Совершенствование технологии пивного сусла на основе активации гидролитических ферментных препаратов микробного происхождения

На правах рукописи

ЛЫСЮК ВАСИЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПИВНОГО СУСЛА

НА ОСНОВЕ АКТИВАЦИИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность: 05.18.07 -

Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре «Процессы ферментации и промышленного биокатализа» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Гернет Марина Васильевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

кандидат технических наук,

Кобелев Константин Викторович

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления имени К.Г. Разумовского»

Защита состоится декабря 2011 года в ___ часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, 11, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП». Автореферат отправлен по адресу [email protected] для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, г.Москва, Волоколамское шоссе, 11, МГУПП, ученому секретарю Совета.

Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь

Совета к.т.н. Тимофеев Д.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Пиво является популярным напитком во всем мире, в т. ч. и в России. Несмотря на то, что в последние годы темпы роста его производства несколько снизились, пиво остается продуктом повышенного потребительского спроса. Развитие пивоваренной отрасли направлено на интенсификацию технологического процесса, повышение качества готовой продукции и снижение затрат на ее производство.

Производство пива – совокупность сложных процессов, тесно связанных между собой. Это биохимические превращения компонентов зерна при солодоращении, многообразные ферментативные превращения при получении сусла, метаболизм дрожжей при брожении и дображивании.

На основании углубленных исследований о биохимических реакциях, протекающих на стадии солодоращения и получения пивного сусла, обоснована целесообразность применения в производстве пива гидролитических ферментных препаратов(ФП) микробного происхождения, как компенсация недостаточной ферментативной активности солодов пониженного качества и при частичной замене солода на более дешевое, чем солод, несоложеное сырье.

С учетом относительно высокой стоимости ФП актуальными являются исследования, направленные на повышение эффективности их применения в технологии пивного сусла на основе разработки способов активации ФП и повышения их функциональной и операционной стабильности, внедрение которых позволит уменьшить дозировку ферментных препаратов, интенсифицировать технологический процесс при увеличении выхода экстракта и будет способствовать более полному использованию сырья.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: научное обоснование, разработка и применение способов активации микробных ферментных препаратов (на примере ФП Laminex BG глюканазного действия, амилазы Альфалад БН и мультэнзимной композиции на их основе) для интенсификации процессов биокатализа в технологии пивного сусла.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

На основании кинетических исследований обосновать выбор С7-алкилоксибензола (С7-АОБ), относящегося к природным структурным модификаторам белков, для применения в качестве активатора промышленных ФП микробного происхождения.

Исследовать влияние С7-АОБ на ферментативную активность (ФА) ФП Laminex BG, его функциональную и операционную стабильность.

Разработать условия предварительной активации ФП Laminex BG в присутствии С7-АОБ для интенсификации биокаталитических процессов в технологии пивного сусла.

Обосновать целесообразность формирования мультэнзимной композиции (МЭК) на основе активированных ФП Laminex BG и Альфалад БН и провести оптимизацию состава МЭК с использованием униформ – ротатабельных планов эксперимента.

Дать сравнительную оценку физико–химических показателей качества пивного сусла, полученного по традиционной технологии и при использовании на стадии затирания активированных ФП.

Провести исследования для характеристики пивного сусла по содержанию белка и его фракционного состава.

Провести опытно–промышленную апробацию применения разработанных способов активации ФП при получении пивного сусла для оценки физико–химических показателей в сравнении с традиционной технологией.

Разработать принципиальную технологическую схему и технологические рекомендации по применению предварительной активации исследованных гидролитических ФП для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов.

Научная новизна.

На основании исследования кинетики ферментативной реакции (на примере гидролиза целлюлозы ФП Laminex BG) установлено, что С7-АОБ, влияет на характер зависимости начальной скорости реакции (Vo) от концентрации фермента [Е] и субстрата [S], способствует увеличению максимальной скорости ферментативной реакции (Vmax) более, чем в 2 раза, и не изменяет при этом другой кинетический параметр ферментативного процесса – константу Михаэлиса (Km), что позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ – фермент, как неконкурентную активацию, вследствие конформационных изменений белка фермента.

Доказано эффективное стабилизирующее действие С7-АОБ на гидролитические ФП микробного происхождения в широком диапазоне рН и термературы биокатализа и показано увеличение рН- и термостабильности ФП при сохранении эффекта активации в процессе биокатализа.

Выявлены условия предварительной инкубации промышленных ФП микробного происхождения (температура, продолжительность, концентрация С7-АОБ) для повышения их функциональной активности при гидролизе крахмальных и некрахмальных полисахаридов при получении пивного сусла.

Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 – 37000, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработан новый подход к интенсификации процесса получения пивного сусла из солода и несоложеного сырья, заключающийся в использовании на стадии затирания предварительно активированных гидролитических ферментных препаратов цитолитического и амилазного действия.

Разработаны способы активации ФП с использованием С7-АОБ в качестве активатора и стабилизатора ФП, приводящие к увеличению их каталитической активности в 1,7 (ФП Альфалад БН) и 3,8 (ФП Laminex BG) раза.

Применение разработанных способов предварительной активации ФП при их раздельном использовании приводит к сокращению продолжительности осахаривания затора на 30 – 45 %, увеличению выхода экстракта на 4,5 – 11 %, скорости фильтрования в 1,2 – 1,3 раза (в зависимости от качества солода).

Экспериментально обоснована возможность замены 30 % солода (для солода пониженного качества) и 40 % (для солода хорошего качества) на несоложеный ячмень при использовании МЭК на основе активированных ФП Laminex BG и Альфалад БН на стадии затирания зернопродуктов. С использованием униформ–ротатабельных планов эсперимента проведена оптимизация дозировок ФП в МЭК для сокращения продолжительности осахаривания затора и получения сусла с физико–химическими и органолептическими показателями, соответствующими стандарту, и обеспечения выхода экстракта 81 – 84 %. Показано, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ позволяет снизить в 2 раза расход ФП на затирание зернопродуктов при получении пивного сусла.

Результаты лабораторных исследований подтверждены при опытно–промышленной апробации в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки». Показано, что пиво из производственного сусла, полученного с использованием активированных ФП, соответствует (а по ряду показателей превосходит) требованиям ГОСТ к светлому пиву.

Разработаны принципиальная технологическая схема и технологические рекомендации по применению предварительной активации в присутствии С7-АОБ ФП Laminex BG и Альфалад БН для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов. Расчетный экономический эффект составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива в год.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-ей Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека», секция «Пищевая химия, биотехнология» (Кемерово, 2010); 3-ей межведомственной научно–практической конференции «Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров» (Москва, 2010); на «Инновационном форуме пищевых технологий», секция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 – в журналах по утвержденному списку ВАК.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Основное содержание диссертационной работы изложено на 151 листах машинописного текста, проиллюстрировано 36 рисунками и 41 таблицами. Список литературы включает 194 источника отечественных и зарубежных авторов.

1. Обзор литературы.

Представлены современные представления о строении, свойствах и превращениях полисахаридов зернопродуктов при получении пивного сусла, проведен анализ опубликованных данных о роли расщепления гемицеллюлоз и гумми – веществ под действием ферментов ячменного солода и цитолитических ферментных препаратов микробного происхождения в технологии сусла и пива. Рассмотрены научные аспекты активации ферментов и применения активации промышленных ферментных препаратов для интенсификации биокаталитических процессов в пищевых технологиях. Обсуждены результаты исследований, характеризующих биологическую активность алкилоксибензолов (АОБ), и их роль в регуляции активности ферментных белков.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Объекты и методы исследования

В работе в качестве объектов исследования использовали: гидролитические ФП Laminex BG компании «Даниско» и Альфалад БН Ладыжинского завода ферментных препаратов «Энзим»; лабораторное и производственное сусло, полученное настойным способом затирания ячменных солодов различного качества (табл. 1) и смеси зернопродуктов (при частичной замене солода на ячмень).

Таблица 1

Характеристика зернопродуктов, ячменного солода, применяемых при получении пивного сусла.

Наименование показателя	Солод (№ 1)	Солод (№ 2)	Солод (№ 3)	Солод (№ 4)
Массовая доля влаги, %	4,0	4,5	5,2	4,5
Экстрактивность, %	73,4	78,2	73,2	79,5
Продолжительность осахаривания, мин	18	22	24	15

В качестве структурного модификатора ферментов, входящих в Laminex BG и Альфалад БН, был выбран С7-АОБ, относящийся к природным ауторегуляторным факторам развития микроорганизмов и растений. В работе использовали аналог природного С7-АОБ, полученный ООО «Новые технологии» РХТУ им Д.И. Менделеева совместно с институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Целлюлозолитическую активность ФП (АФБ) определяли по количеству редуцирующих веществ (РВ), образующихся при гидролизе фильтровальной бумаги (ФБ), активность эндоглюканазы – вискозиметрическим методом, ксиланазную активность – по определению скорости ферментативной реакции по количеству образовавшихся РВ в результате гидролиза ксилана, амилолитическую активность (АС) – по методу Рухлядевой и Горячевой.

Кинетику действия ферментного препарата Laminex BG изучали по гидролизу некрахмальных полисахаридов модельного субстрата (ФБ). Начальную скорость ферментативной реакции (V0) в каждом варианте гидролиза определяли как тангенс угла наклона касательной, проведенной из начала координат к кинетическим кривым накопления РВ в начальный период реакции. Vmax и Кm определяли на основании представления зависимости Vо от [S] в координатах Лайнуивера –Берка.

Определение продолжительности осахаривания (осах) затора зернопродуктов проводили по йодной пробе, содержание экстрактивных веществ в сусле – пикнометрическим методом, на основании чего рассчитывали выход экстракта по соответствующей формуле. Анализ пивного сусла осуществляли в соответствии с ГОСТ 29294–92 и химико–технологическим контролем производства солода и пива.

Определение содержания общего азота проводили методом Кьельдаля, аминного азота методом формольного титрования с применением смешанных индикаторов (фенолфталеина и бромтимола синего).

Для исследования фракционного состава белков и продуктов протеолиза охмеленного сусла использовали метод гель–фильтрации, основанный на разделении смеси молекул по их молекулярной массе.

РВ определяли методом Шомодьи – Нельсона и колориметрически по реакции с 3,5–динитросалициловой кислотой.

Обработку экспериментальных данных выполняли с использованием методов математической статистики. Результаты исследований в виде средних арифметических представлены на рисунках и оформлены в виде таблиц.

Проведение экспериментов по выбору оптимальных соотношений ферментов в МЭК проводили в соответствии с композиционным униформ ротатабельным планом с последующей математической обработкой с использованием метода корреляционно–регрессионного анализа и пакета программ «Matstat» и «Statistica 6,0».

2.2. Исследование условий активации ферментного препарата Laminex BG в присутствии С7-АОБ.

2.2.1. Влияние С7-АОБ на кинетику реакции гидролиза некрахмальных полисахаридов ФП Laminex BG.

На основании опубликованных в литературе данных по активации и стабилизации ферментных белков животного и растительного происхождения (лизоцина яичного белка, трипсина свиной поджелудочной железы, и - амилазы ячменя) природными химическими шаперенами, относящимися к классу алкилрезорцинов – алкилоксибензолов (АОБ), были проведены исследования по обоснованию выбора С7-АОБ в качестве активатора гидролитических ферментных препаратов микробного происхождения.

Рис. 1. Зависимость Vo=[E]: 1 – контроль; 2 – гидролиз в присутствии С7-АОБ. Рис. 2. Зависимость Vo=[S] (а); Vo=[S] в координатах Лайнуивера – Берка (б): 1 – контроль; 2 – ферментативный гидролиз в присутствии С7-АОБ.

Нами было исследо-вано влияние С7-АОБ на кинетику ферментативной реакции на примере гид-ролиза ФБ ферментным препаратом Laminex BG. В результате прове-денных исследований бы-ли получены кинетичес-кие кривые накопления РВ в процессе ферментатив-ного гидролиза при разли-чных концентрациях фер-мента [E], субстрата [S] и С7-АОБ, определены на-чальные скорости фермен-тативной реакции V0 при различных условиях гид-ролиза и получены зави-симости V0 от концен-трации С7- АОБ, от [E] и [S] (в присутствии и в отсутствие С7-АОБ). Анализ полученных зависимостей показал, С7- АОБ выполняет роль активатора ФП Lаminex BG: проведение гидролиза в присутствии С7-АОБ увеличивает начальную скорость реакции более, чем в 2 раза (рис. 1; 2а).

На основании представления экспериментальных данных по зависимости V0 от [S] в координатах Лайнуивера – Берка (рис. 2б), определены кинетические параметры – максимальная скорость ферментативной реакции (Vmax ) и кажущаяся константа Михаэлиса (Km). Установлено, что С7-АОБ не влияет на величину Km (Km = 0,25), но существенно увеличивает Vmax (0,0167) относительно контроля (Vmax = 0,0071). Это является косвенным подтверждением того, что С7-АОБ вызывает определенные конформационные изменения в молекуле белка фермента, следствием чего является увеличение ФА, и это позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ - фермент как неконкурентную активацию.

2.2.2. Исследование влияния тепловой обработки и С7-алкилоксибензола на активность ФП Laminex BG.

Инкубацию 1%-ого раствора ФП в ультратермостате при температуре 45 oС, 50 oС, 60 oС, 70 oС в течение 90 мин. ФА выражали в процентах к контролю (препарат без предварительной тепловой инкубации) (рис. 3.), активность которого была принята за 100 %. Концентрацию С7-АОБ варьировали в интервале 0,05 – 1,5 мг/см3. Было установлено, что проведение предикубации раствора ФП при 50 оС в течение 30 – 60 минут приводит к увеличению активности на 35 – 60% (рис. 3).

Рис.3. Влияние условий предварительной тепловой обработки на активность ФП Laminex BG.

Установлено, что во всем диапазоне изученных концентраций С7-АОБ оказывал активирующее действие на ФП. Макси-мальное увеличение ФП наблюдалось при концент-рации С7-АОБ 1 мг/см3, при длительности предин-кубации 60 мин: в 2,5 раза по сравнению с ак-тивностью ФП после тепловой обработки без С7-АОБ и в 3,8 раза – по сравнению с ФА препарата

Рис. 4. Влияние длительности прединкубации на ФА Laminex BG в присутствии С7-АОБ: К-контроль; О – опыт.

в контроле (ФП без прединкубации) (рис. 4). С учетом результатов кинетических исследо-ваний это можно объяс-нить тем, что С7-АОБ, связываясь с молекулой фермента вне активного центра, приводит к кон-формационным изме-нениям ферментного белка, увеличивающим доступность активного центра для ферментатив-ной реакции.

2.2.3. Влияние С7-АОБ на функциональную стабильность ФП Laminex BG.

Установлена стабилизирующая роль С7-АОБ при изучении термостабильности ФП (рис. 5): при прогреве растворов ФП при температурах

55 – 65 оС в течение часа (в отсутствие С7-АОБ) наблюдается существенное снижение и даже инактивация фермента; при прогреве ФП при 55 – 60 оС в при-

Рис. 5. Термостабильность ФП Laminex BG: 1 – в отсутствие С7-АОБ; 2 – в присутствии С7-АОБ; 3 – максимальная активность в отсутствие С7-АОБ.

сутствии С7-АОБ ФА выше, чем в контроле, в 2,3 – 3,8 раза, а при 65 оС – на уровне контроля. Увеличение рН-стабильности ФП было продемонстрировано проявлением повышенной активности ФП при инкубации в широком диапазоне рН (3,1 – 7,0).

2.2.4. Влияние С7–АОБ на операционную стабильность ФП Laminex BG.

Для изучения влияния АОБ на оптимальные условия действия ФП Laminex BG температуру реакции гидролиза ФБ варьировали от 45 до 70 оС, а значения рН – от 3,3 до 7,0. Влияние АОБ на стабильность конформации молекул фермента оценивали по изменению рН- и температурного диапазона действия.

Анализ полученных данных показал, что операционная стабильность фермента в результате модификации его структуры С7-АОБ проявляется в значительном расширении диапазона рабочих значений рН и температуры действия ФП с сохранением оптимума катализа: даже при температуре гидролиза 70 оС ФП с С7-АОБ еще достаточно активен, его активность выше, чем в контроле более, чем в 3 раза (рис. 6). Отмечено, что во всем исследованном диапазоне рН ФА выше, чем в контроле в 2,5 – 3,0 раза.

Рис. 6. Влияние С7-АОБ на температурный оптимум действия препарата Laminex BG: 1 – ФП без прединкубации с С7-АОБ; 2 – ФП после прединкубации с С7-АОБ.

Таким образом, проведение прединку-бации Laminex BG в присутствии С7– АОБ позволяет не только активировать фермент, но и в значительной сте-пени расширить диапа-зон его действия как в области рН, так и тем-пературы, что будет спо-собствовать более эффективному исполь-зованию ферментного препарата при получе-нии пивного сусла.

2.3. Разработка условий применения предварительной активации ФП Laminex BG при затирании зернопродуктов в процессе получения пивного сусла.

Исследования проводили путем проведения лабораторного затирания настойным способом. В качестве примера в табл. 2 представлены результаты исследований при использовании солода № 1.

Таблица 2

Выбор дозировки С7-АОБ для применения активации ФП Laminex BG при получении пивного сусла (солод №1)

№ п/п	Вариант опыта	Продолжительность осахаривания затора		Выход экстракта		Скорость фильтрования
		мин	% к контролю	%	% к контролю	см3/с	% к контролю
1	Контроль – 1 (без ФП)	18	100	73,7	100	0,25	100
2	Контроль –2 (ФП без активации)	14	77,7	75,2	102	0,27	108
3	Концентрация С7-АОБ при прединкубации ФП, % к солоду
	0,01	14	77,7	75,8	102,8	0,27	108
	0,02	12	66,7	76,4	103,6	0,28	112
	0,06	10	55,6	77,3	104,8	0,33	132
	0,10	10	55,6	80,0	108,5	0,33	132

На основании проведенных исследований определены следующие условия применения ФП Laminex BG для интенсификации гидролитических процессов при получении пивного сусла: концентрация ФП – 0,3% к массе солода; условия прединкубации раствора ФП: tо = 50 оС; длительность прединкубации – 1 час; концентрация С7-АОБ – 0,1 % к массе солода.

Продолжительность осахаривания при этом сокращается на 45 %, выход экстракта увеличивается на 8,5 %, скорость фильтрования увеличивается более, чем на 30 %.

Полученные результаты были подтверждены при использовании других солодов, отличающихся большей продолжительностью осахаривания затора (солод № 2 и № 3) (табл. 3).

Однако при замене 30 % солода на ячмень такой показатель, как выход экстракта (ВЭ) существенно ухудшался. Это указывает на то, что активация ФП Laminex BG не может компенсировать полностью уменьшение количества солодовых ферментов.

Таблица 3

Результаты использования активированного ФП

при затирании солодов различного качества.

Показатели	Вариант опыта
	Солод № 2		Солод № 3
	Конт-роль	Затирание с активи-рованным ФП	Конт-роль	Затирание с активи-рованным ФП
Продолжительность осахаривания, мин	22	15	24	15
Выход экстракта, %	78,3	82,5	73,6	81,8
Скорость фильтрования, см3/с	0,25	0,32	0,25	0,29
рН	5,5	5,60	5,60	5,60
Кислотность	0,8	0,70	0,70	0,70

В этой связи были проведены исследования по формированию и активации мультэнзимной композиции (МЭК) с использованием С7-АОБ для интенсификации процесса получения пивного сусла из солодов, различающихся показателями качества, а также при 15, 30 и 40%-ой замене солода на несоложеный ячмень.

2.4. Создание МЭК на основе активированных ФП Laminex BG и Альфалад БН для интенсификации биокаталитических процессов при получении пивного сусла из солода и несоложеных материалов.

2.4.1. Влияние прединкубации ФП Альфалад БН в присутствии С7-АОБ на ферментативную активность и операционную стабильность ФП.

Нами было установлено, что проведение прединкубации ФП Альфалад БН (tо = 50 оС, концентрация С7-АОБ – 1 мг/см3, продолжительность прединкубации 1 час) способствует увеличению ФА препарата на 70 %. Температурный оптимум действия фермента при этом не изменяется, но в присутствии С7-АОБ существенно увеличивается операционная стабильность ФП, что проявляется в сохранении повышенной ФА в условиях ферментативного гидролиза в широком диапазоне температур (от 40 оС до 70 оС) (рис. 7).

Рис. 7. Влияние С7-АОБ на температурный оптимум действия препарата ФП Альфалад БН: 1 – ФП без прединкубации с С7-АОБ; 2 – ФП после прединкубации с С7-АОБ.

Установлено, что проведение предварительной активации ФП Альфалад БН в присутствии С7-АОБ способствует интенсификации последующего ферментного гидролиза крахмала (рис. 8).

Рис. 8. Накопление РВ при гидролизе растворимого картофельного крахмала ФП Альфалад БН: 1 – прединкубация ФП в присутствии С7- АОБ; 2 – контроль

2.4.2. Применение активированного ФП Альфалад БН на стадии затирания зернопродуктов при получении пивного сусла.

Было установлено, что проведение предварительной инкубации ФП Альфалад БН при тех же условиях, что и в случае Laminex BG, способствует повышению эффективности действия ФП Альфалад БН при получении пивного сусла из солода различного качества. Продолжительность осахаривания сокращается на 40 – 50 %, выход экстракта увеличивается на 7 – 10 %, скорость фильтрования на 8 – 16 % по отношению к контролю (затирание без ФП) и соответственно на 25 – 33 %, 4,5 – 5,0 % и 4 – 11 % по отношению к варианту затирания солода с неактивированным ФП. Однако, применение ФП Альфалад БН при 30%-ой замене солода на ячмень не показало положительного эффекта по такому показателю, как ВЭ, который составил по отношению к контролю 88 – 92 %.

2.4.3. Сравнительная характеристика фракционного состава белков пивного сусла, полученного с использованием при затирании ФП Laminex BG и Альфалад БН.

В процессе получения пивного сусла имеет место не только расщепление крахмала и некрахмальных полисахаридов, но и расщепление белков с образованием средне и низкомолекулярных белков и полипептидов, имеющее значение для пеностойкости и коллоидной стабильности пива, и свободных аминокислот, необходимых для питания дрожжей при брожении. Считается, что для пенообразования имеет значение содержание белка с молекулярной массой 10000 – 60000, а высокомолекулярные белки с молекулярной массой более 60000 влияют на появление в пиве мути.

В свете этого, при модификации традиционной технологии пивного сусла (в частности, за счет применения ФП микробного происхождения и несоложеного сырья) необходимо проверить влияние этой модификации на содержание общего и аминного азота и фракционный состав белков сусла. С этой целью было получено охмеленное сусло без использования ФП (контроль) и с использованием активированных препаратов Laminex BG и Альфалад БН.

Для исследования фракционного состава белков и продуктов протеолиза охмеленного сусла использовали метод гель-фильтрации на сефадексе G-75.

По полученным профилям элюции белков сусла было сделано заключение, что белки сусла можно разделить на три основные фракции. Анализ распределения водорастворимых белков сусла по фракциям (табл. 4) показывает, что незначительную часть анализируемых белков составляют высокомолекулярные белки. Фракция II включает белки и пептиды с молекулярной массой 37000 – 15000. Фракция III, выходящая с общим объемом колонки, включает аминокислоты, средне– и низкомолекулярные пептиды, фенольные соединения и другие низко-молекулярные продукты.

Сравнение данных по фракционированию белков сусла, полученного при затирании солода с ФП Laminex BG, с контролем показало, что соотношение белковых фракций I, II и III изменилось незначительно. В сусле, полученном с Альфалад, было отмечено уменьшение фракции II. Однако, уменьшение при этом в белках сусла доли высокомолекулярных белков и увеличение доли фракции III по сравнению с контролем в комплексе с полученными результатами исследований по влиянию ФП Альфалад БН на осах. при 30%-ой замене солода на несоложеный ячмень говорит в пользу формирования МЭК на основе этих ФП для интенсификации процесса получения пивного сусла из солодов пониженного качества и несоложеных материалов.

Таблица 4

Фракционирование водорастворимых белков охмеленного сусла

на сефадексе G – 75

Фрак-ции	М. м., Да	% от общего количества
		Контроль	Опыт с Laminex BG	Опыт с Альфалад БН
I	100000	9,9	9,0	9,0
II	15000 – 37000	15,7	14,5	9,2
III	12500	74,4	76,5	81,8

4. Оптимизация состава и применение МЭК на основе исследуемых ферментных препаратов при получении пивного сусла.

Формирование МЭК на основе активированных ФП Laminex BG и Альфалад БН проводили методом математического планирования на основе униформ – ротатабельных планов.

Критериями для оценки эффективности действия МЭК являлись ВЭ и осах.

В качестве факторов, влияющих на осах и ВЭ были выбраны: х1- дозировка ФП Laminex BG, х2- дозировка ФП Альфалад БН (в % к массе зернопродуктов).

Затирание зернопродуктов проводили в соответствии с планом эксперимента. Интервал варьирования дозировки ФП выбирали с учетом ранее установленных оптимальных дозировок ФП (0,3 % для Laminex BG; 0,5 % для Альфалад БН).

Исследования проводили при разных вариантах приготовления затора: из солода различного качества (солод № 2 и № 3) и при частичной замене солода на несоложеный ячмень – 15 % (солод № 2) и 40 % (солод № 4).

На основании математической обработки полученных результатов с использованием метода корреляционно–регрессионного анализа и пакета программ «Matstat» и «Statictica 6.0» были получены регрессивные уравнения, достоверно и адекватно описывающие зависимость осах и ВЭ от исследуемых факторов и построены поверхности отклика зависимости ВЭ и осах от исследуемых факторов (рис. 9), анализ которых позволил выбрать концентрации ферментных препаратов в составе активированной МЭК для применения при получении пивного сусла из солода и при частичной замене солода на ячмень: Альфалад БН – 0,20 – 0,25 % к массе зернопродуктов, Laminex BG – 0,12 – 0,15 % к массе зернопродуктов. ВЭ при этом составляет 81 – 84 %, осах составляет 13 – 16 мин.

а

б

Рис. 9. Зависимость выхода экстракта (а) и продолжительности осахаривания

затора (б) от содержания ФП Laminex BG и Альфалад БН в составе МЭК

(затор: солод 60 %, ячмень 40 %).

Результаты сравнительного анализа физико–химических показателей сусла, полученного по различным вариантам затирания представлены в табл. 5.

Полученные результаты позволяют сделать заключение о целесообразности проведения предварительной активации гидролитических ферментных препаратов для интенсификации процесса получения пивного сусла из солода среднего или пониженного качества, а также для сокращения дозировки ФП в 2 раза при замене до 40 % солода на несоложеный ячмень в заторе зернопродуктов.

Фракционный состав белков сусла (табл. 6) характеризуется по сравнению с контролем существенным уменьшением доли высокомолекулярных белков, и увеличением доли белков с молекулярной массой 150000- 370000, что является положительным фактором для увеличения коллоидной стабильности пива и пенообразования. Содержание общего азота в опытном варианте выше, чем в контроле на 15% (солод №2), 6,5% (при замене 40 % солода №4 на несоложеный ячмень), аминного – соответственно выше на 11% и 2,2% (табл.5).

Таблица 5

Показатели качества 11%-ого охмеленного сусла.

№ п/п	Показатель Вариант опыта	Выход экстракта, %	Продолжительность осахаривания, мин	Цветность, см3 0,1 н. раствора I2	Кислотность, см31н. NaOH	Отношение сахара к несахару	рН	Вязкость	Общий азот (мг в 100 см3 сусла)	Аминный азот (мг в 100 см3 сусла)	Содержание РВ в экстракте, %
Опыт 1	Солод № 2 без ФП	78,3	22	0,2	2,1	1:0,36	5,2	1,176	106,9	21,4	73,4
	Солод № 2 + активир. МЭК*	84,3	15	0,2	2,1	1:0,28	5,3	1,160	124,3	23,8	81,0
Опыт 2	Солод № 4 без ФП	79,5	15	0,2	2,0	1:0,35	5,3	1,276	107,1	22,4	74,0
	Солод № 4 + МЭК**	78,1	15	0,2	2,1	1:0,33	5,4	1,170	110,1	22,5	75,1
	Солод № 4 + активир. МЭК*	82,4	13	0,2	2,1	1:0,31	5,3	1,160	114,2	22,8	76,5

* Дозировка ФП в МЭК: Laminex BG 0,12%; Альфалад БН 0,2% к массе солода.

** Дозировка ФП в МЭК: Laminex BG 0,25%; Альфалад БН -0,4% к массе солода.

Таблица 6

Фракционирование водорастворимых белков охмеленного сусла на сефадексе

G – 75 (опыт с активированной МЭК)

Фракции	М.м., Да	% от общего количества
		Солод + ячмень	Солод
I	100000	5,3	6,2
II	15000 – 37000	19,5	21,5
III	12500	75,2	72,3

Результаты проведенных исследований явились основой для разработки технологических рекомендаций по применению активации ФП Laminex BG и Альфалад БН в процессе затирания зернопродуктов для интенсификации процесса получения пивного сусла.

2.5. Опытно-промышленные испытания и разработка технологических рекомендаций для интенсификации процесса получения пивного сусла.

Результаты лабораторных исследований о возможности интенсификации процесса получения пивного сусла на основе предварительной активации ФП в присутствии С7–АОБ были проверены при опытно–промышленной апробации в ООО НТЦ «Солодовые напитки» при получении светлого пива типа «Жигулевское» (11 %).

Были использованы следующие варианты затирания: контроль (К) – дробленый солод; опыт 1 (Оп 1) – солод + ФП Laminex BG; опыт 2 (Оп 2) – солод + ФП Laminex BG после предварительной активации; опыт 3 (Оп 3) – солод / ячмень в соотношении 70% : 30%; опыт 4 (Оп 4) – солод / ячмень в соотношении 70% : 30% + активированная МЭК на основе Laminex BG и Альфалад БН при сокращении дозировки ФП в МЭК в 2 раза по отношению к дозировке ФП без проведения предварительной активации.

ФП вносили в заторный аппарат в начальный момент затирания (45 оС).

Анализ полученных результатов показывает, что применение активированных ФП положительно влияет на процесс получения пивного сусла по сравнению с контролем (К) и применением ФП без активации (табл. 7).

Таблица 7

Физико-химические показатели производственного сусла (11,0 % СВ).

№ п/п	Вариант опыта Показатель	К	Оп 1	Оп 2	Оп 3	Оп 4
1	Продолжительность осахаривания, мин	20	17	12	20	15
2	Выход экстракта,%	75,63	77,05	80,38	71,81	79,93
3	Содержание общего азота, мг/100см3 сусла	97,20	99,41	101,30	95,11	105,8
4	Содержание аминного мг/100см3 сусла	19,72	20,81	21,30	19,00	21,83
5	Содержание РВ, г/100см3 сусла	7,63	7,89	8,14	7,12	8,36
6	рН	5,28	5,20	5,20	5,31	5,30
7	Кислотность, см3 1М NaOH / 100см3 сусла	2,0	2,1	2,1	2,0	2,1
8	Цветность, см3 0,1М I2/ 100см3 сусла	0,54	0,53	0,54	0,53	0,54
9	Вязкость	1,80	1,72	1,71	1,89	1,68

При 30%-ой замене солода на несоложеный ячмень применение активированной МЭК позволило не только сохранить, но даже улучшить показатели качества сусла по сравнению с контролем (К): осах сокращается на 25 %, ВЭ выше на 5,7 %, содержание РВ – на 9,5 %. При этом содержание общего азота увеличивается на 8,9 %, аминного – на 10,5%.

Результаты оценки качества пива, полученного по контрольной (К) и опытной (Оп. 4) варкам представлены в табл. 8 и на рис. 10.

Таблица 8

Сравнительные показатели пива.

№ п/п	Вариант опыта Показатель	К	Оп 4
1	Массовая доля спирта, %	3,85	4,0
2	рН	4,45	4,43
3	Кислотность; см3 1 М р-р NaOH на 100 см3	2,4	2,3
4	Цветность; 0,1 М р-ра I2 на 100 см3	1,0	1,0
5	Стойкость пены; мин.	6,0	7,0
6	Высота пены, мм.	60	70

Анализ этих данных дает основание сделать заключение, что при замене 30 % солода на ячмень применение на стадии затирания активированной МЭК позволяет получить пиво, отвечающее по показателям качества требованиям ГОСТ Р 51174 – 2009, и которое по большинству физико–химических и органолептических показателей не отличается от пива, полученного по классической технологии (контроль), а по таким показателям, как высота пены и пеностойкость даже выше, чем контроль.

На основании результатов лабораторных исследований и опытно–промышленной проверки разработаны принципиальная технологическая схема и технологические рекомендации по применению предварительной активации ФП Laminex BG и МЭК на основе Laminex BG и Альфалад БН в присутствии С7-АОБ для интенсификации процессов биокатализа при получении пивного сусла из солода и несоложеных материалов (ячмень).

Расчетный экономический эффект от применения разработанной технологии составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива. Экономический эффект достигается за счет сокращения дозировки ФП в МЭК при использовании несоложеного сырья для получения пивного сусла.

Выводы

В результате проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснована и подтверждена при опытно-промышленной апробации возможность интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов за счет активированных в присутствии С7-АОБ ФП Laminex BG и Альфалад БН:

1. Изучено влияние С7-АОБ на скорость реакции гидролиза ФБ препаратом Laminex BG при различных концентрациях ФП, субстрата и С7-АОБ. Показано, что начальная скорость гидролиза ФБ в присутствии С7-АОБ увеличивается более чем в 2 раза. Определены кинетические параметры ферментативного процесса – Vmax и Km. Установлено, что С7-АОБ не изменяет Km при увеличении Vmax в 2,3 раза, что является косвенным подтверждением того, что увеличение ФА препарата Laminex BG в присутствии С7-АОБ является следствием определенных конформационных изменений в молекуле белка фермента, а взаимодействие фермент – С7-АОБ может быть интерпретировано как неконкурентная активация.

2. Исследованы условия активации ФП Laminex BG в присутствии С7- АОБ.

Показано, что проведение предварительной тепловой активации ФП Laminex BG в присутствии С7-АОБ при tо = 50 оC в течение 30 - 60 мин способствует увеличению его каталитической активности по отношению к исходному (неактивированному) препарату в 3,2 – 3,8 раза. Установлено, что С7- АОБ способствует повышению функциональной и операционной стабильности ФП в широком диапазоне температуры и рН.

3. Изучено влияние предварительной тепловой активации ФП Lаminex BG в присутствии С7-АОБ на гидролитические процессы при затирании ячменного солода. Установлено, что прединкубация раствора ФП при tо = 500С в течение 1 часа в присутствии С7-АОБ (концентрация 0,1 % к массе солода) дает возможность сократить продолжительность осахаривания затора при использовании солодов различного качества на 32 – 45 %, увеличить при этом выход экстракта на 5,3 – 11,0 % при одновременном увеличении скорости фильтрования на 12 – 32 %.

4. Показана эффективность применения разработанного способа активации ФП Laminex BG для ФП Альфалад при получении пивного сусла.

Обоснована целесообразность формирования активированной МЭК с использованием ФП Laminex BG и Альфалад БН при получении сусла из ячменного солода и несоложеных материалов. Проведена оптимизация состава МЭК методом математического планирования эксперимента на основе униформ – ротатабельных планов при использовании в заторе смеси зернопродуктов и солода различного качества. На основании математической обработки результатов получены регрессионные уравнения достоверно и адекватно описывающие зависимость продолжительности осахаривания и выхода экстракта от соотношения ФП Laminex BG и Альфалад БН в МЭК, построены поверхности отклика и определены оптимальные соотношения ФП в МЭК для интенсификации процесса получения пивного сусла с выходом экстракта 81 – 84 %.

5. На основании исследования физико-химических показателей пивного сусла, полученного при затирании ячменного солода и ячменя с использованием МЭК на основе ФП Laminex BG и Альфалад БН, было установлено, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ способствует сокращению продолжительности осахаривания затора зернопродуктов на 15 – 30 %, увеличению выхода экстракта на 4 – 7 %, увеличению в сусле содержания общего и аминного азота и РВ в экстракте (соответственно на 7 – 15 %; на 2 – 11 % и на 4 – 10 %), позволяет снизить в 2 раза расход ферментов при использовании несоложеного сырья.

6. Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: на 37 – 47 % уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 – 37000 на 24 – 37 %, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

7. Опытно–промышленные испытания в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки» подтвердили целесообразность проведения предварительной активации ФП Laminex BG и МЭК с использованием Laminex BG и Альфалад БН в присутствии С7-АОБ для интенсификации процесса получения пивного сусла из ячменного солода и несоложеных материалов (30 – 40 %) и повышения его качества.

8. Разработаны технологические рекомендации и принципиальная технологическая схема по применению предварительной активации МЭК на основе ФП Laminex BG и Альфалад БН в технологии пивного сусла. Расчетный экономический эффект от внедрения разработанных технологических рекомендаций составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива / год.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Лысюк В.М. Исследование условий активации ферментного комплекса Laminex BG Clucanase Complеx // B сб. матер. 3-ей Всероссийской конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека». Кемерово, 2010. С. 38 – 39.
2. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В., Эль – Регистан Г.И. Активация ферментного комплекса Laminex BG Glucanase Complex в производстве пива. // Пиво и напитки. 2010. № 1. С. 12 – 14.
3. Лысюк В.М. Применение С7- алкилоксибензола для активации и стабилизации ферментных препаратов при производстве пива // В сб. матер. 3-ей межведомственной научно–практической конф. «Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров». Москва. 2010. С. 216 – 219.
4. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В, Эль-Регистан Г.И. Практические аспекты применения активации ферментных препаратов при получении пивного сусла // Пиво и напитки. 2010. № 2. С. 44 – 45.
5. Лысюк В.М. Активация ферментного препарата Laminex BG как фактор интенсификации гидролиза некрахмальных полисахаридов. // В сб. матер. «Инновационного форума пищевых технологий». Москва. 2010. С. 175 – 177.
6. Лысюк В.М., Гернет М.В., Вяльцева И.В., Шаненко Е.Ф. Кинетика гидролиза некрахмальных полисахаридов под действием ферментного препарата Laminex BG // Известия вузов. Пищевая технология. 2011. № 1 (319). С. 20 – 24.

Принятые обозначения и сокращения

АОБ – алкилоксибензол АС – амилолитическая способность АФБ – целлюлозолитическая актив-ность по гидролизу фильтровальной бумаги ВЭ – выход экстракта М.м. – молекулярная масса МЭК – мультэнзимная композиция ФА – ферментативная активность ФБ – фильтровальная бумага

ФП – ферментный препарат [E] – концентрация фермента Кm – константа Михаэлиса [S] – концентрация субстрата Vo – начальная скорость фермента-тивной реакции Vmax – максимальная скорость фер-ментативной реакции осax – продолжительность осахарива-ния затора