Для улучшения функциональныхсвойств белков проведена ферментативная модификация рисовыхбелков эндопротеиназным ФП Protamex® и экзопротеиназнымFlavourzyme 500MG на примере БКиз белозерного риса (белок 83-85%). Показано, что наибольшееколичество аминного азота выделялось при массовой доле концентрата 25%, температуре50°С и времени гидролиза 150– 180 мин. Наиболее эффективным значением рНявилось 5,0-6,0, а концентрации- 1,0-1,4 Е/г(рисунки 11-12). Максимальноеколичество аминного азота (900-920 мг%)выделялось при степенипротеолиза3,89-4,03%.
При определении оптимальныхпараметров гидролиза белков с ФП Flavourzyme 500MG переменными факторамислужили: температура (Х1),концентрация ФП (Х2),время гидролиза (Х3) функцией (Y) – аминный азот.Опыты проводились при массовой долесубстрата - 25 % и рН - 6,0-6,2 (const), в результате полученоуравнение для прогнозирования количествааминного азота в зависимости отисследуемых факторов (рисунок 13). Обработка данныхв
 |  |
| Рисунок11 - Влияние рН и времени гидролизасубстрата на содержание аминного азота,рН: 1 - 4,0; 2 - 5,0; 3 - 6,0; 4 - 7,0 | Рисунок12 - Влияниеконцентрации Protamex® на содержаниеаминного азота. Е/г белка: 1- 0,6; 2- 1,0; 3-1,4 |
программах Matematika и TableCurve позволила получить оптимальныепараметры гидролиза для точек экстремумамаксимума азота: 55°С,концентрация ФП - 1,5 Е/г белка, времягидролиза –195 мин.
 |  |
| Y= -5341,16+134,2741X1-18,9436X2+2,549306X3-1,38757X12-103,741X22-0,0729X32+10,54811X1X2+0,005208X2X3+0,0143X1X3 | |
Рисунок13 – Зависимость аминного азота отфакторовгидролиза
В итоге,определены оптимальные условия дляпротеолиза БК сФП:
- дляProtamex®: температура 50oС, концентрация субстрата 25%, рН – 5,0-6,0, концентрация ФП – 1,0-1,4 Е/г, времягидролиза 150-180 мин;
- для Flavourzyme 500 MG: температура55oС, концентрациясубстрата 25%, рН –5,5-6,2, концентрация ФП – 1,5Е/г, время гидролиза 195 мин.
Изучение функциональных свойств белковыхконцентратов (таблица 4) показало,что ЖСС, ВСС и растворимостьБК избелозерного риса на 10-15% выше, чем у БК,полученного изкраснозерного риса (столбцы 1); ПОС у него также выше - в5–6раз, а стабильность пены из краснозерного рисавообще отсутствовала.
Концентраты,содержащие кальций (столбцы 2), отличались более низкой ПОС истабильностью пены, посравнению с обычным БК, на 11-52%. Пенау БК из краснозерного такжебыла нестабильной.
Функциональныесвойства белков, полученных с ФП Protamex® (столбцы 3),отличались от свойствнегидролизованных белков: у нихзначительно повышены ПОС и растворимость.
Функциональные свойства угидролизата БК из белозерного риса болеевысокие, чем у гидролизата изкраснозерного риса: ВСС, ЖСС, ЖЭС и СЭвыше - на 9-18 %, ПОС - в 5 раз выше, арастворимость - на 21%. Стабильность пенытакже отсутствовала.
Таблица 4 -Функционально-технологические свойстваконцентратов
| Функционально-технологические свойства | Вид риса и коцентраты,полученные при различных условиях | |||||
| Белозерный | Краснозерный | |||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
| ВСС,г/г | 1,50 | 1,49 | 1,78 | 1,32 | 1,29 | 1,51 |
| ЖСС,г/г | 1,42 | 1,41 | 1,32 | 1,27 | 1,26 | 1,10 |
| ЖЭС,% | 50 | 50 | 48 | 46 | 46 | 43 |
| СЭ,% | 50 | 50 | 48 | 48 | 48 | 43 |
| ПОС,% | 90 | 81 | 280 | 16 | 10 | 55 |
| СП,% | 83 | 70 | 83 | 0 | 0 | 0 |
| Растворимость, % | 3,0 | 3,0 | 42,5 | 2,6 | 2,6 | 35,0 |
Примечание: ВСС - водосвязывающаяспособность; ЖСС - жиросвязывающаяспособность; ПОС – пенообразующая способность; ЖЭС -жироэмульгирующая способность; СЭ – стабильностьэмульсии; СП – стабильность пены.
| Растворимость гидролизованныхбелков в кислых и щелочных средах выше у БКиз белозерного риса, по сравнению с белкамииз краснозерного риса. При рН от 5 до 9 она выше в 2-2,7 раза,по сравнению с исходными (рисунок 14),следовательно, ихприменение перспективно для мучныхкондитерских изделий прирН 7,5-9,5. Длявсех видов БК наиболее высокие показателии для ВСС, ЖСС, ЖЭС и ПОСполучены при нейтральныхили слабощелочных значениях рН (около 8),что также делает перспективным ихиспользование при изготовлении пищевыхпродуктов (рисунок 15). |  Рисунок 14 -Растворимость белков при разных значенияхрН БК избелозерного риса: 1- негидролизованный, 2 -гидролизованный; БК из краснозерного риса:3- негидролизованный, 4- гидролизованный |
 |  |
Рисунок 15 -Влияние рН на свойстваконцентратов
БК из белозерного риса: 1 – негидролизованный, 2 – гидролизованный;БК изкраснозерного риса: 3 - негидролизованный, 4 –гидролизованный
Для обоснования различий вфункциональных свойствах концентратов иих гидролизатов изучены физико-химическиесвойства и особенности структуры белков.
Гель-фильтрация насефадексе G-150позволилафракционировать белкиобоих видов БК и ихгидролизатов на 13 фракций: убелозерного риса (рисунок16, кривая 1) с ММ от 1,3до 199,5 кДа, у краснозерного (рисунок 17, кривая1) – с ММ от 1,3до 251,1 кДа.
Рисунок 16 -Гель-хроматография рисовых БК избелозерного риса на сефадексе G 150
Экстинция при длиневолны 280 нм: 1 –негидролизованные БК; 2 – гидролизованныеБК;
Экстинция придлине волны 405 нм: 3-негидролизованные БК; 4- гидролизованныеБК
Рисунок 17 -Гель-хроматография рисовых белковыхконцентратов из краснозерного риса
Экстинция при длиневолны 280 нм: 1 –негидролизованные БК; 2–гидролизованные БК; Экстинция при длине волны 405 нм: 3-негидролизованные БК; 4-гидролизованные БК
У белозерного рисавысокомолекулярные (ВМ)белки (пики I-V)составляют 24,5%, у краснозерного – 51,3%; белки сосреднемолекулярной (СМ)массой (пики VI-VII) -9 и 18,5%, с низкомолекулярной (НМ) (пики VII-ХIII)– 66,5 и 30,2 %,соответственно (таблица 5).
ММбелков в ВМ области у БК из белозерногориса ниже (69,2-199,5 кДa), чем у краснозерного (77,6-251,1кДa), абольшая часть белков у него сосредоточенав VIII - ом пике(34,4%), тогда как у краснозерного - в болеевысокомолекулярном I - ом пике - (45,3%).
Установлено, что в БКприсутствуют соединения,поглощающие свет при 405 нм, ккоторым относятся флавоноиды. В БК изкраснозерного риса они присутствуюттолько в I-ойфракции (ср. ММ 216 кДа)(кривая 3, рисунок 17), а в БК из белозерногоони распределяются по 3-м более НМ фракциям:131, 10 и 4 кДа (кривые 3, рисунок 16). Вероятно, что более низкиезначения ПОС у БК из краснозерного риса,обусловлены тем, что гидрофобные флавоноиды вступают вовзаимодействие с ВМ белками, что неспособствуют удерживаниюводы на пленках и пенастановится нестабильной.
Таблица 5 - Молекулярные массы (ММ) белков негидролизованныхконцентратов
| Фракции | Белозерный рис | Краснозерный рис | ||
| М.М,кДа | % отобщ. | М.М.,кДа | % отобщ. | |
| Высокомолекулярные | 69,2 - 199,5 | 24,5 | 77,6 -251,1 | 51,3 |
| Среднемолекулярные | 27,5 - 69,2 | 9,0 | 28,5 -77,6 | 18,5 |
| Низкомолекулярные | 1,3-27,5 | 66,5 | 1,5-27,5 | 30,2 |
УБКбелозерного риса,подвергнутых модификации ФП Protamex®, обнаружено 18 фракций, вместо 13 для негидролизованных (кривая 2, рисунок 16).
Количество ВМ фракций уменьшилосьпочти в 2 раза, НМ (1,3-27,5 кДа) - в 2,5 раза,(таблица 6).Верхняяграница ММ ВМ фракцийснизилась с 199,5 до 120,2 кДа. В процессе гидролиза образовались пептиды с ММменее 1300 Да, в количестве52,8% от общеймассы.
Если унегидролизованных БК флавоноидыраспределялись между одной ВМ фракцией(131кДа) и двумя НМ (ММ - 10 и 4 кДа) (кривые 3,рисунок 16), то у гидролизованных - междуодной с ММ 27,5 кДа и двумя с НМ (< 1,3 кДа) (кривые 4,рисунок 16).
Таблица 6 - Молекулярныемассы (ММ)белковыхгидролизатов
| Фракции | Белозерный рис | Краснозерный рис | ||
| ММ, кДа | % отобщ. | ММ., кДа | % отобщ. | |
| Высокомолекулярные | 63,1- 120,2 | 12,4 | 77,6-251,1 | 12,8 |
| Среднемолекулярные | 27,5 -63,1 | 8,7 | 27,5-77,6 | 8,7 |
| Низкомолекулярные | 1,3-27,5 | 26,1 | 1,3-27,5 | 27,5 |
| Низкомолекулярные | < 1,3 | 52,8 | < 1,3 | 51,0 |
Из таблицы 6 также видно, чтоколичественный фракционный составгидролизатов у разных видов риса практически одинаковый, аММ у всехфракций БК из краснозерногориса выше, чем у БК из белозерного риса, особенно в высокомолекулярнойобласти.
Из рисунка 17 видно, что угидролизованных БК из краснозерного риса флавоноидынаходятся в составе 2-хбелковых фракций:высокомолекулярной (ср. ММ -216 кДа) и низкомолекулярной(ММ < 1,5кДа)(кривые4). Следовательно, пригидролизе БК обоих видовриса уменьшается количествофлавоноидов, находящихся вовзаимодействии с ВМбелками, что благоприятноотражается на ПОС, по сравнению снегидролизованными БК.
Подтверждением того,что флавоноиды понижают ПОС, служатрезультаты определения общего ихколичества спектрофотометрическим методом. В БК из краснозерногориса флавоноидовсодержится в 2,3 раза больше, чем в обоихБК избелозерного риса: 1305±5 1328±3 мг/100г,против 561±2 560±3мг/100г.Наиболее низкие значенияПОС и отсутствие стабильности пеныбелков из краснозерного риса сопровождаются ихвзаимодействием с наиболее ВМ(ММ 77,6 - 251,1 кДа).
Расчет коэффициентов корреляциидля 4-х образцов БК показал, что между ПОС и верхнимиграницами ММ(r=-0,95), количеством ВМ фракции (r=-0,8) существует значительная функциональная взаимосвязь, таккак коэффициенты близки к 1, и ее можноописывать математической функцией. Длятого, чтобы рисовые белки имели высокую ПОС(около 280%), ММполипептидов не должна быть более 120 кДа. Чемвыше значения ММ белков ибольше количество фракций сММ > 120 кДа, темпенообразующие свойства БК риса ниже.
Методом спектроскопиикругового дихроизма(КД) изученыпараметры вторичной структуры и перестройки вмолекулах рисовых белков после ихгидролиза. Из рисунка 18 видно, что спектры КДхарактеризуется характерными для -спирали белковположительным
 |  |
Рисунок 18-Характеристика спектров кругового дихроизма рисовых концентратов
1 – БК белозерногориса; 2 - гидролизат БК белозерного риса; 3– БКкраснозерного риса; 4 -гидролизат БКкраснозерного риса
максимумом при 191 нм идвумя отрицательными - при 208 и 221 нм. Вбелках обнаружены все формы вторичнойструктуры. Содержание участков - спирали и 310 – спирали меньше 30%(таблица 7). Низкое количество 310 спиралисоответствует литературным данным онезначительном распространении даннойформы в белках.
Таблица 7 - Вторичнаяструктура рисовых белков и ихгидролизатов, %
Структура | Белковые концентраты | |||
| Белозерный рис | Краснозерный рис | |||
| Негидролизованный | Гидролизат | Негидролизованный | Гидролизат | |
| - спираль | 23 | 2 | 10 | 5 |
| 310 - спираль | 5 | 4 | 4 | 4 |
| - структура | 23 | 36 | 31 | 35 |
| - изгибы | 14 | 9 | 12 | 10 |
| Нерегулярная | 36 | 47 | 42 | 46 |
| Сумма | 101 | 98 | 99 | 100 |
После гидролизабелков амплитуда сигнала КД падает испектр деформируется, особенно убелозерного риса, что сопровождаются почтиполным исчезновением -спиралей иодновременным увеличением доли -структуры инерегулярных участков (в сумме на 94 %).
Гидролиз белковкраснозерного риса приводит к значительноменьшей деформацииспектров КД: доля -спиральных участков уменьшилась на50%, но на 21%увеличилось количество-структурыи нерегулярных участков, что указывает нато, что данные белки болееустойчивы к ферментативному гидролизу, чембелки избелозерного риса, иэто может бытьобусловлено их взаимодействием сфлавоноидами.
Методом ИКспектроскопии выявлено участие функциональных групп вструктуре БК. Спектры обоих БК -это типичные спектры полипептидов, так какнаиболее интенсивными у них являютсяполосы в области 3500-3200см-1, характерные для валентныхколебаний связей N-H, атакже полосы 1664 и 1531 см-1, характеризующие группы С=О пептидных связей (рисунок 19). Полученные данныеподтверждают наличие ограниченного протеолиза в белках.
Функциональные группыв составе БК двух образцов рисасущественно отличаются, на что указываютразличия в спектрах в области поглощениясвязей С-Н и С=О. Высокая интенсивность полос в области2840-2960 см-1,соответствующая валентным колебаниямсвязей в группах –СН2,свидетельствуют о повышенном ихсодержании в семействе флавоноидовкраснозерного риса (флаваны, катехины ит.д.). В этом же спектре отчетливопроявляется ненасыщенность (полосы3010 см-1, 700-740 см-1), характерная длянепредельности ароматических секстетов(–С=С)бензольных ядер флавоноидов и ихтрехуглеродной матрицы (-С-С-С-).Содержание подобных групп атомов в БКиз белозерного риса ничтожно мало.
 |  |
| Рисунок 19 - ИК - спектры рисовых БК игидролизатов: белозерныйрис: 1 –негидролизованный БК; 2 –гидролизованный БК; краснозерный рис:3 – гидролизованныйБК; 4 –негидролизованный БК. | |
В спектре белковкраснозерного риса дополнительнопроявляется интенсивная полоса 1742 см-1, характерная длякетонной (R2С=О) илисложно-эфирной (R-C(=O)OR1) группировок,вероятно,метиловых эфиров гидроксигруппфлавоноидов.
ИК-спектры гидролизатов подтверждают данные хроматографии и КД о незначительных изменениях в белкахкраснозерного риса припротеолизе, за исключениемобластивалентных колебаний ОН- и N-H–групп, указывающейнаперестройки водородных связей.
В БМК из белозерногориса обнаружено повышенное количествокатионов металлов, в противовес свободнымкарбоксильным группам, а учитывая, чтобелок получен с цитратом кальция, то возможно заключитьо присутствии в нем данного минерала.
Для определения ролиSH- групп иковалентных S-S связей в структуреБК определено их количество флуоресцентнымметодом. Пример спектрафлуоресценции (506 нм) белков в разныхрастворителях, приведен на рисунке 20, результатыизмерения количества SH- групп и S-S cвязей – в таблице 8.
Таблица 8 - Содержание SH- групп и S-S cвязей в БК,мкмоль/мг белка
| № п/п | Белковый концентрат | SH- группы, реагент | S-S связи | ПОС, % | ||
| Диметилсульфоксид | Меркаптоэтанол | |||||
| избелозерного риса: | ||||||
| 1 | негидролизованный | 763,2 | 1287,4 | 262,1 | 90,0 | |
| 2 | гидролизованный | 577,3 | 2003,2 | 813,4 | 280,0 | |
| изкраснозерного риса: | ||||||
| 3 | негидролизованный | 773,9 | 1108,8 | 167,4 | 15,6 | |
| 4 | гидролизованный | 721,5 | 1630,5 | 454,5 | 55,0 | |
| Коэффициент корреляции, r | -0,80 | +0,80 | ||||
Значения содержанияSH-групп вышев растворителе- диметилсульфоксиде (ДМСО),чем в додецилсульфате натрия (ДДС-Na), поэтомуони ииспользовались для расчета S-S cвязей (таблица 8).
Видно, что количествоSH-групп в БКобоих видов риса практически одинаково,тогда как содержание S-S cвязей почти на60% выше в БК из белозерного риса.
При гидролизе БК избелозерного риса с препаратом Protamex® количество SH-групп в нем уменьшалось на 32%,тогда как из краснозерного - на 7%.Одновременно увеличилось количествоS-S связей: в БК избелозерного риса – в 3,1 раза, из краснозерного - в 2,7раза.
 Рисунок 20 - Спектрыфлуоресценции БК из белозерного риса:1- с ДМСО; 2- сДДС-Na; 3 - смеркаптоэтанолом; 4 -контроль | Таким образом,протеолиз белков рисасопряжен сконформационнымипереходами вмолекулах белка не только во вторичной структуре (-спираль, -структура,неупорядоченные участки), но и третичной (SH/S-Sпереходы), которые также в большейстепени происходят в белках избелозерного риса, чем из краснозерного.Выявленныеструктурныеизменения висследуемыхбелкахсопровождались отрицательной корреляцией между ПОС исодержанием SHгрупп иположительной – сколичеством S-S связей (таблица 8). |
Участие гидрофобныхсвязей в структуре БК изучено методомагрегации иустановлено, что способность к агрегации у БКбелозерного риса во много раз меньше, чемиз краснозерного риса(рисунок 21, таблица 9). У БКконстанта начального этапа ниже в 67 раз,константа конечного этапа - в 3 раза, угидролизованного БК - в 167 и в 10 раз,соответственно.
 Рисунок 21 - Кривыеагрегации белков Белозерный рис: 1–негидролизованный; 2 – гидролизованный;Краснозерный рис: 3 – негидролизованный; 4 –гидролизованный | Этоподтверждает участие большегоколичества гидрофобных бензольных ядер исложноэфирных группировок флавоноидов вструктуре БК, следовательно, и вформировании функциональных свойств.Выявлена закономерность:чем сильнее гидрофобные свойства белков,тем ПОС ниже, на чтоуказывают высокиекоэффициенты корреляции между константамиагрегации и ПОС (r= -1,0 и - 0,8). |
Таблица 9- Константыагрегации белков рисовыхконцентратов
| Белковые концентраты | Константы | ПОС, % | ||
| начального этапа (К x104) | конечного этапа ( 10/C) | |||
| Белозерный рис: | ||||
| негидролизованный | 1,40±0,05 | 1,85±0,05 | 90 | |
| гидролизованный | 0,03±0,005 | 0,20±0,005 | 280 | |
| Краснозерныйрис: | ||||
| негидролизованный | 94,60±0,5 | 5,60±0,05 | 16 | |
| гидролизованный | 5,07±0,05 | 1,95±0,005 | 55 | |
| Коэффициенткорелляции, r | -1,0 | -0,8 | ||
При гидролизе понижаютсягидрофобные свойствабелков, что свидетельствует о перераспределении вних гидрофобных и гидрофильных групп и большейдоступности последних (-ОН,-SН, -NH2,-COOH ит.д.) в составе свободныхаминокислот.
Таким образом,флавоноиды краснозерного рисаотрицательно влияют на пенообразующуюспособность белков и их гидролизатов, как ина свойство перевариваемости (рисунок 10), чтоследует учитывать при выборе вида риса приполучении их в качестве функциональныхкомпонентов. С другой стороны, такиеконцентраты содержат флавоноидов с антиоксидантнымисвойствами, а также большекальция, железа и цинка.
В целях разработки способовприготовления мучных кондитерских изделийс модифицированным рисовымБМК изученамикроструктура пены концентрата и яичного альбуминапри разных их соотношениях.Установлено, чтопузырькивоздуха в пене яичного белка и модифицированногоБМК имеютпрактически одинаковую форму (шарообразная) иразмеры (20 - 50 мкм) (рисунок 22), однако у БМК больше межпоровых перегородок,чем можно объяснить высокую стабильность его пены- 85%. Смесь яичного белка и БМК отличалась отодного яичного белка большейравномерностью распределения воздушныхпузырьков и более тесным их расположениемотносительно друг друга.
1-Яичныйбелок 2-БМК 3- БМК + яичный белок
1’- Яичный белок+ сахар2’- БМК+ сахар 3’-БМК + яичный белок +сахар
Рисунок 22 -Микроструктура различных образцовпены
При добавлении сахарак БМК вколичестве 54% структура пены улучшалась, посравнению с белками и их смесью, при этомчасть пузырьков еще больше уменьшилась вразмере. Добавление яичного белка к смесисахара с БМКобеспечивало получение пены, напоминающейпену одного яичного белка с сахаром, изполученных данных соотношение гидролизатаи яичного белка в изделиях выбрано50:50.
С учетом высокогокачества пены с гидролизатом рисовыхбелков, исследовали применение модифицированного БМКдля приготовления масляных кексов. При этом заменумеланжа на концентрат проводили вколичестве 50% и 100% от массы сухихвеществ яичного белка. Одновременно, взамен рецептурного количествапшеничной муки, использовали однурисовую мукудля разработки изделия без клейковины.
Показано, что опытныеобразцы имели высокие показателикачества (таблица 10).По сравнению сконтрольнымиобразцами, уних повышалась пористость,улучшаласьформоустойчивость; удельный объем кекса сзаменой 50% меланжа на гидролизат,практически равнялся объемуконтроля.
Таблица 10 - Показатели качества масляныхкексов
| Наименование показателей | Значение показателей | ||
| Контроль | Опытные образцы с гидролизатом БМК, % к массе с. в.меланжа | ||
| 50 | 100 | ||
| Влажность,% | 19,0 | 20,0 | 20,0 |
| Удельныйобъем, см3/г | 2,57 | 2,56 | 2,20 |
| Формоустойчивость Н/Д | 0,50 | 0,57 | 0,53 |
| Пористость, % | 77,0 | 78,0 | 78,0 |
| Щелочность, град. | 1,8 | 1,8 | 1,8 |
| Поорганолептическим показателям кексы неуступали контрольному образцу, при этомнаблюдался выраженный его аромат. Призамене меланжа в количестве 100% на рисовыйгидролизат уменьшался удельный объем,появился специфический привкус риса.Результаты органолептической оценкикекса, с применением 5-ти балльной шкалы,показали, что изделия на основе рисовоймуки, имели такие же высокие показатели,как и контроль из пшеничной муки (рисунок23), тогда как при замене 100% меланжа нагидролизат они ухудшались. |  Рисунок23 - Органолептическая оценкакексов: А - смеланжем (контроль); Б - с заменой 50% меланжа; В - сзаменой 100% меланжа. |
Исследования поприменению модифицированногоБМК для производства бисквитного полуфабриката проводили с использованиемизвестной рецептуры порошкообразной сухой смеси, содержащей сухуюпшеничную клейковину (Пат.2316968). Показатели качества контрольногои опытного бисквитных полуфабрикатов приведены в таблице11. Видно, что плотностьбисквитного теста с сухой смесью,содержащей рисовый модифицированныйБМК, несколько понижалась, а удельный объем,формоустойчивость, пористость изделийувеличивались, по сравнению с контролем.
Таблица 11 - Показатели качествабисквитного полуфабриката
| Наименование показателей | Показатели качества кексов | |
| Контроль | Опыт | |
| Плотность теста,кг/м3 | 525 | 518 |
| ФормоустойчивостьН/Д | 0,33 | 0,38 |
| Удельныйобъем, см3/г | 3,12 | 3,25 |
| Пористость, % | 77,0 | 79,0 |
По результатаморганолептической оценки полуфабрикатастроили профилограммы для полуфабрикатовс меланжем и сухой смесью, содержащейрисовый модифицированныйБМК (рисунок24). Бисквит, приготовленный с известнойсухой смесью, обладал правильной формой,имел ровную поверхность и ярко выраженныйвкус, свойственный данному виду изделий. Убисквита с предлагаемой сухой смесью былиболее высокие органолептическиепоказатели; по структуре, консистенции,форме и внешнему виду образец превосходилконтрольный. Вкус, запах, цвет его неотличались от показателей контрольногообразца.
 | Рисунок 24 -Органолептические показателиполуфабриката: А - с меланжем; Б – со смесью, содержащей модифицированный БМК риса. |
Опытно-промышленнаяапробация и разработка проектовнорматиной документации. Отработка процесса приготовления кексов и бисквитногополуфабриката с рисовым модифицированным БМК проведена в условиях ЗАО «Хлебокомбинат«ПЕКО» и этоподтверждено актами испытаний. В готовом кексес рисовым БМК содержание белка повышается на7%, кальция и магния - в 1,7 и 2,6 раза, скорлизина - с 68 до 85, треонина - с 88до 100%, а количество жира понижаетсяна 3,5%, по сравнению сконтрольным.У кекса опытного образца через 3 и 7 дней хранения общаямикробная обсемененность,количество дрожжей и плесеней были ниже, чем у контрольного смеланжем.
Использованиесухой смеси, в которой сухаяпшеничная клейковина заменяется на рисовыйгидролизат, также улучшает показателикачества бисквитного полуфабриката, повышает содержание белкас 10,4 до 15,6%,понижаеткалорийность на 27 ккал, по сравнению с основнымбисквитом. Скорлимитирующих аминокислотлизина и треонинасоставляет100 и 115%, соответственно. Количествокальция в изделииповышается в 1,5 раза, магния в 4,1 раза и достигает 43,0мг/100г и 43,3 мг/100г,соответственно. В процессе всего периода храненияобщая обсемененность микроорганизмами уконтроля выше, чем у опытного образца.
ВЫВОДЫ
Проведены комплексныеисследования по разработке способовполучения и модификации рисовых белковыхконцентратов избелозерного и краснозерного риса, в результате сделаны следующие выводы:
1.В сравнительном аспектеизучен состав муки изразных видов зерна риса и показано, что мука из белозерногориса характеризуется меньшим количеством белка, зольныхэлементов, ибольшимсодержаниемкрахмала, жира и клетчатки. Ее белки содержат меньше проламинов, глобулинов и альбуминов (на 12-65%) и, соответственно, больше – глютелинов, что отражается на выходе исвойствах концентратов;
2.Для разработки способавыделения белков исследована их растворимостьи обосновано применение 0,01 н. соляной кислоты взамен растворовщелочи; созданы математические моделивзаимосвязи растворимости стехнологическими факторамии выявлены их оптимальныезначения: соотношение мука:кислота - 1:9; концентрациякислоты - 0,01 н.;время экстрагирования - 135 мин;
3. Установленырежимы обработки рисовоймуки ферментнымипрепаратами Фунгамилом 2500, Шеарзимом 500 Л и Фунгамилом Супер АХ, применяемые передэкстрагированием белков 0,01 н. соляной кислотой, атакже условия их осаждения (ИЭТ=7,3) с добавлением2-3% цитрата кальция.
Разработана технологическая схема получениябелковых и белково-минеральных концентратов с выходом7,8-8,1% для белозерного риса, акраснозерного – 8,6- 9,0% от общего количества сырья.
4. Определена пищевая и биологическая ценность БК и БМК. Установлено, что концентрат избелозерного риса содержит на 5-6% большебелков (83-85%), калия, магния; кобальта, молибдена, хрома, номеньше кальция, железа, чем концентратиз краснозерногориса;
БМКконцентраты в 4,3-5,0 раз богаче зольными элементами и, соответственно, минеральнымиэлементами, чем БК.Концентратыхорошо сбалансированы по незаменимымаминокислотам. ПеревариваемостьБК и БМК избелозерного риса с пепсином на 38-66 %, а спанкреатином – на 28-50% выше, чемперевариваемость БК и БМКиз краснозерного риса, но у всехона выше, чему яичного альбумина;
5. Разработанпроцесс гидролиза рисовых белковэндо- (Protamex®) иэкзопротеиназным (Flavourzyme 500 МG®)ФП состепенью протеолиза3,89-4,16%. Получены математические моделизависимости количества аминного азота(930-950 мг%) от технологическихпараметров, выявлены оптимальные значения для температуры, концентрации субстрата, временигидролиза,концентрации ФП;
6. Установлено, чтофункциональные свойства концентратов выше у БК из белозерного риса, чем у БК изкраснозерного риса. Приэтом ПОС почти в 5–6 раз выше, а стабильность пеныу белков из краснозерногориса вообщеотсутствует.Под влиянием цитрата кальция свойствабелковых концентратовнесколько ухудшаются;
Угидролизатов БМК, полученных сФП Рrotamex®, повышаются ВСС, ПОС и растворимость, аЖСС, ЖЭС и СЭ, наоборот,понижаются, по сравнению снегидролизованными БК. Пенообразующаяспособность гидролизатабелково-минерального концентрата избелозерного риса достигает ПОС яичногоальбумина;
7.Выявлены особенности структуры белков концентратов рисовых белков, установленоприсутствие в них флавоноидов, отличия в степени протеолиза и взаимосвязь функциональныхсвойств белков с их структурой:
- гельфильтрацией насефадексе G-150 установлено, чтобелки избелозерного риса имеютболее низкие молекулярныемассы: 1,3-199,5 кДа, против1,5-251,1кДа у краснозерногориса. Упервого БКбольшая часть белковсосредоточена в низкомолекуляных фракциях (11,7-27,5 кДа), тогда как у второго – водной болеевысокомолекулярной фракции (182-251,1 кДа). Впроцессе гидролиза ММвысокомолекулярных белкову белозерного рисапонижаются с 199,5 до 120,2 кДа собразованием пептидов с ММ < 1,3 кДа, а украснозерного – неизменяются, что подтверждаеменьшую степень ихпротеолиза;
- белкириса взаимодействуютс флавоноидами: у белозерного с 3-мяотносительно НМ фракциями (131, 10 и 4 кДа), украснозерного – с ВМфракцией (216 кДа). Количество флавоноидов в концентратах избелозерного риса в 2,3 разаменьше, чем вконцентратах изкраснозерного риса;
- методом КД в концентратахобнаружены элементы вторичнойструктуры белков: –спираль, 310– спираль,-структура,-изгибы инеупорядоченная форма. Протеолиз белков сопровождаетсяуменьшением количества -спиралей,увеличением -структуры, нерегулярных участков,ослаблениемгидрофобных свойств и увеличениемсодержания S-S связей. Изменения у гидролизатов краснозерного рисаменьше, чем у гидролизатов избелозерного риса;
- методом ИК-спектроскопииподтверждена ограниченнаястепень протеолиза белков. УБК из краснозерного риса присутствуют вбольшей степени –СН2группы семейства флавоноидов, область ненасыщенности групп бензольныхядер, кетонных и сложноэфирныхгруппировок, указывающих на взаимодействие флавоноидов сбелками;
8.Выявлена отрицательная корреляция (r)пенообразующей способности белков с верхнимиграницами значений ММ (-0,95), их количеством ВМ(-0,80) и константами агрегации (-0,8-1,0), атакже положительная (+0,8) – сколичеством S-Sсвязей. Высокая ПОС взаимосвязана сбелками с ММне выше 120кДа.
9. Разработаныспособы ирецептуры бисквитногополуфабриката и масляных кексов с модифицированнымБМК из риса. Обоснованоприменение модифицированного БМК и рисовой муки взамен всейпшеничной муки в кексах безклейковины. Установлено положительноевлияние сухой белковой смеси с БМК нафизико-химические и микробиологическиепоказатели полуфабриката. Разработаныпроекты ТУ и ТИ на модифицированныйБМК, на масляный кекс «Бесклейковинный» ибисквитныйполуфабрикат «Вегетарианский». Проведенаопытно-промышленная апробация в условияхЗАО «Хлебокомбинат «ПЕКО».
Списокработ, опубликованных по темедиссертации
1. Фан Куинь Чам, Колпакова В.В.Растворимость и выходбелков рисовой муки в присутствии ферментныхпрепаратов // Известиявузов. Пищевая технология. –2012. – № 4. – С.30-33.
2. Колпакова В.В., Фан Куинь Чам,Чумикина Л.В., Смирнов С.О.Рисовый белок: получениебиотехнологическим способом с применениемкарбогидраз // Хранение ипереработка сельхозсырья. – 2012. – №11. – С. 20-24.
3. Колпакова В.В., Чумикина Л.В.,Васильев А.В., Фан Куинь Чам, Арабова Л.И., Топунов А.Ф.Влияние ферментативноймодификации на физико-химическиесвойства зерновых белков // Известия вузов. Пищевая технология. - 2013. -№1. - С.19-24.
4.КолпаковаВ.В., Фан КуиньЧам,ЧумикинаЛ.В.,ВасильевА.В.,АрабоваЛ.И.,ТопуновА..Ф.Функциональные свойства зерновыхбелков, гидролизованных ферментнымипрепаратами// Известия вузов. Пищевая технология. - 2013. - №1. - С.47-50.
5. ФанКуинь Чам, Румянцева Г.Н., Колпакова В.В.Кинетика и режимы действия - и - амилаз в процессеполучения мальтозосодержащихгидролизатов // Сб. статей XI межд. научно-практической конференции «Фундаментальные иприкладные исследования, разработка иприменение высоких технологий впромышленности», Ч.2. – СПб.: 2011. – С. 234-236.
6. Фан Куинь Чам,Колпакова В.В. Экстрагирование белковрисовой муки // Сб. мат. IX
Межд.научно-практической конференции «Технологии и продукты здоровогопитания. Функциональные пищевыепродукты».– М.: МГУПП, 2011. – С. 336-338.
7. ФанКуинь Чам, Колпакова В.В. Комплекснаяобработка рисовой муки ферментнымипрепаратами // Сб. мат. IXМежд. научной конференции студентов и молодых ученых «Живыесистемы и биологическая безопасностьнаселения».– М.: МГУПБ.,2011. – С. 49-51.
8. ФанКуинь Чам, Румянцева Г.Н., Колпакова В.В.Микробные амилазы для получениямальтозосодержащих гидролизатов // Тезисы докл. VIII Межд. научнойконференции студентов иаспирантов «Техника и технология пищевыхпроизводств», Ч.2. – Могилев: УО «МГУП»., 2011. –С. 8.
9. ФанКуинь Чам, Колпакова В.В., Чумикина Л.В.Ферментативная экстракция и выделениебелков из белозерного и краснозерного риса// Тезисы докл. VIII Межд. научнойконференции студентов иаспирантов «Техника и технология пищевыхпроизводств», Ч.1. – Могилев: УО«МГУП», 2012. –С. 119.
10. ФанКуинь Чам, Колпакова В.В. Получение исвойства рисового белка как сырья дляфункциональных продуктовпитания // Cб. мат. X-ойнаучно-практическойконференции смеждународным участием «Технологии ипродукты здорового питания.Функциональные пищевые продукты». – М.: МГУПП, 2012.– С.274-276.
11. ФанКуинь Чам, Белоусов В.И., Колпакова В.В.Получение и функциональные свойствагидролизатов белков белозерного и краснозерногориса //Материалы X Межд. научнойконференции студентов имолодых ученых «Живыесистемы и биологическая безопасностьнаселения». – М.:МГУПП, 2012. –С. 8-9.
12. ФанКуинь Чам, Колпакова В.В., Чумикина Л.В.Биотехнологический способ модификациирисовых белковэндопротеиназами // Сб.тезисов IXМежд. научной конференции «Техника и технология пищевых производств», Ч.1.– Могилев:УО «МГУП»., 2013. – С. 229.
13. ФанКуинь Чам, Колпакова В.В., Чумикина Л.В.Разработка параметров ферментативноймодификации рисовых белков// Сб. статей Межд. научногофорума «Пищевыеинновации и биотехнологии». – Кемерево, 2013. – С.249-252.
14. Фан Куинь Чам,Колпакова В.В. Ферментативное выделение ифункциональные свойстварисовых концентратов// Материалы VII Московского Межд. Конгресса«Биотехнология: Состояние и перспективыразвития», Ч.2.– М: ЗАО«Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д. И.Менделеева, 2013. –С. 65-66.
15 Колпакова В.В., Фан Куинь Чам, Чумикина Л.В.«Способ получениягидролизата белка из рисовой муки». Заявка наизобретение № 2012147113 от07.11.2012
Список принятыхсокращений
ФП–ферментный препарат; АС – амилолитическаяактивность; ПС –протеолитическая активность; ГКА – ксиланазнаяактивность; ВСС –водосвязывающая способность; ЖСС – жиросвязывающаяспособность; СП – стабильностьпены; ПОС – пенообразующаяспособность; ЖЭС –жироэмульгирующая способность; кДа – килодальтон; ДМСО – диметилсульфоксид;ДДС-Na –додецилсульфатнатрия; SH-группы –сульфгидрильныегруппы; S-S связи –дисульфидные связи; ММ–молекулярная масса; ВМ–высокомолекулярные белки; СМ–среднемолекулярные белки; НМ –низкомолекулярные белки; КД – круговойдихроизм; ИК -спектроскопия – инфракраснаяспектроскопия; БК– белковыйконцентрат; БМК –белково-минеральный концентрат, ИЭТ – изоэлектрическаяточка.
Summary
Parameters of protein concentrates isolation from white and redrice using acid extraction, amylase andxylanase enzymesas well as parameters of their functional propertiesmodification by endo-and exoproteases areestablished theoretically. Methods of obtaining rice protein concentrates and modified riceprotein concentrates containing calcium with high protein content and certain desirable functional properties are described.The relational patterns of molecular weights,aggregation ability and presence of flavonoids with functionalproperties areidentified for further modification and regulation of the latter. Possibilities of modified riceprotein concentrates application as foamingagents in productionof biscuits and cakesare investigated.Quality characteristics of biscuits and gluten-free cakesbased on modified riceprotein concentrates are studied.
Автор выражаетглубокую признательностьи благодарность за помощь привыполнении работы к.б.н., ст. научному сотрудникуЛ.В. Чумикиной; д.т.н., проф. Г.Н.Румянцевой;д.б.н., проф. А.Ф. Топунову; к.б.н., научному сотруднику Л.И. Арабовой; к.т.н., доц. Т.А.Юдиной;д.т.н., проф. З.Г. Скобельскойи д.т.н., проф. Т.Г.Богатыревой.
