Контекст-зависимый выбор поведения: нейротрансмиттерные механизмы
На правах рукописи
ДЬЯКОНОВА Варвара Евгеньевна
КОНТЕКСТ-ЗАВИСИМЫЙ ВЫБОР ПОВЕДЕНИЯ:
НЕЙРОТРАНСМИТТЕРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
Специальность – 03.03.01. физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва
2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Научный консультант:
Доктор биологических наук Сахаров Дмитрий Антонович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Балабан Павел Милославович
Доктор биологических наук Авдонин Павел Владимирович
Доктор биологических наук Мошков Дмитрий Алексеевич
Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова
Защита состоится
на заседании диссертационного совета Д002.238.01 Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
по адресу: 119334 Г. Москва, Ул. Вавилова, д.26;
e-mail: [email protected];
Факс: 8-499-135-80-12;
http://idbras.comcor.ru
C диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Автореферат разослан 2011
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Механизмы выбора поведения привлекают исследователей многих областей в силу не только фундаментальной, но и социально-прикладной значимости проблемы. В этологии, физиологии поведения, психологии, социологии хорошо установлен факт зависимости поведенческого выбора от контекста, т.е. от определенных внешних и внутренних факторов, таких как время суток, температура, предыдущий опыт и другие. Влияние одного и того же фактора воспроизводимо, а значит выбор поведения может быть статистически предсказуем на основе знания о существующем контексте. Этот факт позволяет перевести проблему в область изучения клеточных и нейрохимических механизмов контекст-зависимого выбора.
Большая часть нейрофизиологических описаний механизмов контекст-зависимого выбора основана на традиционном представлении о сетевой иерархической организации нервной системы, при этом ключевая роль отводится электрической активности определенных нейронов или отделов мозга и синаптическим (возбуждающим или тормозным) взаимодействиям между ними. Трансмиттерная специфичность, гетерохимизм нейронов при таком подходе не имеет функционального значения и потому не используется в обобщающих описаниях механизмов поведенческого выбора. Между тем накапливается все больше данных, заставляющих говорить о том, что контекст на клеточном уровне, это по-видимому, уровень нейромодуляторов или нейрогормонов, модулирующих работу «сетей». При этом нарастает понятийный дискомфорт, так как к числу нейромодуляторов, нейрогормонов, а также метамодуляторов (модулирующих действие последних) могут относиться те же нейротрансмиттеры, которые за пределами синаптических щелей («beyond neurotransmission») «приобретают дополнительные функции».
В этой ситуации все большую привлекательность приобретает другой теоретический подход к организации нервной системы, в котором ключевую роль играют химические факторы – такие, как множественность сигнальных молекул и интегративное действие каждой из них на множественные мишени (Д.А. Сахаров, 1990, 2010). Под интегративным действием сигнальной молекулы подразумевается характерная для объёмной передачи (volume transmission) ситуация, когда возбуждающие, тормозные и модулирующие, а иногда и гормональные эффекты сигнальной молекулы на разные клеточные мишени складываются в cкоординированный ответ локальной системы.
В пользу химической гипотезы механизмов поведенческого выбора свидетельствуют некоторые фундаментальные изменения в нейробиологических представлениях, наблюдающиеся в последние годы. К их числу относится ослабление представлений об иерархичной организации нервной системы. Этот тренд вызван как многочисленными свидетельствами непосредственного взаимодействия «периферий», так и безуспешными попытками идентифицировать с помощью оптических методов «нейроны, принимающие решение». В последние годы сразу несколько исследователей высказали сходные идеи о коллективной природе поведенческого выбора (W. Kristan 2010; R. Gillete 2010; Harris-Warrick 2010). В том же 2010 году Д. А. Сахаров предложил гипотезу, согласно которой выбор моторной программы ансамблем нейронов определяется химическим составом его экстраклеточной среды, которая, в частности, складывается благодаря активности локальных и входных нейронов. Уже существуют данные, демонстрирующие наличие “физической” основы для такого коллективного химического общения нейронов. На сегодняшний день установлено, что межклеточное пространство занимает 20 - 30% объема мозга в зависимости от области нервной системы (Sykova and Nicholson, 2008, обзор). В последнее десятилетие обнаружены несинаптические рецепторы ко всем известным нейротрансмиттерам, показана утечка нейротрансмиттеров из синаптических щелей, несинаптическая секреция нейротрансмиттеров. Наконец, немалую роль в усилении привлекательности «химического подхода» играет и осознание существующей филогенетической основы для химической самоорганизации нейронов. Демонстрация роли нейрональных сигнальных молекул в организации социального поведения бактерий, одноклеточных и ненейрональных клеточных культур свидетельствует о выработке простейших механизмов химической клеточной координации и самоорганизации уже на донервных стадиях (Бузников 2007, Бродский, 2009, обзор).
Все эти факты делают своевременной попытку сформулировать новую гипотезу о механизмах контекст-зависимого выбора в рамках химического подхода. Можно думать, что поведенческий контекст транслируется в контекст химический, а интегративное действие нейротрансмиттеров и других сигнальных молекул обеспечивает генерацию адекватной активности локальным нейрональным ансамблем (или даже обширными областями нервной системы).
Цели и задачи исследования. Целью работы была проверка гипотезы о том, что поведенческий контекст может транслироваться в контекст химический и о достаточности последнего для адекватного выбора поведенческого ответа. Если гипотеза справедлива, то должны выполняться следующие условия: (1) при изменении поведенческого контекста происходят значимые изменения в интенсивности синтеза и/или высвобождения определенного нейротрансмиттера; (2) повышением содержания определенного нейротрансмиттера можно имитировать действие поведенческого контекста и, наоборот, подавлением соответствующей нейротрансмиттерной системы можно снимать влияние поведенческого контекста; (3) на клеточном уровне существуют механизмы, обеспечивающие изменение объемного высвобождения нейротрансмиттера при формировании поведенческого контекста; (4) нейрохимический контекст влияет на спонтанную или вызванную активность нейронального ансамбля и отдельного нейрона. Выполнение этих условий в разных моделях контекст-зависимого поведения у далеких в систематическом отношении животных может свидетельствовать об универсальности химического механизма поведенческого выбора. Соответственно, были поставлены следующие задачи:
- найти формы контекст-зависимого поведения у модельных нейробиологических объектов, далеких в систематическом отношении и доступных для последующего изучения элементарных механизмов;
- проверить, происходят ли значимые изменения в активности определенной трансмиттерной системы при действии определенного контекста, и можно ли имитировать действие контекста искусственной активацией данной системы;
- исследовать характер секреции нейротрансмиттера нейронами соответствующего фенотипа, активирующимися при данном контексте;
- исследовать влияние нейрохимического контекста на выбор характера активности отдельным нейроном и моторной программы нейрональным ансамблем.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. На модельных объектах, представляющих две основные группы первичноротых (Lophotrochozoa и Ecdysozoa), показано, что влияние поведенческого контекста реализуется через изменение нейротрансмиттерного тонуса. При этом впервые продемонстрирована роль несинаптического пула нейротрансмиттеров. Найдены клеточные механизмы, обеспечивающие изменения несинаптической секреции нейротрансмиттера при изменении поведенческого контекста. Экспериментально доказана роль экстрасинаптической среды в контекст-зависимом выборе поведения организмом, функциональным нейрональным ансамблем и отдельным, полностью изолированными нейроном. Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о трансляции поведенческого контекста в контекст химический, интегративным действием которого обеспечивается адекватный ответ системы.
Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы в образовательных курсах по нейробиологии, психологии, нейрофизиологии, эволюционной биологии, применены в медицине при изучении способов корректировки патологических психических и неврологических состояний фармакологическими и поведенческими методами.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Контекст-зависимый выбор поведения во внутривидовых отношениях у сверчка Gryllus bimaculatus (Insecta, Arthropoda, Ecdysozoa) контролируется моноаминами серотонином и октопамином и эндогенной опиоидной системой. Влияние моторной нагрузки (полета) на высвобождение агрессии у субординантных сверчков опосредуется интегративным действием октопамина.
2. В механизме влияния голода и моторной нагрузки на ориентировочное, локомоторное и защитное поведение прудовика Lymnaea stagnalis (Gastropoda, Mollusca, Lophotrochozoa) ключевую роль играет повышение синтеза и секреции серотонина.
3. Моноаминергические нейроны прудовика обладают механизмом несинаптической объемной секреции нейротрансмиттера. Несинаптическая секреция серотонина локомоторными нейронами усиливается при повышении синтеза серотонина.
4. Химический контекст определяет выбор моторной программы центральными нейронами, управляющими пищевым и локомоторным поведением прудовика.
5. Объемная секреция нейротрансмиттера участвует в механизме контекст-зависимого выбора поведения у обоих исследованных объектов, представляющих две разные группы первичноротых.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на многих российских и международных конгрессах и конференциях, в частности: Goettingen Neurobiol. Conference, 1997, Goettingen, Germany; 9th Symposium on Invertebrate Neurobiology, 1999, Tihany, Hungary; 7th East European Conference of ISIN, Moscow-Pushino, Russiа, 2000; 28th Goettingen Neurobiol. Conference. 2001, Goettingen, Germany; European conference of ISIN, Krakov, Poland, 2001; Физиологический съезд 2001, Казань; 29th Goettingen Neurobiol. Conference. 2003, Goettingen, Germany; 10th Symposium on Invertebrate Neurobiology, 2003, Tihany, Hungary; 7th East European conference of the Society for Invertebrate Neurobiology. 2003, Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe, Russia; 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology, 2007, Tihany, Hungary; IV Всероссийская конференция по поведению животных. 2007. Москва; European conference of the Society for Invertebrate Neurobiology. 2009, S-Peterburg, Russia; 9th Neuroethological Congress, Salamanca, Spain, 2010.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Большинство экспериментальных результатов получено лично автором. Изучение эффектов антагонистов октопаминовых рецепторов и ингибитора синтеза октопамина альфа-метил-триптофана на агрессивность сверчка G. bimaculatus проводилось совместно с П. Стивенсоном и Дж. Риллихом (Лейпцигский Университет, Германия). Исследование эффектов полета на половое поведение сверчка и возможного участия оксида азота в механизме этого влияния проведено совместно с А.Л. Крушинским (биофак МГУ). Совместно с И.А. Чистопольским (ИБР РАН) получены данные о прохождении нейроактивных факторов через толстые оболочки педальных ганглиев моллюска L. stagnalis. Совместно с Л. Хернади и Л. Хирипи (Лимнологический институт, Тихань, Венгрия) исследовано содержание серотонина и дофамина при голоде у L. stagnalis. Совместно с Т.Л. Дьяконовой (ИБР РАН) исследована зависимость эффектов глутамата от уровня оксида азота и механизм координации ритмов нейрона В2 и буккального генератора в буккальной сети L. stagnalis.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 статей, из них 13 - в отечественных журналах, соответствующих перечню ВАК, и 15 - в международных рецензируемых журналах.
Структура и объем. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение. Обзор литературы. Материалы и методы. Результаты из 4 глав. Заключение. Выводы. Список литературы. Работа содержит 273 страницы текста, документирована 102 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 278 источников, из них 245 на иностранных языках.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследования.
В качестве объектов исследования были выбраны представители двух основных групп первичноротых Lophotrochozoa и Ecdysozoa, сверчок Gryllus bimaculatus (Insecta, Arthropoda) и моллюск большой прудовик Lymnaea stagnalis (Gastropoda, Mollusca). Оба вида относятся к так называемым модельным нейробиологическим объектам.
2.2. Поведенческие и фармакологические эксперименты.
2.2.1. Эксперименты на сверчках Gryllus bimaculatus.
Использовалась смешанная культура G. bimaculatus, которую поддерживали и разводили в лабораторных условиях, в отдельном помещении при температуре 270 С и световом режиме 12/12 часов. Использовали сверчков обоего пола в возрасте 2-3 недели после последней линьки, которых в течение 24 часов перед опытом содержали изолированно с достаточным количеством пищи и воды.
Оценка возбудимости и избегательного поведения. Анализировали ответ сверчка на дозированную стимуляцию церки воздушной струей. За грудной сегмент животное закреплялось в держатель и помещалось на поверхность белой сферы с равномерно нанесенными метками. Движение лап животного приводило к перемещению сферы, которое регистрировалось оптической установкой. Струя воздуха (скорость 2-3 м/сек, длительность 20 мсек) направлялась в область церок, сенсорных органов, улавливающих возмущения воздушной среды. Оценивалась максимальная скорость перемещения и длительность перемещения в течение первых двух секунд в ответ на стимул. Детально методика описана в работе (Staudacher and Schildberger, 1998).
Анализ агонистических отношений. Использовали стандартную методику для оценки агрессивности в парных тестах (Hofmann and Stevenson, 2000). Двух самцов помещали в разные отсеки прозрачной камеры (10х12х15 см), разделенные прозрачной перегородкой. Через 5 минут перегородку убирали. Каждую пару наблюдали в течение 5 минут с момента первого физического контакта. Регистрировали интенсивность драки (0 - взаимное избегание, 1- избегание одного из самцов при первом контакте, 2 - агрессивное биение антенн, 3 - демонстрация раскрытых мандибул одним самцом, 4 - демонстрация раскрытых мандибул обоими самцами, 5 - толкания, 6 - укусы мандибулами) и длительность драки. Отмечали также наличие ритуальной песни, наличие и интенсивность преследования в течение минуты после победы. Сходную схему использовали для изучения агрессивности у самок.
Анализ полового поведения. Пару животных, самца и самку, помещали в разные отсеки прозрачной камеры (10х12х15 см), разделенные прозрачной перегородкой. Через 5 минут перегородку убирали. Поведение каждой пары наблюдали в течение 5 минут с момента первого физического контакта. Регистрировали пение самца (латентный период, длительность, характер песни: призывная или копулятивная), процент копуляций в парах. Эксперименты записывали на видеокамеру Sony DCR-SR 220E.
Активация полета. Животным наносили на кутикулу грудного сегмента клейкое вещество и прикрепляли к специальному кронштейну, так чтобы они находились в подвешенном состоянии, обдували струей воздуха от вентилятора в течение 0.5, 1, 3 или 5 минут.
Инъекции фармакологических агентов. Вещества вводили в объеме 20- 50 мкл, растворяли в растворе Рингера для сверчков (0.82% NaCl; 0.075% KCl; 0.04% NaHCO3; 0.021% CaCl2; 0.5% глюкоза), контрольную группу инъецировали раствором Рингера. Инъекции делали в абдомен между третьей и четвертой пластинкой. Исследовали действие агониста октопаминовых рецептров хлодимеформа (1, 0.5, 0.1 мМ, 50 мкл), адренергических блокаторов пропранолола, эпинастина, фентоламина (20 мМ, 20 мкл), антагониста опиатных рецепторов налоксона (0.1 мМ, 50 мкл), агониста опиатных рецепторов мю-типа DAGO (0.1 мМ, 50 мкл), неспецифического блокатора NО- синтаз N-Nitro-l-Arginine (LNNA, 0.02 мг в 50 мкл). Через 2 часа начинали тестирование.
Фармакологическое истощение содержания моноаминов с использованием ложных предшественников. Альфа-метилтирозин (АМТ, Sigma) вызывает существенное снижение содержания октопамина и дофамина, а альфа-метилтриптофан (AMTP, Sigma) – серотонина (Sloley and Orikasa, 1988). Сверчки получали две последовательные инъекции АМТ (1.5 мг в 20 мкл раствора Рингера) с интервалом в 48 часов. Животных тестировали через 48 часов после последней инъекции. AMTP (1 mg, 30 мкл) инъецировали один раз. Тестирование начинали через 48 часов и повторяли через 24 часа в течение 4-х дней. Контрольная группа инъецировалась с тем же интервалом раствором Рингера.
2.2.2. Эксперименты на моллюсках.
Oпыты пpoвoдили нa прудовикax Lymnaea stagnalis aквapиaльнoй линии, кoтopыx coдepжaли в oтcтoeннoй вoдoпpoвoднoй вoдe пpи кoмнaтнoй тeмпepaтype с естественным световым режимом. Стандартная установка для регистрации поведения включала арену, цифровую видеокамеру Sony DCR-SR 220E, соединенную с персональным компьютером с установленной программой для анализа поведения RealTimer (www.openscience.ru).
Оценка общей и локомоторной активности. Улитoк пoмeщaли в заполненную водой арену и легким нажатием прикрепляли ко дну. Измеряли латентный период выхода из раковины и латентный период начала локомоции. Использовали видеозаписи для вычисления пройденного пути в размерах тела данной улитки. Для количественной оценки мышечной наземной локомоции использовали длительность периода натягивания раковины.
Оценка «пугливости» и защитного поведения. Использовали защитный теневой рефлекс прудовика – втягивание в раковину в ответ на затемнение. Для имитации затемнения выключали один из световых приборов на 1 секунду. Измеряли интенсивность реакции по длительности втягивания в раковину и длительности остановки (прекращения локомоции). Применяли также метод с тактильным раздражением щупальца. Животных тестировали поочередно, нанося тактильнoe paздpaжeниe нa кoнeц щyпaльцa, тaк чтo кaждoe живoтное иcпытывaлocь 10 paз. Moтopный oтвeт yлитки oтнocили к oднoмy из cлeдyющиx типoв peaкции, в пopядкe ослабления ee oбopoнитeльнoгo xapaктepa и усиления исследовательского: (1) нaдвигaниe paкoвины нa пepeдний кoнeц тeлa (2) peтpaкция щyпaльцa, (3) игнopиpoвaниe cтимyлa, (4) пoвopoт гoлoвы в cтopoнy cтимyлa. Получали распределения ответов для каждого животного и вычисляли среднее распределение, характеризующее группу.
Оценка поведения в ответ на внезапное предъявление незнакомого объекта. Tecтиpyeмyю yлиткy пepeнocили в бoльшoй плocкий cocyд, нaпoлнeнный чиcтoй oтcтoeннoй вoдoй нa 2 cм. Чepeз 1 мин пocлe нaчaлa лoкoмoции в воду опускался кaмeнь диaмeтpoм oкoлo 1 cм в 2 cм oт гoлoвы. B пoвeдeнчecкoй реакции yлитки ecтecтвeннo paзличaлись двe фaзы: нeпocpeдcтвeнный oтвeт (защитное втягивание) и oтcтaвлeнный oтвeт. Peпepтyap oтcтaвлeнныx oтвeтoв включaл cлeдyющиe четыре вapиaнта: (1) coxpaнeниe ocтaнoвки лoкoмoции в тeчeниe 5 мин нaблюдeния; (2) paзвopoт бoлee чeм нa 900 и yxoд oт кaмня; (3) пoвopoт мeнee чeм нa 900 и движeниe мимo кaмня; (4) coпpикocнoвeния c кaмнeм, пepexoдящee в нaпoлзaниe нa нeгo. Оценивалось распределение отставленных ответов в опытных и контрольных группах.
Моторная нагрузка. Использовали две экспериментальные модели для усиления моторной нагрузки. Первая: животное вынимали из воды и помещали дважды на стеклянную поверхность с перерывом в 5 минут для предотвращения обезвоживания. Продолжительность локомоции на суше была 10 минут в каждой сессии. Во второй модели улиток помещали в контейнер со сниженным уровнем воды (1-2 см) на 25-30 минут, в некоторых сериях опытов на 120 минут. После ползания в условиях повышенной моторной нагрузки улиток переносили в контейнер с высоким слоем воды (12 см) для анализа поведения.
Фармакологические опыты. Мы использовали неинвазивную методику администрации фармакологических агентов, инкубацию в соответствующих растворах. Эта методика хорошо работает на водных гастроподах благодаря высокой проницаемости их кожных покровов (см. напр., Сахаров, Каботянский, 1986). Улиток помещали в 100 мл соответствующего раствора и инкубировали в течение 2-3 часов.
2.3. Электрофизиологические эксперименты.
2.3.1. Препарат изолированной ЦНС улитки.
Улиток наркотизировали, инъецируя 0.2 мл 0.1 М хлорида магния, изолированный мозг обрабатывали протеазой (Sigma, США), 2,5 мг/мл, в течение 10-15 мин, освобождали от оболочек и укрепляли в камере на силгартовой подложке в растворе следующего состава: NaCl - 50 mM, KСl - 1,6 mM, CaCL2 - 4 mM, MgCl2 – 4 mM, Трис - 10 мМ, рН – 7.6. Электрическую активность нейронов регистрировали стеклянными микроэлектродами (15-30 МОм), заполненными 3 М КСl. Использовалось стандартное электрофизиологичское оборудование, электрические сигналы оцифровывались и переводились в компьютер для последующей обработки в программе Spike-3 (автор Д.Д. Воронцов). При фармакологических воздействиях в электрофизиологических опытах все вещества добавлялись в проток.
2.3.2. Изолированные нейроны. Для изоляции нейрона ЦНС после снятия толстых оболочек обрабатывали протеазой Е 3 мг/мл в течение 13-15 минут. Затем снимали тонкие оболочки и оставляли препарат в холодильнике на 40 минут. В выбранный для изоляции нейрон, вводили микроэлектрод, затем, используя микроманипулятор, вытягивали нейрон из ганглия по методике Т.Л. Дьяконовой (Дьяконова, 1989). В процессе эксперимента нейрон находился в проточной камере объемом 4 мл и постоянно омывался соответствующим солевым раствором (2.5 см/мин) при комнатной температуре.
2.3.4. Изолированные нейроны как биосенсоры. Нейрон изолировался с помощью описанной выше методики. После стабилизации электрических характеристик нейрон подводили с помощью микроманипулятора к исследуемой области нервной системы (подробное описание метода Chistopolsky, Sakharov 2003). Изменения в электрической активности нейрона записывались в программе SpikeС3 для последующей статистической обработки. Для сравнения экстрасинаптической секреции из педальных ганглиев при разном поведенческом контексте использовали дополнительную нервную систему в качестве источника изолированных нейронов-биосенсоров. Ее обрабатывали первой по схеме для изоляции нейронов. После отмывания проназы в эту же камеру помещали две «экспериментальные» нервные системы, изолированные из прудовиков с разным поведенческим состоянием. Затем поочередно подводили биосенсор к интересующей области нервной системы разных препаратов. После серии замеров меняли биосенсор и повторяли процедуру. Вычисляли среднее значение электрической активности для биосенсора в каждой позиции.
2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией. Для определения содержания серотонина ткань целого мозга гомогенизировали при помощи ультразвукового гомогенизатора (L-666, MSE, Англия) в 0.1 Н HClO4, добавляли 10 мкл 0.2 Н HClO4, содержащей 1 нг альфа-метилсеротонина (АМГТ) и центрифугировали 20 минут при 14000 об/мин. Супернатант собирали и хранили при -80°C до измерения на хроматографе. Супернатанты исследовали при помощи обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Amperometric detector LC-4B, Bioanalytical Systems, США) при потенциале 850 мВ. Подвижной фазой служил 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0.3 мМ октансульфоната натрия (Sigma), 0.1 мМ ЭДТА (Sigma) и 8 % ацетонитрила (Sigma) (pH 3.2). В качестве стандарта использовали свежеприготовленный раствор следующего состава (нг/мл): серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-ГТ), 100, АМГТ 100. Концентрацию каждого компонента вычисляли путем сравнения величины пика в пробе с величиной пика в стандарте. Содержание серотонина в мозге оценивали как произведение концентрации на вес выделенной ткани.
2.5. Иммуногистохимия. Ганглии вырезали из анастезированных 0.1 М МgCl2 улиток; фиксировали в 4% формальдегиде на 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4 (PBS) в течение 12-14 часов при 4 С; отмывали в PBS. Обрабатывали коллагеназой (1 мг/мл) в течение 30 минут.. Помещали в боргидрид 1% на 20 минут. Помещали на ночь в PBS с 0.5% тритоном (PBS-TX), инкубировали в течение часа в растворе PBS-TX c бычьим сывороточным альбумином (BSA, 0.5%) и нормальной козьей сывороткой (NGS, 5 %) для подавления неспецифического связывания антител. Препараты инкубировали с первичными антителами (1:1000 на растворе PBS-TX-BSA-NGS) в течение 72 часов при температуре 4 С. Отмывали при 4 C. Инкубировали во вторичных антителах с флуоресцентной меткой, разведенных в PBS-BSA 1:40, в течение 4-х часов. Отмывали в PBS, помещали на препаровальное стекло, заключали в PBS/глицерин 1:1. Использовали первичные кроличьи поликлональные антитела к глутамату (Sigma), вторичные козьи антитела, конъюгированные с родамином (Sigma). Препараты анализировались на конфокальном микроскопе Leica.
2.6. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов поведенческих, электрофизиологических и фармакологических экспериментов проводили в программе Statistica. Для оценки значимости различий в связанных группах применялись парные тесты Стьюдента (при нормальном распределении) и Вилкоксона (при ненормальном распределении), для оценки различий в несвязанных группах данных применяли непараметрический тест ANOVA, Kruskal-Wallis ANOVA. Для оценки значимости различий процентных долей применялся тест Фишера. В опытах с оценкой большого количества переменных, а также в экспериментах с повторным последовательным воздействием использовался многомерный тест MANOVA. Применялась коррекция Бонферрони.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Контекст-зависимое поведение Gryllus bimaculatus и его нейротрансмиттерные механизмы.
3.1.1. Модуляция поведения сверчка социальным статусом и полетом.
3.1.1.1. Модуляция агрессивности (контекст-зависимая агрессия). Известно, что агрессивное поведение G. bimaculatus подавляется у побежденных особей и активируется у победителей (Alexander, 1961). Недавние работы выявили необычное физиологическое явление - изменение агрессивного поведения животного после моторного поведения, казалось бы, никак не связанного с агрессией, полета. У проигравших самцов полет вызывал немедленное высвобождение агрессии и провоцировал драки с победителем (Hofmann and Stevenson, 2000). Более детальное изучение эффектов полета на поведенческй выбор при внутривидовых взаимодействиях у сверчков стало первой целью наших исследований.
Было найдено, что полет способен усиливать драки у наивных, т.е. у исходно агрессивных самцов. Чем дольше предварительно изолированные самцы летали перед первой дракой, тем интенсивнее и длительнее становились их агрессивные взаимодействия. Полет до драки также оказывал существенное модулирующее влияние на последующее поведение проигравшего самца. В отличие от контрольных животных, летавшие до драки восстанавливали способность драться вновь с победителем уже через 15 минут после первого проигрыша. Этот эффект также носил «дозо-зависимый» характер: чем дольше самцы летали перед дракой, тем дольше у них сохранялась способность вступать в повторные драки с победителем. Полет оказывал влияние и на поведение доминанта по отношению к субординанту, увеличивая длительность преследований, общее число атак и открытия мандибул. Сходный эффект полета на смещение выбора поведения в сторону агрессии наблюдался и у самок: полет значительно увеличил интенсивность и длительность драк в опытной группе.
3.1.1.2. Модуляция избегательного/защитного поведения.
Активация избегательного поведения у проигравших самцов отчетливо наблюдалась в экспериментах со стимуляцией воздушной струей на подвижной сфере, позволяющей регистрировать перемещение насекомого (Рис.1). Полет в течение 3 минут, напротив, подавлял избегательное поведение как у наивных так и у проигравших самцов (Рис.1).
3.1.1.3. Модуляция полового поведения. Контекст-зависимости ухаживания и спаривания G. bimaculatus также был посвящен ряд работ, результатом которых стала демонстрация зависимости реализации полового поведения от исхода межсамцовых драк (Simmons, 1986). Мы исследовали влияние полета на взаимоотношения между самцами и самками. В первой серии изучали, как влияет полет на выбор поведения самцом. В опытной группе, в которой самцы летали в течение 5 минут перед встречей с самкой, достоверно вырос процент ухаживающих (поющих) самцов и, соответственно, возрос процент копуляций (Рис. 2).
Полет существенно ускорил принятие решения о начале ухаживания: латентный период призывного пения был существенно короче в опытной группе (32 ± 7 сек, против 119 ± 35, H = 4.7, p<0.03, Kruskal-Anova test). Общая относительная длительность пения (процент времени активного ухаживания, пения, от общего времени, проведенного с самкой до копуляции), а также длительность отдельного эпизода непрекращающегося пения была достоверно выше в опытной группе (H=7.2, p<0.01; H=8.6, p<0.005, соответственно, Kruskal-Anova test).
В следующей серии было проверено, оказывает ли полет сходное влияние на выбор поведения самкой в паре с самцом. Животные были разделены на четыре группы: 1. Контроль, нелетавшие самец и самка (24 пары). 2. И самец, и самка перед взаимодействием летали (18 пар). 3. Летала только самка (30 пар). 4. Летал только самец (16 пар). Во всех трех экспериментальных группах значительно возросло число копуляций по сравнению с контролем. Наибольшего значения процент копуляций достиг в группе 4 (летал только самец), достоверно превышая этот показатель не только в контроле, но и в остальных экспериментальных группах. В тех группах, где летала самка, наблюдалось отчетливое увеличение агрессивных взаимодействий. Процент установления отношений победитель-побежденный между самцами и самками также был значительно выше в группах 2 (72%) и 3 (80%) по сравнению с контролем (37.2%, F=5,3 и F=10.7, р<0,05 и р<0.01, соответственно) и группой 4 (20%, F=8.2 и F=14.2, p<0.01 и р<0.001).
Сходный эффект на половое поведение самки оказывала ее победа в драке с другой самкой. Самки-победительницы достоверно чаще реагируют агрессией на самца, чем субординантные самки: 11 из 15 (73.3%) против 2 из 14 (14.3 %, F=11/86, p< 0.002). Уровень и длительность драки с самцом тоже существенно выше у самок, одержавших победу в драке с другой самкой. При этом процент копуляций и процент активно ухаживающих самцов также оказался выше в группе самок-победительниц, а именно 73.3 и 86.7 % против 28.6 и 14.3 % у субординантных самок (F= 6.22, 6.77; p< 0.018, 0.015, cоответственно.)
Подводя итог полученным результатам, можно заключить, что социальный статус и предыдущее моторное поведение являются факторами, оказывающими сильное и хорошо воспроизводимое влияние на поведенческий выбор сверчка. При этом эффекты полета и у самцов, и у самок сходны с проявлениями доминантности.
3.1.2. Нейротрансмиттерные механизмы контекст-зависимого поведения G. bimaculatus.
3.1.2.1. Роль октопамина в механизме модулирующего действия полета.
Предпосылкой для изучения возможной роли октопамина в механизме действия полета на поведение сверчков стала работа Адамо и соавтров (Adamo et al., 1995), которая показала выраженное изменение нейроактивного коктейля в гемолимфе G.bimaculatus после полета и увеличение концентрации октопамина в несколько раз.
В первой серии экспериментов было проверено, не заменит ли инъекция агониста октопамина хлордимеформа (ХДМ) действие полета на проигравших самцов. ХДМ (100 мкл, 1 мМ) вызвал высвобождение агрессивности у проигравших сверчков по отношению к победителям (Рис. 3). Поведение проигравших сверчков, получивших инъекцию ХДМ (черные столбики), четко отличалось от обоих контролей и было сходно с поведением летавших субординантов (черные столбики со штриховкой).
Во второй серии экспериментов ХДМ инъецировали наивным самцам и оценивали эффект на агрессивность в первой драке и способность субординантов вновь вступать в драку с победителем. В первом взаимодействии мы не нашли статистически достоверного эффекта ХДМ на интенсивность и длительность драки. Однако, в последующих взаимодействиях инъецированные ХДМ пары сверчков существенно отличались по поведению от контроля и были сходны со сверчками, летавшими перед первой дракой. 85% проигравших сверчков демонстрировали раскрытые челюсти, 52% драк переступали уровень демонстрации агрессии и переходили в физическую драку, 20% субординантов выигрывали драку.
Пары сверчков, обработанные альфа-метил-тирозином (АМТ), вызывающим снижение синтеза октопамина и дофамина у насекомых, демонстрировали существенно более низкий уровень агрессии, чем контроль. Трехминутный полет был способен несколько повысить интенсивность агрессивности в первой драке до уровня 4-5, средняя длительность 3-5 сек. Однако последующий эффект полета на способность проигравших сверчков вновь вступать в драку с победителем не проявлялся. Хлордимеформ был по-прежнему эффективен при инъекции АМТ-инъецированным животным.
Эпинастин, высокоселективный антагонист нейрональных октопаминовых рецепторов у насекомых (Degen et al., 2000), блокировал эффект полета на агрессию (Рис. 4). Другой эффективный блокатор октопаминовых рецепторов насекомых фентоламин (Evans, 1981), антагонист адренергических рецепторов млекопитающих, в той же дозе оказывал похожее, но менее выраженное действие на агрессию и эффект полета, чем эпинастин. В отличие от эпинастина и фентоламина, адренергический антагонист млекопитающих пропранолол, имеющий более низкое сродство к октопаминовым рецепторам насекомых (Roeder, 1995), оказал слабый эффект на агрессию.
Таким образом, полученные результаты хорошо согласуются с гипотезой о возможной роли октопамина в механизме контекст-зависимого агрессивного поведения сверчка, модулируемого полетом. В пользу этой гипотезы свидетельствуют следующие факты, соответствующие критериям необходимости и достаточности: (1) cинтез и высвобождение октопамина увеличивается при полете; (2) агонист октопаминовых рецепторов имитирует действие полета на поведенческий выбор у субординантов; (3) эффект полета на агрессию снижается или снимается полностью при подавлении либо синтеза октопамина, либо блокировании октопаминовых рецепторов. Эти результаты стали первым указанием на связь агрессии с уровнем октопамина у насекомых.
3.1.2.2.Возможное участие других сигнальных молекул в модуляции поведения сверчка социальным статусом и полетом
Серотонин. АМТР, ингибитор синтеза серотонина, вызывает достоверное увеличение сильных избегательных ответов (прыжков) на тактильное раздражение церки. В норме в распределении ответов на тактильный стимул доля прыжков составляет 10 –20 %. У животных, инъецированных АМТР, она достигала 55%. «Пугливые» сверчки с фармакологическим дефицитом серотонина достоверно чаще проигрывают в драках. Длительность и интенсивность драк у них также существенно снижена. Эти данные хорошо согласуются с результатами японских исследователей, показавшими, что уровень серотонина снижается в мозге субординантов и неагрессивных самцов с удаленными антеннами (Murakami, Itoh, 2001; 2003). Напрашивается вывод, что контекст-зависимость избегательного поведения может опосредоваться уровнем серотонина.
Опиоид-подобные пептиды и опиатные рецепторы были идентифицированы у насекомых еще в 80-х годах. Поскольку опиоиды принимают участие в регуляции поведения, зависимого от социального контекста у позвоночных (Липина и др., 1998; Кудрявцева и др., 2001), было проверено возможное участие опиоидной системы в регуляции контекст-зависимого избегания и агрессии у сверчка. Результаты показали, что инъекция антагониста опиатных рецепторов налоксона (0.05, 0.1, 1 мM) доминантам, а также предварительно изолированным самцам, активирует у них избегательное поведение в ответ на тактильное раздражение церки, так что по этому показателю они становятся сходными с субординантными сверчками. Напротив, инъекция агониста мю-рецепторов DAGO (0.05 мM) субординантам (и изолянтам) подавляла их защитное поведение в этом тесте, увеличивая выбор реакций игнорирования. Налоксон (0.05, 0.1 мM) не влиял на длительность и интенсивность драк предварительно изолированных сверчков, а также не изменял агрессии доминанта по отношению к проигравшему сверчку. Однако у субординантов и у самок сверчка, которые в норме демонстрируют пассивное или активное избегание при столкновении с особью того же пола, налоксон высвобождал агрессивное поведение. Агонист мю-рецепторов DAGO (0.05 мM) уменьшал интенсивность драк между изолированными самцами и существенно подавлял агрессию доминанта по отношению к субординанту. Эти данные указывают на то, что опиоидная система у самок и субординантных самцов принимает участие в подавлении агрессии, а у доминантов в подавлении избегательного поведения.
Оксид азота. Исследовали эффекты неспецифического блокатора NO-синтаз LNNA на агрессивное и половое поведение G. bimaculatus и на эффект полета. Многомерный тест MANOVA показал статистически значимые различия между опытной и контрольной группой по параметрам поведения, характеризующим агрессивность в парах самцов. Все четыре параметра, характеризующие агрессивность, оказались существенно ниже в опытной группе по сравнению с контролем после полета. Напротив, в агонистическом взаимодействии самцов до полета не было выявлено отличий между контрольной и опытной группой ни по одному из показателей. Инъекция L-NNA перед полетом снизила действие последнего и на половое поведение самцов. Тест MANOVA, учитывающий латентный период и длительность призывного пения, выявил значимые различия между группами: Рингер/полет и Рингер, а также Рингер/полет и LNNA/полет. Различия не наблюдались между группами, содержавшими нелетавших самцов, инъецированных соответственно Рингером и LNNA, а также между летавшими и нелетавшими самцами, инъецированными LNNA. Эти данные указывают на то, что во время полета может происходить активация NO-синтазы, и что превышение продукции NO над исходным фоном вносит существенный вклад в формирование вызванного полетом поведенческого состояния.
3.2. Контекст-зависимое поведение моллюска Lymnaea stagnalis и его нейротрансмиттерные механизмы.
3.2.1. Модуляция поведенческого выбора прудовика пищевой депривацией и моторной нагрузкой. Исследовали, как влияет голод и вызванное голодом араузальное состояние на ответ животного на относительно нейтральные стимулы. Достоверные различия наблюдались между группами голодавших (38 часов) и сытых животных по распределению ответов нa тaктильнoe paздpaжeниe щyпaльцa (р< 0.001). Наиболее характерным ответом сытых улиток оказалась умеренная защитная реакция – втягивания щупальца в ответ на прикосновение. Напротив, у голодавших особей 50% ответов составляла ориентировочная реакция – поворот в сторону раздражителя. Далее мы исследовали влияние того же поведенческого контекста на реакцию животного на внезапное предъявление нового объекта. Для этой задачи был разработан метод, который позволял анализировать ответы улитки на неожиданное появление перед ней нейтрального объекта - небольшого камушка (см. Материалы и методы). У голодавшей группы также было выявлено знaчитeльнoe пpeoблaдaниe исследовательского поведения: наползания и ощупывания (Рис. 6).
Результаты экспериментов с модуляцией поведенческих ответов голодом легко трактуются в терминах биологической целесообразности. Действительно, усиление ориентировочной и исследовательской компоненты поведения является характерной чертой голодного поведения всех исследованных в этом отношении животных. Однако предыдущий опыт работы со сверчком G. bimaculatus указывал на существование разных видов влияний предыдущего поведения на последующее, биологический смысл которых не всегда лежит на поверхности. Так, до сих пор существуют только разнообразные спекуляции в отношении биологического смысла мощных поведенческих перестроек, запускаемых полетом у сверчка. Мы предположили, что эффект полета у G.bimaculatus мог развиться в эволюции на основе некоего общего феномена, а именно влияния повышенной моторной нагрузки на поведенческое состояние животных. Примечательно, что к моменту исследований данные о существовании таких эффектов были получены на млекопитающих (Salmon, 2001). Существует ли подобный феномен у других групп животных?
Действительно, оказалось, что после периода повышенной моторной нагрузки у L. stagnalis снизился латентный период локомоции (p<0.001, z =3.3, парный тест Вилкоксона), увеличилась скорость водной локомоции (p<0.05, z=1.9), активировался мышечный тип локомоции в водной среде. Изменились защитные реакции на пугающие и нейтральные стимулы. Так, длительность втягивания в раковину на затемнение достоверно сократилась после периода наземной локомоции (p<0.008, z=2.6). В ответ на тактильную стимуляцию щупальца улитки демонстрировали меньший процент защитных реакций, втягиваний, напротив, доля игнорирований достоверно увеличилась (Рис. 5). Перечисленные выше характеристики свидетельствовали о двигательном араузале улиток после интенсивной моторной нагрузки и о подавлении защитных реакций. Эти эффекты в целом сходны с описанными у сверчка и млекопитающих.
Рис. 5. Распределение ответов улиток на тактильное раздражение щупальца в контроле (слева), после 20 минут наземной локомоции (в центре), после 30 минут локомоции в низком слое воды. (i) частичное втягивание тела в раковину (ii) втягивание щупальца (iii) игнорирование (iv) поворот в сторону стимула. Среднее значение и стандартаная ошибка среднего. Результат многомерного теста Manova указывает на достоверное изменение в распределении ответов после моторной нагрузки (Rao’s R (4,25)= 3.7, p=0.01 и Rao’s R (4,19)= 12.6, p=0.001)
3.2.2. Роль серотонина в механизмах модулирующего действия голода и моторной нагрузки.
В совместной работе с венгерскими коллегами мы исследовали влияние голода на содержание серотонина в разных ганглиях прудовика. Голод достоверно увеличил содержание серотонина в буккальных и педальных ганглиях, ответственных за пищевое поведение и локомоцию: 9 ± 0.44 пкмоль/мг и 136 ± 14.8 пкмоль/мг, соответственно, против 4.5 ± 0.56 пкмоль/мг и 90 ± 15.2 пкмоль/мг в контроле у сытых животных. Повышенное содержание серотонина наблюдалось и у прудовиков, голодавших 48 часов (8 ± 0.65 пкмоль/мг и 135± 15 пкмоль/мг). В качестве контроля отслеживали также уровень дофамина в этих ганглиях, он достоверно не изменялся при голодании 12, 24, 48 часов. Повышение содержания серотонина в нервной системе прудовика зафиксировано Е. Каботянским и после повышенной моторной нагрузки (Kabotyanski et al., 1992).
Метаболический предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан (5-НТР) используется в нейрофармакологии для повышения синтеза серотонина, эффективен и у моллюсков (Fickbohm et al., 2005). 5-НТР, так же как и голод, вызывал активацию ориентировочного и исследовательского ответа и подавление защитного. В ответ на тактильное раздражение щупальца улитка не втягивала его, как это делают контрольные особи, а поворачивала голову в сторону раздражителя. Сходный эффект вызывал также серотонин, а действие 5-НТР снималось предварительной инкубацией улиток в растворе ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот м-гидроксибензил гидразина (0.01 мМ), предотвращающего превращение 5-НТР в серотонин. Прудовики, инкубированные в 5-НТР, в ответ на внезапное предъявление объекта подползали к нему и исследовали, касаясь губами и радулой (Рис. 6, р< 0.01, тест Фишера).
Проведенные эксперименты, показали, что можно имитировать действие голода и повышенной моторной нагрузки на поведенческий выбор фармакологическими агентами, влияющими на состояние серотониновой системы. Принципиальным оставался вопрос о том, почему поведенческий контекст, с одной стороны, тотальная аппликация серотонина, адресующаяся в основном к экстрасинаптическим рецепторам, с другой, и метаболический предшественник серотонина, вызывающий повышенный выброс серотонина в синаптических контактах, с третьей, вызывают сходные изменения в поведении.
3.3. Клеточные механизмы, обеспечивающие изменения экстраклеточного содержания нейротрансмиттеров при изменении поведенческого контекста
3.3.1. Поведенческое состояние сохраняется в изолированной нервной системе. Электрическую активность серотонинергических клеток РеА, которые расположены большой симметричной группой (кластером) в медиальной области педальных ганглиев и иннервируют мышцы и ресничный эпителий ноги прудовика, в препаратах изолированной ЦНС, взятой от сытых и голодных особей, достоверно различалась. Нейроны в ЦНС голодавших в течение 36-40 часов животных демонстрировали более высокий уровень деполяризации и электрической активности (ANOVA F =4.6; 9.6, p= 0.005, N=40, 37). Увеличение длительности голода до 5 суток и выше вызывала противоположный эффект. Эффект кратковременного голодания на электрическую активность сохранялся и у полностью изолированных нейронов РеА кластера (N=16). Эти результаты показали, что поведенческое состояние (поведенческий контекст) сохраняется в изолированной нервной системе, что позволяет изучать клеточные механизмы контекст-зависимого поведения.
3.3.2. Изучение клеточных механизмов действия метаболического предшественника серотонина 5-НТР. Результаты предыдущих экспериментов показали, что непосредственый предшественник серотонина 5-НТР, имитирующий влияние голода и моторной нагрузки на поведенческий выбор, повышает электрическую активность РеА нейронов (Каботянский и др. 1991). Его эффект полностью снимался ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот, отвечающей за синтез серотонина из 5-НТР (Чистопольский и Сахаров, 2000). Мы исследовали влияние 5-НТР на полностью изолированный нейрон, когда исключаются опосредованные влияния со стороны остальной нервной системы.
3.3.2.1. Метаболический предшественник серотонина возбуждает изолированные серотониновые нейроны РеА. 5-HTP (0.025, 0.05 и 0.1 мМ) во всех случаях оказывал активирующее действие на электрическую активность изолированных РеА нейронов прудовика. У исходно активных клеток (n = 23) начальная частота разряда составляла 8 ± 3 потенциалов действия (ПД) в мин, через 5 мин после подачи 0.1 мМ 5-НТР она поднялась до 20 ± 6 (р < 0.001). Исходно молчавшие клетки под влиянием 5-НТР (0.1 мМ) деполяризовались (12 из 12), у 11 появилась устойчивая импульсация с частотой 21 ± 7 ПД\мин.
3.3.2.2. Эффект 5-НТР снимается ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот м-гидроксибензилгидразином (NSD-1015). NSD-1015 (0.025, 0.05, 0.1 и 1 мМ) угнетал электрическую активность изолированных РеА нейронов. Клетки, у которых исходная частота составляла 12 ± 3 ПД в мин, через 5 минут после подачи 0.05 мМ NSD-1015 разряжались с частотой 6 ± 2 (n = 7, р < 0.05). 5-НТР на фоне NSD-1015 не вызывал достоверного увеличения электрической активности (n = 7, 7 ± 2 ПД в мин и 8 ± 3 до и после аппликации 5-НТР (р> 0.5). В отличие от 5-НТР, серотонин продолжал оказывать возбуждающее действие на фоне NSD-1015.
3.3.2.3. Влияние антагониста серотониновых рецепторов мианзерина на активность изолированных нейронов РеА, эффект серотонина и 5-НТР. Мианзерин в концентрации 10 мкМ полностью снимал действие 0.5 мкМ серотонина и достоверно снижал возбуждающий эффект 1 мкМ серотонина на изолированные РеА нейроны. На фоне мианзерина 5-НТР не вызывал достоверного увеличения частоты потенциалов действия. Существенно также, что мианзерин сам по себе вызывал небольшую гиперполяризацию изолированных нейронов ( - 2-3 мВ, N=8, z =2, P < 0.05) и небольшое снижение частоты импульсации. Эффект мианзерина на РеА клетки был обратимым.
3.3.2.4. Ингибитор везикулярных моноаминовых транспортеров резерпин препятствует возбуждающему эффекту 5-НТР. 5-НТР на фоне резерпина не вызывал достоверного увеличения импульсации (n = 8). В ответ на подачу смеси 5-НТР и резерпина слабое учащение активности было заметно всего у двух из восьми спонтанно-активных изолированных нейронов, обработанных в течение 20 мин резерпином (в среднем 17± 7 ПД/мин до, и 14 ± 3 после подачи 5-НТР, р> 0.5). Резерпин снимал возбуждающий эффект 5-НТР и на молчащих клетках.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о существовании экстрасинаптической секреции серотонина, повышающейся в ответ на усиление синтеза нейротрансмиттера, и в свою очередь, по механизму положительной обратной связи, усиливающей электрическую активность и, следовательно, секрецию серотонина. Наличием такого механизма самораскрутки на уровне даже отдельного изолированного нейрона очевидно объясняются сильные поведенческие эффекты 5-НТР (Рис. 7).
3.3.3. Серотонин, синтезируемый РеА нейронами – нейротрансмиттер, нейромодулятор или нейрогормон?
Результаты, описанные в предыдущем разделе, указывали на существование тонической экстрасинаптической секреции серотонина и об усилении этой секреции при повышении синтеза серотонина. Эксперименты И.А. Чистопольского и Д.А. Сахарова (Chistopolsky, Sakharov, 2003) подтвердили наличие функционально-значимой секреции серотонина телами РеА нейронов и продемонстрировали роль несинаптического экстраклеточного серотонина в поддержании определенного уровня тонической активности этих клеток. Мы проверили, зависит ли экстрасинаптическая секреция РеА кластера от поведенческого состояния улитки. Биосенсор подводили к области РеА кластера нервных систем, изолированных из сытых и голодных улиток (n=20) поочередно (Рис. 8). Оценивали изменения частоты его активности около РеА кластера по отношению к нейтральной позиции, равноудаленной от обоих препаратов. Из 10 опытов в 8 наблюдалось существенно более сильное (более 20% ) возбуждающее действие со стороны голодного препарата, в одном опыте был получен противоположный эффект, и в одном опыте различия были недостоверны (менее 5%). Парный тест Вилкоксона свидетельствует о достоверности различий (р= 0.02, z=2.2).
Рис. 8. Изменения в активности двух биосенсоров (б1, б2) при подводе к области РеА кластера препаратов ЦНС прудовика от сытых и голодных животных в одном опыте. Серой линией обозначена активность биосенсора у “голодного” препарата, черной – у “сытого”, o – нейтральное положение, вертикальные линии - начало перемещения биосенсора.
Нервная система моллюсков отделена от циркулирующей по всему организму гемолимфы двумя слоями оболочек. Мы нашли, что биосенсор реагирует возбуждением на подведение к педальным ганглиям, у которых сохранены интактными оболочки (n=8). Ответ в среднем был ниже, чем при подведении к ганглиям со снятыми оболочками. Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует механизм влияния РеА нейронов на другие отделы нервной системы по нейрогуморальному пути.
3.4.4. Повышение синтеза нейротрансмиттера усиливает несинаптическую секрецию нейротрансмиттера и у других нейронов. Уникален ли описанный выше случай несинаптической секреции нейротрансмиттера, управляемой интенсивностью синтеза нейротраснмиттера? Чтобы ответить на этот вопрос, для дальнейших исследований была выбрана клетка, по ряду характеристик отличающаяся от нейронов РеА кластера: (1) нейрон другой эргичности; (2) нейрон с тормозными ауторецепторами; (3) одиночный нейрон, не имеющий в своем окружении сходных клеток по эргичности и функции; (4) интернейрон, а не мотонейрон. Конкретно, мы использовали детально охарактеризованный многими авторами дофамин-продуцирующий нейрон RPeD1 L. stagnalis (Magoski et al., 1995). Проведенные эксперименты показали, что у изолированного RPeD1 L-DOPA вызывает возбуждение, которое затем переходит в торможение. Тормозный эффект снимается (1) ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот, который препятствует превращению L-DOPA в дофамин, (2) антагонистом дофаминовых рецепторов и (3) самим дофамином. Возбуждающий эффект, напротив, усиливается на фоне ингибитора декарбоксилазы, а также на фоне дофамина. Эти данные указывают на то, что возбуждение является результатом прямого действия L-DOPA, а гиперполяризующий эффект опосредован экстрасинаптической секрецией дофамина.
Таким образом, в результате проведенных и описанных в этой главе экспериментов, впервые удалось показать клеточные механизмы, обеспечивающие изменение несинаптической экстраклеточной секреции медиатора при изменении функционального состояния. Показано, что вызванное естественным фактором (голодом, повышенной моторной нагрузкой) повышение синтеза серотонина может увеличивать электрическую активность серотониновых клеток и экстрасинаптическую секрецию нейротрансмиттера. Описан возможный механизм усиления экстрасинаптической секреции в ответ на активацию синтеза на полностью изолированных нейронах и показано, что такая секреция не только создает функционально-значимый фон для нейронов РеА кластера, но и может обеспечить влияние на другие отделы ЦНС и весь организм животного по нейрогормональному типу действия. Эксперименты на дофаминергическом интернейроне RPeD1 свидетельствуют о том, что найденный механизм не является уникальным для серотониновой группы клеток РеА кластера.
3.4. Влияние химического контекста на выбор программы активности нейрональным ансамблем и отдельным нейроном.
3.4.1. Модификация оксидом азота (NO) эффектов глутамата в паттерн-генерирующей сети пищевого поведения Lymnaea stagnalis.
Ранее на виноградной улитке было показано, что NO контролирует ответ определенных нейронов на глутамат (Дьяконова Т., 1998, 2002). В центральном генераторе буккального ритма прудовика глутамат является нейротрансмиттером интернейрона N2v, отвечающего за координацию активности интер- и мотонейронов во второй фазе ритма (Brierley et al., 1997). NO синтезируется нейронами буккальных ганглиев и участвует в хемосенсорной активации пищевой программы. Представлялось целесообразным проверить возможную зависимость эффектов глутамата в этой системе от уровня NO. В качестве мониторов активности буккального генератора использовали мотонейроны В4, которые тормозятся во время 1 и 2 фазы трехфазного ритма и активируются во время 3 фазы (Staras et al., 1998).
3.4.1.1. Действие глутамата на активность нейронов В4. На 17 нейронов из 29 глутамат оказал тормозное действие, а на 12 – возбуждающее. Характер ответа В4 на глутамат не зависел от уровня мембранного потенциала. Возбуждающий ответ характеризовался деполяризацией и активацией дополнительных возбуждающих входов, при этом стандартный трехфазный пищевой паттерн мог существенно модифицироваться, превращаясь в двухфазный, названный ритмом II типа (Рис. 9а).
3.4.1.2. Действие донора NO нитропруссида на активность нейронов В4 и эффект глутамата. Во всех случаях нитропруссид вызывал обильный возбуждающий приток на В4, в том числе, связанный с формированием пищевого ритма. Влияние донора NO на эффект глутамата смотрели на нейронах, исходно демонстрировавших тормозную реакцию на глутамат (n=14). Если нитропруссид вводили в инкубационный раствор на 5-20 мин до глутамата, то исходно тормозное действие глутамата превращалось в возбуждающее (n=9). При действии нитропруссида менее 5 мин тормозный ответ подавлялся, но возбуждения не было (n=4). В контрольных опытах (n=2) с повторным введением глутамата через 20 мин характер ответа В4 не изменялся.
3.4.1.3.. Действие акцептора NO PTIO на активность нейронов В4 и эффект глутамата. Если исходно глутамат активировал буккальный генератор и нейрон В4 (n=7, Рис. 9а), то предварительное воздействие PTIO (0.25 мМ) в течение 5-20 минут превращало этот ответ в тормозный (Рис. 9б). Если исходно ответ был тормозным (n=2), то после воздействия PTIO направление ответа не изменялось.
Рис. 9. Трансформация ответа на глутамат акцептором оксида азота PTIO. Нейрон В4 в препарате изолированной ЦНС. (а) Исходно глутамат (глу; 0,1 мМ) учащает и изменяет буккальный ритм, вызывая исчезновение одной из фаз (стрелки). (б) После воздействия PTIO (0,25 мМ) в течение 20 мин глутамат вызывает полное выключение активности.
3.4.1.4. Действие блокатора (ODQ) NO-зависимой гуанилатциклазы (ГЦ) на глутаматный ответ нейронов В4. ODQ (0,025 мМ) вводили за 10-15 мин до глутамата (6 неизолированных нейронов B4 и 5 полностью изолированных нейронов). Во всех случаях, ODQ подавлял возбуждающее действие глутамата: оно существенно снижалось по сравнению с контролем, но в большинстве случаев становилось тормозным. Эти результаты показывают, что эффекты глутамата на нейроны В4 зависит от активности NO-зависимой ГЦ.
3.4.1.5. Источники глутамата в буккальных ганглиях и возможная функциональная роль двухфазного ритма. Гистохимическое окрашивание выявило интенсивную иннервацию буккальных ганглиев глутамат-иммунореактивными волокнами с множеством варикозных расширений. Было очевидно, что должны существовать другие источники глутамат-иммунореактивности нейропиля буккальных ганглиев помимо интернейронов N2v. В дорзобуккальных нервах наблюдалось два мощных пучка глутаматиммунореактивных волокон. Исследование периферии, связанной с этими нервами, показало, что в пищеводе, особенно в нижнем его отделе, выявляются многочисленные иммунореактивные нейроны. Эти мульти- и биполярные клетки образуют сеть, охватывающую всю поверхность пищевода на уровне наружного мышечного слоя, отростки этих нейронов входят в дорзо-буккальный нерв. Эти результаты свидетельствуют о том, что существенный вклад в глутаматергическую иннервацию буккальных ганглиев вносят нейроны пищевода. Выявленная в пищеводе сеть глутаматиммунореактивных нейронов, дающих проекции в буккальные ганглии, наряду с описанными нами эффектами глутамата (торможение трёхфазного ритма, гиперполяризация ключевых мотонейронов, активация двухфазного «эвакуаторного» ритма), позволяют рассматривать глутамат в качестве кандидата на роль агента, ответственного за сигнализацию из пищевода. В случае подтверждения этой гипотезы возникает теоретически интересная коллизия нейротрансмиттерного изохимизма центральных (N2v) и периферических нейронов, участвующих в обеспечении общей поведенческой функции. Полученные результаты демонстрируют, что ответ буккальной системы нейронов на глутамат радикально меняется при изменениях уровня NO.
3.4.2. Роль экстрасинаптического контекста координации моторных ритмов и в выборе нейроном В2 характера активности.
3.4.2.1. Координация ритмов буккального генератора и нейронов, модулирующих сокращения пищевода. В буккальных ганглиях прудовика помимо описанного выше центрального генератора, управляющего моторикой радулы (ЦБГ), находятся нейроны, отвечающие за контроль моторики пищевода (Perry et al., 1998). Это гигантские парные нейроны В2, синтезирующие NO, ацетилхолин и миомодулин (Park et al., 1998; Perry et al., 1998) и способные к генерации собственного пачечного ритма. Существует несколько вариантов координации ритмов ЦБГ и нейрона В2. Сопоставление уровня мембранного потенциала В2 с активностью ЦБГ свидетельствует о том, что активация ЦБГ в большинстве случаев сопровождается тонической гиперполяризацией В2.
3.4.2.2. NO активирует буккальный ритм и тормозит активность В2. При параллельном мониторинге активности буккального генератора и нейрона В2 показано, что доноры NO (SNP, SNAP, нитрит натрия) вызывают синхронную активацию буккального ритма и торможение ритма нейрона В2. Блокатор NO зависимой гуанилатциклазы ODQ (0.05 мМ), напротив, оказывал выраженное деполяризующее и возбуждающее действие и подавлял тормозные эффекты доноров NO. Блокатор NO-синтазы L-NNA (n=16, Рис. 10a) вызывал деполяризацию нейронов В2, инициировал или усиливал эндогенную пачечную активность и полностью выключал волны гиперполяризации. Возбуждающий эффект L-NNA снимался добавлением в раствор доноров NO. Акцептор NO PTIO (n=8) также оказывал на клетки В2 деполяризующее действие.
Рис. 10. Средняя частота спайков нейрона В2 до и после аппликации L-NNA, PTIO, SNP, SNAP (1mM), и нитрита натрия (NaNO2, 1мМ) in situ (А) и при изоляции (Б). *р<0.05, **p<0.01.
Таким образом, эффекты веществ, влияющих на уровень NO или его метаболический путь, указывают на роль этого эндогенного фактора не только в механизме активации буккального ритма, но и в запуске определенной координации буккального ритма и нейронов В2, управляющих моторикой пищевода. Все проведенные эксперименты в условиях изолированной ЦНС указывают на то, что NO тормозит собственный ритм NO-синтезирующего нейрона В2, гиперполяризует эту клетку и запускает на ней гигантские волны гиперполяризации, ассоциированные с буккальными циклами.
3.4.2.3. Тормозные эффекты NO не проявляются на изолированных В2 нейронах. На изолированных нейронах действие доноров NO в тех же концентрациях не давало достоверного снижения активности клетки (Рис. 10б, 11). Неожиданно оказалось, что вещества снижающие уровень NO способны вызывать деполяризующие эффекты даже на полностью изолированных нейронах В2, хотя и существенно более слабые, чем in situ (Рис. 10б).
3.4.2.4. Возвращение изолированного В2 в химическую среду буккального ганглия восстанавливает его способность тормозиться в ответ на аппликацию NO. В 8 из 10 экспериментов, в которых действие NO исследовали на изолированном нейрон В2, подведенном к месту исходной локализации в ганглии, наблюдался тормозный эффект (Рис. 11б,в), различия были статистически значимы (p< 0.05, парный тест Вилкоксона).
Эти данные однозначно указывают на то, что торможение В2 в ответ на NO обеспечивается изменением экстраклеточного химического контекста. В 25% наблюдался запуск или повышение частоты гигантских волн гиперполяризации на подведенном нейроне В2 под влиянием NO (Рис. 11в), что указывает на возможную экстрасинаптическую природу гигантских волн, обеспечивающих фазовую координацию активности В2 и буккального генератора.
3.4.3. Контекст-зависимое поведение изолированного локомоторного нейрона.
3.4.3.1. Влияние глюкозы на электрическую активность изолированных локомоторных нейронов. Исследования (Scheerboom et al., 1978) показали, что концентрация глюкозы в гемолимфе прудовиков меняется от 20 до 760 мкг/мл в зависимости от уровня сытости животных. Мы исследовали ответ полностью изолированных клеток РеА кластера (n=12) на добавление в омывающий раствор Рингера глюкозы. Наиболее воспроизводимый эффект был обнаружен при концентрации клюкозы 250 мкг/мл, что соответствует изменению осмомолярности раствора на 2 %. Глюкоза вызывала медленную гиперполяризацию нейронов РеА кластера, максимальный эффект развивался к 3-5 минуте появления глюкозы в камере. Парный тест Вилкоксона выявил достовернее снижение частоты электрической активности изолированных РеА на 5 минуте подачи глюкозы (z=3, p<0.01). Гиперполяризующий эффект глюкозы, снижающий электрическую активность изолированных РеА клеток, в целом хорошо согласуется с ожидаемой зависимостью активности этих клеток от степени сытости-голодности животного. Примечательно, что на нейронах с другой функцией, например, отвечающих за синтез инсулина, глюкоза вызывает противоположный, возбуждающий эффект (Kits et al., 1991). А на нейронах, связанных с пищевым поведением, также как и в нашем случае, – тормозный (Alania et al., 2004). Остается неизвестным, экспрессируют ли РеА нейроны специфические глюкорецепторы, как например (Kits et al., 1991). Нельзя полностью исключить и возможного неспецифического метаболического действия глюкозы, позволяющего, улучшить энергетику изолированной клетки, активизировать Na-K обменники и восстановить ионный градиент, возможно, нарушенный процедурой изоляции.
3.4.3.2. Ответ изолированного локомоторного нейрона на химический контекст педального А кластера меняется под влиянием глюкозы. Было проверено влияние глюкозы на ответ изолированных РеА клеток на нейроактивный фон около РеА кластера. Нейрон подводили к поверхности ганглия на расстояние половины диаметра клетки. В присутствии глюкозы снижался и исходный уровень активности нейрона, и его ответ на химическую среду РеА кластера. Ослабление ответа на фоне глюкозы нашло отражение в небольшом снижении уровня значимости различий до подведения и после.
Таким образом, эксперименты с изолированными локомоторными нейронами показывают, что эти клетки потенциально способны самостоятельно контролировать изменение поведенческого состояния животного по изменениям химической экстраклеточной среды и адектватно менять свою активность. Эти результаты не отрицают существование нейронов более высокой иерархии и возможности дополнительного или даже решающего влияния командных нейронов через активное изменение локальной химической среды на поведение этих клеток. Тем не менее, они впервые прямо свидетельствуют о возможности периферического нейрона адекватно реагировать на изменение химического контекста, отражающего контекст поведенческий.
Итак, для изучения роли химического контекста в выборе поведения нейрональным ансамблем и отдельным нейроном были использованы три экспериментальные модели: (1) выбор буккальным генератором пищевого ритма ответа на глутамат; (2) выбор варианта координации ритмической активности буккального генератора и пачечного нейрона, контролирующего моторику пищевода; (3) выбор характера активности локомоторными нейронами РеА кластера. Во всех случаях, была показана зависимость клеточного поведения от химического контекста.
ВЫВОДЫ
- Выбор поведения во внутривидовых отношениях у сверчка Gryllus bimaculatus (Insecta, Arthropoda, Ecdysozoa) зависит от предыдущего социального и моторного опыта (полет). Эффекты полета на избегательное, половое и агрессивное поведение сходны с проявлениями статуса доминанта.
- Фармакологически вызванные изменения в нейрохимической среде (активация/блокада октопаминовых и опиатных рецепторов, изменения синтеза серотонина, октопамина, дофамина, оксида азота) оказывали специфическое и воспроизводимое влияние на поведенческий выбор при социальных и половых взаимодействиях у сверчков
- Контекст-зависимый выбор поведения во внутривидовых отношениях у сверчка контролируется моноаминами серотонином и октопамином, а также эндогенной опиоидной системой. Влияние моторной нагрузки (полета) на высвобождение агрессии у субординантных сверчков опосредуется интегративным действием октопамина.
- В механизме влияния голода и моторной нагрузки на ориентировочное, локомоторное и защитное поведение прудовика Lymnaea stagnalis (Gastropoda, Mollusca, Lophotrochozoa) ключевую роль играет повышение синтеза и секреции серотонина.
- Моноаминергические нейроны прудовика обладают механизмом, связывающим уровень несинаптической объемной секреции и интенсивность синтеза нейротрансмиттера. Несинаптическая секреция локомоторными нейронами РеА кластера усиливается при голоде и моторной нагрузке.
- Химический контекст определяет выбор моторной программы центральными нейронами, управляющими пищевым и локомоторным поведением прудовика.
- Объемная секреция и интегративный характер действия нейротрансмиттера участвуют в механизме контекст-зависимого выбора поведения у обоих исследованных объектов, представляющих две разные группы первичноротых.
- Полученные результаты, таким образом, свидетельствуют в пользу гипотезы о трансляции поведенческого контекста в контекст химический, интегративным действием которого обеспечивается адекватный ответ системы.
Список основных публикаций по теме диссертации.
- Dyakonova V.E., Dyakonova T.L., and Sakharov D.A. Edogenous opioids of 'model' gastropods: Coordination of motor programmes for feeding and defensive behaviour in the pond snail Lymnaea stagnalis // Biol. Membranes. 1992. Т. 9. С. 1874-1876.
- Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Участие эндогенной опиоидной системы в регуляции пищевого и защитного поведения моллюска // Журн. высш. нерв. деят. 1994. Т. 44. N 2. С. 316-322.
- Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Нейротрансмиттерная основа поведения моллюска: управление выбором между ориентировочным и оборонительным ответом на предъявление незнакомого объекта // Журн. высш. нерв. деят. 1994. Т. 44. N. 3. С. 526-531.
- Baker M.W., Croll R.P., Dyakonova V., Khabarova M., Sakharov D.A., Voronezhskaya E. Mode of action of antipsychotic drugs: Lessons from simpler models // Acta biol. hung. 1995. Т. 46. N. 2-4. C. 221-227.
- Dyakonova V.E., Elofsson R., Carlberg M., Sakharov D.A. Complex avoidance behaviour and its neurochemical regulation in the land snail Cepaea nemoralis // Gen. Pharmac. 1995. T. 26. C. 773-777.
- Dyakonova V.E., Carlberg M., Sakharov D.A., Elofsson R. Anatomical basis for interactions of enkephalins with other neurotransmitters in the CNS of a snail // J. Comp. Neurol. 1995. T. 361. C. 38-47.
- Дьяконова В.Е. Эндогенная опиоидная система тонически активирует локомоторные нейроны Lymnaea stagnalis // Журн. высш. нерв. деят. 1998. Т. 48. N. 1. C. 113-120.
- Dyakonova V., Elofsson R., Carlberg M., D.A. Sakharov Effects of Naloxone on c-jun/AP-1 in Met-enkephalin- and FMRFamide-immunoreactive Neurons of a Gastropod Snail // Acta Biol. Hung. 1999. T. 50. N.1-2. C. 43-54.
- Dyakonova V.E., Sakharov D.A., Schuermann F.-W. Effects of serotonergic and opioidergic drugs on escape behavior and social status of male crickets // Naturwissenschaften. 1999. T. 86. C. 435-437.
- Dyakonova V.E., Schuermann F.-W., Sakharov D.A. Social aggressiveness of female and subordinate male crickets is released by opiate receptor antagonist // Acta Biol. Hung. 2000. T. 51. N. 2-3. C. 363-367.
- Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Изолированный серотониновый нейрон: уровня синтеза нейротрансмиттера влияет на импульсацию // Доклады РАН. 2001. T. 376. N. 2. C. 267-270.
- Дьяконова В.Е. Поведенческие функции опиоидных пептидов у беспозвоночных. Обзор // Журн. эвол. биохим. физиол. 2001. T. 4. C. 253-261.
- Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Изолированный серотониновый нейрон: механизм возбуждения, вызванного активацией синтеза нейротрансмиттера // Доклады РАН. 2001. T. 378. N. 5. C. 694-696.
- Dyakonova V.E., Schuermann F.-W., Sakharov D.A Effects of opiate ligands on intraspecific aggression in crickets // Peptides. 2002. T. 23. N. 5. C. 835-842.
- Дьяконова В.Е., Крушинский А.Л. Усиление полового поведения и агрессивности у сверчков после полета. ДАН. 2003. T. 390. N. 5. C. 709-712.
- Herndi L., Hiripi L., Dyakonova V., Gyri J., and Vehovszky. The effect of food intake on the central monoaminergic system in the snail, Lymnaea stagnalis // Acta Biol. Hung. 2004. T. 55. N. 1-4. C. 185-194.
- Alania M., Dyakonova V., Sakharov D.A. Hyperpolarization by glucose of feeding related neurons in snail // Acta Biol. Hung. 2004. T. 55. N. 1-4. C. 195-200.
- Stevenson P., Dyakonova V.E., Rillich J., Schildberger K. Octopamine and Experience-Dependеnt Modulation of Aggression in Crickets // J. Neurosci. 2005. T. 25. N. 6. C. 1431-1441.
- Дьяконова В.Е., Крушинский А.Л. Влияние ингибитора NO-синтазы на агрессивное и половое поведение сверчка // Росс. физиол. журн. им И.М. Сеченова. 2005. T. 91. N. 6. C. 616-624. Переведена в Neurosc.Behav.Physiol. 2006. T. 36. N. 5. C. 565-571.
- Дьяконова В.Е., Дьяконова T. Л., Сахаров Д.А. Двуфазное действие L-DOPA на электрическую активность изолированного дофаминергического нейрона // ДАН. 2005. T. 403. C. 253-256.
- Дьяконова T. Л, Дьяконова В.Е. Модификация оксидом азота (NO) эффектов глутамата в паттерн-генерирующей сети // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2007. T. 93. N. 3. C. 236-247.
- Дьяконова В.Е. Поведенческие эффекты октопамина и серотонина: некоторые парадоксы сравнительной физиологии // Успехи физиол. наук. 2007. T. 38. N. 3. C. 3-20.
- Dyakonova V.E., Krushinsky A.L. Previous motor experience enhances courtship behavior in male cricket Gryllus bimaculatus // J. Insect Behavior. 2008. T. 21. C. 172-180.
- Дьяконова T. Л, Дьяконова В.Е. Электрическая активность NO-синтезирующего нейрона зависит от уровня NO // Бюлл. эксп. биол. мед. 2008. T. 145. N. 6. C. 608-612.
- Dyakonova T.L., Dyakonova V.E. Possible involvement of nitric oxide in coordination of buccal feeding rhythm and gut motility in Lymnaea stagnalis // Acta Biol. Hung. 2008. T. 59. C. 33-37.
- Dyakonova V.E., Chistopolsky I.A., Dyakonova T.L., Vorontsov D.D., Sakharov D.A. Direct and decarboxylation-dependent effects of neurotransmitter precursors on firing of isolated monoaminergic neurons // J. Comp. Physiol. A. 2009. T. 195. N. 6. C. 515-527.
- Дьяконова Т.Л., Дьяконова В.Е. Участие рецепторов NMDA-типа в регуляции глутаматом пищевой моторной программы пресноводного моллюска Lymnaea // Журн. эвол. биохим. физиол. 2010. T. 46. C. 45-51.
- Dyakonova T.L. and Dyakonova V.E. Coordination of rhythm-generating units via NO and extrasynaptic neurotransmitter release // J. Comp. Physiol. A. 2010. T. 196. N. 8. C. 529-541.
