Морфологическое обоснование применения соединительнотканных трансплантатов моделированных лазерным излучением
На правах рукописи
Гайнутдинова Раушания Дамировна
Морфологическое обоснование применения соединительнотканных трансплантатов моделированных лазерным излучением
03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Оренбург-2011
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении
«Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» (г. Уфа).
Научный руководитель: доктор биологических наук
Шангина Ольга Ратмировна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Суворова Галина Николаевна
доктор биологических наук, профессор
Хисматуллина Зухра Рашидовна
Ведущая организация: «Белгородский государственный университет».
Защита состоится « 22 » марта 2011 года в 1000 часов
На заседании диссертационного совета Д 208.066.04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6
Автореферат разослан « 17 » февраля 2011г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
профессор Шевлюк Н.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Современный уровень развития восстановительной хирургии невозможно представить без реконструктивных хирургических вмешательств в сочетании с использованием соединительнотканных трансплантатов. В различных областях медицины (офтальмологии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии, отоларингологии, нейрохирургии, травматологии, ортопедии и т.д.) ведущая роль отводится трансплантатам аллогенного происхождения (Клен Р., 1962; Имамалиев А.С., 1970; Кристинов Г., 1975; Коваленко П.П., 1975; Говалло В.И., 1979; Зайкова М.В., 1982; Arndt K.A., 1982; Мирский М.Б., 1985; Брус И.Г. и др. 1989; Мулдашев Э.Р., 1994; Grover R., 1998; Емельянов В.А., 2000; Канюков В.Н. и др. 2001; Савельев В.И. и др. 2001; Канюков В.Н., Стадников А.А., 2009). Успех любой пластической операции с использованием аллотрансплантатов в значительной степени определяется качеством последних, которое, в свою очередь, зависит от совокупности стадий технологического процесса их изготовления. Поэтому совершенствование технологий изготовления и увеличение производства соединительнотканных трансплантатов является достаточно актуальной задачей.
В процессе изготовления трансплантатов особо важным является сохранение фиброархитектоники донорских тканей. При оптимальном методе изготовления соединительнотканных трансплантатов происходит разрушение клеточных элементов, но при этом сохраняется коллагеново–волокнистый остов (Seiffert K.K., 1970), который служит каркасом для формирования регенерата. Для достижения эффективного результата хирургической коррекции соединительнотканные трансплантаты должны обладать не только необходимыми биологическими свойствами, но и иметь определенную геометрическую форму. В технологическом процессе изготовления трансплантатов существует этап моделирования формы. Этап «выкраивания» трансплантатов традиционно осуществляется при помощи скальпеля, ножниц, трепана или штампа, так как для выполнения микрохирургических операций трансплантаты должны строго соответствовать заданным размерам. В лаборатории консервации тканей Всероссийского центра глазной и пластической хирургии предложен новый метод моделирования соединительнотканных трансплантатов при помощи углекислотного лазера. Для «выкраивания» трансплантатов используется комплекс лазерного моделирования, разработанный по проекту специалистов Всероссийского центра глазной и пластической хирургии в Российском ядерном центре (г. Саров). Данный комплекс предназначен для использования в медицине с целью автоматизации процесса изготовления различных трансплантатов, где лазер выполняет роль скальпеля и способен моделировать трансплантаты любой формы. Кроме того, лазерный луч благодаря монохроматичности, строгой направленности, когерентности и свойствам концентрировать большое количество энергии на малых площадях дает возможность реза различных биологических тканей без существенных повреждений (Стадников А.А. и соавт. 2001, 2005; Сетейкин А.Ю. и соавт. 2002., Москвин С.В., 2007). Степень и результат биологического действия лазерного излучения на различные ткани зависят не только от особенностей излучения (тип лазера, длительность и плотность мощности излучения, частоты импульсов и др.), но и от физико-химических и биологических особенностей облучаемых тканей (гетерогенность, теплопроводность, коэффициент поглощения и отражения различных промежуточных поверхностей внутри среды и др.) (Гамалея Н.Ф. и соавт. 1987).
Однако воздействие лазерного излучения на структуру соединительнотканных трансплантатов на сегодняшний день не изучено. В этой связи представляется актуальным исследование воздействия лазерного излучения на структуру трансплантатов с различной фиброархитектоникой, а также подбор режимов лазерного сечения для моделирования соединительнотканных трансплантатов, применяемых в различных областях хирургии.
Цель исследования
Морфологически обосновать возможность применения лазерной технологии при моделировании соединительнотканных трансплантатов.
Задачи исследования
- Изучить фиброархитектонику различных по структуре соединительнотканных трансплантатов, прошедших этап лазерного моделирования.
- Исследовать пластические свойства соединительнотканных трансплантатов после воздействия лазерного излучения.
- Изучить динамику процессов замещения соединительнотканных трансплантатов, смоделированных лазерным лучом, при экспериментальной пересадке.
- Разработать оптимальные режимы лазерного излучения, не нарушающего структуру соединительнотканных трансплантатов.
Научная новизна исследования
Впервые изучено влияние лазерного излучения на структуру соединительнотканных трансплантатов и их регенераторные свойства при пересадке животным. Установлено, что моделирование формы соединительнотканных трансплантатов с учетом их строения и подбором оптимального режима лазерной резки позволяет максимально сохранять структуру волокнистого остова трансплантатов и их регенераторные свойства. Разработан оптимальный режим лазерной резки для трансплантатов твердой оболочки головного мозга, дермы опорных участков стопы, фиброзной капсулы почки и подкожной жировой клетчатки, с учетом особенностей их архитектоники.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Разработана и предложена для внедрения в практику тканевых банков новая технология лазерного моделирования соединительнотканных трансплантатов, позволяющая сохранять их структуру, биомеханические свойства и способность стимулировать регенераторные процессы. Предложенная технология лазерного моделирования соединительнотканных трансплантатов позволяет значительно повысить эффективность их производства, обеспечивает суперточную, высокопроизводительную резку биологических тканей на заданные геометрические формы, исключает загрязнение ткани, что позволяет обеспечить конечный эффективный результат хирургической коррекции.
Реализация результатов исследования
В настоящее время в лаборатории консервации тканей ФГУ «Всероссийского центра глазной и пластической хирургии Минздравсоцразвития» этап лазерного моделирования включен в технологию изготовления соединительнотканных трансплантатов, применяемых в различных областях хирургии. Трансплантаты, моделированные лазерным излучением, поставляются в 487 клиник России и стран СНГ.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Максимально сохранить структуру моделируемых соединительнотканных трансплантатов позволяет использование разных режимов работы лазера в комплексе с увлажнением и обдувом места лазерного реза.
2. Показатели прочности «шовной фиксации» краевой зоны трансплантатов твердой оболочки головного мозга и фиброзной капсулы почки, моделированных лазерным излучением не изменяются, для трансплантатов дермы опорных участков стопы возрастают в 1,5 раза по сравнению с контрольными (вырезанными трепаном).
3. Динамика резорбции и замещения соединительнотканных трансплантатов, моделированных лазерным излучением, идентична с таковой после имплантации трансплантатов, вырезанных трепаном вручную. Имплантированные ткани в обоих случаях способствуют стимуляции регенерации структурных элементов конъюнктивы глаза, что приводит к полноценному заживлению созданных дефектов.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были доложены на научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения» Московского НИИ глазных болезней имени Гельмгольца, г.Москва, 2008г.; на IX Конгрессе Международной ассоциации морфологов г.Бухара, 2008г.; на Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» г.Самара, 2008г.; на IY Межрегиональной научно-практической конференции «Метрология и инженерное дело в медико-биологической практике» г.Оренбург, 2009г.; на IY Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» г. Санкт-Петербург, 2010г.; на Х Конгрессе ассоциации морфологов г. Ярославль, 2010г.
Работа апробирована на расширенном совместном заседании Башкирского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (ВРНО АГЭ), г.Уфа, 2010г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 7 работ в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка использованной литературы, приложений. Список литературы содержит 225 источник, из них 151 отечественных и 74 зарубежных. Текст изложен на 128 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 48 рисунками, из них графики -7, статистические диаграммы -4, таблицы -8.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являлись соединительнотканные трансплантаты, изготовленные из следующих анатомических структур: твердой оболочки головного мозга, фиброзной капсулы почки, дермы опорных участков стопы, подкожной жировой клетчатки.
Донорские ткани обрабатывали и консервировали по технологии Аллоплант, разработанной во Всероссийском центре глазной и пластической хирургии г. Уфа (патент РФ №2189257). Данная технология заключается в следующем – донорский материал подвергали многоступенчатой физико-химической обработке, которая позволяет достигнуть мембранолиза и способствует экстракции наиболее иммуногенных компонентов тканей, с сохранением коллагенового каркаса.
Моделирование полученных соединительнотканных трансплантатов проводили с помощью комплекса лазерного моделирования, разработанного по проекту специалистов лаборатории консервации тканей ВЦГПХ в Российском Федеральном ядерном центре (г. Саров). Данный комплекс является программно-аппаратным устройством, предназначенным для автоматизированного изготовления материалов хирургического назначения из органов и биологических материалов. Комплекс лазерного моделирования (КЛМ) включает в себя лазерную установку, которая состоит из СО2–лазера с предельной мощностью лазерного излучения 100 Вт на длине волны 10,6 мкм и координатно-управляемую систему (КУС) прецизионного перемещения лазерного луча по плоской поверхности. СО2–лазер и КУС обеспечивают высокопроизводительную резку заготовок биологических тканей на заданные геометрические формы хирургических имплантатов. Установка снабжена автономной системой водяного охлаждения, телеметрической системой на основе цветной телекамеры высокого пространственного разрешения VEC–535, которая осуществляет визуализацию формы заготовок биологических тканей и определяет их геометрические размеры. Управление работой КЛМ производится с помощью компьютерной программы, установленной на ПЭВМ, которая управляет работой всех входящих в КЛМ систем, а также производит оптимальный раскрой заготовок биологических материалов на заданные формы трансплантатов.
Испытуемые образцы по способу изготовления (моделирования) разделили на две группы: контрольная – вырезаны трепаном, экспериментальная – вырезаны лазером. Форма всех образцов круглая -диаметр 10 мм. Для моделирования экспериментальных образцов использовали непрерывный и импульсный режимы работы лазера. Образцы были смоделированы при длине волны лазерного излучения 10,6 мкм. Мощность, скорость излучения и количество проходов лазерного луча подбирали опытным путем в зависимости от фиброструктуры и толщины ткани. Первоначально эффективность лазерного реза соединительнотканных трансплантатов оценивали макроскопически (отсутствием карбонизации по краю трансплантата), затем для подтверждения сохранности структуры проводили морфологические исследования трансплантатов. Подбор режима лазерной резки соединительнотканных материалов фиксировали в журнале.
Для изучения структуры соединительнотканных трансплантатов после воздействия лазерного излучения был использован комплекс морфологических методов.
Гистологические срезы окрашивали гематоксилином, эозином, фукселином по Вейгерту, орсеином по Унны-Тенцера и по Ван Гизону. Микроскопические исследования проводили с использованием световых микроскопов JENAVAL и AXIO IMAGER–Z1 (C.Zeiss, Германия). Микрофотосъемку осуществляли с помощью цифровой камеры Nicon D 100.
Для электронно-микроскопического исследования кусочки тканей фиксировали в 2,5% р-ре глютаральдегида, приготовленном на какодилатном буфере (рН 7,2-7,4) с последующей дофиксацией в 1% растворе OsO4. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон-812 по общепринятой методике Б. Уикли (1975). Предварительно изготавливали полутонкие срезы толщиной 1 мкм и окрашивали их толуидиновым синим на 2.5%-ном растворе безводной соды. На данных срезах выбирали участки для электронно-микроскопического исследования. Срезы готовили на ультратоме LKB-III 8800 (Швеция). Ультратонкие срезы контрастировали 2% водным раствором уранилацетата, цитратом свинца по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975) и изучали в трансмиссионных микроскопах JEM-7A и JEM-СХ II (Япония) при увеличениях от 4000 до 35000.
Структуру волокнистого остова и рельеф поверхности трансплантатов исследовали используя сканирующую электронную микроскопию. Для этого образцы проводили в спиртах возрастающей концентрации, в двух порциях 100% этанола, в двух порциях ацетона и высушивали с последующим напылением в ионно-распылительной установке слоем платины (Волкова О.В. и соавт., 1987г.) Микрофотографирование проводили на сканирующем микроскопе JSM–840 (Jeol, Япония) при увеличениях 500, 1000, 3000.
Рельеф поверхности трансплантатов изучали также с использованием метода импрегнации нитратом серебра по Минигазимову Р.С. (Патент РФ № 2270446 «Способ исследования рельефа поверхностей гистологических препаратов»). Суть метода заключается в импрегнации препаратов серебром с его полным восстановлением, что придает светоотражательную способность всем импрегнированным структурам. Препараты, исследовали с помощью микроскопа AMPLIVAL (C. Zeiss, Германия) с темнопольным эпиобъективом, позволяющим визуализировать объемную картину рельефа поверхности препарата. Микрофотосъемку препаратов проводили цифровой камерой Nicon Coolpix 4500.
Для оценки фиброархитектоники биоматериалов использовали способ количественного поляризационно-оптического анализа. В основе метода – способность волокнистых компонентов соединительной ткани к двойному лучепреломлению (Scheuner G., 1981; Wolman M., Kaster F.H., 1986). Проводили поляризационную микроскопию неокрашенных гистологических срезов толщиной 10 мкм с использованием микроскопа МИН–8 и цифровой фотонасадки Nicon Coolpix 4500 при скрещенных фильтрах.
Морфометрию структурного состояния краевой зоны трансплантата после моделирования трепаном или лазером исследовали с использованием метода количественной оценки относительной плотности волокнистых структур. Учитывая тот факт, что процесс моделирования предполагает рассечение ткани, то есть нарушение ее целостности, нами выявлены две зоны трансплантата: зона реза и интактная зона. При этом выполнялась световая микроскопия гистологических срезов, окрашенных по Ван Гизону с использованием микроскопа МС-50 (Micros, Австрия) с цифровой фотонасадкой Nicon Coolpix 4500. Полученные фотоснимки передавались с Flash-карты фотоаппарата в персональный компьютер для дальнейшей обработки. С помощью предварительно откалиброванной на объектив 40 лицензионной программы Biovision Professional («Westmedica», Австрия) производилось измерение площади зоны препарата, находящейся в поле зрения. Волокнистые структуры и основное вещество регистрировались с помощью специальной функции программы – «сегментация», при заданном диапазоне яркости: 100200, при этом определялась их площадь и процентное соотношение. Площадь исследуемого участка составляла 40 тыс мкм2. Полученные результаты переводились в программу Microsoft Office Excel 2007, для устранения случайных значений. Затем обработанные данные переводились в программу Statistica 7.0.
Биомеханическим испытаниям подвергались следующие анатомические структуры: твердая оболочка головного мозга, фиброзная капсула почки и дерма опорных участков стопы. В работе использовали методику определения «прочности шовной фиксации» (Нигматуллин Р.Т., 1996), а так же метод деформации препарата с постоянной скоростью (Егоров В.И. и др., 2004). Изучение биомеханических свойств трансплантатов проводили на универсальной машине для испытания прочностных свойств материалов модели 1185 INSTRON (Англия). Диапазон нагрузок от 0 до 100 Н (ньютонов), скорость перемещения траверсы от 0,005 до 250 мм/мин. Для механических испытаний из исследуемых биологических тканей изготавливали образцы, имеющие прямоугольную форму (20мм х 25мм). С помощью микрометра определяли толщину образцов. Образцы, изготовленные из твердой мозговой оболочки имели толщину – 1000 мкм, из дермы – 2500 мкм, из фиброзной капсулы почки –100 мкм. Один конец образца фиксировали в зажим разрывной машины, через свободный край ткани проводили 4 лигатуры, концы которых укрепляли в противоположном зажиме. В качестве лигатур использовали аллосухожильные нити толщиной 100-200 мкм. Толщина нитей зависела от типа трансплантата. В последующем образцы подвергали одноосному линейному растяжению. Прочностные свойства трансплантатов испытывали при постоянной скорости деформации – 2 мм/сек.
Статистический анализ полученных данных проводили используя методику, предложенную О.Ю. Ребровой (2002г.). Полученные результаты переводились в программу Microsoft Office Excel 2007. Затем обработанные данные переводили в программу Statistica 7.0.
Экспериментальные исследования по имплантации соединительнотканных трансплантатов, смоделированных разными способами, проводили на 36 кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой от 1,5-2 кг. Животных содержали в виварии, оборудованном согласно требованиям «Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» за № 1045-73. Исследования осуществляли в соответствии с правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к Приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.77), «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986г. и Федерального закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997г. Животные оперировались под кетаминовым наркозом (в отдельный шприц: кетамин 2 мл (внутримышечно) + дроперидол 1 мл (внутримышечно). Техника операции заключалась в следующем. В верхнем секторе глазного яблока трепаном иссекался участок коньюнктивы диаметром 10 мм. Аллотрансплантат фиброзной капсулы почки для экспериментальной группы моделировался при помощи лазера (диаметром 10 мм) и вручную трепаном (диаметр 10 мм), затем укладывался на оголенную поверхность склеры. Фиксация трансплантата производилась узловатыми швами, которые проводились через коньюнктиву, эписклеру и трансплантат. В послеоперационном периоде ежедневно 3 раза в день в конъюнктивальную полость инстиллировали 0,25% раствор левомицетина.
Трансплантаты с окружающими тканями коньюнктивы глазного яблока были изучены гистологическими и электронно-микроскопическими методами в различные сроки после операции. Через 7, 14, 21, 30, 60, 180 суток после операции животных выводили из опыта передозировкой наркоза.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенные морфологические исследования позволили проанализировать зависимость структурных изменений различных видов соединительнотканных трансплантатов при лазерном моделировании от их фиброархитектоники.
Так, трансплантаты твердой оболочки головного мозга, представляющие собой многослойную плотную соединительнотканную пластинку, в зоне реза трепаном выраженных повреждений не имеют. Наблюдается лишь незначительное продольное расщепление пучков коллагеновых волокон в месте сечения. Морфометрические исследования демонстрируют небольшое снижении плотности волокнистых структур в краевой зоне, а именно: показатель плотности волокнистых структур интактного участка составляет 53,7±3,32%, аналогичный показатель трансплантатов, моделированных трепаном соответствует 43,4±2,07%. Общая фиброструктура трансплантата, состоящая из плотных, параллельно лежащих пучков коллагеновых волокон и рыхлой сети эластических волокон, сохраняется полностью. Исследование экспериментальных образцов показало следующее: у трансплантатов ТМО по линии лазерного реза наблюдаются слабовыраженные деструктивные изменения в виде частичной гомогенезации пучков коллагеновых волокон. Максимальная ширина зоны деструкции достигает 4 мкм. Морфометрия краевой зоны трансплантатов, моделированных лазером, демонстрирует уплотнение волокнистых структур и уменьшение межпучкового пространства в зоне реза. Структура самого трансплантата остается сохраненной. Биомеханические исследования трансплантатов ТМО на прочность «шовной фиксации» показывают, что предел прочности контрольных образцов на 0,300 МПа выше экспериментальных, относительное удлинение контрольных образцов на 0,35% ниже экспериментальных, значение модуля упругости контрольных образцов выше аналогичного значения экспериментальных образцов на 0,341 МПа. Полученные данные свидетельствуют о том, что воздействие лазерного излучения на трансплантат практически не меняет его прочностных качеств для «шовной фиксации».
Проведенные морфологические исследования фиброархитектоники трансплантатов дермы опорных участков стопы показали, что в контрольных образцах данного трансплантата повреждений в зоне реза не наблюдается. Разнонаправленность коллагеновых и эластических волокон по линии реза сохраняется. При исследовании краевой зоны трансплантатов дермы, изготовленных при помощи лазера, наблюдается следующая картина: по линии прохождения лазерного луча образуются очаговые деструктивные изменения, ширина которых достигает 4-6 мкм. Выявленные локальные изменения в виде набухания коллагеновых волокон по линии реза не приводят к изменениям в целом фиброархитектоники трансплантата. Морфометрические данные подтверждают повышение плотности волокнистых структур по линии лазерного реза в 2 раза по сравнению с аналогичным показателем для трансплантатов, моделированных трепаном. Высокие пластические свойства трансплантатов дермы обусловлены особенностями ее фиброархитектоники, для которой характерен пространственный коллагеново-волокнистый остов, образованный разнонаправленными, извилистыми, способными к растяжению волокнами. Биомеханические испытания трансплантатов ДП на «прочность шовной фиксации» демонстрируют увеличение в 1,5 раза значения предела прочности и модуля упругости трансплантатов, моделированных лазером.
Сравнительный анализ структуры трансплантатов фиброзной капсулы почки показал, что в образцах изготовленных вручную трепаном наблюдается незначительное продольное расщепление пучков коллагеновых волокон по линии реза, что не нарушает фиброархитектонику самой ткани в целом. Изучение экспериментальных образцов данного трансплантата выявило лишь очаговое набухание коллагеновых волокон в зоне прохождения лазерного луча (ширина зоны до 2 мкм), которое также не влияет на структуру самого трансплантата в целом. Морфометрический анализ показал, что плотность волокнистых структур трансплантатов ФКП в зоне лазерного реза почти в 2 раза выше аналогичного показателя образцов, моделированных трепаном. Биомеханические исследования краевой зоны трансплантатов ФКП демонстрируют сохранение прочностных свойств. Прочностные параметры трансплантатов ФКП, моделированных лазером идентичны аналогичным показателям трансплантатов ФКП, изготовленных трепаном, а именно: для контрольных образцов предел прочности составляет - 2,000±0,333 МПа, относительное удлинение - 1,272±0,225%, модуль упругости - 1,620±0,317 МПа; для экспериментальных образцов предел прочности - 2,050±0,369 МПа, относительное удлинение - 1,182±0.009%, модуль упругости - 1,688±0.282 МПа.
Сравнивая данные морфологических исследований структуры трансплантатов подкожной жировой клетчатки, изготовленных трепаном вручную и образцов, прошедших этап лазерного моделирования можно сказать следующее: ячеистость структуры трансплантата в обеих группах сохраняется, незначительные изменения претерпевают края образцов. В контрольных образцах жировые ячейки с оболочками и тяжи коллагеновых и эластических волокон рассечены по линии реза без изменения их структуры. В экспериментальных образцах по линии реза наблюдаются небольшие деструктивные изменения, которые имеют мозаичный вид. Максимальная ширина очаговой деструкции достигает 2 мкм. В целом фиброструктура трансплантата ЖК, моделированного лазерным лучом сохраняется. Морфометрическая оценка краевой зоны данного трансплантата следующая: плотность волокнистых структур по линии лазерного реза в 2 раза выше плотности волокнистых структур трансплантатов ЖК, моделированных трепаном.
Моделирование трансплантатов с подбором оптимального режима лазерной резки позволяет максимально сохранить структуру волокнистого остова исследуемых соединительнотканных биоматериалов. А.А. Стадниковым и соав., (2001, 2005) была проведена сравнительная морфометрическая оценка состояния стромальных элементов трансплантатов аорты и ТМО при выкраивании данных трансплантатов при помощи хирургического СО2-лазера, гидроножа и трепана. Указанными авторами отмечается, что наименьшие отклонения в структуре волокнистых компонентов соединительнотканных трансплантатов наблюдается при использовании лазерной технологии.
Изменения структуры трансплантатов по линии лазерного реза на наш взгляд - это суммарный конечный фотобиологический эффект, который формируется в результате процессов, возникающих непосредственно в самом объеме облученной ткани. Известно, что наиболее значительные повреждения возникают при поглощении первых 63% проходящей лазерной энергии (Богданович У.Я. и соавт., 1978; Плужников М.С., 2000). Выбор режима лазерного моделирования, позволяющего достигать оптимальный результат, в значительной степени определяется хромофорами ткани - молекулами, способными поглотить излучение и превратить его в тепло. Эффект воздействия зависит от соотношения целевых и конкурирующих хромофоров ткани (Москвин С.В., 2007, Пушкарева А.Е., 2008). Целевыми хромофорами для излучения СО2-лазера являются молекулы воды. Так, при 100 оС молекулы воды, содержащиеся в большинстве тканей, начинают испаряться, сильно увеличиваться в объеме, формируются газовые пузыри. Это, в свою очередь, приводит к повышению давления и вызывает механические разрушения и деструкцию ткани. Так формируется лазерный рез (Елисеенко В.И., 1989; Плужников М.С., 2000; Пушкарева А.Е., 2008). Наличие и количество молекул воды в составе основного вещества, в которое погружены пучки коллагенновых волокон, на наш взгляд, тоже являются слагаемым эффективного лазерного реза соединительнотканных трансплантатов. Основное вещество представляет собой оптически прозрачную гелеобразную субстанцию различной степени вязкости, невидимую на обычных гистологических срезах. Компонентами основного вещества являются углеводно-белковые комплексы (Слуцкий Л.И., 1969; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Ноздрин В.И. и соавт., 2005). Наиболее полно изучены углеводные компоненты этих соединений – гликозаминогликаны (ГАГ). ГАГи имеют несколько разновидностей, которые отличаются друг от друга химической структурой, степенью сульфатированности и молекулярной массой. Наибольшую величину молекул имеет гиалуроновая кислота. Молекулы гликозаминогликанов гидрофильны, связывают большое количество молекул воды и ионов, входящих во внеклеточную жидкость (Слуцкий Л.И., 1969; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981).
Во избежание нежелательной коагуляции, нами для каждого вида соединительнотканных трансплантатов подбирался оптимальный режим лазерного моделирования: режим импульса, мощность, частота, скорость и количество проходов лазерного луча. Кроме того, для охлаждения места воздействия применялось локальное орошение и обдув зоны лазерного реза.
Изменение фиброструктуры соединительнотканных трансплантатов после воздействия лазерного излучения зависит, на наш взгляд, от следующих факторов: 1) от пространственной ориентации и толщины пучков коллагеновых волокон; 2) от количества слоев пучков коллагеновых волокон, а также толщины моделируемой ткани; 3) количественного и качественного состава основного вещества. В зависимости от того, на сколько плотно располагаются пучки коллагеновых волокон и сколько слоев имеет ткань, определяется толщина поглощающего слоя, рассчитываются параметры лазерного излучения.
Полученные данные позволяют сделать следующие заключения. У изучаемых нами соединительнотканных трансплантатов, изготовленных из твердой оболочки головного мозга и дермы опорных участков стопы, выявленные изменения структуры зоны лазерного реза идентичны. В трансплантатах ТМО при относительно небольшой толщине (1 мм), плотном расположении пучков коллагеновых волокон, а также многослойности - доля основного вещества невысокая (Валишина А.Д., 1979; Улумбеков Э.Г., 1998; Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И., 2010). Чередование слоев пучков коллагеновых волокон и основного вещества приводит к образованию очаговых зон деструкции, то есть, лазерный луч, попав в плотную зону наложения друг на друга слоев пучков коллагеновых волокон, рассекая ткань разогревает ее и вызывает термическую деструкцию. В зоне основного вещества лазерный луч попадает в молекулы воды и без повреждений рассекает ткань. Поэтому в данных участках выраженные очаги деструкции отсутствуют.
Аналогичная картина наблюдается и в трансплантатах дермы опорных участков стопы, основная масса которых – коллагеновые волокна, образованные ими переплетающиеся пучки коллагеновых волокон, оплетенные сетью эластических волокон и небольшое количество основного вещества (Мулдашев Э.Р. и соавт., 1981; Нигматуллин Р.Т., 1996; Ноздрин В.И. и соавт., 2005; Кошевенко Ю.Н., 2006; Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И., 2010). Исследования зоны реза трансплантата дермы показывают, что здесь деструкция также имеет очаговый характер, то есть участки гомогенизированных коллагеновых волокон чередуются с участками волокон с сохраненной структурой. Ширина термической деструкции достигает 4-6 мкм. Мы предполагаем, что структурные изменения носят очаговый характер из-за хаотичного расположения волокнистых элементов, не имеющих какой-либо геометрической последовательности, а именно под действие лазерного излучения попадают пучки коллагеновых волокон П и Ш порядка, расположенные друг над другом. Участки, расположенные между коллагеновыми волокнами и заполненные основным веществом, термической деструкции не подвергаются.
Анализируя фиброархитектонику трансплантатов фиброзной капсулы почки можно сказать следующее: ФКП относится к волокнистой соединительной ткани, состоящей из двух слоев: наружного слоя - тонкого, состоящего из плотно лежащих коллагеновых волокон, образующих единый пласт и внутреннего слоя более объемного с множеством разнонаправленных коллагеновых волокон, пучков коллагеновых волокон I порядка, имеющих рыхлую бессистемную организацию (Слуцкий Л.И., 1969; Сорокин А.П., 1973; Шангина О.Р., 2007). Особенная структура ткани (двуслойность), высокий уровень гидратации внутреннего слоя и малая толщина трансплантата (0,1 мм) дали соответствующие результаты. Предполагаем, что незначительные структурные изменения возникают в наружном слое трансплантата ФКП, который имеет более плотную структуру, состоящую из компактно расположенных тонких пучков коллагеновых волокон с характерной для них хаотичностью и извитостью. Отсутствие нарушений в структуре внутреннего слоя, на наш взгляд, объясняется рыхлой организацией волокон и концентрацией основного вещества в данном слое.
Жировая ткань, с точки зрения оптических свойств, представляет собой неоднородную среду, способную поглощать, отражать и рассеивать излучение (Пушкарева А.Е., 2008). Фиброструктура трансплантата, изготовленного из подкожной жировой клетчатки, представлена крупными жировыми дольками, окруженными коллагеново-эластическими оболочками, а также соединительнотканными тяжами, состоящими из плотноупакованных коллагеновых пучков Ш порядка и сети эластических волокон (Кошевенко Ю.Н., 2006). Жировые ячейки содержат легкоплавкие жиры - триглицериды (температура плавления 15 оС). Известно, что при расщеплении легкоплавких жиров образуется вода, поэтому жировую клетчатку можно рассматривать как депо связанной воды. (Ноздрин В.И. и соавт., 2005). Толщина трансплантата ЖК составляет 5-7 мм. В результате лазерного воздействия ячеистость структуры трансплантата подкожной жировой клетчатки по линии реза сохраняется, но наблюдаются очаговые фрагменты коагуляции, расположенные, как правило, в зоне прохождения пучков коллагеновых волокон. Мы предполагаем, что молекулы воды, которые в жировых дольках содержатся в избытке, дают возможность лазерному лучу беспрепятственно рассекать жировые дольки и лишь пересекая плотные соединительнотканные коллагеновые тяжи лазерный луч вызывает слабую деструкцию в зоне их расположения.
Деструктивных изменений эластических волокон, связанных с воздействием лазерного луча мы не наблюдали. Очевидно, это связано с тем, что эластические волокна устойчивы к высоким температурам (Слуцкий Л.И., 1969).
Сохранение пластических свойств соединительнотканных трансплантатов является важным фактором, обуславливающим эффект их клинического применения. После пересадки в организме трансплантаты должны временно или постоянно выполнять различного характера механические нагрузки. Поэтому имплантированные биоматериалы должны обладать адекватными упруго-деформативными свойствами (Кардапольцева Г.В., Дунаева В.Г., 1975; Пуриня Б.А. и др. 1980; Нигматуллин Р.Т., 1996; Шангина О.Р., 2007 и др.). Данные, полученные в результате биомеханических испытаний «на прочность шовной фиксации» подтверждают, что упруго-прочностные свойства трансплантатов, моделирование формы которых было произведено при помощи лазерного луча не изменились, а у трансплантатов дермы опорных участков стопы наблюдалось даже увеличение биомеханических параметров в 1,5 раза по сравнению с контрольными образцами.
Полученные нами результаты морфометрических исследований краевой зоны трансплантатов демонстрируют уплотнение волокнистых структур по краю лазерного реза у всех исследуемых трансплантатов, что в свою очередь приводит к увеличению прочностных свойств трансплантатов Данные по изменению плотности волокнистых структур в краевой зоне представлены в таблице 8.
Таблица 8
Морфометрическая оценка плотности волокнистых структур трансплантатов, моделированных разными способами в краевой зоне
| Виды трансплантатов | Трансплантаты, моделированные трепаном | Трансплантаты, моделированные лазерным лучом |
| ТМО | 43,4±2,07 | 74,7 ±10,41 |
| ДП | 49.1±2,33 | 96,5±1,78 |
| ФКП | 31,2±3,26 | 80,3±5,92 |
| ЖК | 14,1±2,02 | 27,8±3,22 |
При обезвоживании, лишении ткани молекул воды по линии лазерного реза, наблюдается эффект сморщивания, т.е. происходит сближение пучков коллагеновых волокон. Результаты наших исследований находят подтверждение в работах других авторов. По данным исследований, проведенных А.М. Хилькиным, А.Б. Шехтером и др. (1976), в обезвоженных коллагеновых пленках наблюдается возникновение случайных связей между наиболее близко расположенными агрегатами макромолекул коллагена, в результате чего коллагеновые пленки в сухом состоянии (лишенные воды) обладают значительной прочностью при растяжении. Происходит увеличение межмолекулярного сцепления в структуре коллагена. По нашему мнению, повышение прочности края трансплантата ДП, происходит за счет «спаивания-склеивания» коллагеновых волокон по краю трансплантата. Очевидно, происходит некая «структурная сшивка» волокон, что в итоге позволяет обеспечить более надежную шовную фиксацию трансплантата.
Анализируя полученные морфологические данные по фиброархитектонике, результаты морфометрии по состоянию волокнистых структур краевой зоны, данные по биомеханическим свойствам соединительнотканных трансплантатов, а также проведя ряд опытных исследований, можно сказать, что подобранные нами режимы лазерного моделирования являются оптимальными.
Для подтверждения сохранности регенераторных свойств соединительнотканных трансплантатов при лазерном моделировании в оптимальном режиме нами были проведены исследования по имплантации на животных.
Полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что пересаженные на конъюнктиву глаза кролика трансплантаты, моделированные трепаном и лазерным лучом, постепенно в течение месяца резорбируются макрофагами и замещаются полноценным соединительнотканным регенератом. Динамика замещения биоматериалов по морфологической картине в обеих опытных группах и на всех сроках эксперимента идентична.
Результаты гистологических и электронно-микроскопических исследований показали, что уже через месяц после имплантации на конъюнктиву глазного яблока кроликов трансплантатов ФКП в обеих опытных группах выявились все признаки полного замещения трансплантатов. Пучки коллагеновых волокон в регенерате располагались гораздо плотнее, чем в соединительнотканной пластинке конъюнктивы в норме, но при этом новообразованная ткань была пронизана относительно большим количеством тонкостенных сосудов, характерных для соединительнотканной пластинки конъюнктивы. Через 60 суток структура регенерата уже полностью соответствовала окружающей ткани конъюнктивы, то есть была представлена васкуляризированной рыхлой соединительной тканью. В течение второго месяца цикл ремоделирования новообразованной ткани завершился полностью.
Выявленная схема процесса замещения трансплантата новообразованной тканью полностью укладывается в рамки уже изученного механизма действия аллогенных трансплантатов (Мулдашев Э.Р. 1994, Муслимов С.А. 2000, Мусина Л.А. 2007). Установлено, что процесс постепенной резорбции аллогенного трансплантата макрофагами и стимуляция последних продуктами деструкции трансплантата усиливает их влияние на структуру формирующейся ткани на месте трансплантации и индуцирует полноценную регенерацию тканей с формированием в ней всех составных элементов.
Таким образом, полученные результаты экспериментального исследования показывают, что использованные нами способы моделирования соединительнотканных трансплантатов для пластики конъюнктивы глазного яблока не оказывают отрицательного влияния на процессы их замещения и на регенерацию тканей.
В заключении представляется целесообразным выделить некоторые преимущества моделирования соединительнотканных трансплантатов при помощи лазерного излучения.
1. Использование комплекса лазерного моделирования обеспечивает суперточную, высокопроизводительную резку биологических тканей на заданные геометрические формы, исключает загрязнение самой ткани, что особенно важно при выполнении микрохирургических операций и в совокупности позволяет обеспечить конечный эффективный результат хирургической коррекции.
2. При моделировании соединительнотканных трансплантатов трепаном в зоне реза наблюдается небольшое продольное расщепление пучков коллагеновых волокон, некая «бахромчатость», чего не происходит при выкраивании лазерным лучом. Кроме того, «структурная сшивка» коллагеновых волокон по краю трансплантата дермы приводит к повышению его пластических свойств, которые имеют значение при шовной фиксации краев трансплантата.
ВЫВОДЫ
- Моделирование формы трансплантатов с подбором оптимального режима лазерной резки и учетом особенностей фиброархитектоники различных соединительнотканных трансплантатов позволяет максимально сохранить их структуру и не оказывает отрицательного влияния на процессы замещения и регенерации тканей при пересадке.
- Изменение структуры соединительнотканных трансплантатов, после воздействия лазерного излучения зависит от особенностей фиброархитектоники самой ткани, то есть пространственной ориентации коллагеновых волокон и толщины их пучков, количества слоев пучков коллагеновых волокон в ткани. Чем тоньше пучки коллагеновых волокон, шире межпучковые пространства и меньше толщина моделируемой ткани, тем менее выражены деструктивные изменения в зоне лазерного реза.
- Моделирование формы при помощи трепана приводит к продольному расщеплению пучков волокон по линии реза у всех исследуемых соединительнотканных трансплантатов. При лазерном моделировании в зоне реза наблюдается минимальная очаговая деструкция пучков коллагеновых волокон, ширина которой варьирует от 2 до 6 мкм (для трансплантатов твердой оболочки головного мозга – 2-4 мкм, для трансплантатов дермы опорных участков стопы – 4-6 мкм, для трансплантатов фиброзной капсулы почки – 1-2 мкм, для трансплантатов подкожной жировой клетчатки – 1-2 мкм). Деструктивные изменения в зоне лазерного реза сопровождаются уплотнением волокнистых структур соединительнотканных трансплантатов.
- Биомеханические исследования подтверждают сохранение фиброархитектоники трансплантатов, моделированных лазерным лучом. Так, показатели прочности «шовной фиксации» краевой зоны трансплантатов твердой оболочки головного мозга и фиброзной капсулы почки не изменяются, для трансплантатов дермы опорных участков стопы - возростают в 1,5 раза по сравнению с контролем, что связано с высокой плотностью пучков коллагеновых волокон, которые в зоне реза подвергаются «структурной сшивке», обеспечивающей укрепление краевой зоны трансплантата.
- При экспериментальной пересадке соединительнотканные трансплантаты, моделированные лазерным лучом, постепенно резорбируются макрофагами и замещаются полноценным соединительнотканным регенератом.
- Одним из факторов, определяющих характер структурных изменений в трансплантате при моделировании, является мощность и скорость лазерного излучения. Опытным путем для каждого вида ткани разработан оптимальный режим лазерной резки, а именно: для трансплантатов твердой оболочки головного мозга - мощность 10Вт и скорость 3,5см/сек, в один проход лазерного луча; для трансплантатов дермы опорных участков стопы – мощность 30Вт и скорость 10см/сек, в один проход лазерного луча; для трансплантатов фиброзной капсулы почки – мощность 10Вт и скорость 7см/сек, в три прохода лазерного луча; для подкожной жировой клетчатки – мощность 10Вт и скорость 7см/сек, в шесть проходов лазерного луча.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д. Лазерное моделирование трансплантатов для офтальмохирургии // Материалы научно-практической конференции Московского НИИ глазных болезней имени Гельмгольца. – Москва, 2008. - С. 89-91.
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д. Лазерное моделирование соединительнотканных трансплантатов // Морфология, 2008. Т.133, №2. –С.153.
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д., Хусаинова Л.Р. Влияние лазерного излучения на структуру соединительнотканных трансплантатов //Материалы Всероссийской конференции с международным участием. –Самара, 2008. -С.125-127.
- Гайнутдинова Р.Д. Применение лазерного излучения для моделирования соединительнотканных трансплантатов //Морфология, 2008. Т.133, №4. –С.62.
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д. Сравнительная гистологическая характеристика структурных изменений различных соединительнотканных трансплантатов при воздействия лазерного излучения // Морфология, 2008. Т.133, №4. –С.103.
- Гайнутдинова Р.Д., Шангина О.Р. Морфологические изменения различных соединительнотканных трансплантатов после воздействия лазерного излучения //Морфологические ведомости, 2009. №3.–С.52-53.
- Мулдашев Э.Р., Нигматуллин Р.Т., Галимова В.У., Шангина О.Р. Гайнутдинова Р.Д., Гайфуллин С.Н., Мухаметов А.Р. Инновационные технологии в хирургии – альянс творчества и стандартизации // Материалы IV Межрегиональной научно-практической конференции «Метрология и инженерное дело в медико-биологической практике». – Оренбург, 2009. –С.60-62.
- Шангина О.Р., Хасанов Р.А., Лапчик Д.Р., Гайнутдинова Р.Д. Стандартизация деятельности тканевого банка ALLOPLANT ® //Материалы IV Межрегиональной научно-практической конференции «Метрология и инженерное дело в медико-биологической практике». – Оренбург, 2009. –С.88-90.
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д., Кадыров Р.З. Применение лазерного излучения в процессе изготовления аллотрансплантатов для офтальмохирургии //Вестник Оренбургского Государственного Университета, 2009, №12. –С.157-159.
- Гайнутдинова Р.Д. Применение лазерных технологий в процессе изготовления трансплантатов // Материалы IV Всероссийского симпозиума «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». –Санкт-Петербург, 2010. –С.46-47.
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д. Морфологические исследования аллотрансплантатов фиброзной капсулы почки при экспериментальной пересадке // Морфология, 2010. Т.137, №4. –С.216-217.
- Шангина О.Р., Гайнутдинова Р.Д., Мусина Л.А, Муслимов С.А., Булгакова Л.А. Имплантация аллотрансплантатов моделированных разными способами на коньюнктиву глазного яблока. //Вестник Оренбургского Государственного Университета, 2010, №12. –С.236-238.
Гайнутдинова Раушания Дамировна
Морфологическое обоснование применения соединительнотканных трансплантатов моделированных лазерным излучением
03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Подписано в печать 2011. Формат 60х84/16.
Усл. печ. л.. Тираж 150 экз. Заказ №.
Типография
450, г.Уфа, ул.
