Морфофункциональное обоснование применения высоких доз аскорбиновой ки ­ слоты в лечении экспериментального острого панкреатита

На правах рукописи

Щетинин Николай Александрович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ВЫСОКИХ ДОЗ АСКОРБИНОВОЙ КИ­СЛОТЫ В ЛЕЧЕНИИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА

14.01.17 Хирургия 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология,

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

ОРЕНБУРГ – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Заслуженный врач РФ доктор биологических наук, професcор Заслуженный деятель науки РФ Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Заслуженный врач РФ доктор медицинских наук, профессор Заслуженный деятель науки РФ

Тарасенко Валерий Семенович Стадников Александр Абрамович Третьяков Анатолий Андреевич Соловьёв Георгий Сергеевич

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »

Защита состоится «______»_______________2010г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д.6. Зал заседаний ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »

Автореферат разослан «______»_____________________2010г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Р.И. Сайфутдинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Острый панкреатит до настоящего времени остается актуальной проблемой хирургической панкреатологии вследствие возрастающей заболеваемости, увеличения удельного веса его деструктивных форм, сопровождающихся высокой летальностью (Филин В.И., Костюченко А.Л., 1994; Савельев В.С. с соавт., 1996, 2000, 2006; Толстой А.Д. с соавт., 1999; Тарасенко В.С., 2000; Шеина Е.А., 2004; Стадников Б.А., 2005; Демин Д.Б., 2009).

Результаты лечения больных с острым панкреатитом во многом зависят от методов медикаментозного воздействия на паренхиму поджелудочной железы и сальниковую сумку с целью оптимизации репаративных процессов клеточных и тканевых элементов органа. Исследования последних лет доказали важную патогенетическую роль ишемии и активации липопероксидации в развитии острого панкреатита (Simovic M., 1997; Владимиров Ю.А., 1998; Roth E., 2004; Лебедев Д.С., 2005; Савельев В.С., 2006), что обусловливает необходимость применения препаратов, обладающих противоишемическими свойствами, в лечебной коррекции данной патологии.

Доказано, что гемодинамические нарушения появляются на ранних стадиях и сопровождают все последующие периоды заболевания (Атанов Ю.П. 1993; Heinrich S. et. al., 2006; Шапкин Ю.Г. с соавт., 2007). Так, для панкреатогенного шока характерны такие генерализованные расстройства кровообращения, как транзиторная гипертензия, сменяющаяся стойкой гипотонией, повышение вязкости крови за счет дефицита объема циркулирующей плазмы (Osmon S. et. al., 2004; Li C. et. al., 2007).

Наиболее фатальные изменения при остром панкреатите происходят на уровне микроциркуляторного русла (Бурневич С.З, 2000; Толстой А.В., 2003; Нестеренко Ю.А., 2004, Шапкин Ю.Г., 2007). Они характеризуются замедлением линейной скорости кровотока, агрегацией и стазом форменных элементов крови, повышением проницаемости сосудов (Филин В.И. с соавт., 1994; Бескосный А.А., 2003; Tao H.-Q. et. al., 2004 ). При этом микроциркуляторные нарушения носят генерализованный характер (Буянов В.М. с соавт., 1980; Светухин А.М., 2002; Савельев В.С. с соавт., 2003, 2006). Грубые изменения микроциркуляции приводят к гипоксии тканей, извращению тканевого обмена и являются одной из причин развития синдрома полиорганной недостаточности при остром панкреатите (Светухин А.М., 2002, Heinrich S. et. al., 2006; Haykin S., 2007).

Поэтому, общепризнанным элементом патогенетической терапии острого панкреатита, является необходимость коррекции нарушений микрогемодинамики (Молитвословов А.Б. с соавт., 1994; Савельев В.С. с соавт., 2000, 2006; Roth E., 2004; Forsmark  C. E., 2005). С этой целью в комплекс лечебных мероприятий при остром панкреатите включают назначение вазоактивных препаратов, дезагрегантов, антикоагулянтов, кровезаменителей гемодинамического ряда (Бурневич С.З., 2000; Beattie G. C., 2000; Beattie G.C., 2001; Sept G.A., 2005; Haykin S., 2007).

Очевидно, что поиски наиболее эффективного способа местного лечения острого панкреатита вызваны отсутствием заметных успехов в данном направлении. Недостаточно изучен вопрос о характере морфологических изменений в поджелудочной железе, выработке лечебной тактики при использовании общих и местных методов воздействия на бурно протекающий ишемический процесс. Поэтому столь велик интерес клиницистов к различным способам консервативного лечения острого панкреатита (Тарасенко В.С., 2000; Шеина Е.А., 2004; Стадников Б.А., 2005; Демин Д.Б. с соавт, 2009).

Данные литературы, касающиеся изучения уровня продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови или изучаемых тканевых структурах, не содержат гистологических сведений об одновременном изучении в разных тканях оксидантных процессов при экспериментальном остром панкреатите (Antosiewicz J. et al., 1995; Kishimoto W. et al., 1995; Weber H. et al., 1995; Simovic M.D. et al., 1997; Sept G.A., 2005; Li C. et. al., 2007).

Выраженная активация липопероксидации при остром панкреатите ведёт к быстрому истощению факторов антиоксидантной системы, прежде всего аскорбиновой кислоты (АК), ключевого антиоксиданта плазмы крови (Sweiry J.H., 1996). Тяжёлый острый панкреатит сопровождается снижением уровня аскорбиновой кислоты в крови в десятки раз (Scott P., 1993). Раннее истощение аскорбиновой кислоты при остром панкреатите прямо коррелирует с его тяже­стью и обусловливает негативный прогноз (Bonham M.J., 1999; Roth E., 2004). Так показано, что прогрессирующий дефицит аскорбиновой кислоты при тяжёлых воспалительных заболеваниях приводит к нарушению детоксикационной функции печени (Kabrt J. 1982), нарастанию цитолиза (Челак Е.М., 1980), развитию иммуносупрессии (Плецитный К.Д., 1986; Pavelic К., 1989), ослаблению барьерной функции желудочно-кишечного тракта (Радбиль О.С, 1991.), развитию очагов вторичного некроза (Волчегорский И.А., 1997), ак­тивации апоптоза (Хансон К.П., 1997).

В доступной литературе мы не встретили данных об изучении динамики активности анаэробного гликолиза и уровня аскорбиновой кислоты у экспериментальных животных при остром панкреатите.

Совершенно очевидно, что в литературе, посвященной проблеме острого панкреатита, отсутствуют клинические, морфологические и биохимические данные по применению высоких доз аскорбиновой кислоты при остром панкреатите, что и явилось предметом настоящего экспериментально-гистологичекого исследования.

Цель работы

Экспериментально – гистологическое обоснование целесообразности применения высо­ких доз аскорбиновой кислоты в лечении острого панкреатита.

Задачи исследования

1. Изучить морфологические и биохимические изменения в поджелудочной железе и характер репаративных процессов в ее тканях при асептическом и инфицированном экспериментальном остром панкреатите.
2. Определить влияние высоких доз аскорбиновой кислоты на морфофункциональные изменения в поджелудочной железе, печени, селезёнке при остром экспериментальном панкреатите (с инфицированием и без такового).
3. Обосновать целесообразность применения высоких доз аскорбиновой кислоты для лечебной коррекции острого панкреатита в клинических условиях.

Научная новизна исследования

Впервые изучена светооптическая и ультраструктурная реорганизация клеток паренхимы и стромы поджелудочной железы при экспериментальном остром панкреатите в условиях лечебной коррекции высоких доз аскорбиновой кислоты.

С использованием комплексного методического подхода (световая и электронная микроскопия, морфометрия, иммуноцитохимическая идентификация апоптозных клеток) доказана возможность оптимизирующего влияния экзогенно вводимой аскорбиновой кислоты на процессы репаративных гистогенезов, васкулогенеза, восстановления микроциркуляции паренхимы и стромы поджелудочной железы при экспериментальном остром панкреатите, а также показано позитивное воздействие данного препарата на компенсаторно-приспособительные возможности тканевых элементов.

Впервые при экспериментальном остром панкреатите комплексно исследована динамика биохимических маркеров в сыворотке крови, тканях поджелудочной железы, печени и селезенке, отражающих выраженность ишемического процесса, липопероксидации и истощения уровня аскорбата и его изменения под воздействием экзогенно вводимых высоких доз аскорбиновой кислоты.

Получены новые факты, обосновывающие возможность применения высоких доз аскорбиновой кислоты для лечебной коррекции острого панкреатита.

Практическая значимость работы

Установлено, что использование высоких доз аскорбиновой кислоты в лечении экспериментального острого панкреатита создает адекватные условия для стимуляции пролиферации панкреатоцитов, клеток фибробластического ряда, васкулогенеза, эффективного отграничения очагов панкреонекроза и коррегирует измененный клеточный и тканевой гомеостаз поджелудочной железы (в том числе и в инфицированных условиях).

Показано, что уровни молочной и аскорбиновой кислоты в сыворотке крови являются ранними диагностическими и прогностическими предикторами острого панкреатита, отражают тяжесть процесса и эффективность проводимого лечения.

Проведенное исследование открывает перспективы для клинического применения аскорбиновой кислоты, что имеет существенное значение для абдоминальной хирургии.

Внедрение

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах госпитальной хирургии; хирургии факультета последипломной подготовки специалистов; гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно – практическая конференция хирургов, посвящённая 140 – летию Бугурусланской городской больницы (Бугуруслан, 2007), на научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2008, 2009), на II научно-практической конференции хирургов и урологов (Н.Новгород, 2008), XVI Международном Конгрессе хирургов-гепатологов стран СНГ (Екатеринбург, 2009), на научно практическая конференция посвящённая 90 – летию Отделенческой клинической больницы на ст. Оренбург (Оренбург 2009), на региональной конференции дипломированных специалистов «Молодые ученые – медицине» (Самара 2009). По теме диссертации опубликовано 23 работы, из них 5 по перечню ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Активация анаэробного гликолиза и выраженность истощения уровня аскорбиновой кислоты отражают тяжесть поражения панкреатической ткани.
2. Введение аскорбиновой кислоты в условиях экспериментального острого панкреатита приводит к достоверному увеличению объёма ядер панкреатоцитов и ядерно цитоплазматических отношений, улучшает структурную организацию гепатоцитов и клеток кровеносных сосудов, снижает явления отёка в тканях печени и селезёнки. В своей совокупности это свидетельствует о создании адекватных условий для реализации ими репаративных возможностей.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 291 источников, в том числе 185 работ отечественных и 106 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 32 черно-белыми и цветными микрофотографиями гистологических препаратов, электронограмм и 21 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Общие сведения об объеме и структуре исследований

Исследования по изучению морфологических изменений в поджелудочной железе в условиях экспериментального острого панкреатита (ЭОП) с дополнительным инфицированием и без такового, а также при лечении аскорбиновой кислотой были выполнены на 135 половозрелых морских свинках, самцах, массой 450-620 гр. Общие сведения об объеме и структуре исследований представлены в таблице 1.

Морские свинки были выбраны для моделирования экспериментального острого панкреатита в связи с тем, что эти животные, также как и человек, неспособны, в отличие от остальных млекопитающих, к эндогенному синтезу аскорбиновой кислоты, соответственно, нуждаются в её постоянном приёме извне.

Моделирование экспериментального острого панкреатита осуществляли в операционной кафедры гистологии Оренбургской государственной медицинской академии, с соблюдением правил асептики, морским свинкам под эфирным наркозом производили верхнесрединную лапаротомию и выделяли поджелудочную железу. Затем в протоковую систему железы вводили 0,5-1,0 мл стерильной желчи (от больных, оперированных по поводу холедохолитиаза, без гнойного холангита) с каплей аутокрови и механическим повреждением ее тканей: каудальные дольки органа подвергали травматизации путем сдавления их браншами анатомического пинцета. В брюшную полость экспериментального животного для дальнейшего введения препарата (в зависимости от серии) ставили тонкий эпидуральный (стерильный) катетер. Рану брюшной полости зашивали наглухо с подшиванием поджелудочной железы к париетальной брюшине и с фиксированием кисетным и Z- образным швами катетера, для введения лекарств, к коже животного (модель Mallet Guy P.et.all., 1961).

Экспериментальные животные разделены на три группы по 45 свинок. В каждой группе выделены подгруппы по 15 животных:

А - острый панкреатит без инфицирования;

В - острый панкреатит с инфицированием Е. coli (в дозе 3 х 106 микробных клеток);

Таблица 1

Экспериментальные животные

№ п/п	Наименование серии опытов	Кол-во живот­ных	Сроки наблюдения (сутки)
			1	3	5
I	А - ЭОП без применения, каких либо лекарственных средств	15	5	5	5
	В - ЭОП + инфицирование (Е. Coli) + без применения каких либо лекарственных средств	15	5	5	5
	С - ЭОП + инфицирование (S. aureus) + без применения каких либо лекарственных средств	15	5	5	5
II	А - ЭОП + 0,85% раствор хлорида натрия в качестве лечения через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг	15	5	5	5
	В - ЭОП + инфицирование (Е.сoli) + внутривенное введение в качестве лечения 0,85% раствор хлорида натрия через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг	15	5	5	5
	С - ЭОП + инфицирование (S.aureus) + внутривенное введение в качестве лечения 0,85% раствор хлорида натрия через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг	15	5	5	5
III	А - ЭОП + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг	15	5	5	5
	В - ЭОП + инфицирование (Е.сoli) + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг	15	5	5	5
	С - ЭОП + инфицирование (S.аureus) + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг	15	5	5	5
	ВСЕГО	135	45	45	45

С - острый панкреатит с инфицированием S. Aureus штамм Р - 450 (в дозе 3 x 106 микробных клеток).

В I серии животные с ЭОП не получали какого - либо лечения.

Во II серии экспериментальным животным вводили 0,85% раствор хлорида натрия в разовой дозе 6 мл/кг через 2 часа от начала опыта и затем ежедневно.

В III серии опытов животные получали 5% раствор аскорбиновой кислоты в дозе 300 мг/кг через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно.

Контролем служили животные I и II серии.

Сроки наблюдения животных всех групп - 1,3,5 сутки.

Методики морфологических исследований.

Изучение полученного материала (экцизивные биоптаты поджелудочной железы, печени, селезенки) у экспериментальных животных осуществляли на световом и электронномикроскопическом уровнях. Для забора материала животных забивали под глубоким ингаляционным эфирным наркозом путем декапитации. При выполнении исследований соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77). Для светооптических исследований материал после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина и обезвоживания спиртами заключался в парафинцеллойд для получения гистологических срезов. Гистосрезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, метиленовым зелёным и пиронином по Браше, перйодатом К и рективом Шифф по Мак Манусу. Ферменты, маркеры митохондрий (СДГ) и лизосом (КФ) определяли в свежезамороженных криостатных срезах органов в соответствие с методиками Nachlas М. (1960), Gomory G. (1963).

Суммарный белок определяли по Даниэли (Пирс Э., 1962). Морфологические исследования соотношений жизнеспособных и некротизированых зон поджелудочной железы на гистопрепаратах проводили с использованием окулярной вставки (Автандилов Г.Г., 1990).

Выявление диссеминации микроорганизмов в исследуемых тканях проводилось окраской по Граму (Меркулов Г.А., 1969). Выявление ДНК проводилось по методу Фёльгена - Розенбека (Меркулов Г.А., 1969).

Для идентификации клеток с признаками апоптоза применяли иммуноцитохимические реакции на определение экспрессии проапоптотического белка р53 и на выявление интернуклеосомальной фрагментации ДНК (Реактивы фирмы «Дако» Дания).

Для электронномикроскопического исследования материал последовательно фиксировали в 2,5% охлаждённом растворе (+ 4°С) глютарового альдегида и четырехокиси осмия по Millonig G. (1961). Обезвоживание проводили в ацетоне с нарастающей концентрацией и последующей заливкой кусочков в смолу ЭПОН-812. После изготовления полутонких объектов (1 мкм), ультратонкие срезы приготовливали на ультратоме LKB -5 (Bromma, Sweden). В дальнейшем срезы подвергли двойному контрастированию: в 2% водном растворе уранила ацетата при +37° С в течение 2 часов и цитрате свинца (Reynolds E., 1963). Изучение объектов и фотографирование их осуществляли с помощью электронного микроскопа ЭВМ 100 АК при увеличениях х7000 - х48000.

Методики биохимических исследований.

Полученные при забое животных биоптаты отмывали холодным (+4 0С) 0,9 % раствором хлорида натрия и замораживали в жидком азоте, пробы крови центрифугировали с замораживанием полученной сыворотки. Хранение вышеназванных материалов производили в морозильной камере (-18 0С). Нормальные биохимические показатели получены путем забоя в аналогичных условиях 5 интактных морских свинок. В полученном материале изучали содержание одного из первичных продуктов – ДК и одного из конечных продуктов липопероксидации – МДА, концентрацию аскорбиновой кислоты (аскорбата) и молочной кислоты (лактата)

Концентрацию МДА в биоптатах тканей определяли по методу Potter N.A. et al. (1976), ДК - по методу Placer Z. et al. (1966).

Все манипуляции проводили в холодовой комнате при Т +1+30 С.

Определение уровня аскорбиновой кислоты в сыворотке крови, проводили колориметрическим методом с реактивом Folin (коммерческий) (S.K. Jagota, H.M. Dani, 1982).

Определение уровня лактата проводили энзиматическим колориметрическим методом с использованием стандартного набора реагентов Ольвекс Диагностикум (Kat. No: 019.002).

Статистическая обработка полученных результатов исследования проводились с помощью программного комплекса Windows, Statistika и Excel. Данные представлены в виде среднего арифметического по результатам каждого раздела исследования, +/- стандартного отклонения.

Методом вариационной статистики определяли критерий достоверности различий Стьюдента и ранговой корреляции по Спирмену.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В моделируемых условиях (I сутки) структурные изменения в поджелудочной железе носят этапный характер и в полной мере укладываются в картину острого панкреатита. При этом морфофункциональные изменения паренхимы и стромы железы сводятся к выраженному отеку, жировой дистрофии, некробиозу и некрозу панкреатоцитов, а также эпителия выводных протоков.

Через 24 часа от начала эксперимента при ЭОП [I серия] (без экзогенного введения бактерий) в поджелудочной железе возникают локальные некротические изменения паренхимы и стромы органа на фоне резко выраженного геморрагического отека. Появление очагов микронекроза в поджелудочной железе играют важную роль в развитии острого панкреатита. Нами было установлено, что некробиотические и некротические процессы в тканях железы были наиболее выражены через 3-е суток эксперимента (рис.1). При этом наблюдались фатальная дискомплексация волокон и аморфного матрикса соединительной ткани, существенные дезадаптационные ультраструктурные изменения эндотелиоцитов, клеток фибробластического дифферона и сосудов микроциркуляторного русла, демаскировка липидов цитомембран с формированием гигантских липосом, разрушение мембранных компартментов, завершающихся образованием крупных ламеллярных телец и аутофагосом).

Рис. 1 Панкреатоциты концевых отделов поджелудочной железы в зоне, пограничной с

панкреонекрозом 3 сут. ЭОП. Электронограмма Ув. 22600. А – ядро; Б – секретор

ные гранулы

При инфицировании поджелудочной железы (II серия) воспалительная реакция в паренхиме и строме нарастает более стремительно, особенно при введении E.coli. Резко усиливаются процессы альтерации. Интенсивный гистолиз паренхимы органа, наблюдаемый в первые сутки, нарастает к третьим и пятым суткам опыта. Четкого отграничения очагов гнойного воспаления и формирования соединительнотканных пиогенных мембран не происходит. Это в свою очередь приводит к значительному распространению гнойнонекротических процессов в поджелудочной железе и окружающих ее органах.

В очагах панкреонекроза и пограничных с ними зонах наблюдались явления сладжирования гемокапилляров и микротромбоза сосудов микроциркуляторного русла (артериол, венул, артериоло-венулярных анастомозов). При этом всегда отмечались явления адгезии эритроцитов, гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов, а также и тромбоцитов, что приводило к существенному затруднению микроциркуляции. В значительной степени развитию внутрикапиллярной агрегации эритроцитов при ЭОП способствуют соответствующие структурно-функциональные изменения эндотелиоцитов, субэндотелиальных компонентов, ведущие к повышению проницаемости стенок микрососудов и плазморрагии.

Описываемые явления, как правило, носили мелкоочаговый характер и сочетались с явлениями выраженных локальных диапедезных геморрагий, возникающих из артериол, капилляров и венул, сдерживаемых интерстицием поджелудочной железы.

Гистологические исследования показали, что наряду с гибелью части панкреатоцитов, локализованных вблизи зон панкреонекроза, значительное количество ацинарных клеток, подвергаясь дискомплексации, в полной мере сохраняли свои функциональные свойства как при ЭОП, так и особенно в условиях его инфицирования. Они продолжают синтезировать белковые секреторные продукты (по показателям содержания РНК, суммарного белка, гипертрофированного состояния шероховатого эндоплазматического ретикулума, характеру распределения секреторных гранул высокой электронной плотности), высвобождаемые в те участки поджелудочной железы, где развиваются явления панкреонекроза. По нашему мнению это, безусловно, потенцирует и усиливает лизис тканевых элементов органа, способствует прогрессированию панкреонекроза.

Таким образом, феномен активного функционирования дискомплексированных панкреатоцитов может быть расценен как фактор, усугубляющий течение ЭОП, особенно в условиях бактериальной интервенции.

Развитие соединительнотканного регенерата в участках панкреонекроза начинается с 3-х суток эксперимента, идет мозаично и гетерохронно. Процессы коллагенеза и формирования фибриллярных структур происходят сначала в краевых зонах панкреонекроза. При инфицированном панкреонекрозе мы обнаружили как слабо выраженный фибриллогенез, так и одновременный активный лизис коллагеновых волокон, осуществляемый как макрофагами, так и фиброкластами. В этих случаях резко снижается (до полного отсутствия) содержание углеводных биополимеров, особенно кислых гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты).

Исследуя фрагменты поджелудочной железы экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли высокие дозы аскорбиновой кислоты (III серия), мы получили существенные морфологические отличия в развитии репаративных гистогенезов как в асептических условиях моделирования ЭОП, так и при инфицировании.

Это, прежде всего, проявилось в уменьшении летальности в группах экспериментальных животных получавших в качестве лечебной коррекции высокие дозы аскорбиновой кислоты (табл.2).

Таблица 2

Распределение летальности животных по сериям (за 100% принято 15 особей)

№№ n/n	Наименование серии опытов	Кол-во животных	Кол-во умерших животных	Летальность в %
I I	А – ЭОП без применения, каких либо лекарственных средств	15	12	80
	B – ЭОП + инфицирование (E. Coli) + без применения каких либо лекарственных средств	15	13	86,67
	C – ЭОП + инфицирование (S. aureus) + без применения каких либо лекарственных средств	15	11	73,33
III	А – ЭОП + 0,85% раствор хлорида натрия в качестве лечения через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг	15	10	66,67
	B – ЭОП + инфицирование (E. Coli) + внутривенное введение в качестве лечения 0,85% раствор хлорида натрия через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг	15	12	80
	C – ЭОП + инфицирование (S.aureus) + внутривенное введение в качестве лечения 0,85% раствор хлорида натрия через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг	15	11	73,33
IIII	A – ЭОП + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг	15	3	20
	B – ЭОП + инфицирование (E. Coli) + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг	15	6	40
	C – ЭОП + инфицирование (S. aureus) + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг	15	4	26,67
ВСЕГО		135	82	60,74

Также наблюдалось снижение выраженности некробиотических и некротических изменений паренхиматозных и стромальных структур органа за счет усиления процессов васкулогенеза, улучшения микроциркуляции, пролиферации эндотелиоцитов, фибробластов, моноцитарных макрофагов, более раннем отграничении очагов некроза малодифференцированной соединительной тканью.

При использовании аскорбиновой кислоты наблюдается активизация пролиферации и гипертрофия сохранных панкреатоцитов, клеток выводных протоков, сопряженные с васкулогенезом и новообразованием соединительнотканных элементов, что приводит к появлению в пограничных с некротическими участками поджелудочной железы островков органотипической регенерации с формированием атипических ацинусов. Одновременно возрастает численность концевых отделов железы с признаками ослизнения панкреатоцитов (по показателям идентификации мукополисахаридов - сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов). Введение аскорбиновой кислоты в условиях экспериментального острого панкреатита приводит к достоверному увеличению объёма ядер панкреатоцитов и ядерно – цитоплазматических отношений (за счёт возрастания двуядерных клеток). Применение аскорбиновой кислоты существенно стимулирует регенераторные возможности соединительной ткани. Уже через 3 суток развивается малодифференцированная соединительная ткань по краю очагов некроза с пронизанными новообразованными гемокапиллярами (рис. 2). В тех сериях опытов, где применялась аскорбиновая кислота на стадиях 3-х–5-и суток опыта уменьшалось количество тромбированных и сладжированных сосудов микроциркуляторного русла.

На ультраструктурном уровне установлена сохранность митохондрий и мембранных компонентов клеток. Данные изменения протекали на фоне нормализации размеров сосудов микроциркуляторного русла.

В отличие от контрольной серии эксперимента (в опытной группе животных) концевые отделы перестраиваются, подвергаясь мукоидизации (ослизнению - по показателям гистохимических реакций). Следует отметить, что без лечебной коррекции, дискомплексированные и ацинарные клетки, характеризовались высоким содержанием детрита и суммарного белка.

При введении аскорбиновой кислоты отмечены явления митотического деления центрацинозных клеток и клеток выводных протоков, формирующих трубчатые структуры. В результате описываемых процессов в железе можно выделить несколько зон:

1 – регенераторная, представленная пролиферирующим эпителием среди малодифференцированной соединительной ткани;

2 – пограничная зона некробиотически измененных тканей;

3 – пограничная зона повреждённой поджелудочной железы.

Замечено, что в дальнейшем (начиная с 3 суток) число ДНК-синтезирующих клеток и экспрессирующих синтез антиапоптотического белка bcl 2 возрастало (против контроля в 2,6–3 раза). По показателям синтеза суммарного белка у панкреатоцитов наблюдались его подавление и усиление процессов ослизнения.

Рис.2 Фрагмент регенерата поджелудочной железы 5 сут. ЭОП инфицирование (введение аскорбиновой кислоты) Фиксация: спирт-формол. Окраска: перйодат – Шифф-реакция.

Ув. Об.8, ок.10. А – концевые отделы; Б – выводной проток; В – соединительная ткань

Изучение гистопрепаратов и электроннограмм показало, что пограничные с участками панкреонекроза аденоциты, центрацинозные клетки, эпителий выводных протоков сохраняли свои гисто - и органобластические репаративные свойства. Число данных клеток в случаях инфицирования было меньше, чем в экспериментах, когда острый панкреатит вызывался в абактериальных условиях. Выраженных эпителиальных пролифератов в гнойно-некротических зонах железы не отмечалось. Процесс при этом развертывался по некротическому и дегенеративно-воспалительному типам (особенно при введении E.coli).

С целью лечебной коррекции острого панкреатита в эксперименте применение высоких доз аскорбиновой кислоты положительно отразилось на ходе репаративных процессов в поджелудочной железе, а так же повышало репродуктивную активность сохранных панкреатоцитов, эпителиоцитов выводных протоков, фибробластов. Данные эффекты прослежены во все сроки наблюдений, в том числе и в условиях инфицирования.

Анализ полученных результатов свидетельствует о стимулирующем влиянии вводимой аскорбиновой кислоты на процессы репаративных гистогенезов паренхимы и стромы поджелудочной железы как при инфицировании, так и в абактериальных условиях. При этом усиливаются васкулогенез и пролиферация клеток фибробластического дифферона, происходит активизация макрофагических элементов и эффективное отграничение очагов панкреонекроза за счет быстрого разрастания малодифференцированной соединительной ткани, возрастают процессы мукоидизации панкреаотцитов в паранекротических зонах, где уменьшается число дискомплексированных ацинусов серозного типа.

Полученная нами морфологическая картина структурных изменений в печени показала ряд типичных реакций тканей органа характерных для всех форм острого панкреатита (Владимиров В.Г. с соавт., 1986). В I серии эксперимента при отечной форме панкреатита отмечается полнокровие печени, уменьшение поперечных размеров печёночных балок, расширяются межбалочные капилляры и просвет центральной вены. Картина структурных изменений в органе имела гетероморфный характер.

Определялись гепатоциты, особенно центральных зон печеночных долек, с пикнотически изменёнными ядрами и сильновыраженными процессами деструкции в цитоплазме. В последних отмечалась зернистость, определялись мелкие и крупные вакуоли, которые имели тенденцию к слиянию, липидные капли, разрушающиеся митохондрии, расширенные канальцы эндоплазматической сети и цистерны пластинчатого комплекса Гольджи, аутофагосомы. Количество клеток возрастало к 5-м суткам ЭОП. В некоторых гепатоцитах отмечались процессы разрушения мембран. В печеночных балках наряду с малоизменёнными в структурно-функциональном отношении гепатоцитами, дающими положительные гистохимические реакции на выявление гликогена, суммарного белка, рибонуклеопротеидов встречались двуядерные и многоядерные клетки. Часто в таких клетках были видны фигуры митоза. Определялись печёночные клетки с признаками гидропической и баллонной дистрофии.

В процессе развития жировой дистрофии в гепатоцитах определялся жир, который имел пылевидный, мелко- и крупнокапельный вид. Капли липидов оттесняли относительно сохранные органеллы на периферию клетки, которая становилась перстневидной. Жировая инфильтрация охватывала единичные гепатоциты и группы клеток. Некоторые печеночные клетки при жировой инфильтрации погибали, жировые капли сливались и образовывали расположенные внеклеточно жировые кисты, вокруг которых возникала клеточная реакция с начальными признаками разрастания соединительной ткани (5-е сутки ЭОП).

Отмечались признаки нарушения лимфооттока, которые выражались в расширении размеров просвета лимфатических сосудов. Особенно яркая картина поражения печени нами отмечена при развитии явлений панкреонекроза. Уже на ранних стадиях ЭОП определялось резко выраженное полнокровие тканей печени и их отёк, расширение перисинусоидных пространств (Диссе), слущивание звёздчатых ретикулоэндотелиальных клеток (клетки Купфера). В гепатоцитах наблюдались активные деструктивные процессы, которые сопровождались нарушением межклеточных контактов.

Печёночные балки были истонченными, в гепатоцитах развивалась белковая, а позднее и жировая дистрофия. В условиях инфицирования (II серия), особенно при введении E.coli, резко усиливались процессы альтерации тканей печени. В печёночных балках определялось большое количество дегенерирующих клеток. Наблюдалось также расширение перисинусоидальных пространств, В строме железы определялись фибриллярные структуры, лимфоциты, микроорганизмы и реактивно изменённые макрофаги.

Сосуды микроциркуляторного русла были расширенными, переполнены кровью с большим содержанием лейкоцитов и выраженными явлениями экстравазации плазмы и диапедеза форменных элементов. В капсуле печени и под ней также определялось большое количество лейкоцитов. Необходимо заметить, что в серии опытов при инфицировании стафилокком структурные изменения в тканях печени носили экссудативный и продуктивный характер.

При воздействии аскорбиновой кислоты в условиях ЭОП (III серия) отмечалась положительная динамика восстановления в сосудах печени микроциркуляции крови и лимфы, что проявлялось уменьшением экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство. В печёночной дольке возрастало количество двуядерных гепатоцитоов наряду с уменьшением числа деструктивно изменённых. Отмечался процесс восстановления мембран печёночных клеток и межклеточных контактов. Ядра клеток характеризовались увеличением в них эухроматиновых зон и наличием небольших по размерам ядрышек. Позитивные изменения в ядрах коснулись структур цитоплазмы. Это выражалось в уменьшении просвета канальцев эндоплазматической сети и цистерн пластинчатого комплекса, размеров и количества вакуолей и липидных капель, аутофагосом, увеличением количества связанных и свободных рибосом, митохондрий. Положительное действие высоких доз аскорбиновой кислоты проявлялось также в активизации перемещения лимфоцитов, макрофагов в повреждённые зоны органа и активизации клеток фибробластического ряда.

Морфологическая картина структурных изменений в селезёнке, как и в поджелудочной железе и печени, показала ряд типичных реакций тканей органа характерных для всех форм острого панкреатита. При отечной форме панкреатита (I серия опыта) отмечается полнокровие органа, расширяются венозные сосуды и сосуды микроциркуляторного русла, в том числе синусоидные капилляры. Красная пульпа селезёнки характеризовалась наличием в петлях ретикулярной ткани большого количества эритроцитов, моноцитов, кровяных пластинок. Моноциты в ретикулярной ткани быстро дифференцировались в макрофаги.

В условиях инфицирования S.aureus, E.coli (II серия опыта), резко усиливались процессы повреждения тканей селезёнки. Микроорганизмы преимущственно локализовались в красной пульпе. В паренхиме органа определялось большое количество дегенерирующих эндотелиоцитов. Отмечено также расширение периваскулярных пространств, В трабекулах и капсуле определялись фибриллярные структуры, деструктивно изменённые клетки фибробластического ряда и гладкие мышечные клетки, лимфоциты.

Таким образом, в селезёнке наблюдалась картина токсической спленомегалии, причём степень морфологических изменений зависит от интенсивности патологического процесса в поджелудочной железе и печени.

При воздействии аскорбиновой кислоты в условиях ЭОП (III серия) отмечалось восстановление в сосудах селезёнки микроциркуляции, что проявлялось уменьшением размеров сосудов и проницаемости стенки их для плазмы и форменных элементов крови в периваскулярное пространство. Это приводило к снижению объёма патологических изменений в лейкоцитах, макрофагах, эндотелии кровеносных сосудов и ретикулоэндотелиоцитах белой и красной пульпы.

С процессами перекисного окисления липидов тесно связана антиоксидантная система организма, выполняющая роль стабилизатора интенсивности свободно-радикального окисления. При избыточной липопероксидации происходит истощение запасов антиоксидантов в организме (Волчегорский И.А. с соавт., 1997; Хансон К.П., 1997; Сайжили Е.И. с соавт., 2003; Li C. et. al., 2007).

Мы изучили динамику активности анаэробного гликолиза и уровня аскорбиновой кислоты у экспериментальных животных при остром панкреатите. Изучаемые показатели в ткани поджелудочной железы отражают локальные, а в сыворотке крови – системные гомеостатические нарушения.

В нашем исследовании подтверждается факт выраженной ишемизации панкреатической ткани при экспериментальном остром панкреатите с переходом гликолиза на анаэробный путь, что сопровождается прогрессирующим повышением уровня лактата в сыворотке крови, тканях поджелудочной железы и печени (рис. 3).

Рисунок 3

Ишемия ткани поджелудочной железы сопровождается активацией липопероксидации в виде прогрессирующего повышения первичных (ДК) и конечных (МДА) продуктов на всех сроках наблюдения. Свободнорадикальный каскад вызывает массивное потребление аскорбиновой кислоты, одного из ведущих неферментных антиоксидантов плазмы крови, что характеризуется прогрессирующим снижением её уровня в изучаемых субстратах.

Применение физиологического раствора NaCl (II серия) существенно не меняет вышеизложенной картины.

При введении высоких доз аскорбата 3-ей группе животных также имеет место значительная активация липопероксидации (разница в основном достоверно выше нормы), но она, в общем, менее выражена, особенно к 5-м суткам, когда уровни продуктов перекисного окисления липидов становятся в 1,5-3 раза ниже соответствующих показателей в 1 и 2 группах. Уровень аскорбиновой кислоты в сыворотке крови снижается ниже нормы, оставаясь, однако, более высоким, чем соответствующие показатели в других группах, особенно через 120 часов (превышение более, чем в 4 раза,) [рис.4].

В панкреатической ткани и печени данная тенденция ещё показательнее. Содержание аскорбиновой кислоты через 72 часа почти в 5 раз, а через 120 часов почти в 6 раз выше соответствующих значений в 1 и 2 группах. Обращает на себя внимание тот факт, что в эти сроки уровень аскорбата в 3-ей группе превышает норму.

Закономерность изучаемых процессов подтверждается тем, что динамика изучаемых показателей в сыворотке крови и панкреатической ткани практически идентична.

Рисунок 4

Таким образом, экспериментальный острый панкреатит у морских свинок характеризуется выраженной активацией анаэробного гликолиза, что отражает прогрессирующую ишемию панкреатической ткани. Нарастает содержание промежуточных (ДК) и конечных (ТБКАП) продуктов липопероксидации, свидетельствующее об активации процессов ПОЛ. Вследствие этого происходит массивное потребление аскорбиновой кислоты, одного из ведущих неферментных антиоксидантов плазмы крови, что проявляется прогрессирующим снижением её содержания. Применение 0,85% раствора NaCl не приводит к значимым изменениям динамики изучаемых показателей. Введение высоких доз аскорбиновой кислоты снижает выраженность ишемических процессов в ткани ПЖ, уменьшаются проявления системной воспалительной реакции, менее выражено истощение уровня аскорбиновой кислоты.

Применение высоких доз аскорбиновой кислоты позволяет снизить проявления ишемического поражения ткани поджелудочной железы и выраженность свободнорадикальных процессов при экспериментальном остром панкреатите, что говорит об эффективности данного метода лечения и открывает перспективу для дальнейших исследований.

В своей совокупности, полученные в экспериментах результаты, со всей очевидностью обосновывают целесообразность включения высоких доз аскорбиновой кислоты в комплекс лечебных мероприятий при остром панкреатите.

ВЫВОДЫ

1. В условиях экспериментального острого панкреатита структурно – функциональные изменения клеточных и тканевых элементов носят стадийный характер, а ведущим морфологическим компонентом в его прогрессировании является дискомплексация ацинарных панкреатоцитов и возникновение некротических очагов. При инфицировании происходит усугубление развития деструктивных явлений в паренхиме и строме органа, что соответствует выраженности клинической картины у экспериментальных животных.
2. Процессы репаративной регенерации в поджелудочной железе (в абактериальных и инфицированных условиях) происходит по типу регенерационной гиперплазии сохраненных панкреатоцитов, происходящее на фоне альтернативных изменений в очагах некроза и некробиоза железы со слабо выраженным их отграничением соединительнотканными структурами, быстро подвергающиеся «рубцовой» дифференцировке, что не предотвращает распространение патологического процесса за пределы органа.
3. Острый панкреатит характеризуется значительной активацией анаэробного гликолиза вследствие нарушения микроциркуляторных процессов, что сопровождается прогрессирующей генерацией молочной кислоты. Развивающийся лактат-ацидоз может являться одним из факторов интрапанкреатической активации протеолитических ферментов поджелудочной железы. Уровень молочной кислоты в сыворотке крови является маркером тяжести острого панкреатита.
4. Применение высоких доз аскорбиновой кислоты для лечебной коррекции ЭОП (как в условиях инфицирования, так и без него) обеспечивает уменьшение некробиотических и некротических проявлений в паренхиме и строме поджелудочной железы. Использование аскорбиновой кислоты существенно оптимизирует процессы репаративной регенерации эпителиальных, соеденительнотканных структур, сосудов микроциркуляторного русла, как в абактериальных, так и инфицированных условиях, что доказывается адекватной реализацией структурами повреждённой железы своих гисто и органотипических потенций и данными по ослаблению апоптозной динамики в гистоструктурах органа.
5. При использовании высоких доз аскорбиновой кислоты в печени отмечалась восстановление микроциркуляции, лимфотока, желчевыведения, уменьшение экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты могут быть использованы:

1. У больных острым панкреатитом с учетом развивающихся патофизиологических процессов необходимо включение в базисную схему лечения высоких доз аскорбиновой кислоты с целью эффективного воздействия на вышеуказанные звенья патогенеза.
2. У больных острым панкреатитом необходимо учитывать наличие прогрессирующего дефицита аскорбиновой кислоты вследствие ее массивного потребления в результате активации оксидантных процессов. Исследование содержания аскорбиновой кислоты в сыворотке крови больных позволяет прогнозировать исход заболевания.
3. Уровень конечного продукта липопероксидации – малонового диальдегида в интраоперационных биоптатах поджелудочной железы у оперированных больных является предиктором исхода заболевания. Определение содержания малонового диальдегида в сыворотке крови позволяет диагностировать развитие инфицированного панкреонекроза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ:

1. Демин Д.Б. Применение высоких доз аскорбиновой кислоты при остром панкреатите / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А.// Сборник материалов VII Всероссийской научно-практической конференции врачей ПУрВО «Актуальные вопросы военной и практической медицины», г. Оренбург, 2006. - с. 480 – 484.
2. Демин Д.Б. С - Витаминный статус у больных острым панкреатитом / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // Анналы хирургической гепатологии. 2007, №3, Т.12, с. 182 – 183.
3. Тарасенко В.С. Малоинвазивные технологии в лечение панкреонекроза / Тарасенко В.С., Дёмин Д.Б., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // Анналы хирургической гепатологии. 2007, №3, Т.12, с. 231.
4. Дёмин Д.Б. Современные аспекты диагностики тяжести деструктивно

го процесса и лечебная тактика при остром панкреатите/ Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Информационный архив (медицина, биология, образование). – 2007. – том 1. - № 1. – с. 61 – 62.

5. Дёмин Д.Б. Современные подходы к диагностики и лечению остро-

го деструктивного панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Хирург. – 2008. - № 2. – с. 19 – 21.

6. Дёмин Д.Б. Современные аспекты лечения острого панкреатита /

Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Материалы VII межобластной научно – практической конференции хирургов «Актуальные вопросы хирургии» Бугуруслан, 2008. – с. 105 – 107.

7. Дёмин Д.Б. С-витаминный статус – прогностический фактор исхода острого панкреатита./ Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Материалы VII межобластной научно – практической конференции хирургов «Актуальные вопросы хирургии» Бугуруслан, 2008. – с. 96-99.
8. Тарасенко В.С. Острый деструктивный панкреатит: прогноз и лечение / Тарасенко В.С., Демин Д.Б., Волков Д.В., Шефер А.В., Смолягин А.И., Балпеисова А.Б., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Медицинский альманах (спецвыпуск). II международная конференция хирургов и урологов «Высокие технологии в медицине», Н.Новгород, 2008, с. 103-104.
9. Демин Д.Б. Некоторые аспекты малоинвазивной хирургии панкреонекроза / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // -ая международная конференция по торако-абдоминальной хирургии к 100-летию Б.В. Петровского, сборник тезисов 5-6 VI 2008 г., Москва, 2008г., с. 91.
10. Демин Д.Б. Влияние перфторана на процессы липопероксидации, тканевой гипоксии и С-витаминный статус при экспериментальном остром панкреатите / Демин Д.Б., Тарасенко В.С., Никоноров А.А., Щетинин Н.А., Афонина С.П., Павлова М.М., Басов Ф.В // Вестник хирургической гастроэнтерологии, 2008 №2 с 67-70.
11. Демин Д.Б. С-витаминный дефицит при остром деструктивном панкреатите – прогностический фактор исхода заболевания / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Басов Ф.В., Щетинин Н.А. // Хирург, 2008 №5, с. 12-14.
12. Басов Ф.В. Влияние перфторана на течение экспериментального острого панкреатита / Басов Ф.В., Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Валов С.Д., Щетинин Н.А. // Анналы хирургической гепатологии. – 2008. – том 13. - № 3. – с. 39 – 40.
13. Дёмин Д.Б. Применение перфторана при лечении острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Басов Ф.В., Щетинин Н.А., Корнилов С.А.// Анналы хирургической гепатологии. – 2008. – том 13. - № 3. – с. 48 – 49.
14. Демин Д.Б. Влияние перфторана на течение острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Корнилов С.А., Басов Ф.В. // Информационный архив (медицина, биология, образование) Всероссийская научно-практическая конференция врачей приволжско-уральского военного округа. г. Оренбург. 2008г Том 2 №4. с. 25-27.
15. Тарасенко В.С. Современные подходы к лечению панкреонекроза / Тарасенко В.С., Дёмин Д.Б., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Басов Ф.В. // Анналы хирургической гепатологии. 2008, №3, Т.13, с. 264-265.
16. Демин Д.Б. Некоторые патогенетические принципы лечения острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Корнилов С.А., Басов Ф.В.// Сборник научно – практических работ «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» посвящен 90 – летию ОКБ станции Оренбург. Оренбург, 2009, с 18-21.
17. Демин Д.Б. Особенности морфологических изменений печени в условиях экспериментального острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Басов Ф.В., Валов Ф.В., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Щетинин Н.А., Бобылев А.А. //Сборник научно – практических работ «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» посвящен 90 – летию ОКБ станции Оренбург. Оренбург, 2009, с 196-197.
18. Демин Д.Б. Применение перфторана в комплексном лечении острого панкреатита / Демин Д.Б., Тарасенко В.С., Никоноров А.А., Щетинин Н.А., Афонина С.П., Павлова М.М., Корнилов С.А., Басов Ф.В. // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2009, Т.168, №4, с.97-100.
19. Демин Д.Б. Уровень молочной кислоты в сыворотке крови - маркёр объема панкреатического некроза при остром панкреатите / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Корнилов С.А., Щетинин Н.А. // Московский хирургический журнал. 2009, 3(7), с.54-56.
20. Демин Д.Б. Гистологическая характеристика морфологических изменений печени в условиях экспериментального острого панкреатита при использовании перфторана / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Корнилов С.А., Басов Ф.В. // Морфологические ведомости 2009, №3 с.279-28.
21. Щетинин Н.А. Применение высоких доз аскорбиновой кислоты при экспериментальном остром панкреатите / Щетинин Н.А. // Аспирантские чтения 2009. Материалы региональной конференции дипломированных специалистов «молодые учёные – медицине». Самара. 2009, с. 61-63.
22. Демин Д.Б. Актуальные проблемы малоинвазивной хирургии острого панкреатита / Дёмин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Корнилов С.А., Басов Ф.В. // Морфологические ведомости 2009, №3 с.180-181.
23. Демин Д.Б. Влияние перфторана, высоких доз аскорбиновой кислоты и их комбинации на цитокиновый профиль и уровень сывороточных иммуноглобулинов при остром панкреатите / Демин Д.Б., Смолягин А.И., Попова Е.В., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А. // Цитокины и воспаление 2009,Т. 8, №3 с. 59-63.

Изобретения по теме диссертации.

1. Демин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Никоноров А.А., Афонина С.Н., Павлова М.М., Корнилов С.А., Басов Ф.В. Способ диагностики формы острого панкреатита // Патент РФ на изобретение № 2339042 от 20.11.2008 г.
2. Демин Д.Б., Тарасенко В.С., Щетинин Н.А., Никоноров А.А., Афонина С.Н., Павлова М.М., Корнилов С.А., Басов Ф.В. Способ прогнозирования исхода деструктивного панкреатита // Патент РФ на изобретение № 2338195 от 10.11.2008г.