Морфофункциональное исследование взаимодействия вазопрессина и простагландинов в почке крыс вистар и вазопрессин дефицитных крыс браттлборо

На правах рукописи

БАБИНА

Алина Витальевна

Морфофункциональное исследование взаимодействия вазопрессина и простагландинов в почке КРЫС ВИСТАР И ВАЗОПРЕССИНДЕФИЦИТНЫХ КРЫС БРАТТЛБОРО

03.03.01 – Физиология,

03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2011

Работа выполнена на кафедре физиологии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Шестопалова Лидия Владимировна,

кандидат биологических наук,

доцент Лавриненко Валентина Александровна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Шмерлинг Михаил Давыдович,

НИИ физиологии СО РАМН, г. Новосибирск

доктор биологических наук,

доцент Соленов Евгений Иванович,

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт эволюционной физиологии и биохимии

им. И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «____»________________ 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при НИИ физиологии СО РАМН (630017, г. Новосибирск, ул. Ак. Тимакова, 4, тел. 8 (383) 335 97 54, email: [email protected])

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физиологии СО РАМН

Автореферат разослан «____»________________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нейрогипофизарный гормон вазопрессин (ВП) у млекопитающих является главным фактором, регулирующим реабсорбцию воды в почке путем повышения осмотической проницаемости эпителия собирательных трубок. В настоящее время принципиальная схема молекулярных событий, индуцируемых ВП в эпителии собирательных трубок, охарактеризована достаточно полно. Остается наименее изученным влияние гормона на состояние гликокаликса и межклеточного вещества, окружающего канальцы и сосуды, формирующие концентрирующий механизм. Эти внеклеточные структуры составляют дополнительный барьер для диффузии воды. Главным неструктурным компонентом межклеточного вещества внутренней мозговой зоны почки является гиалуронан (гиалуроновая кислота, НА), способный формировать гель с высоким сопротивлением току жидкости (Laurent et al., 1996). В настоящее время достаточно подробно изучено функционирование ферментов синтеза и катаболизма НА в разных тканях млекопитающих (Frost et al., 1997; Stern, 2004). Установлено, что существует корреляция между содержанием НА во внутреннем мозговом веществе почки с интенсивностью диуреза (положительная) и осмоляльностью мочи (отрицательная) (Gransson et al., 2002; Hansell et al., 2000).

Одним из наиболее существенных модуляторов клеточного эффекта ВП в осморегулирующем эпителии собирательных трубок почки млекопитающих является простагландин (ПГ) Е2 (Наточин и др., 2001; Harris and Breyer, 2001). Действие ПГ E2, вырабатываемого клеточными элементами почки, на водную проницаемость эпителия собирательных трубок зависит от типа рецепторов, путей трансдукции сигнала, а также от наличия ВП в крови животного (Hasler et al., 2006; Hatae et al., 2002; Hebert et al., 1993). Считается, что во внутреннем мозговом веществе почки ПГ Е2 может снижать эффект ВП различными путями: действуя на транслокацию AQP2, реабсорбцию осмотически активных веществ, кровоток в мозговом веществе почек и, следовательно, осмоляльность интерстициального пространства, что приводит к уменьшению осмотического градиента и снижает реабсорбцию воды.

Основными продуцентами ПГ Е2 в мозговом веществе почек являются медуллярные интерстициальные клетки (ИК). Показано, что при повышении осмоляльности интерстициального пространства (обезвоживание, высокосолевая диета) возрастает синтез ПГ Е2 (Hao et al., 2000; Harris and Breyer, 2001). Реномедуллярным ИК также приписывают роль основных продуцентов интерстициального НА (Hansell et al., 1999). Но несмотря на интенсивное изучение модулирующей роли ПГ в осуществлении разнообразных физиологических функций и особенно в модуляции эффекта ВП на проницаемость эпителия собирательных трубок, в литературе отсутствуют данные о влиянии ПГ Е2 на состояние интерстициального матрикса, окружающего элементы концентрирующего механизма. В доступной литературе крайне мало сведений о механизме взаимодействия ВП и ПГ Е2, связанном с диффузией воды через структуры интерстициального пространства, которое образовано клеточными элементами и высокомолекулярными гликозаминогликанами (ГАГ). Много работ посвящено изучению влияния нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), блокирующих синтез ПГ, на функционирование разных органов и тканей. Однако данные о влиянии блокаторов синтеза ПГ Е2 на ультраструктуру клеточных элементов внутреннего мозгового вещества почки, являющихся важным звеном в поддержании водно-солевого гомеостаза организма, единичны.

Целью исследования явилось выявление морфофункциональной основы реализации антидиуретического эффекта ВП на фоне подавления синтеза ПГ Е2 в почке крыс Вистар и крыс Браттлборо с наследственным дефектом синтеза ВП.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать влияние десмопрессина (dDAVP, селективного агониста V2 рецепторов ВП), а также блокады синтеза ПГ на показатели осмотического концентрирования у крыс Вистар и ВП-дефицитных крыс Браттлборо.

2. Изучить особенности ультраструктурных изменений эпителиоцитов собирательных трубок и интерстициальных клеток внутреннего мозгового вещества почки нормальных и вазопрессин-дефицитных крыс в условиях введения: 1) диклофенака; 2) dDAVP; 3) сочетанного действия диклофенака и dDAVP.

3. Провести гистохимическое исследование состояния интерсти-циального матрикса внутреннего мозгового вещества почки крыс Вистар и крыс Браттлборо в условиях введения: 1) диклофенака; 2) dDAVP; 3) сочетанного действия диклофенака и dDAVP.

4. Оценить активность -глюкуронидазы как одной из гормонзависимых лизосомальных гиалуронатгидролаз в почке крыс Вистар и Браттлборо в условиях действия диклофенака и dDAVP с использованием гистохимических методов.

Научная новизна

Впервые было проведено комплексное морфофункциональное исследование влияния блокады синтеза ПГ на проявление гидроосмотического эффекта агониста V2 рецепторов ВП (dDAVP) и ультраструктурные изменения клеточных элементов внутренней мозговой зоны, состояние интерстициального пространства и лизосомальных гиалуронатгидролаз в почке крыс Вистар с нормальным синтезом эндогенного ВП и ВП-дефицитных гомозиготных крыс Браттлборо.

Установлено, что блокада синтеза ПГ у гомозиготных крыс Браттлборо приводит к большему по сравнению с крысами Вистар увеличению осмоляльности мочи вследствие возрастания градиентов не только мочевины, но и натрия за счет устранения ингибирующего эффекта ПГ на реабсорбцию натрия и проницаемость для мочевины. Сочетанное введение диклофенака и dDAVP сопровождается преобладанием действия гормона: возрастание осмоляльности мочи у крыс Вистар и Браттлборо не отличается от данных, полученных при введении dDAVP.

Впервые было выявлено, что способность крыс к синтезу эндогенного ВП, несмотря на экспериментально созданный низкий уровень исходного осмотического концентрирования, оказывает значимое влияние на направленность морфофункциональных изменений эпителия и интерстициальных структур при блокаде синтеза ПГ и действия аналога ВП.

Показано, что при введении диклофенака, dDAVP, а также сочетанном действии препаратов в эпителии собирательных трубок возрастает количество клатриновых везикул, которые согласно литературным данным содержат аквапорины, и отмечается их примембранная локализация. В отличие от крыс Вистар для ВПдефицитных крыс Браттлборо характерно уплощение эпителия, по-видимому, вследствие нарастания осмоляльности внутриканальцевой жидкости и дегидратации клеток; а также расширение межклеточных промежутков, что может свидетельствовать об увеличении парацеллюлярного транспорта воды. Кроме того, у крыс Браттлборо в эпителии собирательных трубок выявлена активация процессов синтеза (уплощение цистерн пластинчатого комплекса, возрастание численной плотности полисом, накопление секреторных гранул в клетках).

Установлено, что у крыс Вистар в условиях действия диклофенака, dDAVP и сочетанного введения препаратов в средней трети внутреннего мозгового вещества почки появляются интерстициальные клетки 2 типа, участвующие в процессах деградации НА. Это сопровождается уменьшением гистохимически выявляемого НА в интерстиции при введении dDAVP и сочетанном введении dDAVP и диклофенака. Напротив, у крыс Браттлборо в условиях двухдневного действия диклофенака, dDAVP и сочетанного введения препаратов появляется гистохимически выявляемый НА.

Выявлено накопление гранул -глюкуронидазы в эпителиоцитах и интерстициальных клетках в условиях введения диклофенака. В условиях сочетанного действия блокады синтеза ПГ и агониста V2 рецепторов ВП локализация фермента в эпителиоцитах подобна реакции при введении dDAVP, в то время как реакция интерстициальных клеток аналогична действию диклофенака.

Практическая значимость

Проведенное исследование имеет фундаментальное значение, расширяющее представления о морфофункциональной реализации взаимодействия гормона и модуляторов его действия. Сведения о механизмах взаимодействия ВП и модуляторов его клеточного эффекта полезны для понимания механизмов патогенетических перестроек в почке, основном осморегулирующем органе, в условиях патологии.

Данные, полученные в ходе исследования, используются в курсе лекций и практических занятий по физиологии для студентов Новосибирского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Блокада синтеза ПГ на фоне сниженной (крысы Вистар) или отсутствующей (крысы Браттлборо) секреции эндогенного ВП приводит к нарастанию осмотического концентрирования вследствие увеличения реабсорбции натрия и повышения проницаемости эпителия собирательных трубок для мочевины. При действии агониста V2 рецепторов ВП на фоне блокады синтеза ПГ диклофенаком преобладает эффект гормона.

2. Блокада синтеза ПГ на фоне низкого уровня ВП в крови приводит к существенному изменению как структуры эпителиоцитов собирательных трубок внутреннего мозгового вещества почки, так и компонентов, формирующих интерстициальный барьер для движения воды. Морфофункциональные особенности реакции на агонист V2 рецепторов ВП, характерные для крыс Вистар и ВП-дефицитных крыс Браттлборо, сохраняются в условиях блокады синтеза ПГ.

3. Особенности функциональной и структурной реакции компонентов системы осмотического концентрирования в почке крыс обусловлены различным врожденным уровнем эндогенного ВП.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации были представлены на XV международном биологическом симпозиуме SymBioSE 2011 Switzerland (Швейцария, г. Базель, 2011 г.), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Калуга, 2010 г.), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (г. Санкт-Петербург, 2009 г.), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (г. Пермь, 2009 г.),VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), VI Сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008 г.), II съезде физиологов СНГ (Молдавия, г. Кишинев, 2008 г.), V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК.

Структура и объем диссертации

Содержание диссертации изложено на 221 странице печатного текста. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, главы результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, указателя цитируемой литературы, приложения. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 29 рисунками. Библиографический список включает 15 отечественных и 405 зарубежных источников.

Личный вклад автора

Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором.

Автор выражает искреннюю благодарность д.м.н., проф., академику РАН Ивановой Л.Н. за консультации и ценные рекомендации по работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные животные и воздействия

Эксперименты выполнены на половозрелых крысах Вистар и гомозиготных крысах линии Браттлборо с наследственным гипоталамическим несахарным диабетом, лишенных эндогенного ВП вследствие делеции гуанина в кодирующем гене. Гомозиготные крысы Браттлборо благодаря полному отсутствию эндогенного ВП, но наличию способности увеличивать эффективность осмотического концентрирования при введении экзогенного гормона или его аналогов являются адекватной моделью для изучения механизмов действия АДГ и его модуляторов.

В работе использованы крысы Браттлборо, выпивавшие за сутки объем воды, превышающий 50 % от массы тела, осмоляльность спонтанно отделяемой мочи у которых была менее 200 мОсм/кг Н2О, что характеризовало крыс Браттлборо как гомозигот. Для уравнивания исходного уровня ВП в крови с крысами Браттлборо контрольная группа крыс Вистар предварительно гидратировалась путем содержания на корме повышенной влажности.

Работа проведена с соблюдением «Правил работ с использованием экспериментальных животных» (прил. к приказу Мин. здрав. № 755 от 12.08.1977) и международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным.

Общий дизайн эксперимента приведен на рис. 1. По окончании экспериментального периода осуществляли декапитацию животных. Обе почки забирали для проведения морфофункционального исследования и определения содержания мочевины и электролитов в ткани.

Рис. 1. Дизайн эксперимента, проведенного для изучения действия ВП на фоне подавления синтеза ПГ в почке крыс, обладающих различной способностью к синтезу эндогенного ВП

Измерение осмоляльности мочи

В течение экспериментального периода дважды в сутки у животных собирали пробы мочи, в которых определяли концентрацию осмотически активных веществ криоскопическим методом на осмометре МТ-2 (НПП «Буревестник», Россия).

Определение кортико-медуллярных почечных градиентов

Для количественного определения содержания мочевины и катионов натрия в почечной ткани образцы сосочка, наружного мозгового вещества и коркового вещества высушивали до постоянной массы и экстрагировали в 1н растворе серной кислоты. Определение мочевины осуществляли диацетилмоноксимовым методом с использованием набора реактивов Мочевина-Витал (Витал Диагностикс, Россия) по прилагаемым протоколам. Содержание катионов натрия определяли методом фотометрии пламени на атомно-абсорбционном спектрофотометре Hitachi Z-8000 (Hitachi, Япония). Кортико-медуллярный градиент рассчитывали как отношение концентрации определяемого вещества в сосочке к концентрации этого вещества в корковом веществе почки.

Светооптическое изучение внутреннего мозгового вещества почки

Гистохимические исследования выполнены на уровне средней трети сосочка почки, содержащей структуры, ответственные за осмотическое концентрирование. Препараты изучали под микроскопом Axioscop 40 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении окуляра x16, объектива х100.

Для выявления -глюкуронидазы ткань фиксировали в растворе кальций-формола в течение 48 часов при 4°С и пропитывали холодным гипертоническим раствором гуммисахарозы в течение 5 недель. Срезы получали на микротом-криостате MICROM HM 525 (MICROM, Германия) при –20°С. Замороженные срезы окрашивали при +37°С методом одновременного азосочетания. В качестве субстрата использовали нафтол ASBIглюкуронид (Sigma, США).

Для гистохимического анализа НА ткань сосочка почки фиксировали в 10 % нейтральном формалине в течение 48 часов, обезвоживали и заливали в парафин по стандартной методике. Идентификацию НА на парафиновых срезах проводили коллоидальным железом по методу Хейла.

Морфометрические измерения высоты эпителия собирательных трубок осуществляли на препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, с использованием пакета программ AxioVision 4.5 (Carl Zeiss, Германия).

Ультраструктурное изучение внутреннего мозгового вещества почки

Ткань сосочка почки фиксировали в 3 % растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере pH 7,4 с добавлением 7 % раствора NaCl. Осмоляльность фиксатора соответствовала осмоляльности мочи животного. Дофиксацию проводили в 1% растворе осмиевой кислоты. Далее по стандартной методике кусочки ткани обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, ацетоне и заливали в аралдит – эпоновую смесь (1:6).

Срезы толщиной 60 нм получали при помощи ультрамикротома Leica EM UC6 (Leica Microsystems GmbH, Австрия). Для окрашивания ультратонких срезов использовали метод двойного контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Ультраструктуру клеток изучали на трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 120 kV.

Морфометрический анализ внутриклеточных структур

Морфометрический анализ внутриклеточных структур эпителиоцитов собирательных трубок внутреннего мозгового вещества почки проводили в программе iTEM (OLYMPUS, Германия).

Статистическая обработка данных

Достоверность различий показателей в изучаемых группах оценивали по t-критерию Стьюдента для парных сравнений. Для сравнения независимых выборок анализ достоверности различий проводили с помощью трехфакторного дисперсионного анализа ANOVA, где в качестве независимых переменных были взяты врожденный уровень эндогенного ВП, влияние dDAVP и влияние диклофенака. Достоверными признавались различия при р < 0,05. Приведенные в работе данные представлены в виде: среднее ± ошибка среднего (M ± SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эффективность осмотического концентрирования у крыс Вистар и Браттлборо

При сравнении показателей осмотического концентрирования у крыс Вистар в условиях подавления секреции ВП гидратацией с крысами Браттлборо, у которых постоянно отсутствует эндогенный ВП, достоверных различий не выявлено. Для гидратированных крыс Вистар были характерны низкие значения осмоляльности экскретируемой мочи (рис. 2). Во всех функциональных зонах почки было выявлено невысокое содержание осмотически активных веществ (рис. 3, 4), создающих градиент, обеспечивающий реабсорбцию воды. Это отражается в низких значениях кортико-медуллярных градиентов катионов натрия и мочевины (рис. 7) и является следствием пониженного уровня ВП у гидратированных крыс Вистар.

У контрольных крыс Браттлборо осмоляльность спонтанно отделяемой мочи и значения кортико-медуллярных градиентов натрия и мочевины также имеют невысокие значения (рис. 2, 7). Гипотоничность мочи обусловлена сниженным уровнем реабсорбции осмотически свободной воды в почечных канальцах и является прямым следствием отсутствия эндогенного ВП (Maghnie, 2003). Низкие значения кортико-медуллярных градиентов натрия и мочевины обусловлены малым содержанием этих веществ во внутреннем мозговом веществе почки (рис. 5, 6), сопоставимых с данными гидратированных крыс Вистар, что связано с отсутствием ВПконтролируемого транспорта натрия и мочевины (Blot-Chabaud et al., 2001; Knepper and Gamba, 2004).

Введение диклофенака, блокирующего синтез ПГ, приводит к усилению концентрирующей функции почки как у гидратированных крыс Вистар, так и у крыс Браттлборо (рис. 2). У крыс Вистар возрастание осмоляльности мочи, по-видимому, обусловлено в большей степени увеличением кортико-медуллярного градиента мочевины, в то время как градиент катионов натрия достоверно не изменяется (рис. 7). Содержание осмотически активных веществ в разных зонах почки увеличивается по сравнению с контролем, что может быть связано с устранением ингибирующего эффекта ПГ Е2 на реабсорбцию натрия и проницаемость для мочевины (Haylor et al., 1983; Machida et al., 2007).

У крыс Браттлборо действие блокады синтеза ПГ в отсутствие эндогенного ВП вызывает более значительное увеличение показателей осмоляльности мочи (рис. 2), чем у белых крыс. И натрий (рис. 5), и мочевина (рис. 6) вносят вклад в формирование осмотического градиента, который способствует более значительному увеличению эффективности осмотического концентрирования у крыс Браттлборо по сравнению с крысами Вистар.

При введении десмопрессина (dDAVP, селективного агониста V2 рецепторов ВП) гидратированным крысам Вистар наблюдалось значительное увеличение осмоляльности мочи (рис. 2). Активация V2 рецепторов ВП привела к активации реабсорбции натрия (рис. 3) и увеличению проницаемости почечных канальцев для мочевины (рис. 4). Это повлекло увеличение кортико-медуллярных градиентов натрия и мочевины (рис. 7), что согласуется с литературными данными (Bugaj et al., 2009; Stewart et al., 2007). Однако больший вклад в создание осмотического градиента у крыс Вистар внес кортико-медуллярный градиент мочевины, существенно возросший при действии dDAVP.

Введение dDAVP крысам Браттлборо приводит также к существенному возрастанию осмоляльности экскретируемой мочи, увеличению кортико-медуллярных градиентов натрия и мочевины (рис. 2, 7). Наблюдается накопление натрия во всех функциональных зонах почки (рис. 5), что может быть связано с возрастанием экспрессии субъединиц эпителиального натриевого канала (ENaC), т.к. под влиянием ВП происходит увеличение содержания мРНК субъединицы ENaC в мозговом веществе, сопряженное с изменением содержания белка натриевого канала (Brooks et al., 2003; Ecelbarger et al., 2000). Достоверному увеличению кортико-медуллярного градиента способствовало аккумулирование мочевины в наружном и внутреннем мозговом веществе (рис. 6), где возрастает проницаемость для мочевины эпителия собирательных трубок. По-видимому, более значительное увеличение градиента мочевины привело к достоверно большему возрастанию осмоляльности мочи крыс Браттлборо по сравнению с крысами Вистар.

Для выявления механизма сочетанного действия ПГ и ВП на концентрирующую систему крыс Вистар было проведено одновременное введение диклофенака и dDAVP. Это привело к значительному возрастанию осмоляльности экскретируемой мочи (рис. 2). У животных этой группы наблюдается меньшая аккумуляция катионов натрия в зонах почки по сравнению с животными, которым вводили только диклофенак или dDAVP (рис. 3). Кортико-медуллярный градиент натрия не изменяется по сравнению с контролем (рис. 7). Для наружного и внутреннего мозгового вещества почки достоверность отличий в содержании мочевины как между группами раздельного введения диклофенака и dDAVP, так и с группой сочетанного введения препаратов, не выявлена (рис. 4). На основе имеющихся данных трудно объяснить снижение содержания мочевины и натрия во внутреннем мозговом веществе при сочетанном введении диклофенака и dDAVP. Дополнительно требуется оценка состояния фильтрации и скорости тока жидкости по канальцам почки в этих условиях, поскольку изменения этих параметров могут привести к снижению уровня канальцевой реабсорбции.

У крыс Браттлборо в условиях сочетанного введения диклофенака и dDAVP осмоляльность мочи, кортико-медуллярные градиенты натрия и мочевины возрастают значительно по сравнению с контрольной группой и группой животных, которым вводили диклофенак (рис. 2, 7). Однако в сравнении с группой введения dDAVP достоверности отличий не наблюдается. dDAVP оказал более значимое влияние на изменение содержания осмотически активных веществ в тканях почки, воздействуя при этом, преимущественно, на транспорт мочевины (рис. 5, 6). Сочетанное введение dDAVP и диклофенака не привело к увеличению эффекта dDAVP.

Рис. 2. Эффективность осмотического концентрирования у крыс Вистар и Браттлборо. Примечание: * р < 0.05, *** р < 0.001 по сравнению с контрольной группой; ### р < 0.001 по сравнению с группой введения диклофенака; & р < 0.05, &&& р < 0.001 по сравнению с аналогичной экспериментальной группой другой линии животных

Рис. 3. Содержание катионов натрия в разных зонах почки крыс Вистар

Рис. 4. Содержание мочевины в разных зонах почки крыс Вистар

Примечание к рис. 3, 4: *** р < 0.001 по сравнению с контрольной группой; # р < 0.05, ## р < 0.01, ### р < 0.001 по сравнению с группой введения диклофенака; @@ р < 0.01 по сравнению с группой введения dDAVP; нм – наружное мозговое вещество, вм – внутреннее мозговое вещество

Рис. 5. Содержание катионов натрия в разных зонах почки крыс Браттлборо

Рис. 6. Содержание мочевины в разных зонах почки крыс Браттлборо

Примечание к рис. 5, 6: * р < 0.05, ** р < 0.01, *** р < 0.001 по сравнению с контрольной группой; # р < 0.05, ## р < 0.01, ### р < 0.001 по сравнению с группой введения диклофенака; & р < 0.05, && р < 0.01, &&& р < 0.001 по сравнению с аналогичной экспериментальной группой другой линии животных; нм – наружное мозговое вещество, вм – внутреннее мозговое вещество

Рис. 7. Кортико-медуллярные градиенты катионов натрия и мочевины в почке крыс Вистар и Браттлборо. Примечание: * р < 0.05, ** р < 0.01, *** р < 0.001 по сравнению с контрольной группой; ## р < 0.01, ### р < 0.001 по сравнению с группой введения диклофенака; & р < 0.05 по сравнению с аналогичной экспериментальной группой другой линии животных

Структурные особенности внутреннего мозгового вещества почки крыс Вистар и Браттлборо

Изучение состояния клеток эпителия собирательных трубок в почке контрольных гидратированных крыс Вистар и крыс Браттлборо на ультраструктурном уровне выявило особенности, характерные для низкой водной проницаемости клеток. Об этом свидетельствуют малое количество клатриновых везикул (рис. 8), содержащих преимущественно аквапорины (Christensen et al., 2000; Noda and Sasaki, 2005), и состояние межклеточных контактов эпителиоцитов (отсутствие полостей, выраженные интердигитации латеральных мембран эпителиоцитов).

Несмотря на то, что гидратация крыс Вистар привела к уравниванию осмоляльности мочи, существенные различия между контрольными группами крыс выявлены при гистохимическом изучении средней трети внутреннего мозгового вещества почки. Отличительной особенностью крыс Браттлборо является то, что в интерстиции мозгового вещества почки у них практически полностью отсутствует гистохимически выявляемый НА, в то время как у гидратированных крыс Вистар в этой зоне обнаруживается значительное количество НА, что согласуется с литературными данными (Иванова и др., 2007; Тищенко, Иванова, 1985; McAuliffe, 1980). У ВП-дефицитных крыс, в отличие от гидратированных крыс Вистар, в исследуемой зоне почки имеются ИК 2 типа, участвующие в процессах деградации структур интерстициального матрикса (Lemley and Kriz, 1991). Активное состояние синтетического аппарата, наличие осмиофильных гранул в цитоплазме ИК 1 и 2 типов может указывать на синтез и накопление ферментов, в частности, глюкуронидазы, выявляемой в значительном количестве при гистохимическом исследовании (рис. 9). По-видимому, выявленные различия обусловлены оппозитным уровнем эндогенного ВП: постоянно низким у крыс Браттлборо в отличие от крыс Вистар.

Известно, что ПГ Е2 способен вызывать структурные перестройки компонентов цитоскелета, направленные на блокирование действия ВП (Klussmann et al., 2001b; Tamma et al., 2001). При блокаде синтеза ПГ диклофенаком увеличение высоты эпителиоцитов (рис. 8), наблюдаемое при изучении собирательных трубок почки гидратированных крыс Вистар, по-видимому, связано с реорганизацией цитоскелета клеток. Осмотический ток воды в этих условиях осуществляется через имеющиеся водные каналы без активации и привлечения дополнительных компонентов транс- и парацеллюлярного путей транспорта воды. Подтверждением этому могут служить данные ультраструктурного исследования, при котором выявлены отсутствие расширений межклеточных пространств, малое количество клатриновых везикул (рис. 8), низкая активность процессов синтеза в эпителиоцитах. Важной особенностью группы крыс Вистар в условиях блокады синтеза ПГ является появление в изучаемой зоне почки ИК 2 типа.

Введение диклофенака крысам Браттлборо приводит к появлению существенных особенностей реакции структурных компонентов по сравнению с крысами Вистар. Наблюдаются уменьшение высоты эпителия собирательных трубок (рис. 8) и активация синтетического аппарата клеток, в цитоплазме ИК появляются гранулы гистохимически выявляемого НА. Обильное накопление гранул глюкуронидазы во всех структурных элементах изучаемой зоны почки крыс Браттлборо (рис. 9) может быть связано с мембраностабилизирующим эффектом диклофенака, предотвращающим экзоцитоз секреторных гранул и снижающим функциональную активность лизосом (Ushijima et al., 2005; Tomisato et al., 2004). В пользу усиления трансцеллюлярного тока воды через эпителий собирательных трубок свидетельствует увеличение содержания клатриновых везикул (рис. 8), вероятно, содержащих аквапорины.

При введении dDAVP гидратированным крысам Вистар выявлено значительное увеличение высоты эпителия (рис. 8), которое происходило из-за куполообразного выпячивания апикальной части клеток в просвет собирательных трубок, возможно, как следствие активации актинового цитоскелета и немышечных форм миозина (Chou et al., 2008). Значительное увеличение количества клатриновых везикул в эпителии может указывать на усиление трансцеллюлярного тока воды (рис. 8). Состояние межклеточных контактов эпителиоцитов отражает незначительный вклад парацеллюлярного тока в процесс реабсорбции воды. Наблюдается увеличение проницаемости интерстициального барьера для транспорта воды вследствие уменьшения содержания НА в межклеточном веществе, что согласуется с литературными данными (Hansell et al., 2000).

У крыс Браттлборо при действии dDAVP наблюдаются уплощение эпителиоцитов собирательных трубок и активная транслокация клатриновых везикул в апикальную мембрану эпителиоцитов (рис. 8). Однако число клатриновых везикул меньше по сравнению с крысами Вистар, что соответствует литературным данным (Shen et al., 1997). Укорочение латеральных межклеточных контактов эпителиоцитов, появление межклеточных полостей могут свидетельствовать в пользу усиления парацеллюлярного тока воды. Активация синтетического аппарата эпителиоцитов и ИК, появление гистохимически выявляемого НА в интерстиции и гликокаликсном слое могут являться отражением ВП стимулированного синтеза ГАГ. При действии dDAVP наблюдается активация глюкуронидазы, что гистохимически выявляется в виде снижения количества гранул в эпителиоцитах и наличии небольшого количества гранул только в ИК (рис. 9).

Сочетанное введение диклофенака и dDAVP крысам Вистар привело к структурным изменениям изучаемой зоны, близким к изменениям при введении только dDAVP (рис. 8). Вероятно, активация V2 рецепторов ВП играет ведущую роль в регуляции проницаемости эпителиального и интерстициального барьеров у крыс Вистар. При сравнении аналогичных групп крыс Вистар и Браттлборо, которым вводили либо dDAVP, либо dDAVP в сочетании с диклофенаком, у крыс Браттлборо наблюдается более выраженный вклад парацеллюлярного транспорта воды через эпителий собирательных трубок. У крыс Вистар состояние эпителиоцитов, напротив, указывает на преобладание трансцеллюлярного тока воды (больше клатриновых везикул (рис. 8), отсутствуют расширения латеральных межклеточных пространств).

Рис. 8. Морфометрическая характеристика эпителиоцитов собирательных трубок почки крыс Вистар и Браттлборо. Примечание: * р < 0.05, ** р < 0.01, *** р < 0.001 по сравнению с контрольной группой той же линии крыс; # р < 0.05, ## р < 0.01, ### р < 0.001 по сравнению с группой введения диклофенака той же линии крыс; @ р < 0.05, @@@ р < 0.001 по сравнению с группой введения dDAVP той же линии крыс; & р < 0.05, && р < 0.01, &&& р < 0.001 по сравнению с аналогичной экспериментальной группой другой линии животных

Установлено, что функциональные и структурные компоненты системы осмотического концентрирования находятся под влиянием эндогенного ВП, а также активации V2 рецепторов ВП после введения dDAVP. Однако состояние структур внутреннего мозгового вещества почки модулируется и ПГ, что доказывают наблюдаемые при блокаде синтеза ПГ морфофункциональные изменения. Достоверность эффектов врожденного уровня эндогенного ВП, блокады синтеза ПГ и введения dDAVP подтверждается анализом трехфакторного дисперсионного комплекса (табл. 1). Полученные данные указывают не только на ведущую роль врожденной способности крыс к синтезу эндогенного ВП и наличия АДГ в крови, но и на модулирующее влияние ПГ по отношению к клеточным элементам системы осмотического концентрирования.

Рис. 9. Морфометрическая характеристика гранул глюкурони-дазы в почке крыс Вистар и Браттлборо. Примечание: * р < 0.05, *** р < 0.001 по сравнению с контрольной группой той же линии крыс; ### р < 0.001 по сравнению с группой введения диклофенака той же линии крыс; @@@ р < 0.001 по сравнению с группой введения dDAVP той же линии крыс; &&& р < 0.001 по сравнению с аналогичной экспериментальной группой другой линии животных

Таблица 1. Оценка влияния врожденного уровня эндогенного ВП, блокады синтеза ПГ и введения dDAVP на морфофункциональные характеристики почек крыс Вистар и Браттлборо

Функциональные и морфометрические показатели	Источник изменчивости			Взаимодействие факторов
	эВП	Д	dDAVP	эВП *Д	эВП * dDAVP	Д * dDAVP	эВП *  Д * dDAVP
осмоляльность мочи	+	+	+	-	-	+	+
градиент натрия	-	-	+	+	-	+	-
градиент мочевины	+		+	-	+	+	-
высота эпителия	+	-	+	-	+	-	+
количество гранул глюкуронидазы в эпителии	+	+	+	+	+	+	-
количество гранул глюкуронидазы в ИК	+	+	+	+	-	-	+

Примечание: эВП – способность к синтезу эндогенного ВП, Д – диклофенак, * – взаимодействие факторов, + – достоверное влияние фактора,

- – отсутствие достоверного влияния фактора

Таким образом, результаты комплексного морфофункционального исследования демонстрируют коррелятивные взаимосвязи функциональных показателей и структурных элементов, участвующих в формировании барьеров для движения осмотически свободной воды.

Отсутствие предполагаемого суммирования эффектов блокады синтеза ПГ и активации V2 рецепторов ВП при сочетанном введении диклофенака и dDAVP, по-видимому, связано с преобладанием эффекта гормона, который приводит к возрастанию осмотического концентрирования, а увеличение осмоляльности внеклеточной жидкости интерстициального пространства сопровождается возрастанием экспрессии в ИК фермента синтеза ПГ циклооксигеназы-2 (ЦОГ) de novo (Pucci et al., 2004). Диклофенак вызывает селективное ингибирование ЦОГ-2 – изоформы фермента, катализирующей образование ПГ Е2 (Chan et al., 1999; Riendeau et al., 2001). Возможно, именно продукты фермента ЦОГ-1, не подверженного ингибированию диклофенаком, маскируют эффекты блокады синтеза ПГ Е2 при сочетанном введении диклофенака и dDAVP.

Полное отсутствие эндогенного ВП у гомозиготных крыс Браттлборо на протяжении всей их жизни, а также измененный общий гормональный статус (сниженные уровни окситоцина, соматотропного и адренокортикотропного гормонов, глюкокортикоидных и минералокортикоидных гормонов, ослабленные функции щитовидной и поджелудочной желез, сниженный уровень почечной экскреции ПГ Е2 и F2) (Dunn et al., 1978; Milne et al., 1982; Valtin and Schroeder, 1997; Vinson et al., 1978; Walker et al., 1978), по-видимому, лежат в основе выявленных отличий антидиуретической реакции крыс Браттлборо от крыс Вистар, что указывает на многокомпонентную модуляцию осмотического концентрирования и требует дальнейшего исследования.

Полученные данные могут служить дополнительным подтверждением участия ПГ в модуляции эффекта ВП в отношении функциональных компонентов осмотического концентрирования, а также расширять представления о влиянии взаимодействия ВП и ПГ на структурные компоненты, вовлекаемые в реализацию гидроосмотического эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Блокада синтеза ПГ у крыс приводит к увеличению осмотического концентрирования мочи, более выраженному у ВП-дефицитных крыс Браттлборо, чем у гидратированных крыс Вистар со сниженным уровнем ВП. Повышение осмоляльности мочи обусловлено возрастанием кортико-медуллярных градиентов не только мочевины, но и натрия вне зависимости от врожденной способности секретировать эндогенный ВП.

2. У ВП-дефицитных крыс Браттлборо введение агониста V2 рецепторов ВП (dDAVP) сопровождается более выраженным нарастанием осмотического концентрирования, чем у гидратированных крыс Вистар. Осмоляльность мочи при этом обусловлена большим вкладом кортико-медуллярного градиента мочевины по сравнению с градиентом натрия. При сочетанном введении dDAVP и диклофенака крысам Вистар и Браттлборо не наблюдалось ожидаемого суммирования эффектов блокады синтеза ПГ и активации V2 рецепторов ВП, что отражает преобладание эффекта гормона.

3. При введении диклофенака, dDAVP и сочетанном действии препаратов у крыс Вистар и Браттлборо наблюдается однотипная тенденция увеличения числа клатриновых везикул, что отражает транслокацию аквапоринов и возрастание водной проницаемости эпителия собирательных трубок. У крыс Браттлборо в отличие от крыс Вистар наблюдаются ультраструктурные признаки активации процессов синтеза в эпителии, а также расширение межклеточных промежутков, что может свидетельствовать об увеличении парацеллюлярного транспорта воды.

4. При действии dDAVP и сочетанном введении dDAVP и диклофенака у крыс Вистар снижается количество НА-структур в интерстиции, что может быть связано с появлением в этой зоне популяции интерстициальных клеток 2 типа, участвующих в процессах катаболизма компонентов интерстициального матрикса. У крыс Браттлборо в условиях действия диклофенака, dDAVP, а также сочетанного введения препаратов наблюдается увеличение гистохимически выявляемого НА, что обусловлено усилением процессов синтеза в интерстициальных клетках.

5. Блокада синтеза ПГ на фоне низкого уровня ВП, а также действия агониста V2 рецепторов ВП влияют на состояние системы катаболизма НА, что отражается в количестве гистохимически выявляемых гранул глюкуронидазы в эпителиоцитах и интерстициальных клетках внутреннего мозгового вещества почки крыс Вистар и Браттлборо.

6. Различие реакции клеточных и интерстициальных элементов внутреннего мозгового вещества почки крыс Вистар и Браттлборо на блокаду синтеза ПГ Е2 и агонист V2 рецепторов ВП, несмотря на экспериментально выровненный исходный уровень осмотического концентрирования у этих животных, указывает на роль врожденной способности к синтезу ВП в модуляции развития антидиуретической реакции.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Babina A. Influence of the vasopressin and prostaglandin interaction on the kidney osmotic concentration ability // SymBioSE 2011 Switzerland Abstract Booklet. – 2011. – University of Basel, Switzerland. – PP. 10-11.
2. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В., Бейзель Н.Ф. Влияние диклофенака на концентрирующую функцию почек у животных с разным нейрогипофизарным статусом // XXI Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. – М.–Калуга: Типография ООО «БЭСТ-принт». – 2010. – С. 43.
3. Бабина А.В., Шестопалова Л.В., Лавриненко В.А. Ультраструктурное исследование внутреннего мозгового вещества почки вазопрессин-дефицитных крыс Браттлборо в различных экспериментальных условиях // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». – СПб, 2009. – С. 3839.
4. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В. Сравнительное изучение структурных элементов системы осмотического концентрирования крыс Вистар и Браттлборо // «Симбиоз Россия 2009». Материалы II Всероссийского с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. – Пермь, 2009. – С. 270272.
5. Лавриненко В.А., Бабина А.В., Шестопалова Л.В., Бейзель Н.Ф. Эффективность осмотического концентрирования у крыс Браттлборо в различных экспериментальных условиях // Научные труды II съезда физиологов СНГ. Под ред. А.И. Григорьева, Р.И. Сепиашвили, Ф.И. Фурдуя. – Москва–Кишинэу. Медицина–Здоровье, 2008. – С.146.
6. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В., Бейзель Н.Ф. Морфофункциональный анализ влияния блокады синтеза простагландинов на эффективность осмотического концентрирования у крыс Браттлборо // Тезисы докладов VI Всероссийской конф. с междунар. участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». – СПб, 2008. – Т.1. – С. 14.
7. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В., Бейзель Н.Ф. Влияние диклофенака натрия и десмопрессина на концентрирующую функцию почки (морфофункциональное исследование) // VI Сибирский физиол. съезд. Тезисы докладов. – Барнаул, 2008. – С. 137.
8. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В., Бейзель Н.Ф. Морфофункциональное исследование влияния диклофенака натрия на концентрирующую функцию почки // Тезисы докладов V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». – СПб, 2007. – С. 171172.
9. Лавриненко В.А., Бабина А.В., Андреева Е.М., Хегай И.И. Влияние хронического введения вазопрессина на концентрирующую функцию почки крыс Браттлборо // Тезисы докладов V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». – СПб, 2007. – С.39.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕФЕРИРУЕМЫХ НАУЧНЫХ ЖУРНАЛАХ, ВКЛЮЧЕННЫХ В СПИСОК ВАК

1. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В., Иванова Л.Н. Морфологические особенности внутренней мозговой зоны почек крыс Браттлборо и Вистар в условиях блокады синтеза простагландинов // «БЭБиМ». – 2011.– Т. 151. – № 2. – С. 234239.

1*. Babina A.V., Lavrinenko V.A., Shestopalova L.V., Ivanova L.N. Morphological characteristics of the inner medullary zone in the kidneys of Brattleboro and Wistar rats during blockade of prostaglandin synthesis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2011. – Vol. 151. – № 2. – PP. 268272.

2. Бабина А.В., Лавриненко В.А., Шестопалова Л.В., Иванова Л.Н. Морфофункциональные особенности почек крыс Браттлборо в различных экспериментальных условиях // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2010. – Том 8, выпуск 1. – С. 4044.
3. Иванова Л.Н., Лавриненко В.А., Бабина А.В., Хегай И.И. Структура и концентрирующая способность почек крыс Браттлборо в условиях длительного введения вазопрессина // «БЭБиМ». – 2008. – Т. 146. – № 11. – С.580584.

3*. Ivanova L.N., Lavrinenko V.A., Babina A.V., Khegay I.I. Structure and concentration capacity of the kidneys in Brattleboro rats under conditions of long-term vasopressin treatment // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2008. – Vol. 146. – № 5. – P. 642646.