Экспериментальное обоснование применения споробактериновой мази в лечении острого деструктивного панкреатита
На правах рукописи
КОРНИЛОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ
ПРИМЕНЕНИЯ СПОРОБАКТЕРИНОВОЙ МАЗИ
В ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО
ДЕСТРУКТИВНОГО ПАНКРЕАТИТА
| 14.01.17 Хирургия 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология |
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Оренбург – 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор
Тарасенко Валерий Семенович
Доктор биологических наук, профессор
Стадников Александр Абрамович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор
Третьяков Анатолий Андреевич
Доктор медицинских наук, профессор
Мурзабаев Хасан Хамзович
Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »
Защита состоится «22» сентября 2010г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д.6. Зал заседаний ученого совета.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »
Автореферат разослан «______»_____________________2010г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор Р.И. Сайфутдинов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Острый панкреатит остается серьезной проблемой экстренной абдоминальной хирургии вследствие роста заболеваемости, увеличения числа его деструктивных форм (Савельев В.С. с соавт., 1996, 2000, 2006; Толстой А.Д. с соавт., 1999; Пугаев А.В., Ачкасов Е.Е., 2007). Летальность при этом заболевании составляет 4,28-5,5%, а при деструктивных формах – 20-80% (Яицкий Н.А., 2003). Поиски эффективных методов лечения ОП вызваны отсутствием заметных успехов в данном направлении, дискуссионными вопросами хирургической тактики, высокой частотой инфекционных осложнений, являющихся причиной летальных исходов (Ярема И.В., 2003; Багненко С.Ф., Гольцов В.Р., 2008).
Результаты лечения больных с острым панкреатитом во многом зависят от методов медикаментозного воздействия на паренхиму поджелудочной железы сумку с целью оптимизации репаративных процессов клеточных и тканевых элементов органа (Стадников А.А., Стадников Б.А., 2005; Шеина Е.А. с соавт., 2008). Исследования последних лет доказали важную патогенетическую роль вторичного инфицирования очагов панкреонекроза условно-патогенными микроорганизмами из просвета желудочно-кишечного тракта, что обусловливает необходимость применения препаратов, способных подавлять жизнедеятельность условно-патогенной микрофлоры (Тарасенко В.С., 2000; Стадников Б.А., 2005).
Применение антибиотиков при остром панкреатите основывается на том факте, что летальность при инфицированном панкреонекрозе выше, чем при стерильном, и существует потенциальная вероятность снижения летальности при использовании антибиотикопрофилактики (O'Reilly D.A., Kingsnorth. A.N., 2004).
В Кокрановском систематическом обзоре рассматриваемой тематики (Bassi C. et al., 2003), было показано преимущество антибиотикопрофилактики при панкреонекрозе и рекомендовано использование антибиотиков широкого спектра, активных в отношении возбудителей интраабодинальных инфекций (цефуроксим, имипенем или офлоксацин в сочетании с метронидазолом). Применение антибиотиков является стандартом в лечении больных инфицированным панкреонекрозом (Деллинджер Э.П., 2003). Однако в последние годы было установлено, что профилактическое применение антибиотиков при остром некротизирующем снижало длительность госпитализации и частоту возникновения внепанкреатических инфекций, однако не влияло на уровень смертности, частоту развития инфицированного панкреонекроза и проведения хирургических вмешательств (Nathens A.B. et al., 2004; Hart P.A. et al., 2008).
По мнению V. Di Carlo и A. Zerbi (1995) применение антибиотиков для предотвращения транслокации кишечной флоры при остром панкреатите малоэффективно. Поэтому многие научные исследования ведутся в направлении использования живых бактерий с антагонистическими свойствами в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Большой интерес представляют сведения о закономерно обнаруживаемых в негнойных ранах бактерий рода Bacillus (Волков М.В. с соавт., 1975; Никитенко В.И., 1985, 1990).
В эксперименте и клинически была показана способность бактерий рода Bacillus, а также ряда других непатогенных бактерий, проникать из просвета желудочно-кишечного тракта посредством крови и лимфы в ткани очага повреждения. Было выявлено, что эти бактерии оказывают лечебное действие за счет продукции антибиотиков, протеолитических ферментов и иммуномодуляторов (Никитенко В.И. 1987, 1990, 1991).
Наиболее биологически активным из рода Bacillus являет вид Bacillus subtilis (Перетц Л.Г., 1955; Drazar B.S., 1974; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Бактерии данного вида продуцируют более 70 различных антибиотиков действующих в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Bacillus subtilis являются спорообразующими бактериями, поэтому они попадая в пищеварительный тракт даже в небольших количествах сохраняют жизнеспособность и способны достигать дистальных отделов кишечника (Смирнов В.В. с соавт., 1993). Помимо антибиотиков Bacillus subtilis продуцируют аминокислоты (в том числе и незаменимые), ряд амилолитических, липолитических, протеолитических, целлюлозолитических ферментов, синтезируют лизоцим, обладают иммуномодулирующим эффектом (Смирнов В.В. с соавт., 1982; J. Benedettini et al., 1983; Резник С.Р. с соавт., 1985; Никитенко В.И., 1990; Вьюницкая В.А. с соавт., 1990; Чернякова В.И. с соавт., 1993; Воробьев А.А. с соавт., 1997; Лопатина Т.К. с соавт., 1997).
Применение пробиотиков в хирургической практике показало обнадеживающие результаты при лечении таких заболеваний как аппендицит, холангит, инфекции мягких тканей, деструктивный панкреатит (Дронова О.М. с соавт., 1983; Кукуруза Ю.Н., Навроцкий В.А., 1983; Навроцкий В.А., 1986; Никитенко В.И. с соавт., 1996; Третьяков А.А., 1998; Есипов В.К., 1999; Тарасенко В.С., 2000).
Споробактерин – отечественныq пробиотик, изготовленный на основе штамма Bacillus subtilis 534. Была показана его высокая лечебно-профилактическая эффективность при инфекциях желудочно-кишечного тракта, свежих и гнойных раневых процессах, воспалительных явлениях различной локализации. Споробактерин был рекомендован для широкого применения в медицинской практике (Никитенко В.И. с соавт., 1985, 1987, 1990, 1991)
В литературе, посвященной проблеме острого панкреатита, отсутствуют клинические, морфологические и цитохимические данные по применению споробактериновой мази при остром панкреатите, и ее воздействии как на саму поджелудочную железу, так и на соседние паренхиматозные органы (печень и селезенку), что и явилось предметом настоящего экспериментально-гистологичекого исследования.
Цель работы
Экспериментально–гистологическое обоснование целесообразности применения споробактериновой мази в лечении острого деструктивного панкреатита.
Задачи исследования
1. Изучить морфологические изменения в поджелудочной железе и характер репаративных процессов в ее тканях при асептическом и инфицированном экспериментальном остром деструктивном панкреатите.
2. Определить влияние споробактериновой мази на морфофункциональные изменения в поджелудочной железе, печени, селезёнке при остром экспериментальном деструктивном панкреатите (с инфицированием и без такового).
Научная новизна исследования
Впервые изучена ультраструктурная реорганизация клеток паренхимы и стромы поджелудочной железы, печени и селезенки при экспериментальном остром деструктивном панкреатите в условиях лечебной коррекции споробактериновой мазью.
С использованием комплексного методического подхода (световая и электронная микроскопия, морфометрия, иммуноцитохимическая идентификация апоптозных клеток) доказана возможность оптимизирующего влияния споробактериновой мази на процессы репаративных гистогенезов, васкулогенеза, восстановления микроциркуляции паренхимы и стромы поджелудочной железы при экспериментальном остром деструктивном панкреатите, а также показано позитивное воздействие на компенсаторно - приспособительные возможности поджелудочной железы.
Разработаны способ прогнозирования исхода острого деструктивного панкреатита (патент РФ № 2338195 от 10.11.2008 г.) и способ диагностики формы острого панкреатита (патент РФ на изобретение № 2339042 от 20.11.2008 г.).
Практическая значимость работы
Полученные экспериментальные данные расширяют патогенетические представления о роли ультраструктурной реорганизации клеток паренхимы и стромы поджелудочной железы, печени и селезенки при экспериментальном остром деструктивном панкреатите
Использование споробактериновой мази в лечении экспериментального острого деструктивного панкреатита, начиная с ранних сроков заболевания, приводит к значительному уменьшению выраженности ведущих патогенетических звеньев деструкции тканей поджелудочной железы и позволяет добиться «обрыва» патологического процесса и проведения его по асептическому пути.
Проведенное исследование открывает перспективы для клинического применения споробактериновой мази, что имеет существенное значение для абдоминальной хирургии.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах госпитальной хирургии; хирургии факультета последипломной подготовки специалистов; гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: V межобластной научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2004); международной научно-практической конференции хирургов и урологов «Высокие технологии в медицине» (Нижний – Новгород, 2008); XIV международном конгрессе хирургов – гепатологов России и стран СНГ (Санкт-Петербург, 2007); XV международном конгрессе хирургов – гепатологов России и стран СНГ (Казань, 2008); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург 2008); XVI международном конгрессе хирургов – гепатологов России и стран СНГ (Екатеринбург, 2009),
Получены 2 патента РФ на изобретение («Способ прогнозирования исхода острого панкреатита» № 2338195 от 10.11.2008 г., «Способ диагностики формы острого панкреатита» № 2339042 от 20.11.2008 г.). По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в т.ч., 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- Применения споробактериновой мази в условиях экспериментального острого деструктивного панкреатита приводит к оптимизации регенерации панкреатоцитов, нормализации ядерно-плазматического отношения, коррегирует структурную и функциональную организацию гепатоцитов и клеток стромы, снижает явления отёка в тканях печени и селезёнки и создает необходимые условия для репаративных гистогенезов.
- Использование споробактериновой мази для лечения экспериментального острого деструктивного панкреатита существенно оптимизирует морфофункциональный гомеостаз печени и ослабляет развитие деструктивных процессов в селезенке, способствует восстановлению дифференцированных иммунокомпетентных клеток.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 274 источника, в том числе 175 работ отечественных и 99 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 34 черно-белыми и цветными микрофотографиями гистологических препаратов, электронограммами и 11 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследования морфологических изменений в поджелудочной железе в условиях экспериментального острого деструктивного панкреатита (ЭОДП) с дополнительным инфицированием и местного лечения проведены на 168 лабораторных белых половозрелых крысах-самцах массой 280-300 г. Общие сведения об объеме и структуре исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1
Объем и структура исследования
| № n/n | Наименование серии опытов | Кол-во животных | Сроки наблюдения | |||
| 24ч. | 3сут. | 5сут. | ||||
| I. | ЭОДП | 15 | 5 | 5 | 5 | |
| II | 1. ЭОДП + споробактериновая мазь | 15 | 5 | 5 | 5 | |
| 2. ЭОДП + мазь «Левомеколь» | 15 | 5 | 5 | 5 | ||
| 3. ЭОДП + раствор хлоргексидина | 15 | 5 | 5 | 5 | ||
| III. | 1. ЭОДП + E. coli. + споробактериновая мазь | 15 | 5 | 5 | 5 | |
| 2. ЭОДП + E. coli. + мазь «Левомеколь» | 15 | 5 | 5 | 5 | ||
| 3. ЭОДП + E. coli.+раствор хлоргексидина | 15 | 5 | 5 | 5 | ||
| IV. | 1.ЭОДП+ S. aureus+ споробактериновая мазь | 15 | 5 | 5 | 5 | |
| 2. ЭОДП+ S. aureus + мазь «Левомеколь» | 15 | 5 | 5 | 5 | ||
| 3. ЭОДП+ S.aureus+раствор хлоргексидина | 15 | 5 | 5 | 5 | ||
| V. |
| 9 | 3 | 3 | 3 | |
| 9 | 3 | 3 | 3 | ||
| Всего | 168 | 56 | 56 | 56 | ||
В серии опытов (контрольной) на 15 животных осуществляли моделирование ЭОДП. В операционной кафедры гистологии Оренбургской государственной медицинской академии, с соблюдением правил асептики, крысам под эфирным наркозом производили верхнесрединную лапаротомию и выделяли поджелудочную железу. Затем, в протоковую систему железы вводили 0,5-1,0 мл стерильной желчи (от больных, оперированных по поводу холедохолитиаза, без явлений холангита) с каплей аутокрови и механическим повреждением ее тканей: дольки органа подвергали травматизации путем сдавления их браншами анатомического пинцета. В брюшную полость экспериментального животного для дальнейшего введения препарата (в зависимости от серии) ставили тонкий эпидуральный (стерильный) катетер. Рану брюшной полости зашивали наглухо с подшиванием поджелудочной железы к париетальной брюшине и с фиксированием кисетным и Z - образным швами катетера к коже животного, для введения лекарств.
В серии опытов на 45 животных, создавалась аналогичная модель ЭОДП, в качестве лечения животным, через эпидуральный катетер, вводились споробактериновая мазь (15 животных), мазь «Левомеколь» (15 животных) и водный раствор хлоргексидина (15 животных), через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно. Контролем служили животные I – ой серии.
В I серии опытов на 45 животных при создании модели ЭОДП одновременно с желчью в панкреатические протоки вводились инфекционные агенты: 45 животным - Escherichia coli (в дозе 3 106 микробных клеток), меченных радионуклидом 3Н-тимидином (30 животных). В данной группе животных проводилось лечение, аналогичное животным второй группы. Контролем служили животные пятой группы.
В V серии опытов на 45 животных при создании модели ЭОДП одновременно с желчью в панкреатические протоки вводились инфекционные агенты Staphylococcus aureus штамм P – 450 (в дозе 3 106 микробных клеток). В данной серии проводилось лечение, аналогичное животным второй и третьей группам. Контролем являлись животные пятой группы.
В V серии опытов вошли 18 животных с моделью ЭОП одновременно с желчью в панкреатические протоки вводились инфекционные агенты: 9 животным- E. coli и 9 животным S. aureus штамм P – 450 (в дозе 3 106 микробных клеток), меченных радионуклидом 3Н-тимидином (6 животных). В данной серии лечение не проводилось.
При выполнении всех серий опытов соблюдались правила биоэтики, утвержденные приказом МЗ СССР от 12.08.1977 и европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для лабораторных или других целей.
Методики морфологических исследований.
Изучение полученного материала (экцизивные биоптаты поджелудочной железы, печени, селезенки) у экспериментальных животных осуществляли на световом и электронномикроскопическом уровнях. Для забора материала животных забивали под глубоким ингаляционным эфирным наркозом путем декапитации. При выполнении исследований соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77). Для светооптических исследований материал после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина и обезвоживания спиртами заключался в парафинцеллойд для получения гистологических срезов. Гистосрезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, метиленовым зелёным и пиронином по Браше, перйодатом К и рективом Шифф по Мак Манусу. Ферменты, маркеры митохондрий (СДГ) и лизосом (КФ) определяли в свежезамороженных криостатных срезах органов в соответствие с методиками Nachlas М. (1960), Gomory G. (1963).
Суммарный белок определяли по Даниэли (Пирс Э., 1962). Морфологические исследования соотношений жизнеспособных и некротизированых зон поджелудочной железы на гистопрепаратах проводили с использованием окулярной вставки (Автандилов Г.Г., 1990).
Выявление диссеминации микроорганизмов в исследуемых тканях проводилось окраской по Граму (Меркулов Г.А., 1969). Выявление ДНК проводилось по методу Фёльгена - Розенбека (Меркулов Г.А., 1969).
Для идентификации клеток с признаками апоптоза применяли иммуноцитохимические реакции на определение экспрессии проапоптотического белка р53 и на выявление интернуклеосомальной фрагментации ДНК (Реактивы фирмы «Дако» Дания).
Для электронномикроскопического исследования материал последовательно фиксировали в 2,5% охлаждённом растворе (+ 4°С) глютарового альдегида и четырехокиси осмия по Millonig G. (1961). Обезвоживание проводили в ацетоне с нарастающей концентрацией и последующей заливкой кусочков в смолу ЭПОН-812. После изготовления полутонких объектов (1 мкм), ультратонкие срезы приготовливали на ультратоме LKB -5 (Bromma, Sweden). В дальнейшем срезы подвергли двойному контрастированию: в 2% водном растворе уранила ацетата при +37° С в течение 2 часов и цитрате свинца (Reynolds E., 1963). Изучение объектов и фотографирование их осуществляли с помощью электронного микроскопа ЭВМ 100 АК при увеличениях х7000 - х48000.
Все результаты обработаны статистически с применением программного пакета «MS Excel» с определением критерия значимости (t) Стьюдента, вероятности значений разницы (р), коэффициента ранговой корреляции Спирмена для оценки силы и направленности корреляционной связи между двумя изучаемыми явлениями (Гланц С., 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследования продемонстрировали, что в моделируемых условиях структурные изменения в поджелудочной железе носят этапный характер и укладываются в картину острого деструктивного панкреатита. При этом морфофункциональные изменения паренхимы и стромы железы сводятся к выраженному отеку, жировой дистрофии, некробиозу и некрозу панкреатоцитов, а также эпителия выводных протоков.
Спустя сутки от начала эксперимента при ЭОДП (без экзогенного введения бактерий) в поджелудочной железе возникали локальные некротические изменения паренхимы и стромы органа на фоне резко выраженного геморрагического отека. Появление очагов микронекроза в поджелудочной железе играло важную роль в развитии острого панкреатита. Показано, что некробиотические и некротические процессы в тканях железы были наиболее выражены через 72 часа эксперимента (рис. 1)
При этом наблюдались фатальная дискомплексация волокон и аморфного матрикса соединительной ткани, существенные дезадаптационные ультраструктурные изменения эндотелиоцитов, клеток фибробластического дифферона и сосудов микроциркуляторного русла (кариопикноз, кариолизис, клазмоцитоз цитоплазматических структур), демаскировка липидов цитомембран с формированием гигантских липосом, разрушение мембранных компартментов, завершающихся образованием крупных ламеллярных телец и аутофагосом).
При инфицировании поджелудочной железы (III и IV серия) воспалительная реакция в паренхиме и строме нарастало более стремительно, особенно при введении E.coli. Резко усиливалтсь процессы альтерации. Интенсивный гистолиз паренхимы органа, наблюдаемый в первые сутки, нарастал к третьим и пятым суткам опыта. Четкого отграничения очагов гнойного воспаления и формирования соединительнотканных пиогенных мембран не происходло. Это приводило к значительному распространению гнойно-некротических процессов в поджелудочной железе и окружающих ее органах.
Рис. 1 Панкреатоциты концевых отделов поджелудочной железы в зоне, пограничной с панкреонекрозом 3 сут. ЭОП. Электронграмма Ув. х22600.
Повышение проницаемости стенок сосудов сопровождалось экстравазацией не только плазмы, но и форменных элементов крови. Уже в ранние сроки (24 часа) были отмечены реактивные изменения эндотелиоцитов капилляров: в их цитоплазме появлялось большое количество пиноцитозных пузырьков, расширялись канальцы эндоплазматического ретикулума, набухали митохондрии (разрушались кристы). У сохраненных панкреатоцитов возрастало число свободных рибосом (полисом) и секреторных гранул различной электронной плотности, включая гранулы мукоидного характера.
В раннем периоде развития экспериментального острого деструктивного панкреатита в экссудате преобладали гранулоциты. Значительная их часть подвергалась дегенеративным изменениям при дополнительном инфицировании. Причем введение E. соli приводило к более выраженной деструкции лейкоцитов (табл. 2). Размеры зон отека и некроза при инфицированном ЭОДП были более значительными по сравнению с асептическим панкреатитом. Надо полагать, что более выраженные деструктивные (с геморрагическими компонентами) изменения в поджелудочной железе в определенной мере обусловлены реализацией патогенных и персистентных свойств E. сoli (Шеина Е.А. с соавт., 2005). Через 3 суток подобные изменения происходили с лимфоцитами и макрофагами моноцитарного генеза.
Наряду с гибелью части панкреатоцитов, локализованных вблизи зон панкреонекроза, значительное количество ацинарных клеток, подвергаясь дискомплексации, в полной мере сохраняли свои функциональные свойства как при асептическом ЭОДП, так и особенно в условиях его инфицирования. Они продолжали синтезировать белковые секреторные продукты (по показателям содержания РНК, суммарного белка, гипертрофированного состояния шероховатого эндоплазматического ретикулума, характеру распределения секреторных гранул высокой электронной плотности). По нашему мнению это, безусловно, потенцирует и усиливает лизис тканевых элементов органа, способствует прогрессированию панкреонекроза.
Развитие соединительнотканного регенерата в участках панкреонекроза начиналось с 3-х суток эксперимента, шло мозаично и гетерохронно. При инфицированном панкреонекрозе мы обнаружили как слабо выраженный фибриллогенез, так и одновременный активный лизис коллагеновых волокон, осуществляемый как макрофагами, так и фиброкластами. В этих случаях резко снижалось (до полного отсутствия) содержание углеводных биополимеров, особенно кислых гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты).
Изучение гистопрепаратов и электроннограмм показало, что
пограничные с участками панкреонекроза аденоциты, центрацинозные клетки, эпителий выводных протоков сохраняли свои гисто- и органобластические репаративные свойства. Число данных клеток в случаях инфицирования было в 3,5-4 раза меньше, чем в абактериальных условиях. Выраженных эпителиальных пролифератов в гнойно-некротических зонах железы не отмечалось. Процесс при этом развертывался по некротическому и дегенеративно-воспалительному типам (особенно при введении E. coli), что подтверждалось обнаружением во все сроки опыта значительных участков поджелудочной железы, состоящих из некротизированных панкреатоцитов, эпителиоцитов выводных протоков, большого числа нейтрофилов, находящихся в состоянии дегенерации и деструкции.
Обнаружение в экспериментальных условиях стафилококков и E. coli, меченных 3Н-тимидином в тканях печени и селезенки свидетельствует о гематогеннои и лимфогенной диссиминации инфекции.
Применение споробактериновой мази в эксперименте положительно отразилось на ходе репаративных процессов в поджелудочной железе. Использование его в 2-3 раза повышало репродуктивную активность сохранных панкреатоцитов, эпителиоцитов выводных протоков, фибробластов (в сравнении со стандартной терапией). Данные эффекты прослежены во все сроки наблюдений, в том числе и в условиях инфицирования.
Использование споробактериновой мази приводило к существенной дезорганизации клеточной поверхности бактерий и выраженным изменениям их внутриклеточных ультраструктур (отсутствие фибриллярного материала микрокапсул, исчезновение рибосом и мембранных элементов цитоплазмы, дезорганизация нуклеоида). В тех сериях опытов, где не применялась споробактериновая мазь, вышеуказанные признаки повреждения микроорганизмов не наблюдались.
Микроорганизмы визуализировались не только в межклеточных пространствах, но и в кавеолоподобных структурах плазмолемм, а также внутриклеточно. Было установлено присутствие реактивно измененных бактерий (экзогенно вводимых на этапах моделирования ЭОДП) в вакуолярной системе панкреатоцитов, макрофагов и клетках фибробластического дифферона, что подтверждают ранее полученные факты по «укрытию» бактерий в соматических клетках (Стадников Б.А. с соавт., 2006).
В экспериментах, где не применялась споробактериновая мазь, внутриклеточно расположенные бактерии отграничивались мембранами, изолирующими их от остального матрикса клеток. При использовании споробактериновой мази наблюдалось отсутствие подобного отграничения и лизис микроорганизмов, особенно отчетливо прослеживающийся через 5 суток опытов.
Уже в ранние сроки опытов применение споробактериновой мази существенно стимулировало деятельность макрофагов. Часть из них включала радиоактивную метку 3Н-тимидина, что свидетельствовало об активизации их готовности к клеточной репродукции. Подобных изменений макрофагических клеток не отмечалось во всех других сериях экспериментов, в том числе и при использовании антибиотика.
При использовании споробактериновой мази наблюдалась активизация пролиферации и гипертрофия сохранных панкреатоцитов, клеток выводных протоков, сопряженные с васкулогенезом и новообразованием соединительнотканных элементов, что приводло к появлению в пограничных с некротическими участками поджелудочной железы островков органотипической регенерации с формированием атипических ацинусов. Одновременно возрастала численность концевых отделов протоков железы с признаками ослизнения панкреатоцитов (по показателям идентификации мукополисахаридов - сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов).
Применение споробактериновой мази существенно стимулировало регенераторные возможности соединительной ткани. Уже через 3 суток по краю очагов некроза развивалась малодифференцированная соединительная ткань, пронизанная новообразованными гемокапиллярами. В тех сериях опытов, где применялась споробактериновая мазь, на 3-и–5-е сутки опыта уменьшалось количество тромбированных и сладжированных сосудов микроциркуляторного русла.
Печень. В абактериальных условиях через 1-3 суток эксперимента общая гистоструктура органа существенно не нарушалась. Тем не менее, изменялись структурно-функциональные показатели микроциркуляторного русла.
Наиболее отчетливо это проявлялось в сериях опытов с дополнительным инфицированием (особенно E. сoli). Так, в области печеночных триад наблюдались резкое расширение вен, стаз форменных элементов крови в междольковых кровеносных сосудах (рис 2).
Через 5-7 суток внутри печеночных долек отмечалось чередование участков расширенных синусоидных капилляров с локальными участками их спазмирования, что свидетельствовало о нарушении кровообращения. При дополнительном инфицировании регистрировались участки деструкции гепатоцитов в составе печеночных балок, особенно вблизи v. centralis.
Рис. 2 Фрагменты соседних печеночных долек
Фиксация: спирт-формол
Окраска: перйодат-шифф-реакция
Ув.,: об 90, ок., 10
При микробной инвазии в синусоидных капиллярах печени обнаруживалась картина стаза форменных элементов крови, агрегация тромбоцитов и образование микротромбов (особенно через 5 суток эксперимента). При этом идентифицированы участки ультраструктурных повреждений эндотелиоцитов и васкулярной поверхности гепатоцитов в зонах перисинусоидальных пространств Диссе (рис. 3).
Фрагменты разрушенных эндотелиоцитов и гепатоцитов обнаруживались как в пространствах Диссе, так и в синусоидных капиллярах. Все эти явления указывали на существенное ухудшение процессов дренирования перилимфатических пространств и нарушениях гемоциркуляции в печени экспериментальных животных. В гепатоцитах отмечались баллонообразные расширения канальцев шероховатого эндоплазматического ретикулума, дезорганизация прикрепленных рибосом – их «осыпание». Одновременно происходило набухание митохондрий, дезорганизация их крист, что свидетельствует о развитии гипоксии. Имели место инфильтрация перипортальных зон клетками лимфоидного и моноцитарного ряда, миграция лимфоцитов в паренхиму органа.
Селезенка. У экспериментальных животных (той группы, где нами установлен феномен транслокации S.aureus и E. сoli из очагов панкреонекроза в селезенку) в ранние сроки наблюдений (1-3 сутки) отмечено увеличение размеров лимфоидных фолликулов с одновременным возрастанием Т- и В-зависимых зон. Данные изменения наблюдались на фоне выраженной дилатации сосудов красной пульпы с явлениями стаза форменных элементов крови. Экстравазация плазмы, лейкоцитов и эритроцитов приводила к развитию выраженного отека стромальных элементов селезенки.
В ретикулярной ткани воспалительные изменения носили характер интерстициальных процессов, выражающихся межуточным отеком, лимфоидноклеточной и лейкоцитарной инфильтрацией. В своей совокупности, полученные нами факты свидетельствовали о развитии гиперпластических процессов лимфоидных структур селезенки, характерных для септицемии.
Таким образом, в условиях инфицированного ЭОДП может развиваться клинико-морфологическая картина поражения печени и селезенки, при которой (в результате транслокации бактериальных патогенов) на первый план выступают токсические явления и признаки повышенной реактивности (гиперергические) организма животных (гиперплазия белой пульпы селезенки, лимфоидная и лейкоцитарная инфильтрация гистоструктур селезенки и печени, гиперплазия ретику
Рис. 3 Перисинусоидальное пространство Диссе
Электронограмма
Ув.: х22600
лярных клеток и эндотелия сосудов со слущиванием их в просвет синусов).
В межфолликулярных структурах красной пульпы селезенки обнаруживались очаги экстрамедулярного кроветворения, состоящие из клеток эритро-, мегакариоцито- и миелопоэтического ряда (эритробласты, мегакариобласты, миелобласты и миелоциты).
Причиной развития данных гистологических феноменов, знаменующих статус септицемии, вероятно, являются транслоцированные из очагов панкреонекроза микроорганизмы. При инфицированном ЭОДП (E. сoli) были получены результаты, свидетельствующие о лимитировании адаптивных потенций паренхимы и стромы печени и селезенки.
Применение споробактериновой мази привело к оптимизации процессов структурно-функциональной реорганизации стромальных и паренхиматозных элементов печени и селезенки в аспекте реализации адаптивных и компенсаторно-приспособительных возможностей клеток и тканей изученных органов. Мы полагаем, что наблюдаемый и описанный нами компенсаторный морфофункциональный процесс в печени и селезенке направлен на ликвидацию последствий ЭОДП, при этом в качестве критериев оценки компенсаторного процесса мы избрали общеизвестные показатели (СаркисовД.С., 1995): пролиферация, рост, цитодиференцировка, гипер- и атрофия, межклеточные и межтканевые корреляции, тканеспецифическая детерминация.
Важно подчеркнуть то обстоятельство, что применение споробактериновой мази приводило к позитивным изменениям ультраструктуры печеночных клеток. Так, кроме поврежденных гепатоцитов, имелись паренхиматозные клетки с признаками внутриклеточной регенерации (локализованные преимущественно в периферических отделах печеночных балок). Данные клетки характеризовались наличием двух или трех ядрышек нуклеалонемного строения с развитым гранулярным компонентом (рис. 4). Эти факты свидетельствуют о положительной метаболической реорганизации энергетической, белоксинтезирующей, а, следовательно, и дезинтоксикационной функции подобных гепатоцитов.
Описанные морфологические изменения гепатоцитов не регистрировались в тех сериях экспериментов, где в качестве лечебных воздействий мы использовали мазь «Левомеколь» и хлоргексидин. С другой стороны, подобная ультраструктурная реорганизация гепатоцитов (при применении споробактериновой мази) отмечена при дополнительном инфицировании очагов панкреонекроза. Эти данные в
Рис. 4 Фрагмент гепатоцита
Электронограмма
Ув.: х28000
полной мере коррелировали с частотой транслокации микроорганизмов. Надо полагать, что лечебная коррекция споробактериновой мазью существенно оптимизирует морфофункциональный гомеостаз печени.
При изучении гистоструктур селезенки экспериментальных животных, получавших лечебное воздействие споробактериновой мазью, установлена следующая реорганизация красной и белой пульпы органа. Кровеносные сосуды микроциркуляторного русла не имели признаков повреждений эндотелиоцитов и микротромбоза. Соотношение протяженности Т- и В-зон лимфоидных фолликулов к 5-м суткам эксперимента становилось сопоставимо с аналогичными показателями интактных животных. Тем не менее, в значительном числе сохранялись периваскулярно локализованные плазмоциты (в сериях опытов с дополнительным инфицированием). При этом не отмечены ультраструктурные повреждения ретикулярных клеток стромы, что имело место в тех сериях, когда применяли мазь «Левомеколь» либо раствор хлоргексидина. В последних случаях в данных стромальных элементах всегда отмечались набухание митохондрий, формирование мультиламеллярных телец и липосом.
При использовании споробактериновой мази в реактивных центрах лимфоидных фолликулов (В-зона) и периартериальных (Т-зона) через 5-7 суток эксперимента регистрировались в возрастающем числе иммунобласты (лимфобласты) (рис. 5).
Рис. 5 Иммунобласты в периартериальной зоне лимфоидного фолликула селезенки
Электронограмма
Ув.: х22500
Очевидно, что данное воздействие препарата при ЭОДП, создает необходимые условия для полноценной реализации лимфопоэтических функций селезенки, как отражение компенсаторных процессов. В своей совокупности полученные данные позволяют сделать заключение, что использование споробактеринвоой мази для лечения ЭОДП существенно ослабляет развитие деструктивных процессов в селезенке, способствует восстановлению дифференцированных иммунокомпетентных клеток.
Таким образом, применения споробактериновой мази в условиях экспериментального острого деструктивного панкреатита оказывает положительный эффект на ткани поджелудочной железы, печени и селезенки (оптимизация регенерации панкреатоцитов, нормализация ядерно-плазматического отношения, коррекция структурную и функциональную организацию гепатоцитов и клеток стромы, снижает явления отёка в тканях печени и селезёнки и создает необходимые условия для репаративных гистогенезов), что, в свою очередь, существенно оптимизирует морфофункциональный гомеостаз печени и ослабляет развитие деструктивных процессов в селезенке, способствует восстановлению дифференцированных иммунокомпетентных клеток
ВЫВОДЫ
1. В условиях экспериментального острого панкреатита структурно – функциональные изменения клеточных и тканевых элементов носят стадийный характер, а ведущим морфологическим компонентом в его прогрессировании является дискомплексация ацинарных панкреатоцитов и возникновение некротических очагов. При инфицировании происходит усугубление развития деструктивных явлений в паренхиме и строме органа.
2. Процессы репаративной регенерации в поджелудочной железе в условиях абактериального и инфицированного экспериментального острого деструктивного панкреатита происходят по типу регенерационной гиперплазии сохраненных панкреатоцитов на фоне альтернативных изменений в очагах некроза и некробиоза железы со слабо выраженным их отграничением соединительнотканными структурами, что не предотвращает распространение патологического процесса.
3. Экспериментальный острый деструктивный панкреатит характеризуется значительными морфофункциональными изменениями в печени, а именно: ультраструктурными повреждениями эндотелиоцитов и васкулярной поверхности гепатоцитов в зонах перисинусоидальных пространств Диссе, что указывает на существенное ухудшение процессов дренирования перилимфатических пространств и нарушениях гемоциркуляции в печени. Морфофункциональные изменения в селезенке выражались в развитии гиперпластических процессов лимфоидных структур, характерных для септицемии.
4. Применение споробактериновой мази при асептическом и инфицированном экспериментальном остром деструктивном панкреатите обеспечивает уменьшение некробиотических и некротических изменений паренхимы и стромы поджелудочной железы, существенно оптимизирует процессы репаративной регенерации эпителиальных, соеденительнотканных структур, сосудов микроциркуляторного русла.
5. При использовании споробактериновой мази отмечалось восстановление микроциркуляции и лимфотока в печени, улучшение ее дренажной функции, а так же уменьшение экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство.
6. Применение споробактериновой мази при асептическом и инфицированном экспериментальном остром деструктивном панкреатите существенно ослабляло развитие деструктивных процессов в селезенке, способствовало восстановлению дифференцированных иммунокомпетентных клеток и корректировке лимфопоэтических функций селезенки.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Полученные результаты могут быть использованы для обоснования лечебных мероприятий в абдоминальной хирургии. Целесообразно включение споробактериновой мази в базисную схему лечения больных острым панкреатитом с учетом развивающихся патоморфологических процессов, с целью эффективной коррекции морфофункциональных изменений поджелудочной железы, печени и селезенки.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ:
- Малоинвазивные технологии в лечение панкреонекроза. / Тарасенко В.С., Дёмин Д.Б., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // Анналы хир. гепатологии.- 2007.- №3, Т.12.- С. 231.
- Современные аспекты диагностики тяжести деструктивного процесса и лечебная тактика при остром панкреатите./ Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Инф. архив (медицина, биология, образование). – 2007. – Т. 1, № 1. – С. 61 – 62.
- Дёмин Д.Б. Современные подходы к диагностике и лечению острого деструктивного панкреатита./ Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Хирург. – 2008. - № 2. – С. 19 – 21.
- Дёмин Д.Б. Современные аспекты лечения острого панкреатита./ Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Материалы VII межобластной научно–практич. конф. хирургов «Актуальные вопросы хирургии». Бугуруслан, 2008. – С. 105 – 107.
- Острый деструктивный панкреатит: прогноз и лечение./ Тарасенко В.С., Демин Д.Б., Волков Д.В., Шефер А.В., Смолягин А.И., Балпеисова А.Б., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Медицинский альманах (спецвыпуск). II международная конференция хирургов и урологов «Высокие технологии в медицине», Н.Новгород, 2008.- С. 103-104.
- Некоторые аспекты малоинвазивной хирургии панкреонекроза / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // Первая международная конференция по торако-абдоминальной хирургии. (Сборник тезисов). Москва, 2008. – С. 93;
- Современные подходы к лечению панкреонекроза / Тарасенко В.С., Дёмин Д.Б., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // Анналы хир. гепатологии.- 2008.- Т.13, №3.- С. 264-265.
- Некоторые патогенетические принципы лечения острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Корнилов С.А., Басов Ф.В.// Сборник научно – практических работ «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» посвященный 90–летию ОКБ ст. Оренбург. Оренбург, 2009.- С. 18-21.
- Особенности морфологических изменений печени в условиях экспериментального острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Басов Ф.В., Валов Ф.В., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Бобылев А.А. //Сб. научно – практич. работ «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» посвященный 90–летию ОКБ ст. Оренбург. Оренбург, 2009.- С. 196-197.
- Актуальные проблемы малоинвазивной хирургии острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Корнилов С.А., Басов Ф.В. // Морфологические ведомости 2009, №3 с.180-181.
Изобретения по теме диссертации.
- Демин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Никоноров А.А., Афонина С.Н., Павлова М.М., Корнилов С.А., Басов Ф.В. Способ диагностики формы острого панкреатита // Патент РФ на изобретение № 2339042 от 20.11.2008 г.
- Демин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Никоноров А.А., Афонина С.Н., Павлова М.М., Корнилов С.А., Басов Ф.В. Способ прогнозирования исхода деструктивного панкреатита // Патент РФ на изобретение № 2338195 от 10.11.2008г.
КОРНИЛОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
СПОРОБАКТЕРИНОВОЙ МАЗИ В ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО
ДЕСТРУКТИВНОГО ПАНКРЕАТИТА
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
_____________________________________________________________
Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003
Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.
Подписано в печать 18 июня 2010г.
