Структурно-функциональная характеристика нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной системы и респираторных отделов легкого крыс в условиях интратрахеального инфицирования
На правах рукописи
Лабутин Илья Викторович
Структурно-функциональная характеристика нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной системы и респираторных отделов легкого крыс в условиях интратрахеального инфицирования
03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Оренбург – 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
| Научный руководитель: | доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Стадников Александр Абрамович |
| Официальные оппоненты: | доктор медицинских наук, профессор Зайцев Валерий Борисович |
| доктор медицинских наук, профессор Полякова Валентина Сергеевна | |
| Ведущая организация: | ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». |
Защита состоится ___/___/2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 208. 066. 04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 460000, Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний Учёного совета
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава»
Автореферат разослан «____»_____ 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
профессор Шевлюк Н. Н.
ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Вопросы изучения закономерностей гистогенезов, тканевой реорганизации макроорганизмов в условиях их интервенции современными бактериальными патогенами являются наиболее важными и малоизученными. Решение их существенно для понимания механизмов клеточных и тканевых реорганизаций в условиях многогранных взаимодействий с прокариотами (Бухарин О.В. с соавт, 2004), что чрезвычайно важно относительно клинических аспектов клеточной биологии и инфектологии.
Благодаря внутригеномным преобразованиям микроорганизмы приобрели способность к значительной изменчивости своих свойств, обеспечивающих противостояние защитным силам млекопитающих, к числу которых относятся и генетически детерминированные свойства и биологические особенности структурных (клеточных, тканевых) элементов эукариот, в том числе и механизмы репаративных гистогенезов (Стадников А.А., 2001, 2005; Стадников А.А., Сеньчукова М.А., 2009). Известно, что наличие антилизоцимной, антиинтерфероновой, антилактоферриновой активностей у микробных патогенов существенно затрудняет реализацию репаративных процессов в различных тканях млекопитающих (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1996; Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997; Ковбык Л.В., 2000; Козлова А.Н., 2009, 2010). Однако до сих пор малоизученными остаются вопросы взаимодействия микроорганизмов, обладающих соответствующим персистентным потенциалом, и тканевых элементов ацинусов лёгких.
Согласно имеющимся данным, респираторный отдел лёгкого (ацинус) состоит из альвеолоцитов, стромальных элементов и сосудов. Однако закономерности межклеточных отношений, принципы дифферонной организации этих элементов остаются до конца невыясненными. До сих пор нет единой точки зрения относительно судьбы дифференцированных клеток в условиях репаративного восстановления тканей легких (Токин И.Б., 1972; Саркисов Д.С., 1973, 1977; Лиознер Л.Д., 1982; Ерохин В.В., Романова Л.К., 2000; Полякова В.С., 2004; Мещеряков К.Н., 2008).
Изучение особенностей регенераторных возможностей альвеолоцитов и структурных компонентов подлежащей соединительной ткани, характер их взаимодействия в очаге повреждения друг с другом, с клетками воспаления и бактериальными патогенами в процессе физиологической и репаративной регенерации до сих пор остаются чрезвычайно актуальным.
Среди важнейших регулирующих систем организма весьма существенна роль гипоталамической нонапептидергической нейроэндокринной системы (ГГНС) в поддержании тканевого и клеточного гомеостаза, обеспечении процессов адаптации и компенсации нарушенных функций различных органов висцеральных систем (Поленов А.Л., 1993; Акмаев И.Г., 1979; Шевлюк Н.Н., Руди В.Н., 2000; Стадников А.А. с соавт., 2000; Валов С.Д., 2001; Кузнецов С.Л. с соавт., 2009). Известно, что в критических ситуациях, сопровождающихся значительной активизацией гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной системы (ГГНС), а также при повреждениях и репарациях различных тканей нонапептиды крупноклеточных ядер гипоталамуса (окситоцин, вазопрессин) осуществляют адаптогенное влияние и имеют важное значение в развитии долговременной (структурной) адаптации клеток и тканей. Кроме того, указанные гуморальные факторы выступают как стимуляторы репаративных гистогенезов (Стадников А.А., 2005, 2010; Канюков В.Н., Стадников А.А., 2009). В отношении влияния ГГНС на диапазон пластичности и реактивности гистологических структур респираторных отделов лёгких данных в настоящее время крайне мало, и они характеризуются противоречивостью.
Таким образом, очевидна необходимость дальнейшего исследования роли и значимости ГГНС в процессах взаимодействия бактериальных патогенов со структурными компонентами респираторных отделов лёгких, её влияния на репаративные возможности ацинусов.
Цель настоящего исследования - установить роль и значимость гипоталамической нейроэндокринной регуляции в процессах структурно-функциональной реорганизации тканевых элементов ацинусов легких в условиях взаимодействия про - и эукариот.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
1. Провести морфофункциональную оценку альвеолярных структур лёгких и нонапептидэргической ГГНС у крыс в условиях интратрахеального введения штаммов Klebsiella pneumoniae, обладающих антилизоцимной активностью (АЛА+) и без таковой (АЛА-).
2. Оценить реактивность и пластичность тканевых элементов лёгочных ацинусов крыс при электролитическом выключении супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса на экспериментальных моделях у интактных животных, а также при введении указанных патогенов.
3. Определить регуляторное влияние гипоталамических нонапептидов на репаративные возможности альвеолярных структур легких в условиях их сокультивирования с крупноклеточными ядрами гипоталамуса (в асептических условиях и после инфицирования животных-доноров) по методу Ф.М. Лазаренко (1959).
Научная новизна: Впервые получены данные о характере адаптивных и дезадаптивных изменений структурных элементов ацинусов легких млекопитающих (крыс) в условиях инфицирования, культивирования и органотипического сокультивирования с нонапептидергическими ядрами гипоталамуса in vivo по Ф.М.Лазаренко.
Впервые установлено прямое позитивное влияние нонапептидов гипоталамуса на диапазон органо - и гистобластических потенций клеток легочных ацинусов в условиях интратрахеального инфицирования. Обоснованы критерии оценки персистентных свойств бактерий на основе ультраструктурных данных и показателей апоптозной доминанты нейросекреторных клеток супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса крыс при их инфицировании штаммами Klebsiella pneumoniae, обладающими антилизоцимной активностью.
На современном методическом уровне (электронная микроскопия) использован оригинальный метод Ф.М. Лазаренко (1959) культивирования тканей in vivo, в том числе при сокультивировании респираторных отделов легкого крыс с крупноклеточными ядрами гипоталамуса, что позволило получить приоритетные данные и раскрыть новые возможности данного метода экспериментальной гистологии. Сформулировано положение о регулирующей роли нонапептидергической ГГНС в процессах взаимодействия бактериальных патогенов со структурными компонентами респираторных отделов лёгких в аспекте оптимизации репаративных гистогенезов.
Теоретическая и практическая значимость: Полученные результаты позволяют дополнить существующие представления о закономерностях репаративных процессов в легочных ацинусах млекопитающих и их нейроэндокринной регуляции. Обоснована позитивная роль гуморальных факторов нонапептидергических нейросекреторных ядер гипоталамуса в регуляции тканевого и клеточного гомеостаза альвеолоцитов, сосудистых и стромальных компонентов респираторных отделов легких млекопитающих животных в условиях микробной интервенции. В своей совокупности это позволяет сформулировать новое направление в области клеточной биологии, которое обозначается как нейроэндокринная регуляция взаимодействий про- и эукариот. Полученные результаты могут быть использованы при разработке проблем патологии органов дыхания, позволят существенно расширить и углубить имеющиеся представления о закономерностях репаративных процессов в ацинусах млекопитающих, о роли гипоталамических нонапептидов в репаративном гистогенезе структурных элементов респираторных отделов лёгких. Это создаст предпосылки для дальнейшего развития учения о биологии тканей, а также совершенствования научной базы для клинической пульмонологии.
Положения, выносимые на защиту:
1 Выраженность воспалительно - деструктивных изменений в ацинусах легких при интратрахеальном инфицировании имеет прямую зависимость от обладания микроорганизмом персистентных свойств (в частности антилизоцимной активности).
2. Характер и выраженность фаз нейросекреции нонапептидергических ядер гипоталамуса отражают персистентный потенциал Klebsiella pneumoniae, антилизоцимная активность которых усугубляет процессы рассинхронизации секреторного цикла, вплоть до блокирования высвобождения нейросекреторных продуктов на уровне аксовазальных комплексов в нейрогипофизе.
3. Электролитическое выключение супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса лимитирует реализацию альвеолярными структурами респираторных отделов легких экспериментальных животных своих органотипических и гистобластических потенций, включая процессы репарации.
4. Гипоталамические нейропептиды оказывают позитивное влияние на адаптивную реорганизацию структурных элементов легочных ацинусов в условиях интратрахеального инфицирования, что обосновано методом культивирования по Ф.М. Лазаренко (1959).
5. Адаптивный характер воздействия нонапептидергической ГГНС на клеточный и тканевой гомеостаз альвеолоцитов респираторных отделов легких проявляется дистантно и паракринно через активизацию репаративных процессов фибробластов, макрофагов, эндотелиоцитов и адвентициальных клеток.
Внедрение результатов исследования
Основные результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии; фтизиатрии Оренбургской государственной медицинской академии при изложении материала на лекциях и проведении практических занятий со студентами.
Апробация работы: Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2008), Всероссийской конференции «Медицинская наука и образование Урала» (Челябинск, 2008), Всероссийской научной конференции «Вопросы морфологии ХХI века» (Санкт – Петербург, 2010), Х Конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 6 в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована 57 рисунками, 3 таблицами. Библиография включает 157 отечественных и 88 зарубежных источников. Диссертация написана на русском языке.
Собственные исследования
Материал и методы исследования
Эксперименты проведены на 146 белых беспородных лабораторных крысах-самцах массой 210-250 г. В соответствии с поставленными задачами настоящей работы объектами исследования служили легкие, нейрогипофиз, а также фрагменты гипоталамуса, содержащие супраоптические (СО) и паравентрикулярные (ПВ) ядра. Сведения по количественному распределению материала по сериям экспериментов представлены в таб. 1
Таблица 1
Количественное распределение материала по сериям и срокам экспериментов
| Серия эксперимента | Сроки эксперимента | Количество животных |
| Интратрахеальное инфицирование штаммами Kl. Pneumoniae АЛА+ | 1 | 4 |
| 3 | 4 | |
| 7 | 4 | |
| 21 | 4 | |
| Интратрахеальное инфицирование штаммами Kl.
Pneumoniae АЛА- | 1 | 4 |
| 3 | 4 | |
| 7 | 4 | |
| 21 | 4 | |
| Контрольные животные | 1 | 3 |
| 3 | 3 | |
| 7 | 3 | |
| 21 | 3 | |
| Интратрахеальное инфицирование штаммами Kl. Pneumoniae АЛА+ животных с разрушенными крупноклеточными ядрами гипоталамуса | 1 | 4 |
| 3 | 4 | |
| 7 | 4 | |
| Интратрахеальное инфицирование штаммами Kl. Pneumoniae АЛА- животных с разрушенными крупноклеточными ядрами гипоталамуса | 1 | 4 |
| 3 | 4 | |
| 7 | 4 | |
| Контрольные животные | 1 | 4 |
| 3 | 4 | |
| 7 | 4 | |
| Совместное культивирование альвеолярных структур легких крыс, инфицированных штаммами Kl. Pneumoniae АЛА+ и крупноклеточных ядер гипоталамуса | 1 | 9 |
| 3 | 9 | |
| 7 | 9 | |
| Совместное культивирование альвеолярных структур легких крыс, инфицированных штаммами Kl. Pneumoniae АЛА- и крупноклеточных ядер гипоталамуса | 1 | 9 |
| 3 | 9 | |
| 7 | 9 | |
| Контрольные животные | 1 | 4 |
| 3 | 4 | |
| 7 | 4 | |
| Всего животных | 146 |
Было проведено 3 серии опытов. В первой серии (16 животным) проводилось интратрахеальное введение Kl. pneumoniae, обладающих антилизоцимной активностью (АЛА+). Под эфирным рауш-наркозом с помощью инсулинового шприца интратрахеально вводили 200 млн микробных тел штаммов Kl. Pneumoniae, содержащихся в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия. Вывод их из эксперимента проводился на 1,3,7,21 сутки (по 4 особи). 16 животным было проведено интратрахеальное введение штаммов Kl. pneumoniae, не обладающих АЛА (по 4 особи на 1,3,7,21 сутки). Для контроля использованы 12 интактных животных (по 3 на каждой стадии серии).
Во второй серии было проведено электролитическое разрушение супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса по методике А.А. Стадникова и А.Н. Варламова (1983) с последующим (через сутки) интратрахеальным введением Kl. pneumoniae с АЛА+ (12 животным с выводом из эксперимента по 4 особи на 1,3,7 сутки) и АЛА- (12 животным с выводом из эксперимента по 4 особи на 1,3,7 сутки). на базе известной конструкции для трансаурикулярной гипофизэктомии у крыс (Федотов Б.А. с соавт.,1971). Для контроля были использованы 12 ложнооперированных животных (трепанация черепа без разрушения ядер гипоталамуса)-по 4 особи на каждой стадии серии.
В третьей серии было проведено совместное культивирование альвеолярных структур лёгких (от крыс, инфицированных Kl. pneumoniae с АЛА+ и АЛА- через 3 суток после введения патогена и интактных животных) с крупноклеточными ядрами гипоталамуса по методу Ф.М. Лазаренко (1959). При этом структуры лёгкого для имплантации были взяты от 24 инфицированных (штаммами Kl. pneumoniae с АЛА+ и АЛА-) крыс и 12 интактных животных. Крысами-донорами для получения ядер гипоталамуса служили 24 интактных животных. Крысами-реципиентами были 36 животных.
Крыс-доноров декапитировали под эфирным рауш-наркозом, производили вскрытие грудной полости и легкие осторожно и быстро выделяли из окружающих тканей и помещали в стерильные чашки Петри с охлажденной (+4°С) средой 199. Взятые кусочки размером 1-1,5мм тщательно промывали в нескольких порциях среды 199 с добавлением стрептомицина в разведении 50000 ед. на 1 мл. Указанные дозы антибиотиков не влияют на результаты эксперимента (Хлыстова З.С., 1958), но предотвращают имплантаты от инфицирования. Затем полученный материал измельчали глазными ножницами до консистенции кашицы. Образовавшуюся массу смешивали с целлоидиновым "песочком" в соотношении 1:2 согласно рекомендациям автора метода (Лазаренко Ф.М., 1959). Затем к полученному материалу добавлялись соответствующие фрагменты гипоталамуса. У животных-реципиентов накануне имплантации производили электролитическое разрушение супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса. После эвтаназии крыс-доноров быстро вскрывалась полость черепа, извлекался головной мозг и помещался в стерильную чашку Петри с охлажденной до +4С средой 199.
Выделение крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса производились при помощи микроскопа МБС-9, используя стереотаксические карты (Буреш Я. с соавт., 1962). Для оценки правильности выделения гипоталамических ядер проводился выборочный анализ взятого для трансплантации материала и оставшихся после выделения ядер частей гипоталамуса.
Прооперированных животных содержали в стандартных условиях вивария. В каждой серии опытов взятие материала осуществляли через 1,3,7 суток от начала имплантации.
Исследовано 72 имплантата через 1,3,7 суток культивирования (по 12 имплантатов на каждой стадии). Вывод животных из эксперимента осуществлялся путем декапитации под эфирным рауш-наркозом. в утренние часы (10.00-11.00). Имплантаты выделяли при помощи ножниц и пинцета, не нарушая целостность наружной соединительнотканной капсулы.
При выполнении исследования соблюдались правила биоэтики, утвержденные приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г., а также принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных или иных целей.
Светооптические гистологические методы. Для светооптического исследования полученный материал фиксировали в 10% охлажденном (t +40C) водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле, жидкости Буэна. Парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм окрашивались гематоксилином Майера и эозином, гликоген и нейтральные гликопротеиды обнаруживали перийодат-ШИФФ реакцией по Мак-Манусу (Пирс Э., 1962). Нуклеиновые кислоты выявляли метиленовым зеленым и пиронином по методу Браше (Пирс Э., 1962). Суммарный белок в срезах определяли по методу Даниэлли (Пирс Э., 1962). Нейросекреторный материал идентифицировали паральдегид-фуксином по Гомори-Габу в модификации А.А. Поленова (1963). Все гистохимические методики сопровождались соответствующими энзиматическими контролями (Пирс Э., 1962).
При проведении иммуноцитохимических исследований на парафиновых гистосрезах осуществляли двухэтапные реакции по идентификации белка-маркера апоптоза – р-53 и антиапоптотического белка bcl-2. На первом этапе депарафинированные срезы подвергали высокотемпературной обработке и инкубации с первыми (специфическими) моноклональными антителами (фирма «Дако», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для визуализации позитивного (р53) иммунного окрашивания клеток применяли стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод с последующим докрашиванием ядер гематоксилином Майера. Параллельно для определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Арорtag Рlus Регохidaze in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Integrin», Канада) с докрашиванием ядер клеток 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере. На втором этапе осуществляли инкубацию гистосрезов с моноклональными антителами bcl-2 и авидин-биотин-пероксидазным комплексом с последующим выявлением пероксидазы диамин-бензидином. Подготовленные таким образом гистологические срезы докрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Подсчет р53 и bcl-2 позитивных клеток производили методом их визуализации в каждом гистологическом срезе (при стандартном увеличении х 900, не менее 200 клеток) в соответствии с рекомендациями А.А. Жданкиной (2006).
Для электронномикроскопического исследования материал фиксировался в 2,5-3% охлажденном (t +40С) растворе глутарового альдегида на S-коллединовом буфере. Постфиксация проведена в четырехокиси осмия по Millonig (1961). Материал обезвоживался в ацетоне либо спирте с возрастающей концентрацией и заключался в ЭПОН-812 или аралдит. Ультратонкие срезы были приготовлены на ультратоме LKB-5 (Sweden-Bromma).
Для прицельного выявления гистологических структур использованы полутонкие срезы, окрашенные капельным способом метиленовым синим и основным фуксином по рекомендациям T. Sato et M.A. Shamoto (1973).
Ультратонкие срезы подвергались двойному контрастированию в 2% водном растворе уранил-ацетата при температуре +370С в течение 2 часов и в цитрате свинца (Reynolds E.S., 1963). Исследование ультратонких срезов производилось на электронном микроскопе ЭМВ 100АК с фотографированием ультраструктур при увеличениях от х6000 до х40000. Электронномикроскопическая гистоавторадиография выполнялась по методике Larra F. et Drozz B. (1970) с введением экспериментальным животным Н3-тимидина.
Морфомертрический метод. Необходимая количественная информация о размерах ядер, ядрышек, цитоплазмы альвеолоцитов, ядерно-цитоплазматических (ЯЦО) и ядрышко-ядерных (ЯдрЯО) отношениях была получена в ходе морфометрических исследований при использовании винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15ху42 и окулярных вставок (Автандилов Г.Г., 1984).
Вычисление площади поверхности ультраструктур производилось одномоментным наложением на электронограмму квадратной сетки (размер квадрата 10х10 мм), содержащей внутри каждого квадрата 25 точек (расстояние между точками 1,5 мм). Снятие морфометрических параметров осуществлялось путем подсчета точек, проецирующихся на срез ультраструктуры (А.С. Якубов, В.А. Кац, 1984).
Статистический метод. Статистическая обработка количественных данных, построение таблиц произведена на ПЭВМ Pentium III c использованием пакета программ “Statistica 5,5 for Windows” и программного пакета “MS Excel 2000”. Производили подсчет среднеарифметических значений абсолютных и относительных величин (М), ошибок средних величин (m) и стандартных отклонений (s). Полученные в работе количественные данные подвергнуты статистической обработке в соответствии с рекомендациями П.Ф. Рокитского (1973) и Г.Г. Автандилова (1990). Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента. Различия средних величин считали достоверными при уровне значимости р<0,05 (95%).
Результаты собственных исследований
При исследовании альвеолярных структур легких инфицированных крыс на светооптическом уровне у животных на ранних стадиях эксперимента (1-3сут) наблюдались явления прогрессирующей инфильтрации легочных ацинусов нейтрофилами, лимфоцитами, эозинофилами, плазматическими клетками, на фоне выраженного интерстициального отека. Кроме того, выявлены признаки разрушения и фрагментации межальвеолярных перегородок. Повышение сосудистой проницаемости приводило к выраженной экссудации и набуханию межуточного (основного) вещества стенок альвеол. Следует отметить, что экстравазация плазмы и форменных элементов крови в просвет альвеол до 3-х суток эксперимента (инфицирование АЛА-) удерживается альвеолоцитами I типа, сохраняющими свои межклеточные контакты. При инфицировании же персистентным штаммом бактерий (АЛА+) данный эффект не наблюдался. При этом отмечались явления выраженной дистрофии и некробиоза альвеолоцитов, что и усугубляло развитие экссудативной пневмонии (рис. 1).
Рис. 1. Легочная альвеола крысы в условиях инфицирования Kl. рneumoniae АЛА+
Стадия: 3 сут
Полутонкий срез. Окраска: по Sato et Shamoto
Стрелками показаны деструктивно измененные альвеолоциты
Ув. об.40, ок. 10
В данных условиях просветы альвеол резко суживаются (вследствие отечного утолщения их стенки). Одновременно регистрируется спазм бронхиол, в просвете которых идентифицируются бактериальные агенты.
В респираторных альвеолах (при инфицировании персистентным штаммом бактерий АЛА+) определяются скопление эозинофилов, фибрина, макрофагов и слоистых компонентов дезорганизованного сурфактанта. Можно полагать, что в данных условиях опыта имеет место быть существенное повреждение сурфактантной системы, что и приводит у экспериментальных животных к развитию ателектазов.
В очагах воспаления отмечается незавершенный фагоцитоз со скоплением полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) и выпотом фибрина. В центральных зонах подобных очагов выявляются некротически измененные альвеолоциты, окруженные фибринозным или серозным экссудатом. О незавершенности фагоцитоза бактерий, обладающих АЛА+, свидетельствует также обнаружение внутриклеточно локализованных патогенов. Ультраструктурный анализ показал, что такого рода микроорганизмы сохраняли электронноплотный нуклеоид. Вместе с тем клеточная оболочка приобретала узурированные контуры, что могло быть связано с литическим разрушением структур клеточной оболочки. Следует особо подчеркнуть, что подобного «укрытия» микробов в цитоплазме макрофагов не было нами зарегистрировано в случае контаминации бактериями без АЛА.
При инфицировании экспериментальных животных штаммом микроорганизмов с АЛА, последние определялись и в просвете гемокапилляров аэрогематического барьера. В этих случаях они имели разрыхленный нуклеоид, резко разрушенную клеточную оболочку, что вероятно связано с антибактериальными воздействиями плазменных факторов крови (которые однако не приводили к полному лизированию бактерий). С другой стороны данные наблюдения со всей очевидностью свидетельствуют о феномене транслокации бактерий с АЛА через эпителиальные барьеры воздухоносных и респираторных отделов легких в условиях интратрахеального инфицирования.
При введении бактериального патогена с высокими персистентными свойствами через 7 суток эксперимента развивались морфологические признаки, характерные для интерстициальной пневмонии. Они сопровождались разрушением сурфактантной системы и развитием выраженного отека альвеолоцитов, стромы ацинусов. Их стенки инфильтрированы лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками.
Некроз альвеолоцитов I типа наиболее выражен в сочетании с фибринозным выпотом в полость альвеол. В этих же зонах легкого отмечены явления васкулита с тромбозом сосудов микроциркуляторного русла, развитием геморрагических инфарктов. В более поздние сроки отмечается разрастание соединительной ткани в области аэрогематического барьера, что приводит к очаговому склерозу в участках воспаления либо ателектазов.
Установлено, что при прямом контакте с Klebsiella pneumonia АЛА+ клеточные элементы легочных ацинусов имели признаки ультраструктурных и иммуноцитохимических изменений (в цитоплазме возрастало число лизосом и аутофагосом, эндоплазматический ретикулум резко расширялся, увеличивался объем ядер с деконденсированным хроматином, возрастали размеры перинуклеарных пространств и поровых комплексов, достоверно повышалось количество клеток с признаками апоптоза по показателям экспрессии синтеза протеина р-53. Число клеток, вступающих на путь программированной гибели, было значительно большим в случае инфицирования бактериями с АЛА+, нежели при интратрахеальном введении микробов, не обладающих таковой активностью.
Данная закономерность прослеживалась нами и по показателям деградации ДНК, установленной TONEL-методом (табл 2).
Таблица №2
Уровень деградации ДНК (Apoptag позитивные стромальные элементы ацинусов легких крыс: интактные (А), инфицированные Kl. Pneumoniae АЛА- (Б) и Kl. Pneumoniae АЛА+ (В) через 7 сут эксперимента (%)
| А n=3 | Б n=5 | В n=5 | |
| Стромальные клетки ацинусов | 0,4+0.01 | 3.7+0.02 | 5,5+0.01* |
*p< 0.05
Примечание: идентификацию клеток осуществляли при визуализации гистологических препаратов в условных полях микроскопа МБИ-15, окуляр-вставка 0,25мм2, об. 90, ок. 10
Важнейшим компонентом развивающегося воспалительного процесса у экспериментальных крыс является альтерация. В стенке альвеол это касается локальных некробиотических повреждений альвеолоцитов и эндотелиоцитов. Данные изменения, включая усиление процессов апоптоза, протекают на фоне интенсивной полиморфноклеточной инфильтрации (нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты, тучные клетки) вследствие резкой вазодилятации гемокапилляров и усиления экстравазации плазмы и форменных элементов крови. Данные изменения, приводящие к локальным некрозам, особенно характерны при клебсиеллезных пневмониях (Ерохин В.В., Романова Л.К., 2000).
При введении бактерий АЛА+ особенно выражены процессы отека паренхимы и стромы легкого. В этом случае преобладал диапедез эритроцитов. При АЛА- превалировала миграция лейкоцитов. По данным патологов (Цинзерлинг В.Д., 1963, Струков А.И с соавт, 1984) течение пневмонии с «красным опеченением» является более тяжелым, с фатальными последствиями, по сравнению с вариантом «серой гепатизации».
Светооптическая и ультраструктурная оценка состояния супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса при инфицировании животных штаммом Klebsiella pneumoniae АЛА- показала, что в ГГНС наблюдались выраженная активизация секреторного процесса в нейросекреторных центрах подбугорья и усиление высвобождения нейропептидов в общую гемоциркуляцию на уровне нейрогипофиза. Количество НСК с признаками депонирования нейросекрета невелико (6-10%).
В условиях интратрахеального введения Klebsiella pneumoniae АЛА+ в гипоталамусе и нейрогипофизе на фоне гиперсекреции нейропептидов происходили деструктивные изменения нейросекреторных клеток и существенная задержка выведения нейрогормонов на уровне аксовазальных контактов. Прежде всего, менялось соотношение «светлых» и пикноморфных НСК в пользу последних. При этом НСК, находящиеся в состоянии длительной гиперсекреции, имели сильно гипертрофированный перикарион, округлые пузыревидные ядра, бедные хроматином. Канальцы гранулярного эндоплазматического ретикулума, теряя рибосомы, превращались в вакуолеподобные структуры диаметром 800-1100 нм. В данных клетках нарушалась ультраструктура аппарата Гольджи и митохондрий. Весьма характерным для данных НСК является большое количество лизосом, аутофагических вакуолей и мультиламеллярных телец. Часть таких клеток дегенерирует (подобные клеточные элементы имеют угловатую, различной степени сжатости форму тела и пикнотические ядра).
Интенсификация функционирования приводит к более активному износу и дегенерации НСК, в силу чего количество их удваивалось. В последних были обнаружены явления апоптоза. Увеличение дегенерирующих клеток более чем в 2 раза позволило выявить развитие начальных признаков истощения среди клеток СОЯ.
В условиях электролитического разрушения супраоптических либо паравентрикулярных ядер мы получили однотипный ответ структурных изменений респираторных отделов легких экспериментальных животных. В своей совокупности их можно было охарактеризовать как деструктивно-реактивные.
Во время фазы деструктивно-реактивных изменений (1-3 сут) наблюдается усиление кровенаполнения сосудов, развитие неравномерно выраженного интерстициального и внутриальвеолярного отека. Отмечается также мозаичное утолщение межальвеолярных перегородок.
Изменения в ультраструктурной организации сурфактантного альвеолярного комплекса выражаются в неравномерности толщины гликокаликса альвеолоцитов, локальном его истончении, сглаживании микроворсинок. В просветах отдельных альвеол появляются десквамированные эпителиоциты, хлопьевидный материал в сочетании с фрагментами сурфактанта. В этих участках легких регистрируются микроателектазы.
На ультраструктурном уровне выявляются признаки внутриклеточного отека альвеолоцитов 1-го типа и эндотелия кровеносных капилляров (формирование везикул крупных размеров, локализация микропиноцитозных пузырьков у плазмолеммы, расширение цистерн агранулярной эндоплазматической сети). Одновременно происходит увеличение размеров митохондрий с просветлением их матрикса и редукцией крист. Имеет место микроклазматоз, сопровождающийся отрывом фрагментов цитоплазмы отечно измененных клеток.
На фоне развития внутриклеточного отека появляются микродефекты в плазмолемме респираторных альвеолоцитов. У них наблюдается отек ядра. Как показали исследования В.В. Ерохина, Л.К. Романовой (2000), стойкий и выраженный локальный внутриклеточный отек компонентов аэрогематического барьера как правило приводит к снижению его диффузионной способности.
Альвеолоциты 2-го типа явились более устойчивыми. Их ультраструктура изменяется незначительно во время описываемой фазы.
Указанные изменения нарастали в более поздние сроки наблюдений (7 сут).
При инфицировании Kl. рneumoniae АЛА+ у данных животных воспалителная реакция альвеолярных структур носит дисрегенераторный характер. На экспериментальном материале показаны серьезные нарушения гемоциркуляции на фоне микроателектазов. Прежде всего это проявилось в спазмировании микрососудов и микротромбозами в гемокапиллярах (рис. 2).
Рис. 2. Микротромбоз в гемокапилляре легочной альвеолы крысы в условиях электролитического разрушения паравентрикулярных ядер гипоталамуса и дополнительного инфицирования Kl. рneumoniae АЛА+ (стадия 7 сут)
Ув. х24500
При инфицировании бактериями с АЛА+ повреждения эндотелия носят необратимый характер, заканчивающийся деструкцией клеток с некрозом перикапиллярной зоны.
Таким образом, наблюдаемые процессы могут быть связаны с прямым повреждением эндотелиоцитов, последующим присоединением секвестрации лейкоцитов и тромбоза микрососудов. Такая последовательность событий характерна для токсемии бактериальной этиологии (Pratt P.C. et al, 1979; Katzenstein A.L., 1982). В своей совокупности морфологические изменения у экспериментальных предварительно инфицированных животных с разрушенными гипоталамическими ядрами укладывались в картину отдельных признаков «шокового легкого» (острого респираторного дистресс-синдрома).
Исследования реактивных изменений альвеолярных структур легкого крыс в условиях их сокультивирования in vivo с крупноклеточными ядрами гипоталамуса in vivo по методу Ф.М. Лазаренко (1959) показали, что через 1 сут сокультивирования кусочки имплантата дискомплексированы и представлены фрагментированными структурами альвеол. Обнаруживаются лейкоциты и мононуклеарные фагоциты. Отмечались тесные контакты между альвеолоцитами и лейкоцитами. При этом в области их взаимодействия, происходит разрыхление компонентов базальной мембраны, нарушение целостности цитолеммы альвеолоцитов и выход органелл в межклеточное и перикапиллярное пространство. В этот период наблюдается существенная активизация клеток фибробластического ряда (как клеток донорского материала, так и реципиентов). Соединительная ткань разрастается, обрастает каждый имплантированный кусочек. Одновременно происходит врастание в имплантат гемокапилляров.
В каждом имплантированном кусочке можно выделить две зоны: центральную и периферическую. Клеточные элементы центральных участков имплантата дегенеративно изменены. Однако в небольших фрагментах имплантатов клетки центральной зоны сохранялись лучше, и участок некроза был незначительным. В периферических участках кусочка переживание тканевых структур выражено в большей степени, и на фоне умеренных депрессивных изменений в данной области наблюдается заметный клеточный гетероморфизм. Было установлено, что массивная гибель альвеолоцитов наблюдалась в имплантатах крыс, инфицированных штаммами Kl. pneumoniae с АЛА+.
Идентифицированы 3 основных типа альвеолоцитов, которые отличались друг от друга структурными изменениями, а также выявлены переходные формы между ними.
Во-первых, определялись сохранные альвеолоциты. Такие клетки не имели выраженных дегенеративных изменений цитоплазмы и содержали светлые ядра овальной формы. При ультраструктурном исследовании в таких переживающих альвеолоцитах отсутствовала дискомплексация внутриклеточных структур и не наблюдались разрывы цитолеммы. Митохондрии в клетках были незначительно увеличены в размерах и содержали частично разрушенные кристы. Ядра переживающих альвеолоцитов содержали больше эухроматиновых компонентов. Данные клетки сохраняли способность к своей репродукции. Сохранялась целостность наружной и внутренней мембран кариолеммы. Этот тип чаще наблюдался в имплантатах от крыс, инфицированных штаммами Kl. pneumoniae с АЛА-.
Во-вторых, присутствовали дегенерирующие альвеолоциты. Они имели ядра с выраженными явлениями пикноза, рексиса и последующего лизиса. При ультраструктурном исследовании в дегенерирующих альвеолоцитах всегда наблюдалась дискомплексация внутриклеточных структур. Обнаруживался выраженный полиморфизм митохондрий. Часто отмечались разрывы наружной мембраны органелл, при этом митохондриальный матрикс был «вымыт». Другие митохондрии, уплотненные, имели гребенчатые кристы с электронноплотным матриксом, в проекции которых определялись аморфные осмиофильные включения. Отмечались разрывы цитолеммы и выход органелл в межклеточное пространство. Нередко можно было видеть деструкцию периферической части клеток с образованием фрагментов цитоплазмы, содержащих аутофагические вакуоли, остатки митохондрий. Ядра подобных альвеолоцитов были набухшие (в других случаях были сморщенные). Отмечались выраженная маргинация хроматина и образование крупных гетерохроматиновых участков, отек и просветление кариоплазмы. Перинуклеарное пространство в отдельных участках расширено, с повреждением кариолеммы.
Третий тип альвеолоцитов составили перестраивающиеся клетки. Главным признаком подобных альвеолоцитов на светооптическом уровне является присутствие сохранного ядра в проекции дегенеративно измененной периферической цитоплазмы. Ультраструктурный анализ позволил нам получить дополнительную информацию об особенностях строения таких клеточных форм. Установлено, что особенностью перестраивающихся альвеолоцитов является наличие в проекции их клеточной территории структурно сохранного ядра, заполненного эухроматином с незначительными участками его прикариоллемной конденсации.
В обнаруженных ядерно-цитоплазматических участках содержались многочисленные небольшие митохондрии с единичными сохранными кристами. При этом одни митохондрии подвергались процессу аутолиза, другие же, утратив кристы и сохраняя целостность наружной и внутренней мембран, приобретали вид двумембранных вакуолей, заполненных хлопьевидным материалом. В мелкозернистой цитоплазме отмечались короткие канальцы гранулярного эндоплазматического ретикулума. Кроме того можно было наблюдать крупные и мелкие вакуоли, заполненные хлопьевидным детритом.
На стадии 1-3 сут культивирования среди других клеток легких отмечался выраженный гетероморфизм реактивных изменений. В общей популяции таких клеток присутствовали дегенеративно измененные, жизнеспособные и активизированные клеточные формы.
Имплантированные структуры через 3 суток сокультивирования оказывались окруженными несколькими слоями фибробластов и рыхло расположенных коллагеновых волокон В этот же период между имплантированными кусочками и на их периферии появляются мигрирующие фибробластические элементы. На светооптическом уровне имплантаты выглядели значительно уменьшенными в размерах по сравнению с предшествующей стадией имплантации. При этом основную часть легочной ткани представляли дегенеративно измененные альвеолоциты, особенно в имплантатах от крыс, инфицированных штаммами Kl. pneumoniae с АЛА+.
Через 7 сут от начала сокультивирования фрагментов легких с участками гипоталамуса в проекции разрушающихся альвеолоцитов наблюдались многочисленные макрофагоподобные клетки. В данных условиях опыта присутствовали более крупные макрофагоподобные клетки, по сравнению с условиями культивирования легких без ядер гипоталамуса. Такие клетки имели четкие контуры, крупные овальные или округлые ядра с большими ядрышками и вакуолизированную цитоплазму. Морфометрическое исследование подтвердило также, что в таких происходит одновременное увеличением как объема их ядер, так и цитоплазмы. Кроме того в ядрах этих клеток отмечался рост объема ядрышек (табл 3).
Таблица 3
Морфометрические показатели: фибробластоподобные клетки (Ф) и макрофагоподобные клетки (М) через 7 сут совместного культивирования фрагментов легких с крупноклеточными ядрами гипоталамуса (М±m)
| Измеряемый параметр | Контроль | Опыт |
| Объем ядер Vям (мкм3) | 105,7±23,4 | 214,2±58,7* |
| Объем цитоплазмы Vцм (мкм3) | 4487,7±1204,3 | 7858,3±984,5 |
| Объем ядер Vяф (мкм3) | 345,1±56,8 | 340,9±54,7 |
* Различия по сравнению с контролем значимы при Р<0,05.
Морфометрический анализ показал, что перенос фрагментов гипоталамуса в область формируемых имплантатов по методу Ф.М. Лазаренко хотя и приводит к гибели определенной части нейросекреторных клеток, тем не менее около 60+2,8% клеток сохраняют свою жизнеспособность вплоть до 7-х сут эксперимента.
Прежде всего, была показана лучшая сохранность альвеолоцитов (респираторных, секреторных), эндотелиоцитов гемокапилляров не только в ранние сроки культивирования (1 сут), но и в более поздние (3-7 сут). Жизнеспособными оказывались как клетки периферических зон имплантатов, так и центральных их участков. Это отмечено во всех сериях культивирования, включая «посев» кусочков легкого животных, которым предварительно вводили штамм клебсиелл с АЛА+.
Центральным звеном структурной перестройки паренхимы имплантированных кусочков легких в данных условиях следует признать стойкую гипертрофию альвеол, сопровождающуюся новообразованием кровеносных и лимфатических капилляров, пролиферацией альвеолоцитов, клеток фибробластического ряда, укрепленим эластического и коллагенового каркаса альвеолярных стенок.
В случае имплантации фрагментов легких от крыс-доноров, подвергнутых инфицированию бактериальным патогеном с АЛА+, всегда наблюдались выраженные сосудистые изменения имплантатов (развитие неравномерного интерстициального внутриальвеолярного отека, появление мелкоочаговых ателектазов, мозаичные утолщения межальвеолярных перегородок).
При культивировании фрагментов легких от крыс-доноров, инфицированных штаммом клебсиелл с АЛА+, переживающие до 7-х сут альвеолярные структуры в своих просветах имели хлопьевидный осмиофильный материал в сочетании с дезорганизованным сурфактантом, что безусловно указывало на нарушение целостности этого альвеолярного комплекса.
При сокультивировании объектов с ядрами гипоталамуса общий план ультраструктурной организации упорядоченных мембранных образований резервного сурфактанта во многих сохранных (переживающих) альвеолах сохранялся. Одновременно уменьшалось число микроателектазов.
Гуморальные факторы крупноклеточных ядер гипоталамуса позитивно влияли на процессы внутриклеточного отека имплантированных структур легкого: уменьшалось везикулообразование и число микропиноцитозных пузырьков у плазмолеммы альвеолоцитов 1-го типа и эндотелиоцитов гемокапилляров.
Сокультивирование фрагментов легких экспериментальных животных с крупноклеточными ядрами гипоталамуса показало, что в основе компенсаторно-приспособительных потенций тканевых структур легких лежит активация синтезов белка, ДНК и РНК.
При этом пролиферативная активность касается не только альвеолоцитов, но и клеток межальвеолярных перегородок. К сожалению, нам не удалось точно идентифицировать тип делящихся клеток. Однако мы полагаем, что при развитии компенсаторных реакций в легком почти все клеточные популяции респираторных альвеол способны к клеточной репродукции.
ВЫВОДЫ
- При интратрахеальном инфицировании крыс бактериальными патогенами, обладающими различными персистентными свойствами по показателям АЛА, возникают ответные дифференцированные гисто- и органотипические реакции реакции как в респираторных отделах легких, так и в гипоталамо – гипофизарной нейроэндокринной системе.
- При инфицировании экспериментальных животных штаммами Kl. рneumoniae АЛА- в ацинусах легких возникают обратимые изменения с морфологической картиной пневмонии по типу «серого опеченения», тогда как при интервенции штамма Kl. рneumoniae АЛА+ в ацинусах легких возникают морфологические признаки пневмонии по типу «красного опеченения».
- При инфицировании экспериментальных животных штаммами Kl. рneumoniae АЛА- происходит усиление синтеза и высвобождения нейросекрета в общую гемоциркуляцию, что оказывает стимулирующее действие на комплекс компенсаторно – приспособительных реакций со стороны структурных элементов респираторных отделов легких.
- При инфицировании экспериментальных животных штаммами Kl. рneumoniae АЛА+ наблюдается блокирование высвобождения нейросекрета на уровне аксовазальных комплексов нейрогипофиза, что приводит к дефициту нейрогормонов в общей гемоциркуляции, а это в свою очередь усугубляет течение воспалительных процессов в легких.
- Адаптивное воздействие нонапептидергической ГГНС на клеточный и тканевой гомеостаз ацинусов легких проявляется не только дистантно, но и паракринно через стимуляцию васкулогенеза и активности фибробластов, макрофагов, эндотелиоцитов и периваскулярных клеток.
- Реактивность, пластичность и апоптоз альвеолоцитов и стромальных элементов респираторных отделов легких эксперименталных животных играют существенную роль в патогенезе пневмоний, заключающуюся в аутоселекции дегенеративно измененных клеток, а также в стимуляции регенераторного потенциала эпителиоцитов, плазмоцитов, макрофагов, реализуемой через адекватные механизмы нонапептидергической гипоталамической нейросекреции.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Лабутин И.В. Морфофункциональное состояние крупноклеточных ядер гипоталамуса экспериментальных животных в условиях интратрахеального введения стафилококка / И.В. Лабутин, А.Н. Козлова // Морфология. -2006. –Том 130.-№ 5.-С. 57.
- Лабутин И.В. «Морфофункциональное состояние нонапептидергических ядер гипоталамуса и респираторных отделов легких крыс пр,и интратрахеальном введении патогена». Материалы конференции молодых ученых и специалистов Оренбургской области / И.В. Лабутин // Вестник Оренбургского государственного университета. -2008. -№ 82. –С. 145-147.
- Лабутин И.В. Морфофункциональная характеристика трахеи и респираторных отделов легких длительно стрессированных животных при интратрахеальном введении бактерий, обладающих персистентными свойствами. / И.В. Лабутин, Э.М. Вахитов // Морфология. 2008.–Том 133. -№ 3. –С. 63.
- Лабутин И.В. Морфофункциональная характеристика нейроэндокринной системы и иммунной системы легких крыс в условиях воздействия бактерий различновирулентности / А.Н. Козлова, И.В. Лабутин // Морфология. -2008. –Том 133. -№ 3. –С. 51.
- Лабутин И.В. Реактивность и пластичность эпителиев воздухоносных путей и легочных ацинусов крыс в экспериментальных условиях. / К.Н. Мещеряков, И.В. Лабутин // Медицинская наука и образование Урала. -2008. –Том 54. -№ 4. –С. 92-94.
- Лабутин И.В. О динамике структурно-функциональной реорганизации нонапептидергических нейросекреторных центров гипоталамуса в постстрессорном периоде и условиях инфицирования крыс / А.А. Стадников, В.В. Солодовников, Э.М. Вахитов, И.В. Лабутин // Морфологические ведомости. -2009. -№ 3. –С. 291-292.
- Лабутин И.В. К проблеме нейрогормональной регуляции репаративных гистогенезов, реализуемых в условиях взаимодействия про- и эукариот. / А.А. Стадников, А.Н. Козлова, Н.Н. Кочкина, В.Н. Безносик, И.В. Лабутин, Э.М. Вахитов // Сборник научных трудов «Вопросы морфологии ХХI века» к 80-летию со дня рождения профессора А.А. Клишова. –Санкт-Петербург. -2010. –С. 48-49.
- Лабутин И.В. Адаптивная роль гипоталамической нонапептидергической нейросекреторной системы в аспекте реализации клеточного и тканевого гомеостазиса про – и эукариот. / А.А. Стадников, Н.Н. Шевлюк, А.Н. Козлова, И.В. Лабутин, В.В. Солодовников // Морфология. -2010 - Том 137. -№ 4. –С. 180.
Отпечатано в типографии
Оренбургского государственного педагогического университета
Лицензия 021346 от 2.08.97 г. Подписано в печать 12.10.2010 г.
Заказ № 789. Усл.печ.л. 10,47. Тираж 150 экз.
460844, г. Оренбург, ул. Советская, 19.
