Серотониновые 5-нт2а рецепторы в механизмах ауторегуляции и пластичности серотониновой (5-нт) системы мозга: функциональные взаимодействия с ключевыми генами 5-нт системы и нейротрофическими факторами

На правах рукописи

ЦЫБКО АНТОН СЕРГЕЕВИЧ

СЕРОТОНИНОВЫЕ 5-НТ2А РЕЦЕПТОРЫ В МЕХАНИЗМАХ АУТОРЕГУЛЯЦИИ И ПЛАСТИЧНОСТИ СЕРОТОНИНОВОЙ (5-НТ) СИСТЕМЫ МОЗГА: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С КЛЮЧЕВЫМИ ГЕНАМИ 5-НТ СИСТЕМЫ И НЕЙРОТРОФИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2013

Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институте цитологии и генетики» СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель:

Попова Нина Константиновна, д.м.н., профессор

ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты:

Калинина Татьяна Сергеевна, д.б.н., доцент, старший преподаватель

Новосибирский Государственный Университет, г.Новосибирск

Идова Галина Вениаминовна, д.б.н., профессор, зав. лабораторией

ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН, г.Новосибирск

Ведущая организация: ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится «___» ___ ________ 2013 г. в __ ___ часов

на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН (630017, Новосибирск, ул. Тимакова, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ФФМ»СО РАМН.

Автореферат разослан «___» ______________ 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

к.б.н., доцент Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одним из ключевых факторов, осуществляющих регуляцию нормального и патологического поведения, а также множества физиологических процессов, является серотонин (5-НТ) (Попова и др., 1978; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998). Чрезвычайная полифункциональность данного нейромедиатора достигается за счёт большого числа рецепторов, опосредующих его действие на нейроны (Hannon, Hoyer, 2008). На сегодняшний день идентифицировано 14 подтипов 5-НТ рецепторов, среди которых особый интерес привлекают рецепторы 2А подтипа, в первую очередь из-за их участия в механизмах развития целого спектра различных психических расстройств, включая депрессию и шизофрению (Dean et al., 1998; Mintun et al., 2001; McMahon et al., 2006; Bubar, Cunningham, 2008; Kazek et al., 2010; Bach, Arango, 2012).

Подобная значимость 5-НТ2А рецептора основывается на ряде биологических особенностей, делающих его уникальным в ряду прочих серотониновых рецепторов. Так, 5-НТ2А рецепторы широко представлены в головном мозге, где локализованы на различных типах нейронов, что позволяет им осуществлять модуляцию секреции дофамина, глутамата и ГАМК (Jakab, Goldman-Rakic, 1998; Miner et al., 2003; Alex, Pehek, 2007; Aghajanian, Marek, 1997,1999). Одновременно с этим, 5-НТ2А рецептор обладает обширной внутриклеточной сигнализацией (Blazer et al., 2008). Связь рецепторов с несколькими типами G-белков позволяет запускать различные сигнальные каскады (Kurrasch-Orbaugh et al., 2003b). Фармакологическая регуляция 5-НТ2А рецепторов уникальна – их десенситизацию могут осуществлять не только агонисты но и антагонисты, что резко отличает 2А подтип от остальных 5-НТ рецепторов (Van Oekelen et al., 2003; Berg et al., 2005, 2008; Aloyo et al., 2009, 2010).

Указанные особенности 5-НТ2А рецептора наделяют его большим функциональным потенциалом и делают важным звеном в механизмах действия антидепрессантных агентов. Вместе с тем, функционирование 5-НТ2А рецепторов остаётся недостаточно изученным и изобилует пробелами в ряде ключевых аспектов. Так, мало известно об участии 5-НТ2А рецепторов в ауторегуляции серотониновой системы мозга. Ауторегуляция 5-НТ системы привлекает к себе пристальное внимание в связи с важнейшей проблемой, стоящей перед современной нейрофармакологией, - потерей чувствительности к фармакологическим препаратам. По существующим представлениям (Sharp et al., 2007) в мозге присутствует регуляторная петля «5-НТ2А рецепторыглутаматные нейроны фронтальной корыГАМК нейроны ядер шва5-НТ нейроны ядер шва». В соответствии с данной моделью, активация 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре ведёт к ингибировании серотониновой системы мозга. Однако, эта модель применима только к острой активации 5-НТ2А рецепторов. До сих пор остаётся неизвестным, как изменяется состояние 5-НТ системы мозга при хронической активации 5-НТ2А рецепторов. Важность понимания этой проблемы продиктована тем, что большинство антидепрессантов применяется хронически. Это неизбежно приводит к накоплению нейромедиатора в проекционных областях и активирует 5-НТ2А рецепторы.

Кроме того, отрывочны сведения о функциональном взаимодействии 5-НТ2А рецепторов с 5-НТ1А рецепторами, играющими колоссальную роль в регуляции 5-НТ системы. Остаётся практически неизвестным, существует ли связь между 5-НТ2А рецепторами и генами, контролирующими 5-НТ систему мозга.

В последнее время в центре внимания оказался новый тип антидепрессантных агентов, – нейротрофические факторы BDNF (нейротрофический фактор мозга) и GDNF (глиальный нейротрофический фактор) (Hoshaw et al., 2005; Deltheil et al., 2008; Peng et al., 2008; Тихонова и др., 2009; Naumenko et al., 2012). BDNF и GDNF являются не только одними из самых распространённых и функционально значимых в ЦНС, но и наиболее перспективными средствами для лечения большого спектра неврологических расстройств (Cho et al., 2007; Peng et al., 2008; Deltheil et al., 2008; Ebert et al., 2010; Rangasamy et al., 2010). Совершенно очевидно, что данные нейротрофические факторы не действуют в отрыве от существующих в мозге моноаминергических систем. Показано взаимодействие BDNF и серотониновой системы (Merlio et al., 1992; Anderson et al., 1995; Duman, Monteggia, 2006; Sen et al., 2008; Duman, 2009). Сравнительно меньше известно о взаимодействии 5-НТ системы и GDNF, но имеющиеся данные убедительно говорят о наличии сильной связи между ними (Beck et al., 1996; Hisaoka et al., 2004; Shao et al., 2006; Tsuchioka et al., 2008; Zhang et al., 2008; Diniz et al., 2012). Более того, показано, что через 5-НТ2А рецепторы можно модулировать экспрессию BDNF (Vaidya et al., 1997; Meller et al., 2002; Tan et al., 2007) и GDNF (Hisaoka et al., 2004; Tsuchioka et al., 2008). Однако, очень мало известно о том, как 5-НТ2А рецепторы участвуют в механизмах действия BDNF и совершенно неизвестно, участвуют ли они в механизмах действия GDNF.

Целью настоящего исследования было изучение роли 5-НТ2А рецепторов в механизмах ауторегуляции и пластичности 5-НТ системы мозга, участие в функциональных межрецепторных взаимодействиях, рецептор-зависимой регуляции экспрессии генов, а также действии нейротрофических факторов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированны следующие задачи:

1. Исследовать участие 5-НТ2А рецепторов в ауторегуляции 5-НТ системы мозга в модели хронической активации рецепторов. Выявить, существуют ли функциональные взаимодействия между 5-НТ2А рецепторами и ключевыми генами 5-НТ системы мозга;
2. Изучить влияние хронической активации 5-НТ2А рецепторов на общую двигательную активность, тревожность и депрессивно-подобное поведение;
3. Исследовать функциональные межрецепторные взаимодействия между 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторами в модели хронической активации 5-НТ1А рецепторов;
4. Установить, участвуют ли 5-НТ2А рецепторы в механизмах действия нейротрофического фактора BDNF, исследовать эффекты BDNF на выраженность депрессивно-подобного поведения мышей «депрессивной» линии ASC и «недепрессивной» линии СВА;
5. Выявить, участвуют ли 5-НТ2А рецепторы в механизмах действия нейротрофического фактора GDNF, влияет ли центральное введение GDNF на депрессивно-подобное поведение мышей, а также сравнить эффекты BDNF и GDNF на состояние 5-НТ2А рецепторов и поведение животных.

Научная новизна работы.

1. впервые показано, что при хронической активации 5-НТ2А рецепторов происходит активация 5-НТ системы мозга. Обнаружена 5-НТ2А рецептор-зависимая регуляция экспрессии генов в серотониновой системе мозга. Хроническая активация 5-НТ2А рецепторов повышает экспрессию и активность ключевого фермента биосинтеза серотонина триптофангидроксилазы-2 (ТПГ-2) и также снижает экспрессию транспортёра серотонина (5-НТТ) в среднем мозге Показана роль этих процессов в компенсаторных механизмах, направленных на минимизацию поведенческих отклонений.
2. впервые установлено, что хроническая активация 5-НТ1А рецепторов вызывает существенное снижение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре подопытных животных;
3. впервые выявлено, что центральное введение BDNF повышает функциональную активность и экспрессию 5-НТ2А рецепторов;
4. впервые показано, что центральное введение GDNF существенно повышает экспрессию гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре, и ослабляет выраженность каталепсии у мышей-каталептиков линий ASC и СВА.

Научно-практическая ценность работы.

Выдвинута новая концепция, согласно которой хроническая активация 5-НТ2А рецепторов оказывает активирующее воздействие на 5-НТ систему мозга, посредством рецептор-зависимой регуляции экспрессии генов. Новые, ранее неизвестные эффекты хронической активации 5-НТ2А рецепторов продиктуют в будущем необходимость выработки оптимальной фармакологической стратегии, учитывающей значительный ауторегуляторный потенциал данных рецепторов.

Показана роль нейротрофических факторов BDNF и GDNF в подавлении выраженности генетически детерминированного депрессивно-подобного поведения и выявлено участие 5-НТ2А рецепторов в антидепрессантном эффекте данных нейротрофических факторов, что может найти применение при создании антидепрессантнов нового поколения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроническая стимуляция 5-НТ2А рецепторов приводит к активации 5-НТ системы мозга;
2. Обнаружена 5-НТ2А рецептор-зависимая регуляции экспрессии ключевых генов в серотониновой системе мозга. Эти процессы играют существенную роль в компенсаторном механизме, направленном на минимизацию поведенческих отклонений при хронической активации 5-НТ2А рецепторов;
3. Между 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторами существуют реципрокные взаимодействия, которые проявляются на уровне транскрипции генов;
4. Центральное введение нейротрофических факторов BDNF и GDNF подавляет выраженность депрессивно-подобного поведения. У мышей с генетической предрасположенностью к депрессивно-подобному поведению, введение BDNF и GDNF вызывает изменения в функциональной активности и экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов.

Апробация работы.

Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчётной сессии ИЦиГ СО РАН в 2013 г., XLVII Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2009), XLVIII Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2010), V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011), III съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), II Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных "Биология будущего: традиции и новации" (Екатеринбург, 2012), VIII Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2012), VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012), International Summer School "Neurogenetics. Unraveling behavior and brain mechanisms using modern technologies" (Звенигород, 2012), научной школе "Современная биология & биотехнологии будущего" (Пущино, 2013), XXII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013).

Публикации

Материал диссертации представлен в 17 публикациях, в том числе в 4 статьях в отечественных (1) и зарубежных (3) реферируемых журналах.

Структура и объем работы

Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы (432 источника) и приложение. Общий объем составляет 125 машинописных листов. Представлено 17 рисунков и 7 таблиц.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю Н.К. Поповой, своим соавторам В.С. Науменко, Е.М. Кондауровой, и Т.В. Ильчибаевой принимавшим участие в получении экспериментального материала, Д.В. Базовкиной, совместно с которой проведено тестирование поведения, а так же старшему лаборанту Л.М. Гаус за помощь в проведении ряда экспериментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

Эксперименты проводились на взрослых самцах мышей инбредных линий AKR/J, CBA/LacJ, ASC/Icg, так же были задействованы мыши линий AKR.CBA-D13Mit76, DBA2, Balb/c, C57Bl/6 и ICR. Мыши ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy) были получены в результате длительной селекции (более 40 поколений) на повышенную предрасположенность к каталепсии (реакции замирания) из популяции бэккроссов между мышами некаталептической (AKR) и каталептической (CBA) линий. Линия ASC характеризуется более высоким процентом мышей-каталептиков (80%), чем родительская каталептическая линия СВА (54%). Селекция на высокую предрасположенность к каталепсии привела к формированию депрессивно-подобного состояния у мышей (Базовкина и др., 2005). Модель генетической предрасположенности к каталепсии у мышей соответствует двум основным требованиям, предъявляемым к экспериментальным моделям депрессии (Willner, 1987; 1990): face validity (сходство симптомов депрессивных расстройств с депрессивно-подобными чертами модели) и predictive validity (сходство реакции на введение антидепрессантов), и является удобным инструментом для изучения механизмов развития депрессии и действия антидепрессантов (Тихонова и др., 2009).

Препараты

8-ОН-DPAT (8-Hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin; Sigma, США), селективный агонист 5-НТ1А рецепторов, растворяли в физиологическом растворе и вводили животным внутрибрюшинно остро (в дозе 1 мг/кг), хронически (в дозе 1 мг/кг) в течение 14 дней. В хроническом эксперименте введение 8-ОН-DPAT осуществлялось после поведенческих тестов. Мыши контрольной группы получали инъекции физиологического раствора.

DOI (2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine; Sigma, Tocris Bioscience, США), агонист 5-НТ2А рецепторов растворяли в физиологическом растворе и вводили животным внутрибрюшинно остро (в дозе 1 мг/кг) или хронически (в дозе 1 мг/кг) в течение 14 дней. Животные контрольной группы получали инъекции физиологического раствора.

BDNF (Human Brain-derived neurotrophic factor; Sigma, USA) растворяли в стерильной воде и вводили мышам в левый боковой желудочек мозга (intracerebroventricularly, i.c.v.) AP: -0.5 мм, L: -1.6 мм, DV: 2 мм (Slotnick, Leonard, 1975) в дозе 300 нг. Перед процедурой центрального введения препарата, животные подвергались легкому (20-30 сек) эфирному наркозу. Мыши контрольной группы получали инъекции стерильной дистиллированной воды вместо препарата. Объем жидкости, вводимый центрально составлял 5 мкл. Исследование функциональной активности рецепторов, экспрессии генов проводили через 21 день.

GDNF (Human Glial cell line-derived neurotrophic factor; Peprotech, USA) растворяли в стерильной воде и вводили мышам в левый боковой желудочек мозга (см. выше) в дозе 800 нг на животное. Мыши контрольной группы получали инъекции стерильной дистиллированной воды вместо препарата.

Функциональную активность 5-НТ1А рецепторов определяли по выраженности гипотермической реакции в ответ на острое введение 8-ОН-DPAT (Overstreet et al., 1996). Функциональная активность 5-НТ2А рецепторов была определена по количеству опосредованных 5-НТ2А рецепторами встряхиваний головой (Green, Heal, 1985), вызванных агонистом 5-НТ2А рецепторов – DOI.

Исследование поведения мышей

Все поведенческие характеристики оценивались по стандартным методикам, таким как тест открытого поля (open field) (Kulikov et al., 2008), тест на каталепсию (pinch-induced catalepsy) (Kulikov et al., 1993), тест свет-темнота (light-dark box), приподнятый крестообразный лабиринт (elevated plus maze), межсамцовая агрессия (intermale aggression) (Popova, Kulikov, 1986), тест подвешивания за хвост (tail suspension test, TST) (Trullas et al., 1989), тест закапывания шариков (marble burying test) (Njung'e, Handley, 1991), при помощи системы компьютерной регистрации «EthoStudio» (Kulikov et al., 2008).

Определение экспрессии генов

Выделение общей РНК проводили при помощи гуанидин тиоционатного лизиса с последующей фенольной депротеинизацией и спиртовым осаждением (Chomczynski, Sacchi, 1987), полученную фракцию РНК обрабатывали ДНКазой, разводили обработанной диэтилпирокарбонатом водой РНК до концентрации 0.125 мкг/мкл и проводили обратную транскрипцию с помощью вырожденного гексамерного олигодезоксирибонуклеотида.

Концентрацию примесей геномной ДНК в препаратах кДНК измеряли с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для 5 и 6 экзонов гена триптофангидроксилазы-1 мыши, который не экспрессируется в головном мозге (Науменко, Куликов, 2006). Ни в одной из исследуемых проб концентрация геномной ДНК не превышала 80 копий на мкл.

Концентрацию мРНК генов определяли методом полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием известных количеств геномной ДНК мыши (линия C57BL/6J) в качестве внешнего стандарта и оценивали по числу копий кДНК на 100 копий кДНК РНК полимеразы II, -актина или глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, используемых в качестве внутреннего стандарта (Науменко, Куликов, 2006; Naumenko et al., 2008).

Уровни 5-НТ и 5-ГИУК оценивались при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Активность ТПГ-2 определяли в экстрактах среднего мозга посредством реакции гидроксилирования триптофана, переводе образовавшегося 5-гидрокситриптофана в серотонин и измерении его концентрации методом ВЭЖХ. Активность ТПГ-2 выражали в нанограммах 5-гидрокситриптофана на миллиграмм общего белка на минуту (нг/мг/мин).

Статистический анализ данных.

Результаты были представлены как m ± SEM и сравнивались с использованием однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным множественным сравнением по Фишеру.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора у мышей различных линий

Сравнение уровня экспрессии гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре мышей линий AKR, CBA, ASC, AKR.CBAD13Mit76C, C57Bl/6, Balb/c, DBA2 и ICR показало существенные межлинейные различия (F6,36 = 5.67; p<0.0001; рис. 1). Так, экспрессия 5-НТ2А рецептора у мышей AKR примерно вдвое выше, чем у мышей линий DBA, CBA, ASC и AKR.CBAD13Mit76C, и втрое выше, чем у мышей C57Bl/6, Balb/c и ICR. Интересно, что мыши DBA2, отличающиеся от других мышей резко пониженным престимульным ингибированием реакции вздрагивания и рассматривающиеся как модель шизофрении (O'Neill et al., 2003; Popova et al., 2009), имеют относительно низкий уровень экспрессии 5-НТ2А рецепторов по сравнению с мышами AKR.

Рис. 1. Экспрессия гена, кодирующего 5-НТ2А рецептор, во фронтальной коре мышей различных линий. Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК -актина. n6. ***p<0,001 по сравнению с мышами AKR; ###p<0,001 по сравнению с мышами Balb/c, C57Bl/6 и ICR.

Одновременно с этим, уровень мРНК 5-НТ2А рецептора у мышей DBA2 близок к таковому у мышей каталептических линий, но превышает уровни мРНК у мышей линий Balb/c, C57Bl/6 и ICR. В целом, полученные нами результаты хорошо согласуются с литературными данными о межлинейных различиях в экспрессии 5-НТ2А рецептора (Naumenko et al., 2010) и наглядно показывают связь 5-НТ2А рецепторов с патологическими состояниями. Проявление каталепсии, депрессивно-подобного поведения и черт свойственных шизофрении сопровождается снижением экспрессии гена, кодирующего 5-НТ2А рецептор. Интересен тот факт, что мыши конгенной линии AKR.CBAD13Mit76C, у которых фрагмент 13 хромосомы был перенесён от мышей линии СВА в геном мышей линии AKR, демонстрируют существенное снижение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора. В перенесённом фрагменте находится ген, кодирующий 5-НТ1А рецептор. Известно, что мыши-каталептики, включая конгенную линию, имеют существенно более высокую функциональную активность 5-НТ1А рецепторов, нежели мыши AKR (Naumenko et al., 2010). Возможно, чрезмерная активность одного подтипа рецепторов ведёт к подавлению другого подтипа, что отражает реципрокное взаимодействие между 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторами. Что касается мышей линии DBA2, то наблюдаемое нами снижение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора хорошо согласуется с данными о снижении плотности и уровня мРНК 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре больных шизофренией (Gurevich, Joyce, 1997; Hernandez, Sokolov, 2000; Matsumoto et al., 2005).

Эффект хронической активации 5-НТ2А рецепторов на состояние серотониновой системы мозга и поведение. Взаимодействие 5-НТ2А рецепторов с ключевыми генами 5-НТ системы

Хроническое введение агониста DOI мышам линии AKR привело к заметному снижению функциональной активности 5-НТ2А рецепторов, что характерным образом проявилось в уменьшении числа встряхиваний головой в ответ на острое введение DOI (F1,22 = 11.5; p<0.01; рис. 2А). Подобный эффект хорошо согласуется с литературными данными (Green, Heal, 1985). Однако, снижение функциональной активности рецепторов не сопровождалось изменениями в экспрессии кодирующего их гена (рис. 2Б). Введение

Рис. 2. Влияние хронического введения DOI (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на функциональную активность 5-НТ2А рецепторов (А) и экспрессию кодирующего их гена (Б). Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n11. **p<0.01.

DOI не повлияло на экспрессию гена 5-НТ2А рецептора во всех исследованных структурах мозга, и изменение функциональной активности рецепторов обусловлено посттрансляционными механизмами регуляции.

Неожиданным результатом было то, что хроническое введение DOI привело к значительным изменениям экспрессии гена ключевого фермента биосинтеза серотонина – ТПГ-2. Существенное повышение уровня мРНК ТПГ-2 было обнаружено в среднем мозге мышей, подвергавшихся хроническому введению DOI (F1,20=5.2; p<0.05; рис. 3А). Соответствующие изменения найдены и при исследовании активности ТПГ-2: активность фермента была выше в среднем мозге мышей, получавших инъекции DOI, по сравнению с мышами контрольной группы (F1,19 = 5.6; p<0.05; рис. 3Б).

Изменения экспрессии и ферментативной активности ТПГ-2 сопровождалось резким увеличением уровня 5-НТ в среднем мозге (F1,19 = 9.6; p<0.01) без существенных изменений в уровне основного метаболита 5-ГИУК (F1,19 = 0.11; p>0.05). Достоверных изменений в уровне 5-НТ и 5-ГИУК в гиппокампе и фронтальной коре обнаружено не было (рис. 4А). В тоже время, не было выявлено каких-либо различий в соотношении

Рис 3. Влияние хронического введения DOI (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на экспрессию гена, кодирующего ТПГ-2 (А), и активность ТПГ-2 (Б) в среднем мозге. n10. ** p<0.01, *p<0.05.

Рис. 4. Влияние хронического введения DOI (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на уровни 5-HT и его основного метаболита 5-ГИУК (А) и соотношение 5-ГИУК к 5-НТ (Б). n10. **p<0.01.

Рис. 5. Влияние хронического введения DOI (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на экспрессию гена, кодирующего 5-НТТ в среднем мозге. Число копий кДНК 5-HTT отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n11. *p<0.05.

5-ГИУК/5-НТ во всех исследованных структурах мозга (рис. 4Б). Таким образом, хроническая активация 5-НТ2А рецепторов вызвала усиление экспрессии гена ТПГ-2, активности самого фермента и, как следствие, усилило синтез серотонина в среднем мозге, что говорит об активации всей 5-НТ системы.

Нами также обнаружено снижение уровня мРНК гена 5-НТТ в среднем мозге мышей, подвергавшихся хроническому введению DOI, по сравнению с мышами контрольной группы (F1,19 = 6.8, p<0.05; рис. 5). Снижение экспрессии гена 5-НТТ демонстрирует синергический эффект активации 5-НТ системы, когда экспрессия 5-НТТ, по механизму обратной связи, снижается, что усиливает накопление медиатора в синаптической щели. Вероятно, в отличии от ТПГ-2, активность основного фермента катаболизма серотонина, моноаминоксидазы А, не изменилась, поэтому не произошло роста концентрации 5-ГИУК и изменения индекса катаболизма.

Рис. 6. Влияние хронического введения DOI (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на экспрессию гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор. Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n11.

Нами не выявлено изменений в экспрессии гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор, в среднем мозге, гиппокампе и фронтальной коре подопытных животных (рис. 6). Не смотря на то, что уровень мРНК 5-НТ1А рецепторов у мышей линии AKR не отклоняется от нормы, чувствительность рецепторов является довольно низкой (Naumenko et al., 2010). Вероятно, недостаточная чувствительность 5-НТ1А рецепторов и, как результат, слабая обратная связь «рецептор-ген», послужили причиной отсутствия изменений в уровне мРНК.

Ожидалось, что хроническая активация 5-НТ2А рецепторов вызовет существенные изменения в поведении подопытных животных, однако проведённые поведенческие тесты дали противоположные результаты. Единственный поведенческий параметр, который достоверно изменился, это число выглядываний из закрытого рукава в тесте поднятого крестообразного лабиринта. Увеличение числа выглядываний у животных, получавших DOI, можно было бы интерпретировать как анксиолитический эффект препарата, но данный параметр не информативен в отрыве от остальных исследованных параметров, которые свидетельствуют об отсутствии каких-либо сдвигов в поведении животных. Можно заключить, что отсутствие существенных сдвигов в поведении подопытных животных является результатом сильного компенсаторного ответа 5-НТ системы.

Таким образом, можно сделать вывод, что хроническая активация 5-НТ2А рецепторов приводит к активации серотониновой системы мозга, включая изменение транскрипции её ключевых генов. Ранее уже обсуждалась модель ауторегуляции 5-НТ системы посредством 5-НТ2А рецепторов (Sharp et al., 2007), в соответствии с которой они обладают ингибирующим воздействием. На первый взгляд, полученные нами данные противоречат указанной модели. Однако противоречие снимается, если допустить, что повторяющееся ингибирующее воздействие 5-НТ2А рецепторов в конечном итоге привело к компенсаторному ответу системы, выраженному в активации экспрессии и активности фермента ТПГ-2, повышению синтеза серотонина и уменьшению обратного захвата нейромедиатора из синаптической щели.

Функциональное взаимодействие 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторов мы исследовали в модели хронической активации 5-НТ1А рецепторов у мышей линии СВА. Хроническое введение селективного агониста 5-НТ1А рецепторов 8-ОН-DPAT ожидаемо вызвало десенситизацию рецепторов. Это выразилось в троекратном снижении гипотермической реакции в ответ на острое введения 8-ОН-DPAT у мышей опытной группы (F1,18=19.4, P<0.001; рис. 7А). Однако какого-либо эффекта на функциональную активность 5-НТ2А

Рис 7. Влияние хронического введения 8-ОН-DPAT (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на функциональную активность 5-НТ1А (А) и 5-НТ2А (Б) рецепторов. n8.***p<0,001.

рецепторов выявлено не было (рис. 7Б). Стоит отметить, что мыши линии СВА имеют высокую чувствительность 5-НТ1А рецепторов и существенно более низкую чувствительность 5-НТ2А рецепторов. Вероятно, по этой причине не проявился эффект на функциональную активность 5-НТ2А рецепторов.

В среднем мозге мышей, получавших 8-OH-DPAT, выявлено существенное снижение экспрессии гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор (F1,16=5.3, P<0.05; рис. 8). Данный эффект объясняется тем, что хроническая активация 5-НТ1А рецепторов запускает механизм обратной связи, результатом чего становится усиление экспрессии сайленсера Freud-1, подавляющего экспрессию рецепторов (Науменко и др., 2010). Тот факт, что в гиппокампе и фронтальной коре не наблюдалось изменений экспрессии гена 5-НТ1А рецептора, говорит о том, что компенсаторные изменения в результате хронической активации затрагивают в первую очередь 5-НТ1А ауторецепторы ядер шва среднего мозга. Это вполне естественно, с учётом большого ауторегуляторного потенциала, которым обладают соматодендрические 5-НТ1А рецепторы ядер шва.

Рис. 8. Влияние хронического введения 8-ОН-DPAT (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на экспрессию гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор. Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n8. *p<0.05.

Чрезвычайно интересно то, что нами выявлено двукратное снижение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре мышей опытной группы (F1,16=10; P<0.01; рис. 9). Подобной картины не наблюдалось в среднем мозге, хотя в гиппокампе прослеживается тенденция к понижению экспрессии (F1,13=3.7; P<0.08; рис. 9). Таким образом, активация 5-НТ1А рецепторов, привела к снижению экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов. Известно, что острое введение DOI подавляет выраженность каталепсии у

Рис. 9. Влияние хронического введения 8-ОН-DPAT (14 дней, 1 мг/кг в.б.) на экспрессию гена, кодирующего 5-НТ2А рецептор. Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n8. **p<0.01.

мышей СВА, ассоциированной, по-видимому, с 5-НТ1А рецептором (Naumenko et al., 2010). Поученные нами данные по экспрессии, вместе с вышеуказанными антикаталептическим действием 5-НТ2А рецепторов, говорит о существовании сильных реципрокных взаимодействия между 1А и 2А подтипами рецепторов.

Достаточно интересным является то, что хроническая активация 5-НТ1А рецепторов привела к значимому снижению экспресс гена ТПГ-2 в среднем мозге (F1.16=6.9, P<0.05; рис. 10А). Однако, это не сопровождалось достоверными изменениями в экспрессии транспортёра серотонина (F1.17=1.8; P>0,05; рис. 10Б). Хорошо известно, что острая активация 5-НТ1А рецепторов приводит к ингибированию секреции серотонина (Sharp et al., 2007). Теперь же мы можем убедиться, что при хронической активации 5-НТ1А рецепторов ингибирующее воздействие становится более существенным,

направленным на центральное звено 5-НТ системы.

Рис. 10. Экспрессия генов, кодирующих ТПГ-2 (А) и 5-НТТ (Б) в среднем мозге мышей подвергавшихся хроническому введению 8-OH-DPAT (14 дней, 1 мг/кг в.б.). Число копий кДНК ТПГ-2 и 5-НТТ отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n8. *p<0.05.

Две разные модели хронической активации рецепторов продемонстрировали два разнонаправленных по своей сути эффекта на 5-НТ систему. Если для 5-НТ1А рецепторов характерно ингибирующее воздействие, то 5-НТ2А рецепторы оказывают явно активирующий эффект, который оказалось возможным обнаружить лишь при хронической активации. В обоих случаях мы можем наблюдать сильные гетерологические взаимодействия 5-НТ2А рецепторов как с 5-НТ1А рецепторами, так и с другими компонентами серотониновой системы.

Участие 5-НТ2А рецепторов в механизмах действия нейротрофических факторов

Центральное введение BDNF осуществляли мышам двух линий, - «депрессивной» ASC и «недепрессивной» СВА. BDNF оказал существенный эффект на функциональную активность 5-НТ2А рецепторов (F1,40 = 6.7; p<0.05; рис. 11А). Однако апостериорное сравнение по Фишеру показало повышение (p<0.05) функциональной активности у мышей ASC, но не у СВА (p>0.05). Апостериорное сравнение также показало, что внутрижелудочковая инъекция BDNF приводит к устойчивому повышению экспрессии гена 5-НТ2А рецептора спустя три недели после инъекции (рис. 11Б). Двухфакторный дисперсионный анализ выявил значительное взаимодействия факторов BDNFлиния (F1,37 = 10.7; p<0.01) в гиппокампе, существенный эффект линии (F1,38 = 101.5; p<0.001) и введения BDNF (F1,38 = 8.6; p<0,001). Вместе с этим, не выявлено взаимодействия факторов BDNFлиния (F1,38 = 1.4; p > 0.05) во фронтальной коре и среднем мозге (F1,37 = 0.4; p>0.05), и эффекта введения BDNF в тех же структурах (F1,38 = 1.3; p>0.05 и F1,37 = 0.1; p>0.05 соответственно.Однако выявлен эффект линии (F1,38 = 21.1; p< 0.001) на экспрессию гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре, показывающий существенно больший уровень мРНК рецептора у мышей линии ASC. Интересным результатом является то, что изменение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора у мышей ASC сопровождалось ростом функциональной активности 5-НТ2А рецепторов.

Рис. 11. Влияние BDNF на функциональную активность (А) и экспрессию гена (Б) 5-НТ2А рецептора в структурах мозга мышей ASC и CBA. Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК rPol II. n11, *p<0.05 по сравнению с контролем ASC; n8,***p<0.001 по сравнению с контролем ASC; ###p<0.001 по сравнению с контролем CBA.

Через три недели после инъекции BDNF у мышей ASC и СВА наблюдалось значительное снижение продолжительности каталепсии (F1,40 = 18.2; p<0.001; рис. 12А). У мышей ASC время неподвижности сократилось в 2,5 раза (с 63.7 ± 11.6 сек. до 22.3 ± 5.0

Рис. 12. Влияние BDNF на каталепсию (А) и депрессивно-подобное поведение в тесте подвешивания за хвост (Б) мышей линий ASC и CBA. n11**p<0.01; *p<0.05.

сек.; p<0.001), а у мышей СВА вдвое (65.5 ± 9.4 сек. до 37.5 ± 6.2 сек.; p<0.05). Также инъекция BDNF привела к сокращению времени неподвижности в тесте подвешивания за хвост у мышей линии ASC (c 176.1 ± 14.8 cек. до 143.0 ± 10.8 сек.; p<0.05) но не у мышей линии СВА (рис. 12Б). Двухфакторный дисперсионный анализ показал значительный эффект линии (F1,40 = 26.9; p<0.001) и взаимодействия BDNFлиния (F1,40 = 5.2; p<0.05).

Таким образом, BDNF увеличил экспрессию и функциональную активность 5-НТ2А рецепторов и проявил отчётливые антидепрессантные свойства, наблюдавшиеся через продолжительное время после инъекции. Причём, мыши «депрессивной» линии ASC оказались более чувствительны к действию BDNF, чем мыши «недепрессивной» линии СВА. Известно, что после курса лечения антидепрессантами в гиппокампе восстанавливается сниженный уровень 5-НТ2А рецепторов (Zanardi et al., 2001; Bhagwagar et al., 2006), поэтому наблюдавшиеся нами повышение функциональной активности и экспрессии 5-НТ2А рецепторов по-видимому являются частью антидепрессантного эффекта BDNF. Выраженные межлинейные различия в экспрессии 5-НТ2А рецептора, вероятно, могут играть существенную роль в проявлении антидепрессантных свойств BDNF.

Так же как и BDNF, центральное введение GDNF осуществляли мышами линий ASС и СВА. Двухфакторный дисперсионный анализ выявил эффект препарата (F1,34=9.8; p<0.01) но не линии (F1,34=3.1; p>0.05) или взаимодействия этих факторов (F1,34=0.02; p>0.05) на время каталептического замирания. Апостериорное сравнение показало, что внутрижелудочковое введение GDNF привело к значительному снижению каталептического замирания как у мышей ASC, так и у мышей СВА (p<0.05 для обеих

Рис. 13. Влияние GDNF на каталепсию (А) и депрессивно-подобное поведение в Тесте подвешивания за хвост (Б) мышей линий ASC и CBA. n8 **p<0.01; *p<0.05; ###p<0.001 по сравнению с контролем CBA.

линий; рис. 13А). GDNF повысил время неподвижности в тесте подвешивания за хвост у мышей СВА, демонстрируя усиление выраженности депрессивно-подобных черт. В тесте подвешивания за хвост показаны эффект линии (F1,33=20.8; p<0.001) и взаимодействия GDNFлиния (F1,33=6.8; p<0.05). Время неподвижности было повышено у мышей СВА (p<0.01) но не у мышей ASC (p>0.05; рис. 13Б). Следует отметить, что у мышей ASC из контрольной группы время неподвижности значительно выше по сравнению с контрольной группой мышей СВА (p<0.001), что демонстрирует более выраженные депрессивно-подобные черты у мышей ASC.

Внутрижелудочковое введение GDNF не оказало какого-либо значительного эффекта на функциональную активность 5-НТ2А рецепторов (рис. 14А). В то же время были обнаружены существенные изменения в экспрессии гена 5-НТ2А рецептора (рис. 14Б). Двухфакторный дисперсионный анализ показал эффект линии (F1,30=108.1; p<0.001), GDNF (F1,29=12.4; p<0.01) и взаимодействия GDNFлиния (F1,29=14.1; p<0.001) во фронтальной коре; эффект линии (F1,31=16.1; p<0.001) и GDNF (F1,31=5.2; p<0.05) в гиппокампе.

Рис. 14. Влияние GDNF на функциональную активность (А) и экспрессию гена (Б) 5-НТ2А рецептора в структурах мозга мышей ASC и CBA. Число копий кДНК рецептора отнесено на 100 копий кДНК ГФД. n7. *p<0.05 по сравнению с контролем ASC; ***p<0.001 по сравнению с контролем ASC; ###p<0.001 по сравнению с контролем СВА.

Сравнивая эффекты BDNF и GDNF, можно сделать вывод, что оба нейротрофических фактора обладают достаточно сильным антидепрессантным потенциалом. Мыши ASC, с выраженным депрессивно-подобным поведением, проявляют повышенную чувствительность к обоим нейротрофическим факторам. Тот факт, что BDNF повысил экспрессию 5-НТ2А рецепторов в гиппокампе, а GDNF во фронтальной коре, связан, в первую очередь с особенностями биологии самих нейротрофических факторов, и различной представленностью в структурах мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами впервые показано, что хроническая активация 5-НТ2А рецепторов приводит к активации 5-НТ системы мозга, что выражается в увеличении экспрессии и ферментативной активности ТПГ-2, и усилении секреции серотонина в среднем мозге. Установлены сильные реципрокные взаимодействия между 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторами, реализующиеся на уровне транскрипции генов, кодирующих рецепторы. Впервые показано, что центральное ведение нейротрофических факторов BDNF и GDNF приводит к изменениям функциональной активности и экспрессии 5-НТ2А рецепторов. В свете полученных данных, существенно возрастает значимость 5-НТ2А рецепторов в механизмах ауторегуляции и пластичности 5-НТ системы мозга.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены существенные различия в уровне мРНК гена, кодирующего 5-НТ2А рецептор во фронтальной коре мышей, различающихся по активности 5-НТ системы. Уровень мРНК 5-НТ2А рецептора у мышей линий ASC, CBA, AKR.CBAD13Mit76C и DBA2, являющихся моделями нарушений поведения, существенно снижен по сравнению с линией AKR;
2. Хроническая активация 5-НТ2А рецепторов привела к повышению экспрессии гена и усилению активности фермента ТПГ-2, сопровождавшихся повышением уровня 5-НТ в среднем мозге, что свидетельствует об активации 5-НТ системы мозга. Снижение уровня мРНК гена 5-НТТ демонстрирует синергический эффект между генами ТПГ-2 и 5-НТТ в процессе активации 5-НТ системы;
3. Длительная активация 5-НТ2А рецепторов агонистом не сопровождалось значительными изменениями в поведении подопытных животных;
4. В результате хронической активации 5-НТ1А рецепторов существенно снизился уровень мРНК гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре мышей линии СВА, что демонстрирует реципрокные взаимодействия между двумя подтипами рецепторов;
5. Внутрижелудочковое введение BDNF снизило выраженность депрессивно-подобного поведения у мышей линии ASC, снизив время каталептического замирания и время неподвижности в тесте подвешивания за хвост;
6. У мышей линии ASC с генетической предрасположенностью к депрессивно-подобному поведению введение BDNF вызвал усиление функциональной активности 5-НТ2А рецепторов и экспрессии кодирующего их гена в гиппокампе;
7. Внутрижелудочковое введение GDNF снизило выраженность каталепсии у мышей линий ASC и СВА, однако усилило депрессивно-подобные черты у мышей СВА, что выразилось в увеличении времени неподвижности в тесте подвешивания за хвост;
8. У мышей линии ASC введение GDNF вызвало существенное повышение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре и снижение экспрессии в гиппокампе. В то же время введение GDNF не вызвало изменений в экспрессии гена 5-НТ2А рецептора у мышей линии СВА.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Науменко В.С., Цыбко А.С., Базовкина Д.В., Попова Н.К. Участие 5-НТ2А рецепторов в генетических механизмах ауторегуляции серотониновой системы мозга // Мол Биол. 2012. Т.46(3). С.416–422.
2. Popova N.K., Naumenko V.S., Cybko A.S., Bazovkina D.V. Receptor-genes cross-talk: effect of chronic 5-HT1A agonist 8-OH-DPAT treatment on the expression of key genes in brain serotonin system and on behavior // Neuroscience. 2010. V.169(1). P.229-235.
3. Naumenko V.S, Kondaurova E.M, Bazovkina D.V, Tsybko A.S, Tikhonova M.A, Kulikov A.V, Popova N.K. Effect of brain-derived neurotrophic factor on behavior and key members of the brain serotonin system in genetically predisposed to behavioral disorders mouse strains // Neuroscience. 2012. V.214. P.59-67.
4. Naumenko V.S., Bazovkina D.V., Semenova A.A., Tsybko A.S., Il’chibaeva T.V., Kondaurova E.M., Popova N.K. Effect of GDNF on behavior and key members of the brain serotonin system in genetically predisposed to behavioral disorders mouse strains // J. Neurosci. Res. 2013. V.91(12). P.1628-1638.

Подписано к печати 13.11.2013

Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 110 экз. Заказ № 67

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН

630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10