Влияние острого стресса и липополисахарида на серотониновую систему мозга и поведение мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии

На правах рукописи

БАЖЕНОВА

Екатерина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО СТРЕССА И ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НА СЕРОТОНИНОВУЮ СИСТЕМУ МОЗГА И ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НАСЛЕДСТВЕННОЙ КАТАЛЕПСИИ

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2013

Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт цитологии и генетики» СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Куликов Александр Викторович

ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

заведующая лабораторией

Идова Галина Вениаминовна

ФГБУ НИИ физиологии и фундаментальной

медицины СО РАМН

г. Новосибирск

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник

Алехина Татьяна Алексеевна

ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет

им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита диссертации состоится ______________________ 2013 г. в________ на заседании

диссертационного совета Д 001.014.01 при ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН по адресу: г. Новосибирск, ул. акад. Тимакова, 4.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 630117, г. Новосибирск, а.я. 237, ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН, диссертационный совет. Телефакс 383-3359556, эл. почта [email protected]. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН.

Автореферат разослан «__» __________2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время исследование взаимодействия между серотонином мозга (5-гидрокситриптамин, 5-HT), гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой (ГГНС) и иммунной системой в механизме психопатологии является важной проблемой в психонейроиммунологии. Существует большое количество доказательств взаимодействия между этими системами (Weigent, Blalock, 1995; Dunn et al., 2005; Uhlig, Kallus, 2005; Ziemssen, Kern, 2007). Психические расстройства часто сопровождаются нарушениями в иммунной системе (Perry, 2004; Zunszain et al., 2011; Onore et al., 2012), в то время как стрессы, воспаление и активация иммунной системы увеличивают риск развития психопатологии (Porter et al., 2004; Irwin, Miller, 2007; Anisman et al., 2008; Miller, 2010; Kelley, Dantzer, 2011; Leonard, Maes, 2012).

Для активации неспецифического иммунитета наиболее часто применяют введение бактериального эндотоксина (липополисахарид, ЛПС) (Kent et al., 1992; Dunn, 1992; Anisman et al., 2008). Введение ЛПС приводит к увеличению концентраций IL-1, IL-6 и TNF-. Именно IL-1, IL-6 и TNF- вызывают болезненное состояние (sickness) и депрессивноподобное поведение: гипертермию, гипокинезию, гипофагию, гипералгезию, сниженный интерес к исследованию окружающей среды, снижение либидо, увеличение времени сна, снижение мотивации и когнитивных функций (Kent et al., 1992; Dantzer et al., 2001; Larson, Dunn, 2001). ЛПС также активирует 5-HT систему мозга (Dunn, Wang, 1995; Dunn, 2006), которая вовлечена в регуляцию многих форм поведения (Lucki, 1998; Popova, 2006).

Эмоциональный стресс является естественной и адаптивной реакцией млекопитающих на различные угрожающие стимулы внешней среды, например, на появление хищника. При опасности происходит изменение в поведении, активация ГГНС, секреция глюкокортикоидов, увеличение экспрессии генов раннего реагирования в нейронах мозга, изменение метаболизма моноаминов в мозге (Pacak, Palkovits, 2001). Важную роль в реакции на эмоциональный стресс играет 5-HT система мозга (Науменко, 1971; Chaouloff et al., 1999). Полагают, что именно стресс являться пусковым механизмом развития психопатологии у чувствительных к стрессу особей (Anisman et al., 2008).

Другой важной и актуальной проблемой современной физиологии является изучение взаимодействия генотипа с факторами окружающей среды в развитии тяжелых психических расстройств (De Maio et al., 2005; Caspi, Moffitt, 2006). Наиболее важными факторами являются эмоциональный стресс и активация иммунной системы, вызванная инфекций. Имеющиеся данные о влиянии эмоционального стресса и активации иммунной системы на метаболизм 5-HT в мозге были получены преимущественно на крысах (Tanaka et al., 1983; Kirby et al., 1997; Dunn, 2006; Mo et al., 2008). Однако эти авторы не исследовали вклад генетических факторов в реакции 5-HT системы мозга на стресс и введение ЛПС.

Каталепсия (животный гипноз, мнимая смерть, тоническая неподвижность) – это состояние, при котором животное или человек не может совершать произвольные движения (впадают в ступор) и сохраняют приданную им неудобную позу в течение длительного времени (Dixon, 1998). В гипертрофированной форме каталепсия и кататония являются синдромами тяжелых нарушений нервной системы (Sanberg et al., 1988; Caroff et al., 2000; Lee, 2007, 2010; Weder et al., 2008; Daniels, 2009; Paparrigopoulos et al., 2009).

У мышей была выявлена так называемая «щипковая» каталепсия (pinch-induced catalepsy), которая вызывается щипками кожи животного в области загривка (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981). Были выявлены существенные межлинейные различия в предрасположенности к каталепсии (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Из 10 исследованных линий мышей высокая выраженность к каталепсии была обнаружена только у мышей линии CBA (54% каталептиков). Недавно была определена локализация главного гена предрасположенности к каталепсии в дистальном фрагменте хромосомы 13 (59-70 cM) мыши (Куликов и др., 2003; Kondaurova et al., 2006; Kulikov et al., 2008). В результате переноса данного фрагмента хромосомы 13 от каталептической линии CBA в геном некаталептической линии AKR была получена конгенная линия AKR.CBA-D13Mit76 (D13) (около 50% каталептиков).

Показано участие 5-HT системы мозга в регуляции наследственной каталепсии у мышей. Так, у мышей инбредной линии СВА, характеризующихся высокой генетической предрасположенностью к щипковой каталепсии, повышена активность ключевого фермента биосинтеза 5-НТ триптофангидроксилазы-2 (ТПГ-2) и снижена плотность 5-НТ2А серотониновых рецепторов в стриатуме (Kulikov et al., 1995; Popova, Kulikov, 1995). Введение ингибиторов ТПГ-2 снижало выраженность каталепсии у мышей (Popova, Kulikov, 1995).

Иммунная система также вовлечена в механизм наследственной каталепсии. У линии мышей ASC, полученной в результате селекции на высокую предрасположенность к каталепсии, обнаружена низкая способность животных отвечать на Т - зависимый антиген – эритроциты барана (Альперина и др., 2007). А недавно нашими коллегами было обнаружено, что введение ЛПС вызывает реакцию замирания у линий мышей DBA/2 и C57BL/6, которые являются устойчивыми к щипковой каталепсии (Базовкина, Куликов, 2009).

Следовательно, наследственная каталепсия является удобной моделью для изучения взаимодействия 5-HT, эндокринной и иммунной систем, а также роли генотипа и различных видов стресса в развитии нарушений нервной системы и поведения. Поэтому выяснение закономерностей влияния эмоционального стресса и активации иммунной системы на выраженность поведения и 5-НТ систему мозга мышей с наследственными различиями в предрасположенности к каталепсии, несомненно, является актуальным.

Целью данной работы являлось исследование ассоциации наследственной каталепсии с выраженностью поведения и метаболизма 5-HT мозга при воздействии острого эмоционального стресса и активации иммунной системы бактериальным липополисахаридом (ЛПС). В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность половой мотивации у самцов мышей некаталептической линии AKR и каталептических линий CBA и D13;
2. Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей некаталептической линии AKR и каталептических линий CBA и D13;
3. Сравнить влияние острого стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей линий AKR, CBA и D13;
4. Сравнить влияние острого стресса на экспрессию гена c-Fos в мозге у мышей линий AKR и D13;
5. Оценить влияние острого стресса на метаболизм 5-HT в мозге у мышей линий AKR, CBA и D13;
6. Изучить влияние ЛПС на выраженность каталепсии у мышей линий AKR, CBA и D13;
7. Оценить влияние ЛПС на метаболизм 5-HT в мозге у мышей линий AKR, CBA и D13.

Научная новизна. В настоящей работе впервые были получены доказательства ассоциации наследственной предрасположенности к каталепсии с вызванными эмоциональным стрессом и введением ЛПС изменениями в поведении и метаболизме 5-HT в мозге:

• Острый эмоциональный стресс (рестрикция) вызывал более выраженный каталептогенный эффект у мышей каталептических линий CBA и D13 по сравнению с некаталептической линией AKR.
• 5-HT система среднего мозга у мышей каталептических линий более чувствительна к эмоциональному стрессу по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии.
• Введение ЛПС вызывало более выраженный каталептогенный эффект у мышей каталептических линий CBA и D13 по сравнению с некаталептической линией AKR.
• 5-HT система среднего мозга и стриатума у мышей каталептических линий более чувствительна к ЛПС по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии.

Научно-практическая ценность. Основным вкладом данного исследования в изучении взаимодействия нервной, иммунной и эндокринной систем в механизме психопатологии является экспериментальное доказательство тесного взаимодействия 5-HT системы (нервная система), ЛПС (иммунная система) и эмоционального стресса (ГГНС) в механизме такого наследственного нарушения поведения как каталепсия. Была показана научно-практическая ценность наследственной каталепсии у мышей уникальной конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 (D13) как модели для изучения генетической предрасположенности к психопатологиям, ассоциированным со стрессом и нарушениями в иммунной системе. Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.

Положения, выносимые на защиту

1. Острый эмоциональный стресс усиливает выраженность наследственной каталепсии.
2. Усиление каталепсии, вызванное стрессом, сопровождается увеличением обмена 5-HT в среднем мозге у предрасположенных к каталепсии мышей.
3. ЛПС оказывает выраженный каталептогенный эффект. Интенсивность вызванной ЛПС каталепсии более выражена у мышей с наследственной предрасположенностью к каталепсии.
4. ЛПС усиливает метаболизм 5-HT в среднем мозге и стриатуме у предрасположенных к каталепсии мышей, но не у устойчивых к каталепсии животных.
5. Выявлена ассоциация между реакциями наследственной каталепсией на эмоциональный стресс и на введение ЛПС. Показана важная роль 5-HT системы мозга в механизме этой ассоциации.

Апробация работы. Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLVIII и XLIX Международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010, 2011), VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012), VIII International interdisciplinary congress «Neuroscience for Medicine and Psychology» (Sudak, 2012), International Summer School «Neurogenetics. Unraveling behaviorand brain mechanisms using modern technologies» (Zvenigorod, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных (2) и международных (2) журналах.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (307 источников). Работа изложена на 82 страницах, содержит 11 оригинальных рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В работе использовались мыши некаталептической линии AKR/J, каталептических линий СВА/Lac и AKR.CBA-D13Mit76 (D13). Линия D13 была получена переносом фрагмента хромосомы 13, сцепленным с геном каталепсии, из генома линии CBA в геном линии AKR (Kulikov et al., 2008). Линии мышей AKR, CBA и D13 поддерживается в Институте цитологии и генетики СО РАН инбридингом брат-сестра в течение 55, 55 и 20 поколений, соответственно.

Воздействия. Были проведены 2 экспериментальные серии. В первой серии в качестве острого эмоционального стресса использовали рестрикцию (1 час). Рестрикция представляет собой ограничение подвижности животного при помещении его в рестрикционный пенал (Buynitsky, Mostofsky, 2009). Контрольных животных в пеналы не помещали, а оставляли в домашних клетках. Первая экспериментальная серия состояла из 5 отдельных опытов. Так после окончания действия одночасовой рестрикции животных: 1) тестировали на половую мотивацию; 2) тестировали на каталепсию; 3) проводили забор крови для определения уровня кортикостерона; 4) декапитировали сразу для определения содержания 5-HT и его основного метаболита 5-ГИУК в мозге; 5) декапитировали через 1 ч для определения c-Fos эксперессии в мозге.

Во второй серии для активации неспецифического иммунного ответа использовали ЛПС. ЛПС (Escherichia coli 055:B5; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) разводили в физиологическом растворе и вводили лабораторным животным внутрибрюшинно в дозах 50 и 200 мкг/кг. Через 3 ч животных тестировали на каталепсию или декапитировали.

Тест «перегородка» проводился в клетке (29 x 15 x 10 см), разделенной на два отсека прозрачной перфорированной перегородкой, через которую могут происходить обонятельные и визуальные контакты между животными. За один день до теста самца помещали в один из отсеков экспериментальной клетки для адаптации животного к новым условиям содержания. После 5-минутной адаптации к условиям тестирования в течение 10 мин регистрировали спонтанную активность самца у перегородки с пустым отсеком. Затем в соседний отсек помещали рецептивную самку линии ICR (3-4 мес.) на 10 мин. Регистрировали время активного исследования самцом перегородки (основной показатель) и количество подходов к ней (дополнительный показатель, отражающий двигательную активность).

Для стимуляции эструса каждой самке вводили внутрибрюшинно 15 UI человеческого гонадотропина (Profasi, “Serono”, Италия), разведенного в физиологическом растворе, в объеме 0.15 мл за 1 сут до тестирования, рецептивность самки подтверждали вагинальным мазком в день теста.

Каталепсию измеряли по разработанной ранее в лаборатории нейрогенетики поведения Института цитологии и генетики СО РАН методике (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Животное вынимали из клетки и в течение 5-8 с мягко (чтобы не вызвать боли) сдавливали кожу загривка и помещали на разновысокие перекладины (карандаши), расположенные на высоте 60 см от поверхности стола. Расстояние между верхней и нижней перекладинами составляло 5 см, а угол - 45°. Затем мышь осторожно отпускали и измеряли время неподвижности (пока животное не начинало активно двигаться). Тест считался положительным, если период, в течение которого мышь сохраняла приданное ей неестественное положение, был не менее 20 с. Время ограничивали 120 с, после чего животное возвращали в клетку. Каждый из последовательных 10 тестов проводили с интервалом 1-2 мин. Животное, демонстрирующее 3 положительных теста из 10, рассматривалось как каталептик. Время замирания рассчитывали как среднее из трех максимальных значений, полученных в тестах.

Определение уровня кортикостерона. Кровь брали в пробирку, обработанную гепарином, центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин, отбирали плазму и хранили при температуре -24°C. Уровень кортикостерона определяли в разведенных образцах (1:30) с помощью набора ИФА Correlate-EIATM Corticosterone Enzyme Immunoassay Kit (Assay Designs Inc., USA) согласно инструкции производителя.

Экспрессию c-Fos гена определяли при помощи количественного метода ОТ-ПЦР (Kulikov, Naumenko et., 2005; Науменко, Куликов, 2006).

Содержание 5-HТ и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в мозге определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Kulikov et al., 2012). Образцы ткани взвешивали и гомогенизировали в буфере, содержащем 0.4 M HClO4, 0.27 мM EDTA, после чего гомогенат центрифугировали 5 минут на 15000 оборотов/мин при температуре 4°С, и супернатант в объеме 40 мкл наносили на колонку Nucleosil С18 (5 µm, 150мм2мм Penomenex, USA), используя электрохимический детектор (500 мВ, Сoulochem III; ESA, Inc., USA) c электрохимической ячейкой (BASInc, USA), с использованием насоса LC-20AD (Shimadzu Corporation, Japan). Мобильная фаза содержала КН2РО4, 100 мM, 0.1 мM Na2EDTA, 1.4 мM 1-октансульфоновой кислоты (Sigma, USA) и метанол (8% от объёма), pH=4,35. Скорость мобильной фазы составила 0,5 мл/мин.

Раствор внешнего стандарта содержал в 20 мкл 2 нг 5-HТ, 5-ГИУК. Высота пиков была оценена при помощи программы MultiChrom v.1.5 (Ampersand Ltd., Россия) и калибрована на соответствующий внешний стандарт. 5-HТ и 5-ГИУК были представлены в мг/г образца ткани. Интенсивность метаболизма 5-НТ оценивали по соотношению 5-ГИУК/5-HT.

Статистическая обработка результатов. Все полученные результаты представлены как М±m. Для анализа данных по параметрам половой мотивации использовали двухфакторный дисперсионный анализ для повторных измерений (Repeated measures ANOVA). Различия между отдельными группами оценивали с помощью с применением теста Ньюмана–Кеулса. Для всех остальных данных использовали двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим post-hoc-сравнение по Фишеру. Число животных-каталептиков сравнивали с помощью критерия 2. Различия считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность полового мотивационного поведения у самцов мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и CBA. Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,50=10,46, р<0,001), «стресс» (F1,50=7,02, р<0,01), «активация» (F1,50=80,01, р<0,001), взаимодействия (фактора активация х линия) (F2,50=5,81, р<0,01), и взаимодействия (активация х стресс) (F1,50=4,28, р<0,05) на число подходов к перегородке (Рис.1).

Острый эмоциональный стресс не влиял на число подходов к перегородке в отсутствии рецептивной самки у мышей исследуемых линий. У нестрессированных самцов мышей линий CBA и D13 присутствие рецептивной самки за перегородкой достоверно увеличивало число подходов к перегородке (р<0,01). Однако у нестрессированных самцов AKR присутствие рецептивной самки не вызывало увеличение числа подходов к перегородке (р>0,05). Родительские линии нестрессированных мышей были контрастны по числу подходов к перегородке при предъявлении рецептивной самки: у мышей каталептической линии CBA их было достоверно больше (р<0,001) по сравнению с некаталептической линией AKR. Конгенная линия D13 занимала промежуточное положение. В то же время, у стрессированных животных всех исследованных линий наличие рецептивной самки за перегородкой достоверно увеличивало число подходов к перегородке.

Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,50=2,60, р<0,001), «стресс» (F1,50=6,88, р<0,01), «активация» (F1,50=162,65, р<0,001) и взаимодействия (активация х линия) (F2,50=5,98, р<0,01) на время, проведенное самцом у перегородки (Рис.2).

Время пребывания самца у перегородки является основным показателем полового мотивационного поведения (Амстиславская, Храпова, 2002). Рестрикция достоверно снижала время пребывания самца у перегородки при предъявлении рецептивной самки только у каталептичекой линии CBA (р<0,05), но не у AKR и D13. Не было обнаружено достоверных различий между линиями нестрессированных и стрессированных мышей по времени у перегородки при пустом отсеке. Родительские линии нестрессированных мышей были контрастны по времени подходов к перегородке при предъявлении рецептивной самки: у линии CBA время подходов при предъявлении рецептивной самки было достоверно выше (р<0,001), чем у линии AKR. У конгенной линии D13 этот показатель был промежуточный и достоверно отличался как от родительской линии CBA (р<0,05), так и от родительской линии AKR (р=0,053). Примечательно, что у нестрессированных мышей линии AKR не происходило увеличение времени пребывания самца у перегородки по сравнению с пустым отсеком в отличие от CBA и D13.

Ранее нами были выявлены достоверные различия между интактными мышами родительской некаталептической линией AKR и каталептической конгенной D13 по времени у перегородки (Тихонова и др., 2010), а в настоящем исследовании мы наблюдали лишь тенденцию. Таким образом, перенос фрагмента 59-70 сМ хромосомы 13, ассоциированного с наследственной каталепсией, способствует улучшению проявления половой мотивации, которое снижено у родительской линии AKR. Было обнаружено угнетение половой мотивации у стрессированных мышей линии CBA, что согласуются с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории (Амстиславская, 2004, 2009). Однако рестрикция, по-видимому, не влияла на выраженность половой мотивации у самцов с преобладанием генотипа AKR (AKR и D13). В настоящее время наряду с данными об угнетающем влиянии стресса на половую систему самцов все больше накапливается сведений о зависимости этих изменений от генотипа (Chaouloff, 1999). В нашем исследовании мы подтвердили участие генотипа в механизме угнетающего влияния эмоционального стресса на половую мотивацию. В то же время, мы не обнаружили участия фрагмента хромосомы 13 мыши в механизмах снижения половой мотивации на острый эмоциональный стресс.

Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и CBA. В чрезмерно выраженной форме, каталепсия ассоциирована с тяжелыми неврологическими и психическими расстройствами. Механизм каталепсии и влияние стресса на ее развитие остаются неясными. Существует только несколько работ по влиянию стрессовых стимулов на проявление фармакологической каталепсии, однако они достаточно противоречивы (Bhattacharya, Ghosh, 1982; Antelman et al, 1991; Antelman et al, 1992). У мышей каталепсию можно вызвать с помощью щипков кожи загривка (щипковая каталепсия) (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981). Эта модель является весьма интересной, так как сам щипок представляет собой легкий эмоциональный стресс (Куликов и др., 1989). Если предположить, что генотип одних животных чувствителен к щипку, а у других нет, то можно считать, что животные с чувствительным генотипом к щипку более чувствительны к стрессу. Для проверки этой гипотезы, мы вводим другой эмоциональный стресс – рестрикцию - предшествующий щипковому стрессу.

После воздействия острого эмоционального стресса каталепсия была обнаружена у всех мышей каталептических линий D13(n=7) и CBA (n=9) и у 3 из 8 животных у некаталептической линии мышей AKR. Однако увеличение числа каталептиков у некаталептической линии мышей AKR было недостоверным (p>0,05).

Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,48=14,84, p<0,001), «стресс» (F1,48=14,9, p<0,001), но не взаимодействия (линия х стресс) (F2,48=1,72, p>0,05) на продолжительность каталепсии. Рестрикция увеличивала время неподвижности у всех трех исследованных линий, однако достоверное увеличение было обнаружено только у родительской каталептической линии CBA (p<0,01) (Рис.3).

Следовательно, каталептические линии, более чувствительны к стрессу. Таким образом, полученный результат подтверждает гипотезу о том, что наследственная каталепсия возникает в результате сочетания генетически детерминированной высокой чувствительности к стрессу и стрессора.

Рис.3. Влияние острого эмоционального стресса на время неподвижности у AKR, CBA и D13 линий.

** p< 0,01 по сравнению с контролем.

Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и CBA. Общеизвестно, что острый стресс активирует ГГНС. Эндокринным маркером активации ГГНС у мышей является увеличение уровня кортикостерона в плазме крови (Lanfumey et al., 2008).

Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,35=17,42, р<0,001), «стресс» (F1,35=275,82, р<0,001) и их взаимодействия (линия х стресс) (F2,35=13,71, р<0,001) на уровень кортикостерона (Рис.4).

По базальному уровню кортикостерона исследуемые линии достоверно не различались. Одночасовая рестрикция достоверно увеличивала уровень кортикостерона у всех трех линий (р<0,001). Родительские линии мышей различались по данному показателю: у линии CBA уровень кортикостерона был достоверно ниже (р<0,001), чем у линии AKR. У конгенной линии D13 этот показатель был промежуточный и достоверно отличался как от каталептической линии CBA (р<0,01), так и от некаталептической линии AKR (р<0,001).

Таким образом, фрагмент хромосомы 13, связанный с высокой предрасположенностью к каталепсии может быть вовлечен в регуляцию гормонального ответа на стресс.

Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень экспрессии гена c-Fos в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительской линии AKR. Разные виды стресса, в том числе острый эмоциональный стресс, активируют экспрессию гена раннего реагирования c-Fos в нейронах мозга (Morgan, Curran, 1991). Иными словами, увеличение экспрессии c-Fos гена можно рассматривать как нейрональный маркер стресса.

Выявлено влияние фактора «стресс» на уровень мРНК c-Fos в гипоталамусе (F1,24=17,31, р<0,001), коре (F1,24=5,81, р<0,05), среднем мозге (F1,24=14,14, р<0,001), гиппокампе (F1,24=4,32, р<0,05), миндалине (F1,24=6,86, р<0,05), и стриатуме (F1,24=5,83, р<0,05). Стресс увеличивал экспрессию гена c-Fos в гипоталамусе конгенной линии D13 (р<0,01) и AKR (р<0,05), а также в среднем мозге мышей D13 (р<0,05) и AKR (р<0,05) и только в коре у конгенной линии D13 (р<0,05) (Рис.5). В то же время, не выявлено влияния фактора «линия» (F1,24<1) и взаимодействия (линия х стресс) (F1,24<1) на экспрессию гена c-Fos ни в одной из этих структур.

В нашем исследовании рестрикция вызывала увеличение экспрессии c-Fos мРНК в гипоталамусе, коре, среднем мозге, что согласуется с литературными данными (Ceccatelli et al, 1989; Imaki et al,1992; Melia et al, 1994) и свидетельствует о том, что в нашем эксперименте рестрикция вызывает активацию данных структур мозга. В то же время, мы не обнаружили межлинейных различий по влиянию стресса на уровень экспрессии гена c-Fos в исследованных структурах мозга у мышей линии AKR и конгенной линии D13. Отсюда следует, что перенос дистального фрагмента хромосомы 13 в геном линии AKR не приводит к существенным изменениям реакции нейронов в исследованных структурах мозга на эмоциональный стресс, вызванный ограничением подвижности животного.

Сравнение действия острого эмоционального стресса на метаболизм 5-HT в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и CBA. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют, что эмоциональный стресс приводит к увеличению метаболизма 5-HT в мозге (Kirby et al., 1997; Tanaka et al., 1983; Mo et al., 2008). Однако влияние генотипа изучено не было.

Не выявлено влияние фактора «стресс» на уровень 5-HT в гиппокампе (F1,56<1), гипоталамусе (F1,39<1) и среднем мозге (F1,55<1). Влияние фактора «линия» на уровень 5-HT было обнаружено в гиппокампе (F2,56=5,03, р<0,01) и среднем мозге(F2,55=5,14, р<0,01). В покое уровень 5-HT в гиппокампе у конгенной линии D13 был ниже (р<0,05), чем у родительской линии CBA, и не отличался от уровня 5-HT у другой родительской линии AKR. При стрессе уровень 5-HT у каталептической линии CBA был достоверно выше (р<0,05), чем у некаталептической линии AKR. В среднем мозге у конгенной линии D13 уровень 5-HT при стрессе был ниже (р<0,01), чем у родительской линии CBA (Рис.6А).

Выявлено влияние фактора «стресс» на уровень 5-ГИУК только в среднем мозге (F1,55=4,85, р<0,05). Влияние фактора «линия» на уровень 5-ГИУК было обнаружено в гиппокампе (F2,56=4,61, р<0,05) и гипоталамусе (F2,39=3,32, р<0,05). В покое уровень 5-ГИУК в гиппокампе у линии CBA был выше (р<0,05), чем у линии AKR. В среднем мозге стресс достоверно увеличивал уровень 5-ГИУК только у каталептической линии CBA (Рис.6Б).

Не показано влияния факторов «стресс» (F1,56<1 и F1,39<1 в гиппокампе и гипоталамусе, соответственно), «линия» (F2,56<1 и F2,39<1 в гиппокампе и гипоталамусе, соответственно) и взаимодействия (линия х стресс) (F2,56<1 и F2,39<1 в гиппокампе и гипоталамусе, соответственно) на метаболизм 5-HT в гиппокампе и гипоталамусе. В то же время, выявлено существенное влияние факторов «стресс» (F1,55=12,67, р<0,001) и «линия» (F2,55=20,31, р<0,001), но не их взаимодействия (F2,55<1) на метаболизм 5-HT в среднем мозге. Рестрикция увеличивала метаболизм 5-HT в среднем мозге у каталептических мышей линий СВА (р<0,05) и D13(р<0,05), но не у некаталептической линии AKR. Как в покое, так и при стрессе метаболизм 5-HT был выше у конгенной линии по сравнению с мышами родительских линий СВА (р<0,001) и AKR (соответственно, р>0,01, р<0,001) (Рис.7).

Таким образом, фрагмент хромосомы 13 ассоциированный с наследственной каталепсией, вовлечен в регуляцию метаболизма 5-HT при остром эмоциональном стрессе.

Рис.7. Влияние острого стресса на метаболизм 5-HT (5-ГИУК/5-HТ) в гиппокампе, гипоталамусе и среднем мозге у линий мышей AKR, CBA и D13.

*p<0,05 по сравнению с контролем; @@p<0,01 по сравнению с AKR контроль; +++p<0,001 по сравнению с AKR стресс; ### p<0,001 по сравнению с CBA контроль;&&&p<0,001 по сравнению с CBA стресс.

Сравнение эффектов ЛПС на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и CBA. После введения физиологического раствора каталепсия была обнаружена у 1 животного из 10 у линии мышей AKR, 9 из 10 у конгенной линии D13 и 8 из 11 у CBA. ЛПС в дозе 50 мкг/кг вызывал каталепсию у 1 животного из 10 у линии мышей AKR и у всех мышей линий D13 (n=11) и CBA (n=8). При введении дозы 200 мкг/кг 8 из 11 оказались каталептиками у линии AKR, как и все животные линий D13 (n=9) и CBA (n=10).

Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,80=53,15, p<0,001), «ЛПС» (F2,80=14,9, p<0,001) и взаимодействия (линия х ЛПС) (F4,80=4,05, p<0,01) на продолжительность каталепсии. После введения физиологического раствора время неподвижности у мышей D13 и CBA было выше, чем у линии AKR (p<0,01). ЛПС в дозе 50 мкг/кг не оказывал влияние на время неподвижности у AKR, но значительно увеличивал его у мышей линии D13 (с 72,03 ± 11,43 сек контроль до 115,9 ± 2,31 сек ЛПС, p < 0,001) и у CBA мышей (с 46,18 ± 8,7 сек контроль до 96,25 ± 9,91 сек ЛПС, p < 0,001). ЛПС в дозе 200 мкг/кг ЛПС увеличивал время каталепсии у всех линий у AKR (p<0,01), D13 (p<0,05) и CBA (p<0,001) (Рис.8).

Рис.8. Эффект ЛПС (50 и 200 мкг/кг) на время неподвижности у мышей линий AKR, CBA и D13.

* p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001 по сравнению с контролем; ## p< 0,01, ### p< 0,001 по сравнению с AKR контролем; @@@ p< 0,001 по сравнению с животными линии AKR (ЛПС доза 50 мкг/кг); &&& p< 0,001 по сравнению с животными линии AKR (ЛПС доза 200 мкг/кг).

В данном исследовании мы показали участие иммунной системы в механизме щипковой каталепсии. ЛПС оказывал более выраженный каталептогенный эффект на мышей каталептических линий СВА и D13, чем на некаталептическую линию AKR. ЛПС доза 50 мкг/кг не способна вызвать каталепсию у AKR, но значительно увеличивает время замирания и процент каталептиков у мышей каталептических линий СВА и D13. Таким образом, этот результат указывает на ассоциацию между основным локусом каталепсии и каталептогенным эффектом ЛПС.

Сравнение эффектов ЛПС на метаболизм 5-HT в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и CBA. Не было выявлено влияние фактора «линия» на уровень 5-НТ в гиппокампе (F2,54<1) и среднем мозге (F2,54<1). В то же время было обнаружено влияние фактора «линия» на уровень 5-НТ в стриатуме (F2,54=3,46, р<0,05): уровень 5-НТ в этой структуре был выше у мышей линии AKR по сравнению с мышами линий СВА (р<0,05) и D13 (р <0,01). ЛПС снижал уровень 5-НТ в гиппокампе (F2,54=7,60, р<0,01) и стриаутме (F2,54=18,68, р<0,001), но увеличивал уровень 5-НТ в среднем мозге (F2,54=4,37, р<0,05). ЛПС в дозе 50 мкг/кг значительно снижал уровень 5-НТ в гиппокампе у мышей линий AKR (р<0,01) и D13 (р<0,05). В то же время ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно снижал уровень 5-НТ в стриатуме у всех мышей исследуемых линий. ЛПС в дозе 200 мкг/кг (р<0,05), но не 50 мг/кг увеличивал на уровень 5-НТ в среднем мозге у мышей линии СВА по сравнению с контрольными мышами. Тенденция к увеличению была обнаружена в конгенной линии мышей D13 при обеих дозах ЛПС (р=0,055 и р=0,054) (Рис. 9А).

Ни фактор «линия» (F2,54=2,03, р>0,05), ни фактор «ЛПС» (F2,54=3,10, р>0,05) не влияли на уровень 5-ГИУК в гиппокампе. У животных, которым вводили физиологический раствор, не было обнаружено никакой разницы в уровне 5-ГИУК в стриатуме (F2,54<1) или среднем мозге (F2,54=1,16, р>0,05). В то же время ЛПС значительно изменил уровень 5-ГИУК в этих структурах (F2,54=3,31, р<0,05 в стриатуме и F2,54=11,30, р<0,001 в среднем мозге). В то время как ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно снижал уровень 5-ГИУК в стриатуме у мышей линии AKR (р=0,02), обе дозы ЛПС значительно увеличивали уровень 5-ГИУК в среднем мозге у мышей линий СВА (р<0,01 при 50 мкг/кг и р<0,001 при 200 мкг/кг) и D13 (р<0,01) (Рис. 9Б).

ЛПС увеличивал метаболизм 5-HT (отношение 5-ГИУК/5-HT) в среднем мозге (F2,54=13,2, р<0,001), гиппокампе (F2,54=45,43, р <0,001) и стриатуме (F2,54=10,43, р<0,001). Обе дозы ЛПС значительно увеличивали метаболизм 5-HT в гиппокампе у всех трех линий (р<0,001). ЛПС в дозе 50 мкг/кг увеличивал метаболизм 5-НТ в среднем мозге только у каталептических линий CBA (р<0,001) и D13 (р<0,05). В то же время ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно увеличивал метаболизм 5-НТ в этой структуре у всех трех линий. Ни доза 50 мкг/кг ни доза 200 мкг/кг ЛПС не влияла на метаболизм 5-НТ в стриатуме у AKR. Однако ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно увеличила метаболизм 5-НТ в стриатуме у каталептических линий CBA (р<0,01) и D13 (р <0,05) (Рис.10).

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что ЛПС увеличивает метаболизм 5-HT в головном мозге крыс (Dunn, 1992; Dunn, Wang, 1995; Dunn et al., 1999; Lavicky, Dunn, 1995; Merali et al., 1997; Wang, Dunn, 1999). Однако другие авторы его не обнаружили (Kabiersch et al., 1988). У мышей влияние ЛПС на 5-HT систему мышей не так выражено и оно, по-видимому, зависит от генотипа линии: ЛПС увеличивал уровень L-триптофана и 5-ГИУК у мышей C3H/HeJ и C3H/HeN (Dunn, Chuluyan, 1994), но не оказывал влияние на метаболизм 5-HT у мышей линии BALB/c (Cho et al., 1999). Однако эти результаты получены разными авторами в различных условиях и, следовательно, не могут служить строгим доказательством влияния генотипа на реакцию 5-HT системы мозга на ЛПС.

Рис.10. Эффект ЛПС (50 и 200 мкг/кг) на метаболизм 5-HT (5-ГИУК/5-HT) в среднем мозге, гиппокампе, стриатуме у линий мышей AKR, CBA и D13.

*p< 0,05, **p<0,01, ***p<0,001 по сравнению с контролем.

Нами впервые приведены доказательства важной роли генотипа в регуляции реакции 5-HT системы мозга на стимуляцию неспецифической иммунной системы у мышей. Важным результатом исследования по влиянию ЛПС на 5-HT систему мозга было то, что в среднем мозге и стриатуме эффект ЛПС на метаболизм 5-HT зависел от генотипа линии: эффект был более выраженным у каталептических линий мышей, чем у некаталептической линии. В тоже время, в гиппокампе ЛПС увеличивал метаболизм 5-HT у всех исследуемых линий.

Важном отметить, что каталептические линии CBA и D13 отличаются от некаталептической линии AKR по реакции 5-HT системы в среднем мозге и стриатуме на эмоциональный стресс и ЛПС. Это не кажется неожиданным, так как в среднем мозге сосредоточены тела всех 5-HT нейронов, тогда как стриатум является ключевой структурой в регуляции движения и позы. Такая локализация изменений в метаболизме 5-HT при действии стресса или ЛПС является еще одним доказательством ассоциации наследственной каталепсии с чувствительностью 5-HT системы к острому эмоциональному стрессу и активации иммунной системы.

ВЫВОДЫ

1. Наследственная предрасположенность к щипковой каталепсии у мышей линий CBA и D13 ассоциирована с повышенной чувствительностью к эмоциональному стрессу, активации иммунной системы и с повышением метаболизма 5-HT в мозге.
2. Острый эмоциональный стресс не влияет на половую мотивацию самцов линий мышей AKR и D13, но подавляет ее у линии CBA.
3. Рестрикция вызывала более сильное увеличение уровня кортикостерона в плазме крови у линий AKR и D13 по сравнению с животными линии CBA.
4. Острый эмоциональный стресс значительно облегчает возникновение каталепсии у каталептических линий мышей СВА и D13, но не у животных некаталептической линии AKR.
5. Рестрикция увеличивает метаболизм 5-HT (отношение 5-ГИУК/5-HT) в среднем мозге у каталептических линий мышей СВА и D13, но не у некаталептической линии АКR.
6. Введение ЛПС значительно облегчает возникновение каталепсии у каталептических линий мышей СВА и D13 по сравнению с некаталептической линией AKR.
7. Введение ЛПС увеличивает метаболизм 5-HT (отношение 5-ГИУК/5-HT) в среднем мозге и стриатуме у линии мышей каталептических линий CBA и D13, но не у некаталептической линии АКR.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тихонова М.А., Баженова Е.Ю., Базовкина Д.В., Попова Н.К. Влияние хронического введения имипрамина на поведение мышей конгенных линий AKR и AKR.CBА-D13Mit76, различающихся дистальным фрагментом хромосомы 13 // ЖВНД. 2010. Т.60(5). С. 588-595.
2. Баженова Е.Ю., Куликов А.В., Тихонова М.А., Цыбко А.С., Попова Н.К. Влияние стресса на уровень кортикостерона, экспрессию гена с-Fos и обмен серотонина в мозге у мышей с генетической предрасположенногстью к каталепсии // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2012. Т.98(9). С. 1070-1078.
3. Tikhonova M.A., Kulikov A.V., Bazovkina D.V., Kulikova E.A., Tsybko A.S., Bazhenova E.Yu., Naumenko V.S., Akulov A.E., Moshkin M.P., Popova N.K. Hereditary catalepsy in mice is associated with the brain dysmorphology and altered stress response // Behav. Brain Res., 2013. V. 243. P. 53–60.
4. Bazhenova E.Yu., Kulikov A.V., Tikhonova M.A., Bazovkina D.V., Fursenko D.V., Popova N.K. On the association between lipopolysacharide induced catalepsy and serotonin metabolism in the brain of mice genetically different in the predisposition to catalepsy // Pharmacol. Biochem. Behav., 2013. V. 111. P. 71-75.
5. Баженова Е.Ю. Вклад дистального фрагмента хромосомы 13 в регуляцию чувствительности каталепсии, полового мотивационного и социального поведения к действию имипрамина у мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76. Материалы XLVIII Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2010, С. 19.
6. Баженова Е.Ю. Влияние острого эмоционального стресса на половую мотивацию и уровень моноаминов в мозге у мышей с высокой наследственной предрасположенностью к каталепсии. Материалы XLIX Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2011, С. 5.
7. Баженова Е.Ю., Тихонова М.А., Цыбко А.С., Куликов А.В. Влияние острого стресса на уровень кортикостерона в плазме крови, экспрессию гена с-Fos и на метаболизм серотонина в мозге у линий мышей AKR и AKR.CBA-D13Mit76, различающихся дистальным фрагментом хромосомы 13. Тезисы докладов VII Сибирского съезда физиологов, Красноярск, 2012, С. 29.
8. Bazhenova E.Yu., Tikhonova M.A, Tsybko A.S., Kulikov A.V. Effects of acute stress or endotoxin (LPS) on the 5-HT metabolism in the midbrain in the mice differing in high hereditary predisposition to catalepsy. International Summer School «Neurogenetics. Unraveling behaviorand brain mechanisms using modern technologies», Zvenigorod, 2012, P. 5.
9. Bazhenova E.Yu., Tikhonova M.A, Tsybko A.S., Kulikov A.V. Effects of acute stress on sexual motivation and the 5-HT metabolism in the brain in the mice with high hereditary predisposition to catalepsy. The VIII International interdisciplinary congress «Neuroscience for Medicine and Psychology», Sudak, Crimea, Ukraine, 2012, P. 72.