Физиологические исследования отсроченных условных реакций у рептилии в разных сезонах года и роль гиппокампа, нейропептида дерморфина в их регуляции

На правах рукописи

ЧОРИЕВ

Субхонкул Адамхонович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОТСРОЧЕННЫХ УСЛОВНЫХ РЕАКЦИЙ У

РЕПТИЛИИ В РАЗНЫХ СЕЗОНАХ ГОДА И РОЛЬ

ГИППОКАМПА, НЕЙРОПЕПТИДА ДЕРМОРФИНА

В ИХ РЕГУЛЯЦИИ

03.03.01 - физиология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Душанбе – 2012 г.

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Таджикского национального университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Устоев Мирзо

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор кафедры зоологии

Таджикского педагогического

университета им. С.Айни

Сатторов Тоирджон.

кандидат биологических наук,

доцент, зав. лабораторией общего

анализа Института

животноводства ТАСХН

Джураева Улугой Шаймардоновна

Ведущая организация: Худжандский государственный

университет им. академика

Б. Гафурова

Защита диссертации состоится «29» мая 2012 г. в «1300» часов на заседании объединённого диссертационного Совета ДМ. 737.004.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Таджикского национального университете по адресу пр. Рудаки, 17

Автореферат разослан «_____» ____________ 2012 г.

Ученый секретарь объединенного

диссертационного совета,

к.б.н., доцент Бурханов Д.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Как известно рептилии занимают ключевое положение в эволюции позвоночных. Их древние предки дали начало двум крупнейшим линиям современных высших позвоночных – птицам и млекопитающим, это находит отражение в тех кардинальных преобразованиях мозга рептилий, которые могут быть отнесены к разряду ароморфозов. Известные специалисты в области сравнительной нейрологии прошлого и настоящего Дж. Эллиот Смит, Дж. Джонстон, Н. Холмгрен, И.Н. Филимонов, У. Рисс, А.И. Карамян, М.Г. Белехова, Т.Н Соллертинская, Х.М. Сафаров и др. считали и считают, что правильная интерпретация мозга рептилий является ключом к пониманию хода эволюции мозга млекопитающих.

Уникальность рептилий как класса состоит в том, что две его дивергентные линии – зауропсидная (ящерообразные, sauropsida), представленная большинством современных рептилий, в том числе чешуйчатым (squamata), и терапсидная (зверообразные, therapsida), к которой относятся черепахи (chelopia), - имеют существенные различия в организации первичного мозга (Белехова, 1977; Ивазов, 1983; Карамян, 1970, 1976; Нуритдинов, 1992; Нуритдинов, Ивазов, 1992; Сафаров, 1983; Устоев, 1986, 2000, 2005, 2009, 2010 и др.).

Эволюционный подход к экологическим закономерностям, физиологические механизмы природных форм адаптации, лабильность функционирования ряда функциональных систем у позвоночных различной филогенетической группы и экологической специализации и участие различных нейропептидов в процессах приспособления их к среде обитания являются одним из важнейших и малоизученных направлений в современной нейробиологии. С этой точки зрения исследования физиологии гипобиоза, зимней и летней спячки - своеобразных и удивительных природных форм адаптации ряда позвоночных для переживания неблагоприятных условий окружающей среды представляется весьма актуальной задачей.

Одним из наиболее сильных регуляторов температуры тела является нейропептид дерморфин. Установлено, что инъекция этим пептидом теплокровным животным приводит к резкой гипотермии изменении парога активации всех терморегуляторных эффектов к более низкой температуре, снижает термоустойчивость организма, особенно зимосящих животных.

В настоящее время в литературе имеются данные, указывающие на то, что ряд пептидов, как: бомбезин, дерморфин и другие опиоиды являются регуляторами многих физиологических процессов зимоспящих животных (Игнатьева, Колаева с соавт., 1990; Крамарова, 1988; Ярыгин, Крамарова, Иваницкий, Колаева, 1986; Нуритдинов, 1992, 2000, 2004; Becman et al., 1981; Becman, Stanton, 1982; Margulies et al., 1979 и др.).

Однако, если механизмы высшей нервной деятельности у зимоспящих в литературе изучены достаточно, но данные относительно изучения этого вопроса в период эстивации летноспящих животных единичны и они не систематизированы. Хотя изучение роли опиоидных пептидов в регуляции высшей нервной функции, эстивации летнеспяших животных известны, но недостаточно изучено регулирующая роль опиоидного нейропептида дерморфина в эволюционном плане и данные по этому вопросу в литературе почти отсутствуют.

Исходя из вышеизложенного для нас было очень важным исследовать механизмы отсроченной реакции у рептилий в разных сезонах года и влиянием нейропептида.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы явилось изучение поведенческих, нейрофизиологических и нейропептидных механизмов высшей нервной деятельности и эстивации у степной черепахи (Testudo horsfieldi) при различных физиологических состояниях.

В связи с выше изложенными исходя с этими перед нами были поставлены следующие задачи:

На модели пищевого поведения у черепах изучить физиологические особенности процессов высшей нервной деятельности и эстивации в норме.

Изучить роль гиппокампа на механизмах формирования отсроченных условных реакций в разных сезонах года.

Изучить нейрофизиологические и нейропептидные особенности механизмов эстивации и гипобиоза и его изменения после введения нейропептида дерморфина.

Научная новизна. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что на низших этапах эволюции позвоночных (рептилий) впадение в состояние эстивации и изменение процессов ВНД наступает «с ходу»: в процесс нарушения ВНД включаются оба нервных процесса – возбудительный и тормозной. В период эстивации и гипобиоза сохраняется ранее накопленный объем биологически полезная информация. Реализация заторможенных на фоне эстивации и гипобиоза, условных отсроченных рефлексов после естественного пробуждения предварительно обученных черепах происходит значительно быстрее по сравнению с необученными. Получены также новые нейрофизиологические и нейрохимические данные о роли нейропептида дерморфина, выделенного из кожи пойкилотермного животного – южноафриканской лягушки Phylomedusa, в регуляции процессов ВНД и эстивации у представителя другого пойкилотермного животного – степной черепахи. Показано, что инъекция дерморфина приводит к уменьшению вегетативных показателей и кратковременному погружению в сноподобное состояние. Обнаружено, что зрительное представительство в гиппокампальной коре не связано со специфической функцией сенсорного анализа, но, очевидно, играет роль в сенсорном обеспечении лимбических функций. Исследование комплексных методических приемов позволило выяснить корреляцию между структурно-функциональной организацией гиппокампа черепах и его значение для условно-рефлекторной деятельности.

Научно-практическая значимость работы

Работа относится к разряду фундаментальных исследований. На основе эколого-физиологического анализа процессов ВНД у черепах сформулированы новые теоретические положения, имеющие значение для понимания эволюционных и экологических механизмов ВНД, эстивации и гипобиоза у этих животных. Полученные результаты раскрывают новые стороны механизмов природной адаптации организма и могут быть использованы для оценки функциональных возможностей организма в условиях высоких и низких температур окружающей среды. Результаты исследований по нейропептидному анализу высших нервных функций у черепах углубляют наши знания о механизмах, лежащих в основе нейрохимических механизмов памяти и обучения, а также сноподобных состояний. Они свидетельствуют о механизмах этих состояний в которых участвует опиоидная система: дерморфин возможно, является одним из важнейших индукторов летней и зимней спячки.

Анальгетическая способность может быть использована в кардиохирургии и нарколепсии. Существуют предпосылки применения искусственного гипобиоза для развития животноводства, медицины и космической биологии. За рубежом нейропептиды применяются с лечебной целью (Bristow, 1986) не только при функциональной, но и органической (язвенные заболевания). В России применение ряда пептидов в качестве лечебных средств внедряется в ряде клиник Санкт-Петербурга (ВМА) и Москвы (ВКНЦ).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эстивация – это сезонное оцепенение или состояние «глубокого сна», характерное для терапсидной линии рептилий – степной черепахи в ответ на черезмерное повышение температуры окружающей среды и бескормицы в летний сезон года. Границу между эстивацией и зимним гипобиозом провести трудно, ибо остается неясным, существуют ли между этими состояниями нейрофизиологическая и нейрохимическая непрерывность.
2. У черепах впадение в эстивацию наступает «с ходу» (в течение 2-3 суток). Нарушения возникают параллельно во всех исследуемых функциональных системах. Этот период по своим условно-рефлекторным критериям: наличию парадоксальных и ультрапарадоксальных отношений, растормаживанию дифференцировок напоминает картину невротических нарушений, имеющих место у этих животных при предъявлении им трудных условно-рефлекторных задач.
3. У черепах после естественного пробуждения из гипобиотического состояния отсроченные условные реакции вырабатываются и стабилизируются значительно быстрее по сравнению с таковыми у необученных черепах в этот период года. По-видимому это свидетельство, того, что в процессе эстивации и гипобиоза имеет место сохранение ранее полученной биологически полезной информации, извлечение которой после пробуждения животных из спячки происходит быстрее, чем выработка новых условных связей у интактных животных.
4. У предварительно гиппокампэктомированных степных черепах в период вхождения в эстивацию условно-рефлекторная деятельность нарушается полностью, о чем свидетельствуют наличие последовательного превентивного торможения процессов высшей нервной деятельности, функциональной дезинтеграции мозга, снижение температуры тела и угнетение функций вегетативных систем организма.
5. Подкожное введение нейропептида дерморфина (0.1 мг/кг) приводит к значительным поведенческим нарушениям, сопровождающимся изменением вегетативных и электрографических показателей, анальгезией, впадением в сноподобное состояние. На фоне введения дерморфина у черепах выявляется значительное ухудшение процессов высшей нервной деятельности. Дерморфин возможно является специфическим индуктором эстивации и гипобиоза и может быть рассмотрен как примитивный механизм протеинового синтеза, ранее использованного в эволюции.

Реализация результатов исследования. Существуют предпосылки применения искусственного гипобиоза в медицине, в клинической практике, животноводстве и космической биологии. Материалы диссертации будут использованы при чтении лекционных курсов по общей экологии, физиологии, биохимии человека и животных, а также спецкурсов: физиология и патология высшей нервной деятельности, нейробиология, экологическая физиология и нейрохимия в ВУЗах медико-биологического и экологического профиля.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-теоретической конференции по экологии и охране окружающей среды (Ташкент, 2002г.), на съезде физиологов России (Екатеринбург, 2004г.),на ежегодном научном семинаре ТГМУ (2005-2012), на научном семинаре кафедры физиологии человека и животных Таджикского Национального Университета (Душанбе, 2005г.), на республиканской конференции посвященное 70 летию академика Х.М.Сафарова (2007г.), на кафедре физиологии человека и животных (2010г.) и на совместном расширенном заседании кафедры физиологии человека и животных Таджикского Национального Университета и кафедры биологии с основами генетики Таджикского государственного медицинского университета (2012г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК Минобрнауки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах компьютерного набора и состоит из введения, литературного обзора, 5 глав, обсуждение результатов исследования, выводов и списка цитированной литературы, включающего 195 источника, из которых 82 на иностранном языке. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Опыты были проведены на 30 черепах обоего пола в хронических условиях в лаборатории кафедры физиологии человека и животных ТНУ по общепринятой методике разработанной А.Н.Карамяном, И.В. Малюковой (1986) и методике разработанной в нашей лаборатории Х.М. Сафаровым (1976) для рептилии, в фанерной камере размером 180х80см, сущность которой заключалось в том, что у черепах в условиях свободного поведения вырабатывались отсроченные условные реакции и пищедобывательная реакция к одной из трех кормушек, в которых находилась приманка. Для этой цели применялась таблица случайных чисел при разных соотношениях вероятности: 0.1–0.9; 0.2–0.8; 0.3–0.7; 0.4–0.6 и 0.5-0.5. Пища в кормушках давалась по разному в течение каждого опыта. При соотношении вероятностей 0.1–0.9 в одной кормушке давалось подкрепление в 10% случаев, а в других – 90%. Соответственно при других соотношениях вероятностей в одной кормушке давалось пищевое подкрепление в 20% случаев, а в других - 80% и т.д. У черепах отсроченные условные реакции изучались в период активной жизнедеятельности; в период вхождения в эстивацию; на фоне эстивации и гипобиоза, после естественного пробуждения животных из гипобиоза и у контрольной группы.

Гиппокампэктомию у черепах проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в конечности). В стереотаксическом приборе Мещерского гиппокампальная кора разрушалась с двух сторон электролитически через стальные биполярные электроды с толщиной кончиков 100–200 мкм и расстоянием между ними до 0.5 мм. Электроды вводилось в две точки гиппокампа в каждом полушарии по собственным координатам (глубина около 1500 мкм). Электрокоагуляция производилось током 0.4 мА в течение 45 с. Двигательно-оборонительные условные реакции у черепах изучены в условиях частичной обездвиженности животных. Регистрация биоэлектрической активности осуществлялось на электроэнцефалографе «Орион» фирмы «Медикор» (Венгрия). Цифровые значения мощности обрабатывалось математически по методике используемой в лаборатории эволюции сна и бодрствования института эволюционной биохимии и физиологии им. И.М. Сеченова РАН. Температуру мозга у черепах измеряли согласно методике Т.В. Пискаревой (1987). Полученные результаты обрабатывались статистически, определялись средние арифметические. Достоверность результатов определялось по таблице Стьдента-Фишера.

Нейропептид дерморфин (ДМ) фирмы «Serva» с физиологическим раствором вводили черепахам из расчета 0.1 мг/кг непосредственно за 10 мин перед опытом. Животные были тестированы по следующим поведенческим показателям: двигательная активность, пищевое, зоосоциальное поведение, анальгезия. Болевая чувствительность и анальгетический эффект на ДМ изучался по методике «тейл-флек» в течение 120 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физиологические особенности процессов высщей нервной деятельности, эстивация и гипобиоза у черепахи (Testudo horsfieldi).

Для этой части исследований физиологические изучения с целью механизмов высшей нервной деятельности и отсроченных условных реакции у черепах в разных сезонах года были проведены несколько серии опытов:

1-я серия. Особенности отсроченных условных реакций в период активной жизнедеятельности (весной)

Исследование показали что у степных черепах условные отсроченные реакции вырабатывались в весенне-летний сезон года. После образования наличных условных рефлексов, для проявления и стабилизации которых потребовалось, соответственно 29.2±1.3 и 176.4±8.4 проб, вырабатывали отсроченные условные реакции на световые раздражители с использованием одноминутной отсрочки. В начале (2-3 опыта) введенные отсрочки сопровождалось снижением общеповеденческой активности и пищевой мотивации, а также значительным нарушением процессов ВНД. Так, величина условных реакций снижалась до 57.4±1.2%, при норме 2.2±1.6, латентный период удлинялся до 72.3±1.8 с при норме 4.2±0.1 с. Регистрировались неадекватные реакции: в ответ на условный стимул черепахи подходили к кормушке, которая ранее не подкреплялась. Формирование отсроченных реакций носило волнообразный характер, стабилизировалась в течение более 2-х месяцев, в конце которых величина правильных ответов достигала 78-80%-ного критерия осуществления: К1 - 80.3±1.4, К2 - 81.7±2.5 и К3 - 77.5±2.1 с. Величина латентного периода условной пищедобывательной реакции к соответствующим кормушкам составляла: К1 - 29.1±1.5, К2 - 45.1±1.5 и к К3 - 83.6±2.0 с.

Таким образом, образование отсроченных условных реакций у черепах в активный период их жизнедеятельности является трудной условно-рефлекторной задачей и сопровождается нарушением предварительно выработанных наличных условных рефлексов. Отсроченные условные реакции вырабатываются волнообразно, их стабилизация происходит в течение более 2-х месяцев.

2-я серия. Особенности отсроченных условных реакций в период вхождения в эстивацию (летом)

Обнаружено, что по мере постепенного вхождения черепах в эстивацию динамика отсроченных реакций существенно нарушалось. Величина правильных подходов к кормушкам градуально падала, составляя: К1 - 54.9±1.6, К2 - 46.2±1.2 и К3 - 47.4±1.3 %. Характерной особенностью этого периода является также снижение числа правильных ответов, главным образом к К2 и К3. животные ошибались при выборе подкрепляемой кормушки. Критерий правильных решений снижался, о чем свидетельствует также резкое увеличение латентного периода условной реакции:К1 - 81.2±3.5, К2 - 86.5±3.6 и К3-95.1±4.1с.

Эстивация у степных черепах наступает в течение 2-4 суток. Этот период соответствует середине июля, когда температура окружающей среды достигает +40-45°С, что совпадает с наступлением засухи и бескормицы. На фоне эстивации у черепах наблюдается значительное угнетение приобретенных и ослабление некоторых безусловных реакций. Двигательная активность и пищевая мотивация заторможены, ориентировочно-исследовательские реакции угнетены. Животные становятся сонливыми, глазные щели закрыты или полузакрыты, порог тактильного раздражения конечностей повышается. При помещении подопытных черепах в искусственные температурные условия (26-30°С) обнаружено, что их поведение не отличается от интактных, находящихся в этот период в виварии. В отдельных случаях имеет место наличие спонтанной двигательной активности. В период эстивации условно- рефлекторная деятельность заторможена полностью.

Таким образом, установлено, что изменения процессов ВНД у степной черепахи в период впадения в эстивацию однонаправленно и заключаются в торможении положительных и отрицательных условных реакций. Анализ последовательного нарушения динамики условно- рефлекторной деятельности показывает, что изменения наступают «с ходу», в процесс нарушений включаются оба нервных процесса: возбудительный и тормозной. Вначале нарушаются приобретенные формы нервной деятельности, затем врожденные.

3-я серия. Особенности отсроченных условных реакций в период гипобиоза (зимой)

Состояние гипобиоза у степных черепах соответствует осенне-зимнему периоду. В этот период общая двигательная активность угнетена, разнообразные поведенческие реакции заторможены. Зоосоциальные взаимоотношения и пищевая мотивация отсутствуют. Сохраняется лишь очень слабые неуклюжие двигательные акты и слабые формы ориентировочно-исследовательских и защитно-оборонительных реакций. В период глубокого гипобиоза (зимой) при температуре окружающей среды до 13-15°С черепахи остаются неподвижными. Глазные щели закрыты, ЧДД снижается до 4-6 движений в мин. при норме 25-30. С целью выяснения возможности влияния температурного фактора на ВНД черепах животных переводили в теплое помещение при температуре 20-25°С, где наблюдения в этих условиях проводились в течение 22 суток. Было обнаружено, что общий уровень состояния бодрствования было чрезвычайно низким и у них новые условные рефлексы не вырабатывались, ранее выработанные не восстанавливались.

Отсюда из вышеизложенного следует, что у черепах эстивация переходит постепенно в другое функциональное состояние – гипобиоз, который характеризуется полным торможением приобретенных и угнетением сложных врожденных форм нервной деятельности.

4-я серия. Особенности отсроченных условных реакций после естественного пробуждения из гипобиотического состояния (весной следующего года)

Период естественного пробуждения степных черепах из гипобиотического состояния характеризуется повышением их двигательной и пищедобывательной активности, наличием разнообразного инстинктивного поведения. В экспериментах, возобновленных спустя 8 месяцев после продолжительной спячки (эстивация и гипобиоз) основное внимание было сосредоточено на динамике восстановления условных отсроченных реакций и на возможности ранее выработанных временных связей. Было обнаружено, что у черепах на 3-4 сутки после естественного пробуждения частично восстанавливалось простые условные двигательно-пищевые рефлексы затем через 10-12 суток проявлялется, а на 21 сутки восстанавливается более сложные формы нервной деятельности – отсроченные реакции. К этому времени процент адекватных ответов к кормушкам составлял: К1 - 76.0±2.0, К2 - 81.2±2.3 и К3 - 75.3±1.9.

Таким образом, полученные данные на степных черепах свидетельствуют о том, что после естественного пробуждения животных из эстивации+гипобиоза, общая продолжительность которых составляет 8 месяцев, скорость образования и упрочнения отсроченных реакций значительно выше таковой, имеющей место у этих же животных в активный период жизнедеятельности, до обучения. Результаты этой серии экспериментов привели нас к высказыванию предположения, что у черепах в период эстивации и гипобиоза ранее накопленная биологически полезная информация сохраняется

5-я серия. Особенности отсроченных условных реакций у контрольной (интактной) группы черепах (весной)

В серии контрольных опытов изучены особенности образования условных отсроченных рефлексов у интактных, ранее необученных черепах. Было обнаружено, что образование отсроченных реакций у черепах затруднено. Они стабилизировались спустя 2.5 месяца после непрерывной тренировки (57-61 опытные дни). Процент правильных ответов к этому периоду при 1-минутной отсрочке составляла: К1 - 78.1±2.1, К2 - 82±4.1 и К3 - 81.3±2.3. В дальнейшем этот уровень оставался более или менее стабильным. Аналогичная картина наблюдалось и в динамике изменений латентного периода условной реакции, которая снижалось от опыта к опыту: К1 - 36.2±1.4, К2 - 45.2±2.3 и К3 - 26.4±1.2. с. и в дальнейшем оставалась на том же уровне.

Таким образом, было установлено, что после естественного пробуждения предварительно обученных черепах из гипобиоза условно- рефлекторная деятельность восстанавливается и стабилизируется гораздо быстрее, чем формирование этих же форм временных связей в аналогичных условиях опытов у необученных животных. Возможно, поступающая в активный период жизнедеятельности в мозг летне - и зимоспящих животных полимодальная информация, как жизненно важная и биологически полезная информация, фиксируется мозгом надолго и после пробуждения из спячки эта программа полезной информации по принципу долгосрочной памяти пускается в ход заново.

2. Влияние предварительного разрушения гиппокампа на процессы высшей нервной деятельности и эстивации у степных черепах.

Целью данной серии опытов явилось выяснение механизма индукции эстивации у степных черепах после предварительного разрушения гиппокампальной коры мозга. Животные были тестированы методикой двигательно-пищевых условных рефлексов. Опыты проводились по следующей схеме: в начале у шести (п = 6) интактных черепах в активный период жизнедеятельности вырабатывали условные двигательно-пищевые рефлексы; затем у подопытных животных в обоих полушариях разрушалось гиппокампальная кора; в дальнейшем условно-рефлекторная деятельность и ее параметры сравнивались в различных функциональных состояниях. Было обнаружено, что на первом этапе у 6-ти интактных черепах первые условно-рефлекторные реакции появились после 16.4±0.5 проб и укрепилось после 42.1±1.4 совпадений условных и безусловных раздражителей. Величина адекватных ответов в этот период составила 81.2±1.8%. Время латентного периода условной реакции и время возвращения на стартовый отсек экспериментальной камеры составляло, соответственно 26.0±0.2 и 27.0±0.3 с. Температура воздуха в камере колебалось в пределах 30-35°С.

Исходя из задачи эксперимента, на втором этапе опыты проводились летом, в середине июня, когда животные предварительно были гиппокампэктомированы. Так, на этом этапе условно-рефлекторная деятельность была нарушена значительно. Величина правильных ответов составляла всего лишь 12.4±0.2%, а дифференцировочное торможение - 17.5±0.2%.

Вхождение в эстивацию у гиппокампэктомированных черепах протекало весьма своеобразно. Животные были вялыми, снизилась двигательная активность, затормаживалось ориентировочно- исследовательские реакции, а также отсутствовала полностью пищевая мотивация. Вместе с тем значительно повысилась тактильная чувствительность, прикосновение предметов к телу животных, вызывало бурную спонтанную двигательную активность.

Таким образом, установлено, что гиппокампэктомированные черепахи способны впадать в состояние эстивации и гипобиоза. Отсутствие гиппокампальной коры мозга не делает эстивацию невозможной. Предварительно выработанная условно-рефлекторная деятельность со зрительного анализатора как у гиппокампэктомированных, так и у интактных животных сохраняется после естественного пробуждения черепах из гипобиотического состояния (весной следующего года). Небольшая тренировка привела к восстановлению заторможенной условной реакции. Можно полагать, что эстивация и гипобиоз рептилий как идиоадаптивные явления прогрессировала в процессе эволюции на протяжении многих миллионов лет и их происхождение соответствует этапам происхождения различных дивергентных линий позвоночных.

3. Нейрофизиологическая характеристика состояния эстивации и гипобиоза у степной черепахи

Анализ электрограмм общей коры и дорзального гиппокампа показывает заметное доминирование высокочастотных ритмов от 8 до 20 в состоянии активного бодрствования.

В очередной серии наших экспериментов задача состояло выявлении значении биоэлектрической активности структуры гиппокампальной коры мозга степной черепахи в период вхождения животных в эстивацию и на ее фоне. Было обнаружено, что погружение в эстивацию сопровождается незначительным падением температуры мозга до 31-29°С, при температуре атмосферного воздуха 40-42°С. Особенностью этого периода является появление медленноволновых и синхронизированных форм нейрональной активности общей и гиппокампальных коры мозга. Эти колебания достигают амплитуды 70-120, а иногда 70-150 мкВ - в гиппокампальной коре и 50-70 мкВ – в общей коре. Напомним, что в общей коре свойственны диффузные неритмичные волны частот от 3-6 до 20-30 Гц. Амплитуда этих волн, как правило, не превышает 30-40 мкВ.

Спектральный анализ распределения волн ЭЭГ, показывает, что в активный период бодрствования черепах доминирующей формой нейральной активности дорзального гиппокампа при температуре мозга 34-32°С являются низковольтные колебания частот 30-15 Гц, амплитуда которых не превышает 50-60 мкВ. Эти же формы активности были обнаружены и в гиппокампалических ядрах. Однако, появление различных форм ЭЭГ может свидетельствовать о различном происхождении каждой из них. Анализ распределения волн в ЭЭГ эстивации чаще всего показывает значительные изменения частотного спектра при сравнительно незначительных изменениях температуры мозга. В гиппокампальной и общей коре в этих периодах доминирующей формой активности становятся потенциалы частот 5-7 Гц. Падение температуры мозга до 26-24°С и погружение черепах в сноподобное состояние сопровождается преобладанием в дорзальном гиппокампе синхронизированных колебаний с частотой 4-5 в 1 с. амплитудой 120-80 мкВ. Окончательное погружение степной черепахи в эстивацию и падение температуры гиппокампальной коры до 26°С сопровождалось значительным угнетением амплитуды активности, появлением диффузной десинхронизации ответов в дорзальном гиппокампе.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных было обнаружено, что нейрофизиологическая картина эстивации степных черепах характеризуется постепенным угнетением биоэлектрической активности в общей и гиппокампальной коре. Однако характер полиэлектрограммы показывает, что угнетение ЭЭГ первоначально начинается в заднем отделе гипоталамуса. В начале эти изменения регистрируются без заметного сдвига частотного спектра и только в дальнейшем сменяются синхронизацией активности. Вхождение в эстивацию сопровождается неизбежным угнетением электрограммы и процент медленных колебаний во всем спектре частот неизбежно возрастает по мере углубления эстивации.

4. Нейропептидная регуляция механизмов высшей нервной деятельности эстивации и гипобиоза степной черепахи

Среди опиоидных нейропептидов особый интерес представляет дерморфин (ДМ), выделенный в 1980 г. из кожи южноамериканской лягушки рода Phylomedusa. Роль этого нейропептида в регуляции механизмов ВНД и индукции эстивации и гипобиоза у летне- и зимоспящих позвоночных не исследована. По этой причине в условиях открытого поля у 6-ти черепах были изучены следующие поведенческие показатели: общая двигательная активность, пищевое и зоосоциальное поведение, агрессия, анальгезия и их изменения после введения ДМ.

а). Влияние нейропептида дерморфина (ДМ) на общеповеденческую деятельность

Обнаружено, что подкожное введение ДМ в дозе 0.1 мг/кг черепахам вызывает значительные изменения поведенческой деятельности и нарушения врожденных форм поведения. Тактильная чувствительность была подавлена, обнаруживался выраженный анальгетический эффект. Порог раздражения кожно-мышечных рецепторов или электрическое раздражение конечностей животного повышался в 6-8 раз. Через 10-15 мин после введения у черепах развивался сноподобное состояние: глазные щели закрыты, животные неподвижно распластаны на песке. Эффект ДМ у черепах пролонгирован и длится до 4-5 суток. Ориентировочно- исследовательские реакции заторможены. ДМ ускорял и углублял процессы эстивации, в пользу его свидетельствует пролонгированное состояние сонливости, имеющее место у черепах в середине лета. После введения ДМ зоосоциальные взаимоотношения были изменены. При этом происходит торможение амбивалентного и агонистического поведения, а также полное торможение индивидуального поведения. Отставленные эффекты ДМ у черепах имеют место до 27 суток.

б).Влияние нейропептида дерморфина (ДМ) на общеповеденческую деятельность

Изучение влияния ДМ на электрографические условные рефлексы у черепах установило следующее: ДМ вызывал выраженные изменения процессов ВНД, которые условно могли быть подразделены на три периода.

1-й период от 10 мин до 4-6 часов после введения препарата характеризуется выраженными вегетативными, соматическими и поведенческими нарушениями. Они заключалются в первоначальном появлении симпатических эффектов (тахиритмия, тахипноэ (р > 0.05), дилятация зрачков. Через 10-15 мин после инъекции препарата симпатические эффекты сменялись парасимпатическими и животные погружались в сноподобное состояние. Глазные щели закрыты, тактильная чувствительность снижена. Изменяется и фоновые вегетативные показатели. Частота дыхательных движений (ЧДД) в течение одного часа урежалась в среднем от 25±2.2 до 15±1.7 дых. дв./мин. Изменяется амплитуда дыхательных движений, которая в первые 20 мин увеличивается а затем падает в 2-3 раза. Аналогично изменялись и фоновые показатели частоты сердечных сокращений (ЧСС). Обнаружено, что ЧСС к 4 часам после введения ДМ снижалась от 65.4±3.2 – в норме до 31.4±1.2 - после введения. Однако выраженных изменений со стороны формы ЭКГ не выявлялось.

Особенно отчетливые изменения регистрировалось со стороны фоновой ЭЭГ полушарий переднего мозга. Установлено, что через 15-20 мин после введения ДМ наблюдалось значительное угнетение электрической активности полушарий переднего мозга и уплощение электрограммы. Через 1-1.5 часа после введения ДМ у черепах развивалось значительная анальгезия, порог ноцицептивного раздражения лапы с последующей реакцией отдергивания возрастал до 45-60 В при норме 15-20 В.

2-й период – со 2-го по 10-й день после введения ДМ характеризовался как период максимальных изменений. Анальгетический эффект в это время был ярко выраженным, достигая на 2-6 сутки максимальных величин 70-80 В при норме 5-20 В. Частота дыхания падала до 10-8 дыхательных движ./мин. Эта картина изменений весьма напоминала таковую, имеющую место у рептилий в состоянии гипобиоза. Условно-рефлекторная деятельность по всем изученным нами показателям была значительно заторможена, достигая примерно 20%-ного критерия осуществления для сердечного и дыхательного компонентов. ЭЭГ показатели условных реакций отсутствовали или проявлилось в виде одиночного вызванного ответа.

3-й период – с 10-го по 20-й день после введения ДМ характеризовался постепенной нормализацией вегетативных показателей, нестабильностью анальгетического эффекта, фоновые показатели ЧДД и ЧСС к 12-му дню после введения нейропептида возвращалось к норме, и даже наблюдалось их учащение. Однако условные электрографические реакции постепенно восстанавливалось лишь на 20-е сутки после введения ДМ. Введение контрольным черепахам физиологического раствора не сопровождалось изменением ни фоновых, ни условно-рефлекторных показателей.

в). Роль нейропептида ДМ в регуляции процессов эстивации (период перед вхождением в эстивацию)

Нейропептидные механизмы эстивации в литературе не изучено. Исходя из этого, в специальной серии экспериментов в условиях открытого поля у 4-х черепах исследовали влияние ДМ в середине лета. Обнаружено, что однократное введение ДМ в дозе 0.1 мг/кг вызывает расслабление тонуса мускулатуры, ослабление двигательных реакций, ухудшение реактивности животных и сноподобное состояние. Ориентировочно- исследовательская деятельность подавлена. Глазные щели закрыты, животные не реагируют на приближение экспериментатора. На 16-й день после введения дерморфина ЧДД и ЧСС урежаются до 6.2±117 дых. дв./мин. и 21.0±3.0 серд. сокр./мин., соответственно. Было обнаружено, что по мере удержания высокой температуры окружающей среды эти поведенческие изменения углублялось и наблюдалось глубокие торможения инстинктивных форм поведения. На этом фоне выработать условно- рефлекторную деятельность не удалось. Следует подчеркнуть, что аналогичная картина нарушений поведенческой деятельности у интактных черепах в естественных условиях обычно наблюдается в период впадения животных в состояниях эстивации и гипобиоза.

Вышеизложенные данные и их анализ свидетельствуют о том, что на уровне рептилий подкожное введение ДМ в дозе 0.1. мг/кг приводит к значительным поведенческим нарушениям, сопровождающимся изменением вегетативных, электрографических и условно-рефлекторных фоновых показателей. ДМ вызывает значительное ухудшение условно- рефлекторной деятельности мозга, появление сноподобного состояния.

Изложенные экспериментальные данные, их анализ и сопоставление с имеющимися в литературе немногочисленными косвенными данными в этом аспекте позволяют нам высказать несколько положений об эволюционных закономерностях у одного из представителей ленте- и зимоспящих – степных черепах, о нейрофизиологических и нейрохимических механизмах, лежащих в индукции процессов эстивации и гипобиоза. Анализ изменений условно-рефлекторной деятельности в процессе впадения в эстивацию и гипобиоз показал, что у черепах впадение в эстивацию наступает «с места». При этом одновременно угнетаются все формы нервной деятельности: приобретенные и врожденные. По ряду условно- рефлекторных критериев: наличию парадоксальных и ультрапарадоксальных отношений, пространственной дезориентации при вероятном выборе пищесодержащей кормушки, характеру изменений врожденных реакций, увеличению спонтанной двигательной активности, высокой тактильной чувствительности весьма напоминает картину невротических нарушений, имеющую место у рептилий и млекопитающих в ряде работ (Нуритдинов, Ивазов, 1992; Нуритдинов, Сафаров, 2002; Нуритдинов, Холбеков, 2002; Сафаров, Нуритдинов, 1999; Устоев, 1986, 2000).

Одним их наиболее сложных и дискуссионных вопросов является вопрос о сохранении предварительно накопленного объема биологически полезной полисенсорной информации на фоне эстивации и гипобиоза, и о ее адаптивной реализации после естественного пробуждения летне и зимоспящих животных из продолжительной спячки. Обнаружено через 1.5-2 недели после пробуждения из гипобиотического состояния у рептилий картина условно-рефлекторной деятельности по критерию осуществления и величине отсроченных реакций была таковой, какая имела место у этих животных до эстивации, в активный период жизнедеятельности. В то время как у необученных черепах для выработки именно этих форм нервной деятельности требуется длительное (до 2-х месяцев и более) время.

По электрофизиологическим данным ряда авторов (Аристокесян, Карманова, Нуритдинов, 1990; Белоусов, 1993; Карманова, Аристокесян, Шиллинг, 1987; Карманова, Оганесян, 2004; Нуритдинов, 1992, 1995; Соллертинская, Авакян, Сафаров, Нуритдинов, 1980; Штарк, 1970; Kayser, 1961; South et al., 1972 и других) в период спячки электрическая активность коры мозга представлена зоной молчания, в то время как подкорковые структуры в течение всего периода спячки активизированы. Динамика подавления электрической активности при вхождении в спячку подчинена следующему градиенту: неокортекс-ретикулярная формация среднего мозга- -таламус-гипоталамус-гиппокамп-амигдала. Для восстановления электричес-кой активности мозга пробуждающегося из спячки животного свойственна обратная последовательность «включения» этих структур. Согласно Геллеру и др. (Heller et al., 1978) функционирование на фоне зимней спячки «лимбическая система–средний мозг» является доказанным.

В условиях ряда экспериментов установлено, что гипокампэктомия степных черепах приводит к значительному нарушению условных двигательно-пищевых отсроченных рефлексов, но на процессы эстивации не оказывает влияние, т.е. предварительная гиппокампэктомия не препятствует индукции эстивации и гипобиоза (Нуритдинов, Холбегов, Чориев 2002; Устоев, Чориев, Ахмедов 2007; Холбегов, Устоев, Чориев 2011 ). Можно предположить, что в основе эстивации и гипобиоза лежат различные нейрогуморальные и церебральные механизмы, а гиппокампальная кора служит лишь «пусковым механизмом» этих состояний. Об этом свидетельствует также изучение нейрофизиологических, соматовегетативных и поведенческих характеристик сноподобных состояний у степной черепахи, которое позволило И.Г.Кармановой 1977 и ее сотрудникам выделить состояние П-2 первичного сна как эволюционным предшественником эстивации и гипобиоза (Карманова, 1977; Карманова, Аристокесян, Шиллинг, 1987; Карманова, Белич, Пастухов, Чепкасов, 1983; Карманова, Нуритдинов, 1991; Карманова, Сафаров, Нуритдинова, 1989; Карманова, Оганесян, 2004).

Однако, спектральный анализ распределения волн ЭЭГ показывает, что если в активный период бодрствования черепах доминирующей формой нейрональной активности является дорзальный гиппокамп при температуре мозга 34-32°С низковольтные колебания частотой 30-15 Гц, то доминирующая активность этих же структур в период эстивации при температуре мозга 27-25°С становятся потенциалы частотой 5-7 Гц. Дальнейшее снижение температуры мозга на фоне эстивации до 22°С и ниже сопровождается преобладанием в гиппокампальной коре синхронизированных колебаний частотой 4-5 Гц и амплитудой 120-80 мкВ. В общей коре доминирующую активность составляют мелкие колебания порядка 20-30 Гц, характерные для форм покоя промежуточного сна. Последнее, вероятно, показывает, что эстивация на этапе рептилий реализуется через промежуточную фазу сна и роль вероятного триггера в этом выполняют структуры гиппокампальной и общей коры мозга.

Вопрос о нейропептидной регуляции процессов эстивации и гипобиоза является одной из наиболее актуальных и наименее исследованных проблем в современной нейрохимии. Полученные нами экспериментальные данные приводит к высказыванию нескольких предположений о значении опиатной дерморфиновой системы в регуляции процесса спячки в целом, о вероятной специфической роли ДМ в механизмах эстивации о возможной коррекции функционального состояния организма рептилий путем инъекции нейропептида ДМ. Установлено, что системное введение ДМ представителю летне- и зимоспящего животного – степной черепахе сопровождается у них снижением температуры тела, кратковременным впадением в сноподобное состояние, нарушением дыхательного и сердечного ритма, выраженным анальгетическим эффектом и изменением ВНД. При этом длительность сноподобного состояния, имитирующего в определенной степени эстивацию с одной стороны, на низших этапах эволюции (рептилий) пролонгирована, с другой – наиболее выражена в летний период, период впадения в эстивацию. Подобные закономерности не обнаруживается у представителей другой дивергентной линии рептилий – серого варана. В связи с этим возникает вопрос, что специфического вносит ДМ в регуляцию функционального состояния зимоспящих и каков его возможный механизм действия? В сравнительно-физиологических исследованиях А.И. Карамяна и его учеников (Карамян, Соллертинская, Нуритдинов, 1990; Нуритдинов, 1992, 2002, 2004; Нуритдинов, Соллертинская, 1990; Нуритдинов, Дустов, Бозоров, 2002; Нуритдинов, Мирзаева, 2005; Соллертинская, Нуритдинов, Обухова, 1992; Соллертинская, Нуритдинов, Обидова, 1990 и других) было установлено, что введение опиоидных нейропептидов бета-эндорфина, дерморфина и бомбезина зимоспящим (рептилии, насекомоядные, грызуны) сопровож-дается у них выраженными поведенческими изменениями и наступлением зимней спячки. Эффекты наиболее демонстративны в условиях экспериментального невроза. При этом, при неврозе по тормозному типу наблюдается аналогия с эффектами ДМ и впадение в заторможенное состояние. Однако, как свидетельствуют исследования ряда авторов (Соллертинская, Нуритдинов, Обухова, 1992; Нуритдинов, 1992; Нуритдинов, 2004 и другие), влияние ДМ на организм зимоспящих животных более выражено и в первую очередь на те функциональные системы, которые связаны с состоянием летней и зимней спячки млекопитающих (терморегуляционная, метаболическая, вегетативные). Однако наши данные указывают на то, что эффекты ДМ на этапе рептилий более пролонгированы по сравнению с млекопитающими, как по таким неспециализированным критериям, свойственным всем позвоночным, как анальгетический эффект, так и по более специфичным, как угнетение вегетативных показателей и впадение в сноподобное состояние. Это в целом согласуется с гипотезой Д. Липмана (Lypman, 1981), согласно которой ДМ может быть рассмотрен как примитивный механизм протеинового синтеза, ранее использованного в эволюции. Однако этот вопрос гораздо сложнее и не может быть рассмотрен однобоко. Учитывая гипотезу И.П. Ашмарина о принципах каскадной регуляции в действии регуляторных пептидов можно предположить, что в данном случае мы имеем дело с запуском пептида, синтезируемых в гипоталамических образованиях мозга. Косвенным доказательством возможного участия гипоталамуса (его переднего отдела) является имеющее место снижение температуры тела и урежение вегетативных показателей. Р.С. Монтекуччи (Montecuchi, 1981) который высказал предположение о возможном наличии ДМ в мозге.

ВЫВОДЫ

1. Способность к периодической эстивации характерна для теропсидной линии рептилий - степной черепахи и зависит от температуры окружающей среды и бескормицы в летний сезон года.
2. У предварительно обученных черепах после естественного пробуждения из гипобиоза (весной следующего года) отсроченные условные реакции вырабатываются и стабилизируются значительно быстрее, по сравнению с таковыми у необученных животных в этот же период года. По-видимому, это свидетельствует о том, что в периоды эстивации и гипобиоза имеет место сохранение ранее полученной биологически полезной информации, извлечение которой после пробуждения животных из спячки происходит быстрее, чем выработка новых условных связей у интактных животных.
3. У предварительно гиппокампэктомированных черепах в период вхождения в эстивацию условно-рефлекторная деятельность нарушается полностью. Это доказывает о наличии последовательного превентивного торможения процессов высшей нервной деятельности и функциональной дезинтеграции мозга эстивирующих черепах. Отсутствие гиппокампальной коры мозга не препятствует наступлению процесса эстивации.
4. Активность различных отделов головного мозга степных черепах в цикле «бодрствование-эстивация» представлена колебаниями биопотенциалов широкого спектра, обусловленного полифункциональностью различных структур конечного мозга и особенностями их морфо- функциональных связей.
5. У черепах подкожное введение нейропептида дерморфина (0.1 мг/кг) приводит к значительным поведенческим нарушениям, сопровождающимся изменением вегетативных и нейрофизиологических показателей, анальгезией, впадением в сноподобное состояние. Учитывая принципы каскадной регуляции в действии регуляторных пептидов можно предположить, что дерморфин является специфическим индуктором эстивации и гипобиоза.
6. Эстивация и гипобиоз как идиоадаптивные явления, вероятно, являются древнейшими формами природной адаптации. Их возникновение на этапе рептилий соответствует различным периодам эволюционных преобразований и критическим этапам развития интегративной деятельности мозга животных филогенетически различной дивергентной линии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Нуритдинов Э.Н., Холбегов М.Ё., Чориев С.А. Физиологическая и биохимическая стратегия гипобиоза и спячки. //Вестник ТГНУ (научный журнал) № 4 Душанбе-2002.С-58-63.

2.Нуритдинов Э.Н., Холбегов М.Ё., Чориев. Гипокампалные механизмы условнорефлекторной деятельности у рептилий. //Вестник ТГНУ № 4 (научный журнал) Душанбе-2002.С-68-73.

3.Устоев М.Б., Чориев С.А., Ахмедов Д.М. Эколого- физиологические характеристика высшей нервной деятельности и эстивации у степной черепахи. //Мат.науч.конф. «Современные проблемы физиологии и морфологии человека и животных» Душанбе-2007.С-120-123.

4. С.А.Чориев., Холбегов.М.Ё., М. Б. Устоев. Наќши ќишри гиппокамп дар фаъолияти рефлектории хазандагон. (Роль гиппокампальной коры в рефлекторной деятельности рептилий- на тадж.яз.) «Ављи Зуњал» Душанбе 2011с.№2. С- 65-68.

5.С.А.Чориев., М.Ё. Холбегов Особенности условнорефлекторной деятельности на фоне зимней спячки (гипобиоза) у черепах. «Актуальные вопросы медицинской науки» Ярослав 2012г С-178.

6.С.А.Чориев., М.Ё Холбегов М.Ё. Влияние нейропептида дерморфина на поведении степной черепахи в активный период жизнедеятельности (весной). «Современная медицина в Таджикистане: проблемы, достижения и перспективы развития» Душанбе-2012г С-94

7.Холбегов М.Ё., Устоев М.Б., Чориев С.А. Особенности условнорефректорной деятельности у зимосящих позвоночных. //Вестник педагогического университета (научный журнал) Душанбе-2012.С- 82-85.