Механизмы дизрегуляции рецептор-опосредованной активации т-лимфоцитов крови при туберкулезе легких
На правах рукописи
Кошкина Анна Алексеевна
МЕХАНИЗМЫ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ
РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЙ АКТИВАЦИИ
Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ
14.03.03 – патологическая физиология
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Томск – 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАМН,
заслуженный деятель науки РФ Новицкий Вячеслав Викторович
доктор медицинских наук,
профессор Уразова Ольга Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор, главный научный сотрудник
лаборатории патофизиологии
ФГБУ НИИ фармакологии СО РАМН Агафонов Владимир Иванович
доктор медицинских наук,
профессор кафедры гистологии,
эмбриологии и цитологии
ГБОУ ВПО СибГМУ
Минздравсоцразвития России Потапов Алексей Валерьевич
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится: «26» октября 2012 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета
Автореферат разослан «___» ______________2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Петрова И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Положение о том, что в основе туберкулеза легких (ТЛ) лежит дизрегуляция иммунной системы, стало основой для более детального изучения иммунопатогенеза туберкулезной инфекции и поиска маркерных нарушений со стороны иммунокомпетентных клеток крови [Новицкий В.В. и соавт., 2006; Ивашкин В.Е., 2008]. При этом важную роль отводят межклеточной кооперации, в процессе которой происходит активация наивных Т-клеток с последующей их дифференцировкой в Т-лимфоциты хелперы (Th) типа 1, участвующие в реакциях Т-клеточного иммунного ответа [Свирщевская Е.В. и соавт., 2005; Ивашкин В.Е., 2008; Ярилин А.А., 2010; Schwander S., Dheda K., 2011].
Одной из главных предпосылок к активному изучению роли T-клеток в формировании защиты против Mycobacterium tuberculosis является их способность синтезировать цитокины, в частности интерлейкин (IL) 2. Способность IL-2 направлять дифференцировку наивных Т-клеток в Th1-лимфоциты, регулировать реакции гиперчувствительности замедленного типа, предотвращать гиперактивацию иммунной системы при смещении баланса T-хелперных клонов по пути доминирования гуморальных реакций иммунитета играет значительную роль в патогенезе туберкулезной инфекции [Симбирцев А.С., 2004; Зенин В.В. и соавт., 2009; Сологуб Т.В. и соавт., 2009; Ярилин А.А., 2010; Almeida A. et al., 2011; Zuiga J. et al., 2012].
Дефицит IL-2, часто регистрируемый у больных ТЛ, большинство авторов связывают с развитием вторичной иммунологической недостаточности (ВИН), а среди причин, обусловливающих ее развитие, выделяют уменьшение количества и/или функциональную несостоятельность (гипо- и анергию) Т-клеток [Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003; Чучалин А.Г., 2004; Новицкий В.В. и соавт., 2005; 2006; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Алешина Р.М., 2007; Лусс Л.В., 2007; Маркелова Е.В., 2008; Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П., 2008; Хасанова Р.Р. и соавт., 2008; Корецкая Н.М., 2011; Корецкая Н.М., Большакова И.А., 2011]. Однако вопрос о том, какие механизмы лежат в основе Т-лимфоцитопении и/или анергии Т-клеток при ТЛ остается спорным и требует детального анализа.
Нарушения межклеточной кооперации, опосредующей активацию Т-лимфоцитов в процессе взаимодействия их CD3-рецепторов (CD3-TCR) с комплексом «МНС II-пептид» антигенпрезентирующих клеток (APC) при участии корецептора CD4 и костимулирующих рецепторных молекул (CD28 на Т-лимфоцитах, СD80/СD86 на APC), могут быть одной из причин Т-клеточного дефицита [Felix N., 2010; Harding C., Boom W., 2010]. Важная роль при этом отводится процессам костимуляции. Так, взаимодействие CD28-молекулы на Т-лимфоцитах и СD80/СD86 на APC является ключевым импульсом, «разрешающим» активацию Т-клеток и развитие Th1-иммунного ответа. Отсутствие или недостаточность данного сигнала приводят к гибели Т-клеток путем активации программы апоптоза [Wang H. et al., 2005; Briken V., Miller J., 2008]. Помимо этого, некоторые ингибиторные молекулы иммуносупрессорных Т-регуляторных клеток (прежде всего, цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 или CTLA-4) в силу своей высокой авидности к молекулам CD80/CD86 на APC способны блокировать CD28-костимуляторный сигнал в Т-лимфоцитах и, таким образом, подавлять их активацию [Mukherjee S. et al., 2006; Goronzy J., Weyand C., 2008; Ahmed A., 2009].
Известно, что индукция Т-лимфоцитов, опосредованная комплексом «МНС II-пептид-TCR-костимулирующие молекулы», приводит к запуску основных каскадных путей активации ядерных факторов NF-B, AP-1, NFAT, инициирующих транскрипцию гена IL2 и секрецию данного цитокина, активирующего процессы пролиферации и дифференцировки Т-клеток [Скулачев М.В., 2005; Macian F., 2005; Gelinas С., 2006; Абатуров А.Е., 2007; Киселевский М.В., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Щебляков Д.В. и соавт., 2010; Jung D.H. et al., 2010; Домнинский Д.А., 2011; Yarilina A. et al., 2011; Lee D., 2012].
Между тем, несмотря на значительные успехи в изучении роли основных рецепторных молекул и транскрипционных факторов в регуляции Th1-иммунного ответа, механизмы гипопродукции IL-2, связанные с нарушениями TCR-опосредованной активации Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции, изучены недостаточно, а представленные в научной литературе данные носят фрагментарный и порой противоречивый характер. Учитывая, что рецептор-опосредованная активация Т-лимфоцитов является сложным комплексным процессом, при котором нарушения могут присутствовать в различных его звеньях, исследование в данной области является своевременным и актуальным.
Цель исследования: выявить механизмы и установить особенности нарушений рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких.
Задачи исследования:
- Провести сравнительную оценку базальной и CD3/CD28-индуцированной секреции IL-2 in vitro у здоровых доноров и больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких.
- Оценить количество IL-2-синтезирующих лимфоцитов крови, экспрессирующих антигены CD3 (TCR) и CD28, у здоровых доноров и больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких.
- Оценить содержание CTLA-4+ Т-клеток и активных форм внутриклеточных транскрипционных факторов (NF-B, NFAT и AP-1) в Т-лимфоцитах крови при CD3/CD28-индукции in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.
- Установить молекулярные механизмы дизрегуляции рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя.
Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное исследование молекулярных механизмов дизрегуляции передачи сигнала рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов и дана их сравнительная оценка при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких (ТЛ). Показано, что гипопродукция IL-2 in vitro (базальная и при индукции антиCD3- и антиCD28-антителами) при ТЛ сочетается с уменьшением общего числа CD3- и CD28-позитивных лимфоцитов в крови и изменением их субпопуляционного состава вследствие снижения количества CD3+CD28+IL2+, CD3+CD28+IL2 и увеличения содержания CD3+CD28IL2 клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении. Продемонстрировано, что у больных ТЛ имеет место увеличение процентного и абсолютного числа лимфоцитов с иммуносупрессорным фенотипом CD3+CTLA-4+, что, наряду с дефицитом активных форм факторов транскрипции NF-B и NFAT2 в Т-клетках, обусловливает нарушение трансдукции сигнала CD3/CD28-опосредованной активации в Т-лимфоцитах синтеза и секреции IL-2. Установлено, что инфильтративный лекарственно-устойчивый (ЛУ) ТЛ характеризуется увеличением числа Т-лимфоцитов, содержащих активные формы транскрипционных факторов NFAT1 и AP-1, тогда как при лекарственно-чувствительном (ЛЧ) его варианте количество CD3+NFAT1+ и CD3+AP-1+ остается в пределах нормы. Диссеминированный ТЛ сопровождается снижением количества данного типа клеток – CD3+NFAT1+ при ЛЧТЛ и CD3+AP-1+ при ЛУТЛ.
Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют имеющиеся фундаментальные представления об иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, вносят дополнительный вклад в понимание молекулярных механизмов формирования вторичной иммунологической недостаточности и дизрегуляции иммунного ответа в целом при туберкулезе легких. Результаты исследования могут служить основой направленной модуляции иммунного ответа, профилактики и лечения иммунозависимых болезней, а также предпосылкой для разработки новых подходов к патогенетически обоснованной иммунотерапии, направленной на коррекцию нарушений индуктивной фазы иммунного ответа на ранних этапах активации Т-клеток при туберкулезе легких.
Положения, выносимые на защиту:
- У больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких угнетение базальной и CD3/CD28-индуцированной секреции IL-2 in vitro сопряжено с дефицитом общего числа CD3+, CD28+ и IL-2+ лимфоцитов и их CD3+CD28+IL2+ и CD3+CD28+IL2 субпопуляций в крови.
- Дизрегуляция рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких определяется как в период формирования иммунологического синапса вследствие дефицита поверхностных молекул CD3 (TCR), CD28 и CTLA-4-зависимой супрессии сигнала костимуляции, так и на этапе трансдукции активирующего сигнала в связи с недостаточностью в Т-клетках активных форм транскрипционных факторов NF-B и NFAT2, наиболее выраженной при диссеминированном туберкулезе легких с устойчивостью возбудителя к препаратам этиотропной терапии.
- CD3/CD28-индукция Т-клеток in vitro вызывает разнонаправленные изменения активности транскрипционных факторов NFAT1 и AP-1 у больных туберкулезом легких, проявляющиеся ее увеличением при инфильтративном и снижением при диссеминированном туберкулезе легких.
Реализация и апробация материала работы. Основные положения и материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на IX Съезде фтизиатров России (Москва, 2011), XVII и XVIII Межгородских научных конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2012), Научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти член-корреспондента РАМН, профессора А.К. Стрелиса «Достижения в лечении множественно лекарственно-устойчивого туберкулеза (10-летний опыт)» (Томск, 2012), Итоговой 71-й студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова (Томск, 2012), X Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2012), X Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2011 – 2012), на научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2011 – 2012).
Исследования проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ГК №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких», руководитель – профессор О.И. Уразова) и РФФИ (Проект № 11-04-98057-р «Разработка комплекса иммунодиагностических биомаркеров для оптимизации лечения больных туберкулезом легких», руководитель – профессор О.И. Уразова).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 13 таблицами. Библиографический список включает 287 наименований, из них 148 отечественных и 139 зарубежных источников.
.
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 109 больных (89 мужчин и 20 женщин) с распространенными деструктивными формами впервые выявленного туберкулеза легких (ТЛ) в возрасте 20-55 лет. Все пациенты с ТЛ пребывали на стационарном лечении во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. – А.А. Платоненкова) Томской областной клинической туберкулезной больницы (гл. врач – канд. мед. наук Г.В. Янова). Пациенты поступали в Томскую областную клиническую туберкулезную больницу из муниципальных бюджетных учреждений поликлинической сети (МБЛПУ) г. Томска и Томской области.
Диагноз ТЛ устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты, которые были получены на базе биохимической, рентгенологической и бактериологической лабораторий Томской областной туберкулезной больницы (зав. лабораторией – Г.Г. Глотова), а также бактериологической лаборатории Томского областного противотуберкулезного диспансера (зав. лабораторией – В.Е. Павлова).
Клиническую форму заболевания устанавливали на основании данных рентгенологического исследования легких. Из 109 обследованных лиц диагноз инфильтративного ТЛ был выставлен 56 (51,38%) пациентам, диагноз диссеминированного ТЛ – 53 (48,62%) больным. Группы больных с инфильтративным и диссеминированным ТЛ дополнительно были разделены на подгруппы в зависимости от чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (лекарственно-чувствительный (ЛЧТЛ), лекарственно-устойчивый туберкулез легких (ЛУТЛ)).
Критериями исключения пациентов из исследования являлись: возраст больных младше 20 и старше 55 лет, наличие других клиническими форм туберкулезной инфекции, тяжелых сопутствующих заболеваний инфекционного и неинфекционного генеза, отягощенного аллергологического анамнеза, терапия глюкокортикоидами и иммуномодулирующими препаратами.
Группу сравнения составили 50 практически здоровых доноров (группа здоровья II) в возрасте от 20 до 55 лет. Все лица (37 мужчин и 13 женщин), входящие в контрольную группу, прошли медицинский осмотр на базе МБЛПУ Поликлиника №3 (гл. врач – канд. мед. наук А.В. Михленко). Условиями включения в группу сравнения являлись: отсутствие патологических изменений в легких при флюорографическом исследовании, отсутствие в анамнезе легочной патологии, тяжелых аллергических реакций, хронических инфекционных заболеваний, заболеваемость острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не чаще 3-х раз в год, при отсутствии в анамнезе инфекционных заболеваний в течение не менее 3-х месяцев, предшествующих исследованию. Все включенные в исследования добровольцы отрицали наличие в анамнезе аллергических заболеваний, отягощенной наследственности, лекарственной и пищевой аллергии.
Материалом для иммунологического исследования служила периферическая венозная кровь, стабилизированная гепарином (25 Ед/мл). Взятие крови проводили утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл. Исследование проводились однократно, до начала специфической противотуберкулезной химиотерапии.
Подсчет общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм (лимфоциты, моноциты) осуществляли на гематологическом анализаторе MEK-6400 (Nihon Kohden, Япония).
Мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3) [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Лимфоциты отделяли от моноцитов, основываясь на способности последних к адгезии на стекле и пластике [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].
Концентрацию жизнеспособных клеток в суспензии определяли с использованием 0,5% раствора трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].
Специфическую индукцию лимфоцитов осуществляли путем добавления индукторов пролиферативного ответа (моноклональные антитела (МКАТ) к CD3- и CD28-молекулам) и блокатора внутриклеточного транспорта (моненсин) в дозах 1, 4, и 5 мкг/мл соответственно. Время индукции в зависимости от исследуемого параметра составляло: 40 мин (транскрипционные факторы), 10 ч (рецепторные молекулы CD3, CD28 и внутриклеточный IL-2) и 48 ч (рецепторная молекула CTLA-4 и IL-2 in vitro).
Определение рецепторных молекул (CD3, CD28, CTLA-4), внутриклеточных транскрипционных факторов (NF-B, АР-1, NFAT1, NFAT2) и IL-2 в лимфоцитах крови выполняли методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с помощью МКАТ, меченных флуоресцентными метками (PerCP, FITC, PE).
Для оценки базальной и CD3/CD28-индуцированной секреции IL-2 in vitro (по содержанию интерлейкина в супернатантах культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов) использовали метод твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» анализа (ELISA).
Обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых статистических методов с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы «Statsoft Inc.». Проверка нормальности распределения выборочных данных осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Вилка. При сравнении анализируемых выборок проверяли гипотезу о равенстве их генеральных дисперсий с помощью критерия Фишера. В случае нормального распределения признака в исследуемых выборках и равенстве их генеральных дисперсий проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента, при различных дисперсиях – с помощью критерия Аспина-Уэлча. Для оценки статистической значимости различий между независимыми выборками с ненормальным распределением и равными дисперсиями использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, при различных дисперсиях – критерий Уолда-Вольфовита. С целью установления взаимосвязей между изучаемыми количественными показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (при нормальном распределении) и Спирмена (при ненормальном распределении). При уровне значимости р0,05 различие двух сравниваемых величин считали достоверным [Бронштейн И.Н., Семендяев К.А., 1986; Флейс Дж., 1989; Боровиков В.В., 2001].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В отечественной и зарубежной литературе представлено много работ, посвященных изучению иммунного статуса и эффективности иммунного ответа у больных туберкулезом легких (ТЛ) [Кноринг Б.Е. и соавт., 1999; Хонина Н.А. и соавт., 2000; Ulmer A.J. et al., 2000; Черешнев В.А., 2001; Dantzer R., 2001; Комогорова Б.Э., 2005; Краснов В.А. и соавт., 2005; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Новицкий В.В. и соавт., 2008; Шовкун Л.А, 2008; Лядова И.В., Гергерт В.Я., 2009; Хасанова Р.Р. и соавт., 2009; Шилько Т.А., 2009; Колосова А.Е. и соавт., 2010; Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011]. Это связано, прежде всего, с тем, что состояние факторов иммунологической защиты является решающим при инфицировании, а также определяет характер течения патологического процесса и исход заболевания при развитии туберкулезной инфекции.
В настоящее время среди причин, лежащих в основе развития ТЛ, особое значение отводится комплексу этиологических и патогенетических факторов, обусловливающих нарушение иммунного ответа на M. tuberculosis и формирование вторичной иммунологической недостаточности (ВИН), сопровождающей данное заболевание. Наличие ВИН существенно влияет как на течение туберкулезного процесса, так и на качество этиотропной терапии; ее характерной особенностью является дисбаланс в цитокиновой сети, проявляющийся, как правило, гипопродукцией цитокинов, ответственных за «поляризацию» дифференцировки наивных (нулевых) Т-лимфоцитов-хелперов (Th) в Th1-клетки и развитие иммунного Th1-ответа [Чучалин А.Г., 2004]. Наиболее отчетливо с характером течения туберкулезной инфекции связаны изменения секреции интерлейкина (IL) 2, являющегося основным аутокринным фактором роста и активации Т-лимфоцитов и обладающего способностью направлять дифференцировку наивных Т-клеток по Th1-пути. Гипопродукция IL-2, часто регистрируемая при ТЛ, в настоящее время считается основным критерием ВИН и рассматривается среди основных факторов неэффективности иммунного ответа на M. tuberculosis [Сахно Л.В. и соавт., 2004; Лусс Л.В., 2007; Ивашкин В.Т., 2008].
Известно, что основными клетками-продуцентами IL-2 являются активированные Th1-лимфоциты, на долю которых приходится до 90-95% секретируемого в ходе иммунных реакций IL-2. В этой связи причины дефицита IL-2 напрямую зависят от активации Т-клеток [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008].
Причины снижения активности Th1 могут лежать в нарушении взаимодействия между T-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (APC) [Ивашкин В.Т., 2008; Griffiths G.M., Tsun A., 2011]. Известно, что межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется путем как непосредственного контактного взаимодействия клеток, в котором участвуют их поверхностные молекулы, так и посредством цитокинов [Dustin M.L., 2010; Alarcn B. et al., 2011]. При этом основным механизмом индукции секреции IL-2 принято считать передачу импульсов посредством Т-клеточного рецептора (CD3-TCR) [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008]. Показано, что для активации наивных Т-клеток по Th1-пути необходимо соединение CD3-TCR лимфоцита с комплексом «МНС II+пептид» APC при участии корецептора CD4 и молекул костимуляции CD28 (на Т-клетках) и CD80/CD86 (на APC) [Ивашкин В.Т., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Yokosuka T., Saito T., 2010]. При этом активация костимулирующей молекулы CD28 является обязательным условием для запуска клеточно-опосредованного иммунного ответа. Отсутствие или недостаточная стимуляция через CD28 приводит к активации программы апоптоза и гибели Т-лимфоцита [Ивашкин В.Т., 2008; Gerdes N., Zirlik A., 2011; Lichtman A.H., 2012].
По существующим представлениям, иммунный ответ на M. tuberculosis подавляется в связи с активацией Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), оказывающих супрессорное влияние на процессы лимфопролиферации и опосредующих Т-клеточную анергию [Ярилин А.А., 2010; Зурочка А.В., 2011; Симбирцев А.С., 2011; Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011; Sakaguchi S., 2011]. При этом большое значение придается присутствию на поверхности Treg-лимфоцитов ингибитора костимуляции – молекулы CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), поскольку именно с этой молекулой связывают реализацию их иммуносупрессорной функции [Сахно Л.В., 2004; Ярилин А.А., 2010]. Среди основных эффектов супрессии выделяют способность CTLA-4, обладающей высокой авидностью к молекулам CD80/CD86 на APC, предотвращать их костимулирующее действие через CD28-молекулу и, таким образом, подавлять активацию Th1-клеток [Казимирский А.Н., 2006].
Исходя из этого, нами была предпринята попытка оценить секрецию IL-2 при специфической индукции лимфоцитов, имитирующей взаимодействия между антигенпрезентирующими клетками и Т-лимфоцитами in vitro, и выявить возможные нарушения процессов межклеточной кооперации на уровне Т-клеточного рецептора и молекул костимуляции.
Анализ цитокинсекреторной активности показал, что у больных ТЛ отмечается гипосекреция IL-2 лимфоцитами крови как в спонтанных условиях (базальная), так и при CD3/CD28-индукции клеток, наиболее выраженная при ЛУТЛ (базальная при диссеминированной его форме, индуцированная – при инфильтративной) (таблица 1). При этом было отмечено снижение относительного и абсолютного числа CD3-, CD28- и IL-2-позитивных лимфоцитов у больных как ЛЧТЛ, так и ЛУТЛ относительно соответствующих показателей у здоровых доноров, наиболее выраженное в группе пациентов с диссеминированным ЛУТЛ. Кроме того, у больных ТЛ было зарегистрировано изменение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, которое проявлялось снижением числа CD3+CD28+IL-2+, CD3+CD28+IL-2 и увеличением содержания CD3+CD28IL-2 лимфоцитов, а также повышением количества иммуносупрессорных CTLA-4+ Т-клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении. Наиболее значительные их изменения обнаруживались у пациентов с лекарственно-устойчивым вариантом туберкулезной инфекции (рисунок 1, 2).
Таблица 1
Секреция IL-2 лимфоцитами крови in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких, Ме (Q1-Q3)
| Группы обследованных лиц | Базальная секреция, пг/мл | CD3/CD28-индуцированная секреция, пг/мл | |
| Здоровые доноры | 12,81 (11,26-15,57) | 35,88 (32,39-44,15) р4<0,001 | |
| Больные инфильтративным туберкулезом легких | ЛЧТЛ | 8,73 (6,46-13,42) р1<0,05 | 13,45 (10,62-18,09) р1<0,001; р4<0,01 |
| ЛУТЛ | 6,24 (4,58-9,13) р1<0,001; р3<0,01 | 8,80 (7,80-12,51) р1<0,001; р3<0,001; р4<0,01 | |
| Больные диссеминированным туберкулезом легких | ЛЧТЛ | 7,62 (7,00-8,94) р1<0,001; р2<0,05 | 23,74 (20,62-27,88) р1<0,001; р2<0,01; р4<0,001 |
| ЛУТЛ | 3,56 (3,13-4,77) р1<0,001; р2<0,01; р3<0,001 | 12,56 (11,59-16,68) р1<0,001; р2<0,01; р3<0,001; р4<0,001 | |
Примечание. ЛЧТЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких; ЛУТЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких; р1 – по сравнению с показателями у здоровых доноров; р2 – по сравнению с показателями у больных с ЛЧТЛ (внутри каждой клинической формы); р3 – по сравнению с показателями у больных с инфильтративным ТЛ; р4 – по сравнению с показателями базальной секреции (без использования индукторов).
Угнетение IL-2-секреторной активности Т-лимфоцитов, установленное в настоящем исследовании, во многом определяется снижением количества данной субпопуляции клеток. Уменьшение общего числа CD3-позитивных лимфоцитов может быть связано как с непосредственной гибелью клеток в очаге воспаления в легких, что приводит к ускоренной миграции Т-клеток из периферической крови [Сахно Л.В., 2004], так и, как уже указывалось выше, с запуском программы их апоптоза [Ивашкин В.Т., 2008].
В качестве ключевых факторов активации апоптоза при действии на макроорганизм инфекционных агентов в настоящее время рассматриваются нерепарируемые повреждения и рецептор-зависимая селекция клеток. Так, было показано, что Т-клеточный дефицит при туберкулезе может быть обусловлен индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата лимфоцитов и систем, обеспечивающих генетический гомеостаз макроорганизма. При этом угнетение индекса стимуляции ДНК-репарации в лимфоцитах крови при туберкулезе связывают с инфекционно-токсическим их повреждением, которое может быть одной из причин запуска Fas-индуцированного апоптоза и снижения численности данной популяции клеток [Ивашкин В.Т., 2008; Шилько Т.А., 2009; Уразова О.И., 2010; Чурина Е.Г. и соавт., 2011].
Немалая роль в регуляции клеточной гибели принадлежит также фактору некроза опухолей (TNF), являющемуся ключевым регулятором иммунного ответа [Биктасова А.К., 2010; Ярилин А.А., 2010]. В условиях туберкулезной инфекции TNF--опосредованная гибель иммунокомпетентных клеток может иметь доминирующее значение в развитии Т-клеточного дефицита в виду индуцированной M. tuberculosis гиперсекреции данного цитокина [Воронкова О.В., 2007; Серебрякова В.А., 2011].
Известно, что CD4+ Т-лимфоциты являются более чувствительными к активации
апоптоза за счет высокой экспрессии ими рецепторов FasR и TNFR1 и подавления активности антиапоптотических генов семейства bcl-2 [Пичугин А.В., Апт А.С., 2005; Ивашкин В.Т., 2008; Тюлькова Т.Е. и соавт., 2008; Ярилин А.А., 2010].
Кроме того, в индуктивной фазе иммунного ответа путем апоптоза удаляются Т-лимфоциты, не получившие адекватного костимуляторного сигнала при взаимодействии антигенспецифического рецептора с презентируемым антигеном. Активация процесса апоптоза в данном случае зависит от NFAT1-индуцированной экспрессии апоптотического фактора FasL в ответ на неадекватный антигенный стимул, определяющий гибель Т-клетки [Сибиряк С.В. и соавт., 2006; Gwack Y. et al., 2007]. В пользу данного предположения может свидетельствовать зарегистрированное в настоящем исследовании снижение относительного числа CD28-позитивных Т-лимфоцитов у больных ТЛ, максимально выраженное при ЛУТЛ (рисунок 1).
Однако следует отметить, что гипопродукция IL-2, а также снижение числа CD3+CD28+IL-2+ лимфоцитов у больных ТЛ могут быть обусловлены анергией Т-клеток. Выявленное у больных ТЛ увеличение содержания CD28IL2 и CTLA-4+ Т-клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении и гипосекреции IL-2, вероятно, связано с увеличением количества и функциональной активности Т-регуляторных клеток, способных супрессировать процессы лимфопролиферации, вызывая развитие гипо- и анергии Т-лимфоцитов [Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011].
Таким образом, у больных ТЛ отмечается существенное снижение числа Т-лимфоцитов, гипосекреция IL-2 при CD3/CD28-индукции и изменение процентного соотношения субпопуляций CD3-позитивных клеток, проявляющееся снижением IL-2-синтезирующих (IL-2+) Т-клеток, увеличением числа CD28- и IL-2-негативных лимфоцитов, а также CD3+CTLA-4+ клеток. Выявленные изменения носят в большей степени однонаправленный характер и максимально выражены у пациентов с лекарственно-резистентным вариантом туберкулезной инфекции. Учитывая, что передача активационного сигнала в процессе межклеточной кооперации, опосредованная Т-клеточным рецептором и костимуляцией через CD28, является одним из ключевых моментов формирования противотуберкулезного иммунитета, выявленные изменения в Т-лимфоцитах при ТЛ могут свидетельствовать о неспособности Т-клеток эффективно отвечать на антигенный стимул, что приводит к выраженной гипосекреции IL-2.
Как уже отмечалось ранее, активация CD3-TCR лимфоцита при участии корецептора CD4 и костимулирующей молекулы CD28 на Т-клетках приводит к запуску механизмов сигнальной трансдукции, конечным итогом которых (применительно к Th1-ответу) является секреция IL-2 и экспрессия его поверхностного рецептора [Bromley S.K. et al., 2001; Пименов А.А. и соавт., 2003; Ярилин А.А., 2003; Wang H. et al., 2005; Ивашкин В.Е., 2008]. Активация CD3-TCR/CD28 приводит к запуску цепочки тирозиновых киназ Fyn, Lck, ZAP70, вызывающих расщепление фосфатидилинозитолдифосфата с образованием диацилглицерола и инозитолтрифосфата. Последний высвобождает из внутриклеточных депо Са2+, необходимый для активации кальциневрина, который, в свою очередь, дефосфорилирует цитоплазматическую форму ядерного фактора транскрипции NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells), способствуя, тем самым, его транслокации в ядро. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С и белок Ras. Последний способствует фосфорилированию протеинкиназы Raf, запускающей сигнальный каскад митоген-активированных белков (MAPK и MAPKK (Мек)). Активная протеинкиназа С при помощи Carma-1 (caspase-recruitment-domain-containing membrane-associated guanylate kinase 1) связывается с фосфорилированным белком Bcl-10. Протеин Bcl-10 взаимодействует с каспазоподобной протеазой MALT-1, которая в последующем активирует комплекс IB-киназ (IKK). Следствием является фосфорилирование ингибитора B (IB) по двум близкорасположенным остаткам серина (32 и 36), что служит сигналом для убиквитинации и последующей деградации молекулы IB в 26S-протеосомах с освобождением из связи с ингибитором фактора транскрипции NF-B. Параллельно этому в каскаде МАР-киназ активируются ядерная форма транскрипционного фактора (ТФ) NFAT (NFATn). Совместное действие ядерных факторов NFATc, NFATn, объединенных в полноценный транскрипционный фактор NFATc/n, и NF-kB включает в ядре «ранние гены» клеточной пролиферации Fos и Jun и промотор AP-1, который (взаимодействуя с NFAT) активирует транскрипцию генов IL-2 (IL2) и его рецептора (CD25) [Kintzel P.E., Calis K.A., 1991; Chang C.P. et al., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Monaco C. et al., 2004; Macian F., 2005; Абатуров А.Е., 2006; 2007; Gilmore T.D., 2006; Ивашкин В.Е., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Hayden M.S., Ghosh S., 2008; Зенин В.В. и соавт., 2009].
Таким образом, ключевыми звеньями в механизмах трансдукции сигнала стимуляции секреции основного Th1-ассоциированного цитокина – IL-2, является активация ТФ NF-B, AP-1 и NFAT. С этих позиций было проанализировано количество CD3-позитивных лимфоцитов, содержащих активные формы указанных ТФ в условиях CD3/CD28-индукции клеток in vitro.
Как показали результаты проведенного исследования, у больных ТЛ отмечается снижение относительного и абсолютного числа CD3+NF-B+ лимфоцитов относительно показателей у здоровых доноров, наиболее выраженное при диссеминированной форме ЛУТЛ. При этом количество CD3+AP-1+ лимфоцитов у больных ЛЧТЛ оставалось в пределах нормы, повышалось у больных инфильтративным ЛУТЛ и снижалось при диссеминированной его форме (рисунок 3).
Низкая активность NF-B и AP-1 при ТЛ, вероятно, связана с недостаточностью активационного сигнала, обусловленной снижением экспрессии молекулы костимуляции CD28, а также увеличением супрессорного влияния CTLA-4-молекулы, согласно выявленному у пациентов с ТЛ повышению численности экспрессирующих ее Т-клеток.
