Динамика альфа-фето протеина, минеральных элементов и показатели физического развития у куриных эмбрионов в онтогенезе
На правах рукописи
ЧЕРНИКОВ
Сергей Валерьевич
ДИНАМИКА альфа-фетопротеина, МИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ
И показатели ФИЗИЧЕСКОГО развИтия
У курИНЫХ эмбрионов в онтогенезе
03.03.05 – биология развития, эмбриология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ставрополь – 2012
Работа выполнена в
ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет»
и Южном научном центре Российской академии наук.
| Научный руководитель: | доктор ветеринарных наук, профессор Тимченко Людмила Дмитриевна. |
| Официальные оппоненты: | доктор сельскохозяйственных наук, профессор Иванов Виктор Михайлович; кадидат биологических наук Гутникова Людмила Валерьевна. |
| Ведущая организация: | ФГБОУ ВПО «Кабардино-Балкарская государственная сельскохозяйственная академия». |
Защита диссертации состоится 4 апреля 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.
Автореферат разослан 15 февраля 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Ржепаковский И.В.
e-mail: [email protected]
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Изучение общих закономерностей онтогенеза имеет большое значение для решения теоретических и практических вопросов биологии развития. В условиях современности не теряет актуальности выяснение механизмов регуляции роста и развития клеток и тканей организма, нарушение которых приводит к возникновению различных патологий (Шилов В.Н., 2006). Знание таких механизмов особенно важно в эмбриональный период, когда происходит формирование будущего организма, закладываются ткани и органы. В основе формообразовательных процессов лежат такие взаимосвязанные явления, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз (Ярыгин В.Н. и др., 2001), интенсивность и интеграция которых в онтогенезе регулируется многочисленными биохимическими факторами, в том числе белками и различными минеральными веществами, представленными в организме как моносубстанциями, так и в виде сложных, и прежде всего, ферментных соединений (Авцын А.П., 1991; Шилов В.Н., 2006; Reiser S. et al., 1985; Harris E.D., 1992; Pena M.O. et al., 1999; Araya M. et al., 2003).
Большинство веществ-регуляторов обладают низкомолекулярной структурой, и соответственно реализуют свои функции на молекулярном уровне (Ширшев С.В., 1993). К таким веществам относят альфа-фетопротеин, являющийся по своей структуре уникальным соединением белковой природы. Эффекты его реализуются на уровне комплексной регуляции клеточной пролиферации, механизмов апоптоза, обеспечения клетки энергетическим и пластическим материалом, иммунорегуляции, индукции регуляторных сигналов через усиление экспрессии рецепторов и других жизненно важных процессов (Ширшев С.В., 1993; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003; Черешнев В.А. и др., 2004; Hooper D.C. et al., 1987; Geuskens M., 1991; Geuskens M. et al., 1994; Nunes E.A., 1994; Filella X. et al., 2001). Однако установление его функций остаётся на протяжении продолжительного периода самой загадочной и противоречивой областью в исследовании этого белка (Абелев Г.И., 1989; Виноградская Г.Р., Маринец О.В., 2001; Гранов А.М. и др., 2008).
Широкий спектр воздействия на организм обусловливает использование АФП в биотехнологических целях (Рощин Е.М. и др., 1997; Стариков В.В. и др., 1997; Родионов С.Ю. и др., 1998; Родионов С.Ю., Стариков В.В., 2000, 2001; Черкасов В.А. и др., 2000; Черешнев В.А. и др., 2004). Поэтому изучение содержания и механизмов регуляции синтеза этого белка в различных биологических объектах – крайне интересное и многообещающее направление в биологии. В настоящее время эти вопросы наиболее детально изучены у человека и некоторых млекопитающих. У них исследовано содержание АФП в различных органах: желточном мешке, печени, крови, желудочно-кишечном тракте плода (Абелев Г.И., 1994; Пустотина О.А., 2006; Leung W.Т. et al., 1994).
В то же время общепризнано, что куриный эмбрион – это классическая модель для изучения особенностей эмбрионального развития, механизмы которого и сегодня являются предметом неослабевающего интереса исследователей. Тем не менее, практически отсутствуют сведения о содержании АФП в развивающемся эмбрионе птицы, являющемся важным биологическим объектом исследования и перспективной сырьевой субстанцией для использования в биотехнологии. Имеются лишь единичные сообщения о наличие у куриного эмбриона АФП в нервной ткани и сетчатке глаза в отдельные периоды эмбриогенеза (Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003).
Считается, что наиболее полно уровень развития организма, как в норме, так и при патологии, отражает комплекс морфометрических показателей. Однако их перечень, установленный для куриных эмбрионов, сравнительно невелик и представлен, преимущественно массой тела, органов и линейными размерами (Задарновская Г.Ф., 1966; Шмальгаузен И.И., 1984; Долгорукова А.Н., 2007; Хохлов Р.Ю., 2009; и др.). Также узок спектр показателей физического развития, в частности, имеются единичные сообщения лишь о некоторых простейших индексах (Трунова А.П., 2008), перечень которых, по нашему мнению, недостаточен для полноценной характеристики его пропорциональности и гармоничности. Заслуживает внимание и отсутствие точных сведений о динамике в тканях развивающегося куриного эмбриона уровня минеральных элементов, являющихся важнейшим фактором обеспечения не только функций отдельных клеток, но и механизмов межклеточного взаимодействия.
В связи с вышеизложенным, представляется актуальным получение новых сведений о морфофункциональных преобразованиях в курином эмбрионе, в том числе о критериях физического развития, содержании АФП, и характере взаимосвязей между этими показателями, а также о динамике минеральных элементов, которые могут заложить основы для управления эмбриогенезом особи.
Цель исследования: изучить динамику альфа-фетопротеина, общего белка и минеральных элементов в курином эмбрионе, а также дать комплексную оценку уровня его физического развития в онтогенезе, с выявлением характера взаимосвязей между изучаемыми показателями.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
1. Определить содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона и его процентное соотношение в составе общего белка в процессе развития.
2. Изучить морфометрические показатели эмбрионов птицы на разных этапах развития и на их основе вычислить основные индексы развития куриного эмбриона.
3. Провести корреляционный анализ взаимосвязи уровня альфа-фетопротеина в процессе развития куриного зародыша с его морфометрическими показателями и уровнем общего белка.
4. Исследовать содержание кальция, магния, натрия, калия, железа цинка, марганца, меди, хрома, селена и кобальта в курином эмбрионе в процессе развития.
Научная новизна. Установлено содержание альфа-фетопротеина, определена его динамика в гомогенате куриного эмбриона, а также доля в составе общего белка в процессе развития.
Впервые в эмбриогенезе кур проведена оценка физического развития куриного зародыша с использованием широкого перечня показателей, в том числе с помощью метода индексов.
Впервые в эмбриогенезе кур выявлен характер коррелятивной взаимосвязи между уровнем АФП, общего белка в гомогенате куриного эмбриона и его морфометрическими показателями.
Проведены исследования комплекса минеральных элементов (кальций, магний, натрий, калий, железо, цинк, марганец, медь, хром, селен, кобальт) в тканях куриного эмбриона в процессе развития.
Теоретическая и практическая значимость. Данные о динамике АФП в процессе развития куриного эмбриона существенно дополняют и расширяют представление о его роли в эмбриогенезе. Установленные взаимосвязи уровня альфа-фетопротеина в эмбриональном гомогенате с другими морфофункциональными показателями дают основание обозначить его регуляторную роль в соматическом эмбриогенезе, что может быть использовано для регуляции эмбрионального развития в хозяйственных, научных, а также в биотехнологических целях, в частности для получения АФП-содержащего сырья.
Результаты исследования внедрены и используются в научной деятельности и учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биологии размножения и развития, гистологии, цитологии, эмбриологии, физиологии и биологии клетки в Ставропольском государственном университете, Ставропольском филиале Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Брянском государственном университете им. академика И.Г. Петровского и в Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии.
Полученные данные используются в научно-исследовательской работе НИИ биологии Южного федерального университета.
Результаты исследования используются в практической деятельности при разработке АФП-содержащих биологически активных препаратов на основе активированной эмбрионально-яичной массы на базе ПНИЛ «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» Ставропольского государственного университета, и в практической деятельности ООО НПО «Биомодуль» и ООО Малое инновационное предприятие «Кормовые концентраты» и в качестве вспомогательных данных при разработке технологий производства и схем применения новых БАП и кормовых добавок для животных и птицы.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-методических конференциях: «Университетская наука – региону» (Ставрополь, 2007, 2008, 2009, 2011); на 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008); 5-й ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), где доклад был отмечен почётной грамотой; международной научно-практической конференции «Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК» (Нальчик, 2011).
На защиту выносится:
1) динамика альфа-фетопротеина, его абсолютные значения и характер взаимосвязи с уровнем общего белка в супернатанте гомогената, массой и длиной тела и массой внутренних органов в процессе развития куриного эмбриона;
2) особенности физического развития и уровень минеральных элементов в гомогенате куриных эмбрионов в процессе инкубации.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе 3 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой учёной степени.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 21 рисунками, 13 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 327 источников, в том числе 112 зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИсследованиЙ
Работа выполнялась в течение 2007-2012 гг. на кафедре общей биологии, на базе ПНИЛ «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» Ставропольского государственного университета и базовой кафедре иммунологии и микробиологии Южного научного центра РАН при СГУ.
Материалом для исследований послужили 3200 куриных эмбрионов на разных этапах развития. Исследования всех морфометрических показателей, а также уровня альфа-фетопротеина (АФП) и общего белка на каждом этапе развития проводили у одних и тех же 1600 эмбрионов. Морфометрические показатели измеряли у каждого эмбриона. При определении содержания АФП и общего белка в каждые изучаемые сутки готовили по 20 проб гомогената пяти эмбрионов. Определение минеральных элементов на каждые сутки развития проводили в 20 пробах гомогената, также состоящих из пяти эмбрионов (всего 1600 эмбрионов).
Для получения эмбрионов использованы сертифицированные оплодотворённые яйца яйценосной породы кур белый леггорн. Яйца инкубировались при температуре плюс 37,5±2°С и относительной влажности 80% в вентилируемом инкубаторе ИПХ-10И (Россия). Контроль качества яиц и степень развития зародыша и эмбриона осуществляли с помощью овоскопа ПКЯ-10 (Россия). Результаты, полученные в процессе визуального осмотра куриных яиц во время инкубации и при их вскрытии, легли в основу критериев выбора эмбрионов для экспериментальной работы.
Морфометрические исследования эмбриона начинали с 5-х, а внутренних органов с 10-х суток инкубации.
На каждые сутки развития проводили вскрытие яиц, определяли степень оперения, развитость кровеносной системы и провизорных органов, а также выявляли различные аномалии развития и уродства. Эмбрионы, которые не соответствовали общепринятым критериям, изложенным в руководствах по инкубации яиц (Третьяков Н.П., 1990; Рахманов А.И., 2005; Бессарабов Б.Ф., 2006) выбраковывались.
Содержимое вскрытого яйца извлекали из скорлупы и выливали в чашку Петри. Затем эмбрион отделяли от провизорных органов и выполняли с ним комплекс манипуляций, заключающийся в исследовании содержания АФП, общего белка и минеральных веществ, морфометрических показателей роста и развития, с последующим вычислением индексов развития и анализом степени взаимосвязи изучаемых критериев.
Массу тела эмбрионов определяли с помощью электронных весов ВЛТЭ-150 (класс точности II, ГОСТ 24104-2001) (Россия). После этого с помощью скальпеля, ножниц и препаровальных игл выделяли внутренние органы: печень, сердце и лёгкие, и проводили их взвешивание на тех же весах. Абсолютный и относительный прирост массы тела и органов, а так же относительную массу органа к массе тела определяли с помощью формул предложенных И.И. Шмальгаузеном (1984).
Линейные размеры тела определяли с помощью штангенциркуля, линейки с ценой деления 0,5 мм, нитки и сантиметровой ленты.
Длину тела (L) и окружность грудной клетки (Т) измеряли в сантиметрах, причём за критерий длины тела принимали линейный краниокаудальный размер, измеряемый от верхушки черепа до конца хвоста. Массу тела эмбриона (P) измеряли в граммах.
Полученные морфометрические данные использовали для вычисления комплекса критериев физического развития. Вычисляли посуточный абсолютный и относительный прирост массы тела и органов, отношение массы органов к массе тела, индексы физического развития Кетле I, Кетле II, Ливи, Рорера, Боргарндта I, Эрисмана, Вервека и индекс гармоничного морфологического развития (ИГМР).
Для вычисления индексов физического развития использовали общепринятые формулы для млекопитающих, предложенные В.Ф. Красота, В.Т. Лобановым, Т.Г. Джапаридзе (1983); Е.Я. Борисенко, К.В. Барановой, А.П. Лисицыным (1984); С.И. Изааком, Т.В. Панасюком, Р.В. Тамбовцевой (2005). Выбор перечня исследуемых индексов проводили с учётом величины объекта и особенностей периода его онтогенеза.
Для исследования содержания АФП и общего белка были адаптированы методики, используемые для определения этих показателей в сыворотке крови. Адаптация заключалась в использовании вместо сыворотки крови гомогенизированной массы тканей куриного эмбриона, которую готовили с помощью гомогенизатора фирмы Vitek (Австрия). Полученная гомогенизированная масса центрифугировалась на 8000 об/с в течение 20 минут с использованием центрифуги Hettich Universal 320 (Германия). Затем с помощью пипетки супернатант отбирался в пробирки. При необходимости набора большого количества проб допускалось замораживание в морозильной камере при температуре минус 10…15°С. Перед исследованием супернатант подвергали разморозке при комнатной температуре, с последующим определением в нем АФП и общего белка.
Содержание общего белка в супернатанте гомогената исследовали колориметрическим биуретовым методом с помощью биохимического фотометра Stat Fax 1904+R (США) и набора реагентов ПРОТЕИН-НОВО (В-8012).
Содержание альфа-фетопротеина определяли с использованием иммуноферментного анализатора марки Stat Fax 303 Plus (США) с помощью набора реагентов АФП-ИФА-БЕСТ (Т-8456) для определения АФП в сыворотке крови.
Исследования содержания минеральных элементов проводили в нецентрифугированной эмбриональной массе с использованием атомно-абсорбционного спектрофотометра PERKIN-ЕLMER 2280 (США).
Результаты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с использованием программы Primer of Biostatistics (Version 4.03). Используя критерий Стьюдента, вычисляли среднюю арифметическую величину (М) и стандартную ошибку среднего (m). Для сравнения варьирующих признаков измеряемых в различных единицах использовали ту же программу с критериями расчета коррелятивной зависимости.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриных эмбрионов
и его уровень в составе общего белка на разных этапах развития
Куриный эмбрион все чаще используется не только в качестве удобной биологической модели, но и в качестве субстанции для производства биологически активных препаратов, иммунотропных и косметических средств (Ржепаковский И.В., 2003; Тимченко Л.Д., Косик Н.В., 2004; Маханьков О.В., Сумеркина В.А., 2006; Каузова А.С., 2009). Такой интерес обусловлен широким комплексом биологически активных веществ, в том числе и АФП, входящих в состав яйца и образующихся непосредственно в процессе развития эмбриона (Ржепаковский И.В., 2003). Однако отсутствуют рекомендации о конкретных сроках развития, в которые содержание АФП в эмбриональных тканях кур достаточно для его использования в качестве сырьевого субстрата. Кроме того, уровень содержания АФП в процессе развития куриного зародыша представляет и научный интерес, как фактор регуляции процессов онтогенеза.
Установлено, что АФП в курином эмбрионе присутствует с 5-х по 20-е сутки развития, его содержание не постоянно, а динамика имеет волнообразный характер (табл. 1).
В период с 5-х на 6-е сутки наблюдается достоверное увеличение содержания белка на 3,82 МЕ/мл, а к 7-м суткам концентрация АФП снижается на 4,24 МЕ/мл. Тенденция снижения уровня АФП сохраняется вплоть до 10-х суток развития. На 9-е сутки отмечено минимальное содержание АФП за всё время эксперимента – 1,12±0,02 МЕ/мл. С 9-х по 10-е сутки развития концентрация АФП вновь увеличивается на 0,8 МЕ/мл, а с 10-х по 11-е сутки – еще на 2,17 МЕ/мл. С 11-х по 12-е сутки эмбриогенеза отмечена наиболее выраженная за весь период развития суточная динамика АФП, его концентрация достоверно увеличивается на 38,71 МЕ/мл. При этом к 12-м суткам, исследуемый показатель, достигает своего максимального значения – 42,8±0,29 МЕ/мл. Далее, в промежутке между 12-ми и 13-ми сутками концентрация АФП резко снижается – на 30,9 МЕ/мл. С 13-х по 15-е сутки содержание АФП возрастает, и если к 14-м суткам прирост содержания АФП составляет 1,2 МЕ/мл, то к 15-м суткам он более существенен (12,40 МЕ/мл), а уровень АФП достигает второго по величине значения за весь период инкубации – 25,5±0,31 МЕ/мл. Между 15-ми и 17-ми сутками наблюдается снижение концентрации АФП, выраженное с разной посуточной интенсивностью. Концентрация АФП в промежутке между 17-ми и 18-ми сутками снова достоверно увеличивается на 7,78 МЕ/мл. На 18-е сутки развития наблюдается очередной всплеск концентрации белка (13,7±0,17), он является третьим по величине, за весь период развития. В период между 18-ми и 19-ми сутками отмечено выраженное снижение уровня АФП (на 11,29 МЕ/мл). С 19-х суток содержание АФП продолжает снижаться, но с меньшей интенсивностью, достигая на 20-е сутки 1,51±0,03 МЕ/мл.
Таблица 1
Содержание АФП в гомогенате куриных эмбрионов в процессе развития
| Сутки развития, n=20 | Содержание АФП МЕ/мл |
| 5 | 2,11±0,03 |
| 6 | 5,93±0,06* |
| 7 | 1,69±0,02* |
| 8 | 1,47±0,02* |
| 9 | 1,12±0,02* |
| 10 | 1,92±0,04* |
| 11 | 4,09±0,03* |
| 12 | 42,8±0,29* |
| 13 | 11,9±0,11* |
| 14 | 13,1±0,17* |
| 15 | 25,5±0,31* |
| 16 | 12,1±0,19* |
| 17 | 5,92±0,09* |
| 18 | 13,7±0,17* |
| 19 | 2,41±0,02* |
| 20 | 1,51±0,03* |
*(P<0,05) – достоверная разница в сравнении с предыдущими сутками
n – количество проб гомогената 5-ти эмбрионов на каждые сутки исследования.
Таким образом, динамика АФП в супернатанте эмбрионального гомогента в процессе развития куриного эмбриона характеризуется чередованием, в разной степени выраженных пиков спадов и подъёмов. Наиболее видимые пики роста концентрации АФП отмечены на 6-е, 12-е, 15-е и 18-е сутки инкубации. Следует отметить, что каждый указанный пик увеличения содержания АФП сопровождается снижением его концентрации. В целом, к концу эмбрионального развития просматривается закономерное снижение уровня АФП, который приближается к значениям, зарегистрированным на начальных этапах эксперимента.
Учитывая научный интерес к АФП, как к белку участвующему в процессах роста и развития, нами вычислено его процентное содержание от уровня общего белка в супернатанте гомогената куриных эмбрионов с 5-х по 20-е сутки инкубации (табл. 2).
Таблица 2
Содержание общего белка и доля в нем АФП в гомогенате куриных эмбрионов в процессе развития
| Сутки развития, n=20 | Общий белок, г/л | Доля АФП (%) |
| 5 | 6,7±0,05 | 0,3910-4 |
| 6 | 8,0±0,07* | 0,9310-4 |
| 7 | 8,8±0,07* | 0,2410-4 |
| 8 | 8,7±0,08 | 0,2110-4 |
| 9 | 15,1±0,22* | 0,0910-4 |
| 10 | 15,0±0,22 | 0,1610-4 |
| 11 | 22,0±0,26* | 0,2310-4 |
| 12 | 38,0±0,37* | 1,4110-4 |
| 13 | 56,4±0,33* | 0,2610-4 |
| 14 | 51,1±0,33* | 0,3210-4 |
| 15 | 45,0±0,38* | 0,7110-4 |
| 16 | 40,0±0,34* | 0,3810-4 |
| 17 | 40,3±0,33 | 0,1810-4 |
| 18 | 34,0±0,46* | 0,5010-4 |
| 19 | 38,0±0,41* | 0,0810-4 |
| 20 | 47,4±0,41* | 0,0410-4 |
*(P<0,05) – достоверная разница в сравнении с предыдущими сутками
n – количество проб гомогената 5-ти эмбрионов на каждые сутки исследования.
Установлено, что уровень общего белка не постоянен и изменяется в процессе развития. На 13-е сутки достигается его максимальная концентрация за весь период исследования, которая составила 56,4±0,33 г/л, что в 8,4 раза больше, чем на 5-е сутки инкубации.
Сопоставляя динамику общего белка и изменения содержания АФП, можно сделать заключение о том, что в целом она характеризуется общей тенденцией нарастания концентрации данных веществ до 18-х суток развития. При этом, вплоть до этих суток инкубации, оба показателя после достижения максимального пикового значения (12-е сутки для АФП и 13-е для общего белка), постепенно снижаются. После 18-х суток динамика АФП и общего белка противоположна. Интересно отметить, что пороговых изменений в динамике уровня общего белка меньше, и они менее выражены по сравнению с динамикой уровня АФП. Не всегда посуточный подъём или спад уровня общего белка совпадает с такой же динамикой уровня АФП.
Установлено, что доля АФП (%) в объёме общего белка в эмбриогенезе характеризуется пороговым характером, с чередованием пиков нарастания и снижения уровня данного показателя, совпадающими с таковыми в динамике абсолютных значений АФП в процессе развития. Максимальная доля альфа-фетопротеина (1,4110-4%) в объёме общего белка, также как и его абсолютное количество в эмбриогенезе, отмечено на 12-е сутки развития, а минимальное достигается на 20-е сутки (0,0410-4 %), что не совпадает с динамикой абсолютного показателя содержания АФП в супернатанте эмбрионального гомогената. В процессе эмбрионального развития наблюдаются периоды (5-6-е, 10-11-е, 11-12-е сутки), в которые концентрация общего белка возрастает параллельно с увеличением содержания альфа-фетопротеина, что в свою очередь может свидетельствовать о взаимосвязи динамики этих показателей и об активно идущих пролиферативных процессах в данное время.
По нашему мнению, эти данные могут служить основой выбора оптимальных сроков инкубации куриного эмбриона для дальнейшего его использования в качестве субстрата для разработки и производства белковых препаратов, содержащих альфа-фетопротеин.
Показатели физического развития куриных эмбрионов в онтогенезе
Нет сомнения в том, что установленную динамику и абсолютные значения АФП можно считать нормативными только в том случае, если они не сопровождаются отклонениями в развитии, наличие которых принято оценивать по ряду морфологических критериев. Кроме того, морфометрические показатели тела и отдельных органов, при сопоставлении с установленными нами количественными значениями АФП конкретного эмбриона, по нашему мнению, могут послужить важным дополнением для объяснения механизма изменчивости уровня АФП в онтогенезе. В свете этого возникает потребность в расширении для куриных эмбрионов перечня морфометрических показателей, позволяющих судить не только об интенсивности роста и развития, но и об их пропорциональности.
В связи с вышеизложенным, физическое развитие куриного эмбриона на разных этапах онтогенеза (начиная с 5-х суток инкубации), оценивали по комплексу критериев (масса тела и внутренних органов, длина тела и окружность грудной клетки, прирост массы, отношение массы органов к массе тела), рассчитывали различные индексы развития.
Установлено, что масса тела куриного эмбриона, начиная с 5-х суток развития, постепенно увеличивается, достигая на 20-е сутки максимального значения – 32,86±0,215 г. Несмотря на закономерное увеличение массы тела в процессе развития куриного эмбриона, интенсивность её посуточного прироста различна. С 5-х по 10-е сутки масса тела увеличивается с низкой интенсивностью. После 10-х суток интенсивность посуточного прироста массы тела увеличивается вплоть до 20-х суток инкубации.
Абсолютный прирост массы тела куриного эмбриона с 5-х по 20-е сутки развития увеличивается равномерно, за исключением периода с 17-х по 18-е сутки. Относительный прирост массы тела, напротив, на 5-е сутки достигает максимального значения, после чего снижается вплоть до 20-х. В динамике данного показателя можно отметить два существенных периода его уменьшения: с 6-х по 7-е и с 12-х по 13-е сутки эмбриогенеза.
Масса сердца, печени и лёгких, как и масса тела эмбриона, увеличивается в процессе развития (с 10-х по 20-е сутки).
Динамика массы сердца и лёгких на протяжении всего периода исследования примерно одинакова, но её абсолютные значения во все сроки исследования отличаются: масса лёгких всегда выше, чем масса сердца.
На всём протяжении исследования наибольшей абсолютной массой, среди органов, обладает печень. К концу эксперимента (20-е сутки) она достигает 0,743±0,0026 г, что в 26,5 раз больше, чем на 10-е сутки инкубации.
Динамика абсолютного и относительного прироста массы сердца, печени и лёгких отличается от динамики абсолютных значений массы данных органов. Абсолютный прирост массы печени характеризуется нарастающими колебаниями в процессе развития данного органа. Абсолютный прирост массы сердца и лёгких изменяется менее значительно по сравнению с абсолютным приростом массы печени. Относительный прирост массы печени и сердца в целом уменьшается с 10-х по 20-е сутки. Как и в динамике абсолютного прироста массы данных органов, межсуточные колебания относительного прироста массы печени наиболее выражены, чем для массы сердца.
Относительный прирост массы лёгких незакономерно изменяется в процессе развития куриного эмбриона. Так максимальное значение данного показателя отмечено в период с 12-х по 13-е сутки, а минимальное с16-х по 17-е. Динамика относительного прироста массы печени к массе тела имеет волнообразный характер. Минимальное значение данного показателя отмечено на 10-е сутки – 1,43±0,009%, максимальное приходится на 17-е – 2,50±0,009%.
Динамика относительной массы сердца и лёгких до 12-х суток противоположна, далее динамика исследуемых показателей изменяется примерно одинаково. Максимальное значение относительной массы органа к массе тела для серда отмечено на 14-е сутки (1,10±0,009%), для лёгких – на 10-е (1,38±0,007%), минимального значения данный показатель для сердца достигает на 20-е сутки (0,65±0,008%), для лёгких – на 19-е (1,01±0,008%).
Линейные размеры тела куриного эмбриона, так же как и показатели абсолютной массы тела и органов, постепенно увеличиваются в процессе развития. Длина тела КЭ на 5-е сутки равна 1,4±0,02 см, а к 20-м достигла значения 8,5±0,04 см.
Обхват грудной клетки исследовался, начиная с 7-х суток инкубации, на которые составил 2,1±0,03 см, а к 20-м увеличился до значения 7,1±0,03 см.
Наибольшим показателем отношения массы органа к массе тела обладает печень. Динамика данного показателя печени характеризуется чередованием пиков увеличения и уменьшения. Максимальное значение достигнуто на 17-е сутки – 2,50±0,009%, минимальное на 10-е – 1,43±0,009%.
Динамика отношения массы сердца и лёгких к массе тела характеризуется менее выраженными колебаниями, чем динамика этого критерия для печени.
Максимальное значение отношения массы лёгких к массе тела отмечено на 10-е сутки, оно составило 1,38±0,007%, а минимальное значение, достигнуто на 17-й день инкубации и составило 1,03±0,008%.
В динамике исследуемого показателя для сердца максимальное значение отмечено на 14-е сутки (1,10±0,009%), а минимальное на 20-е (0,65±0,008%).
В целом за весь период исследования отношение массы печени к массе тела достоверно увеличивается с 10-х по 20-е сутки. Напротив, отношение массы лёгких, а также массы сердца к массе тела, с 10-х по 20-е сутки достоверно уменьшается.
Установленная динамика, а также абсолютные и относительные значения массы, линейных размеров тела и жизненно важных органов (печень, сердце и лёгкие), посуточный прирост массы на протяжении онтогенеза, принципиально не противоречат данным, полученным многими другими авторами (Задарновская Г.Ф., 1966; Шмальгаузен И.И., 1984; Долгорукова А.М., 2007; Трунова А.П., 2008; Голубцова В.А., 2008; Беличенко В.М., Шошенко К.А., Кислякова Л.П. и др., 2010; и др.), что позволяет считать нормативными и представленные выше значения уровня АФП.
Различные сутки развития куриного эмбриона характеризуются конкретными числовыми значениями индексов физического развития (табл. 3).
Индекс Кетле I с 5-х по 20-е сутки закономерно увеличивается, соответственно минимальное значение индекса приходится на 5-е сутки (0,152±0,001), а максимальное на 20-е (3,866±0,009). Индекс «степени», в отличие от индекса Кетле I, с 7-х по 20-е сутки закономерно снижается, максимальное значение приходится на 7-е сутки (0,687±0,006), а минимальное на 20-е (0,117±0,001).
Анализ индексов Кетле II, Борнгардта I и Ливи, не выявил закономерностей их посуточной динамики. Так индекс Кетле II с 5-х по 6-е, с 9-х по 10-е, с 11-х по 12-е и с 15-х по 16-е сутки снижается, в остальные периоды возрастает. Индекс Борнгардта I снижается с 11-х по 12-е и с 15-х по 16-е сутки, в остальные периоды отмечается его посуточный рост. Индекс Ливи с 11-х по 12-е и с 15-х по 16-е сутки снижается, а между всеми остальными сутками инкубации возрастет. Однако, в целом, к 20-м суткам инкубации по сравнению с началом исследования, значения этих трех индексов достоверно увеличиваются. Максимальные значения для индексов Кетле II (0,455±0,006), Борнгардта I (0,544±0,003) и Ливи (0,180±0,005) приходятся на 20-е сутки, а минимальные для индексов Борнгардта I (0,119±0,001) и Ливи (0,039±0,001) на 7-е, а индекса Кетле II (0,109±0,001) на 5-е сутки инкубации.
Индекс Эрисмана, характеризующий пропорциональность развития грудной клетки, с 7-х по 20-е сутки увеличивается.
Достоверных различий, при посуточном сравнении ИГМР (индекса гармоничного морфологического развития) обнаружить не удалось, за исключением периодов с 8-х по 9-е и с 9-х по 10-е сутки.
В целом показатель индекса Рорера с 5-х по 20-е сутки уменьшается с 7,762±0,05 до 5,351±0,04, несмотря на то, что максимальное значение индекса приходится на 9-е (8,262±0,06), а минимальное на 16-е сутки (3,976±0,02).
Таблица 3
Показатели индексов физического развития куриного эмбриона
| Сутки развития (n=100) | Кетле I | Кетле II | Ливи | Рорера | Борнгардта I | ИГМР | Эрисмана | Индекс «степени» |
| 5 | 0,152±0,001 | 0,109±0,001 | - | 7,762±0,05 | - | - | - | - |
| 6 | 0,186±0,001* | 0,098±0,001* | - | 5,146±0,04* | - | - | - | - |
| 7 | 0,251±0,002* | 0,114±0,001* | 0,039±0,001 | 5,184±0,04* | 0,119±0,001 | 104,76±0,6 | 1,01±0,017 | 0,687±0,006 |
| 8 | 0,368±0,002* | 0,160±0,002* | 0,053±0,001* | 6,953±0,05* | 0,160±0,001* | 104,54±0,6 | 1,15±0,016* | 0,576±0,005* |
| 9 | 0,516±0,003* | 0,206±0,001* | 0,059±0,001* | 8,262±0,06* | 0,178±0,001* | 97,961±0,5* | 1,65±0,018* | 0,486±0,005* |
| 10 | 0,611±0,005* | 0,191±0,002* | 0,065±0,002* | 5,963±0,04* | 0,197±0,001* | 103,12±0,6* | 1,50±0,017* | 0,457±0,004* |
| 11 | 0,841±0,005* | 0,240±0,003* | 0,084±0,003* | 6,867±0,05* | 0,255±0,001* | 103,03±0,7 | 1,55±0,017* | 0,381±0,004* |
| 12 | 0,961±0,007* | 0,209±0,002* | 0,081±0,003* | 4,543±0,02* | 0,246±0,001* | 100,38±0,6 | 1,60±0,018* | 0,361±0,004* |
| 13 | 1,182±0,007* | 0,223±0,003* | 0,095±0,003* | 4,207±0,02* | 0,288±0,001* | 100,64±0,5 | 1,45±0,016* | 0,319±0,003* |
| 14 | 1,498±0,008* | 0,263±0,002* | 0,118±0,003* | 4,610±0,02* | 0,357±0,002* | 99,023±0,4 | 1,35±0,015* | 0,270±0,003* |
| 15 | 1,850±0,007* | 0,298±0,002* | 0,142±0,004* | 4,813±0,02* | 0,430±0,002* | 99,171±0,3 | 1,20±0,017* | 0,228±0,003* |
| 16 | 2,061±0,008* | 0,286±0,002* | 0,133±0,004* | 3,976±0,02* | 0,404±0,002* | 99,442±0,4 | 1,50±0,017* | 0,207±0,002* |
| 17 | 2,495±0,009* | 0,333±0,003* | 0,135±0,004* | 4,435±0,02* | 0,409±0,002* | 99,982±0,3 | 2,35±0,019* | 0,172±0,002* |
| 18 | 2,932±0,008* | 0,376±0,003* | 0,149±0,005* | 4,819±0,02* | 0,451±0,003* | 99,280±0,4 | 2,60±0,019* | 0,149±0,002* |
| 19 | 3,401±0,009* | 0,420±0,005* | 0,167±0,005* | 5,182±0,04* | 0,507±0,003* | 99,589±0,5 | 2,65±0,019* | 0,131±0,001* |
| 20 | 3,866±0,009* | 0,455±0,006* | 0,180±0,005* | 5,351±0,04* | 0,544±0,003* | 99,379±0,3 | 2,85±0,021* | 0,117±0,001* |
*(P<0,05) – достоверная разница в сравнении с предыдущими сутками.
n – количество эмбрионов на каждые сутки исследования.
Корреляционная зависимость между уровнем альфа-фетопротеина,
общего белка в гомогенате куриного эмбриона и его морфометрическими показателями
Акцентируя внимание на регуляторной роли АФП в пренатальном онтогенезе, сочли необходимым провести коррелятивные параллели его уровня с содержанием общего белка на разных этапах онтогенеза, а также с динамикой массы, длины тела и массы внутренних органов, поскольку именно эти критерии являются интегрированным отражением реализации всех регуляторных механизмов и эффекторных структурных преобразований в эмбриональном развитии (табл. 4).
Таблица 4
Корреляции уровня АФП и морфофункциональных показателей куриных эмбрионов в онтогенезе
| Сутки | Масса тела | Длина тела | Масса лёгких | Масса печени | Масса сердца | Общий белок |
| 5 | 0,645 | 0,501 | не исследовали | не исследовали | не исследовали | 0,738 |
| 6 | 0,571 | 0,439 | не исследовали | не исследовали | не исследовали | 0,602 |
| 7 | 0,351 | 0,350 | не исследовали | не исследовали | не исследовали | 0,240 |
| 8 | 0,379 | 0,363 | не исследовали | не исследовали | не исследовали | 0,124 |
| 9 | 0,403 | 0,378 | не исследовали | не исследовали | не исследовали | 0,223 |
| 10 | 0,444 | 0,409 | 0,448 | 0,864 | 0,502 | 0,315 |
| 11 | 0,563 | 0,453 | 0,406 | 0,780 | 0,406 | 0,459 |
| 12 | 0,739 | 0,486 | 0,541 | 0,943 | 0,672 | 0,660 |
| 13 | 0,644 | 0,361 | 0,364 | 0,851 | 0,444 | 0,250 |
| 14 | 0,396 | 0,315 | 0,271 | 0,783 | 0,311 | 0,339 |
| 15 | 0,336 | 0,287 | 0,227 | 0,755 | 0,124 | 0,278 |
| 16 | 0,232 | 0,266 | 0,184 | 0,746 | 0,114 | 0,254 |
| 17 | 0,261 | 0,105 | 0,114 | 0,732 | 0,084 | 0,229 |
| 18 | 0,113 | 0,078 | 0,036 | 0,669 | 0,079 | 0,154 |
| 19 | 0,089 | 0,053 | 0,015 | 0,565 | 0,026 | 0,110 |
| 20 | 0,078 | 0,051 | 0,014 | 0,439 | 0,024 | 0,090 |
Установлено, что уровень АФП и общего белка в гомогенате на протяжении всего эксперимента зависят друг от друга. На 5-е сутки наблюдается максимальная корреляция (0,738 – тесная). На 6-е сутки она составляет 0,602 (выраженная), а к 7-м суткам снижение продолжается. С 8-х по 12-е сутки она увеличивается вновь, достигая значения выраженной (0,660). Начиная с 12-х суток, коэффициент корреляции АФП и общего белка в целом снижается, соответствуя слабой корреляции, достигая к концу развития минимального значения, свидетельствующего об исчезновении коррелятивных связей. Исключение составляют 14-е сутки, на которые отмечена заметная корреляция.
Коэффициент корреляции между уровнем АФП и показателями массы и длины тела изменяется примерно одинаково. Динамика показателя незакономерно изменчива от одних суток к другим, однако, к концу развития коэффициент корреляции снижается и соответствует слабой взаимосвязи.
Слабая коррелятивная зависимость АФП с массой тела отмечается с 16-х, а с длиной – с 15-х суток. Максимальный коэффициент корреляции с массой тела отмечен на 12-е сутки (тесная). На 5-е, 6-е, 11-е и 13-е сутки отмечена выраженная корреляция. После достижения 12-х суток развития коэффициент корреляции между АФП и массой тела снижается.
Коэффициент корреляции уровня АФП с длиной тела, в целом, снижается с 5-х по 20-е сутки. Максимальное значение корреляции отмечено на 5-е сутки.
Коэффициент корреляции АФП с массой печени наиболее высокий по сравнению с другими органами, на всём протяжении инкубации. Максимальная корреляция отмечена на 12-е сутки (функциональная), после которых коэффициент корреляции снижается, достигая минимального значения на 20-е сутки (заметная). Максимальная корреляция уровня АФП с массой лёгких и сердца отмечена на 12-е сутки (0,541 и 0,672 соответственно), после чего коэффициент корреляции уровня АФП с массой обоих органов снижается.
Таким образом, для всех исследуемых показателей после 12-х суток развития эмбриона, характерно постепенное снижение степени корреляционной зависимости с уровнем АФП. Для показателей массы и длины тела, а также уровня общего белка на 5-е сутки характерен высокий коэффициент. Минимальная корреляция для всех изучаемых показателей отмечена на 20-е сутки.
Содержание некоторых минеральных элементов
в курином эмбрионе в процессе развития
Исследовано содержание железа, цинка, меди, марганца, кобальта, селена, хрома, натрия, калия, кальция и магния в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития. Таких элементов, как селен, кобальт и хром в отдельные периоды онтогенеза куриного эмбриона выявить не удалось. Остальные исследуемые минералы присутствовали на протяжении всего периода инкубации.
Динамика меди заключается в постепенном нарастании содержания в гомогенате, вплоть до 12-х суток включительно, на которые её концентрация достигла максимума (0,192±0,0015 мкг/г). Далее происходило постепенное снижение количества данного элемента в гомогенате. Минимальное количество меди зафиксировано на 5-е сутки – 0,012±0,0003 мкг/г.
Кобальт и хром с 5-х по 15-е сутки обнаружить не удалось. На 16-е, 18-е и 19-е сутки были зафиксированы следовые значения кобальта. Следовые значения хрома зафиксированы на 16-е и 17-е сутки. На 17-е и 20-е сутки содержание кобальта составило 0,014±0,0003 мкг/г и 0,013±0,0003 мкг/г соответственно. Содержание хрома с 18-х на 19-е сутки достоверно увеличилось на 0,005 мкг/г, а на 20-е сутки оно составило 0,017±0,0003 мкг/г.
Следовые количества селена отмечены лишь на 11-е сутки. Максимальное количество селена, отмеченное на 14-е и 20-е сутки, одинаково и составило 0,018±0,0003 мкг/г. Минимальное значение также отмечено дважды: на 12-е (0,011±0,0003 мкг/г) и 16-е (0,011±0,0002 мкг/г) сутки.
Натрий, калий, кальций и магний (рис. 1) присутствуют в эмбриональном гомогенате кур на протяжении всего периода исследования. Их динамика не постоянна и имеет волнообразный характер.
Рис. 1. Динамика натрия, калия, кальция и магния
в эмбриональном гомогенате.
Наиболее высоко содержание калия. На 5-е и 6-е сутки оно составило 0,82±0,008 и 0,81±0,009 мг/г. На 7-е сутки количество элемента снизилось на 0,12 мг/г, а на 8-е достигло значения 6-х суток. На 10-е сутки отмечено снижение содержания металла на 0,20 мг/г. С 10-х суток содержание калия начинает нарастать, достигая на 13-е сутки 0,99±0,009 мг/г. С 13-х суток содержание элемента снижается, достигая к 14-м суткам 0,86±0,008 мг/г. Снижение продолжается до 15-х суток. Затем количество калия начинает достоверно увеличиваться, достигая на 17-е сутки максимального содержания– 1,11±0,008 мг/г. Далее количество элемента снижается, вплоть до 20-х суток включительно, практически до первоначального значения, зафиксированного на 5-е сутки.
В динамике кальция можно отметить четыре пика увеличения его содержания – на 6-е, 14-е, 17-е и 20-е сутки. Максимальное значение данного элемента отмечено на 17-е сутки – 0,84±0,007 мг/г, минимальное на 8-е (0,02±0,001 мг/г) и 10-е (0,02±0,001). Максимальное суточное увеличение уровня кальция приходится на период между 16-ми и 17-ми сутками – 0,63 мг/г, второе по значимости в промежутке между 5-ми и 6-ми – 0,47 мг/г. Между 13-ми и 14-ми, 19-ми и 20-ми сутками повышение его уровня менее значимо, и составило 0,15 мг/г и 0,07 мг/г соответственно. Максимальное суточное снижение содержания кальция отмечено в периоде между 6-ми и 7-ми сутками – на 0,51 мг/г, второе по значимости между 17-ми и 18-ми сутками – на 0,43 мг/г.
Динамика натрия и магния выглядит более ровной, чем калия и кальция. Максимальное содержание натрия отмечено на 5-е сутки, и составило 0,61±0,006 мг/г, а минимальное на 10-е – 0,31±0,008 мг/г.
Наибольшее среднесуточное снижение содержания натрия отмечено между 5-ми и 6-ми сутками и составило 0,25 мг/г. На 10-е сутки содержание натрия снова снижается, достигая минимального значения 0,31±0,008 мг/г. С 10-х по 11-е сутки его концентрация возрастает, достигая значения 0,41±0,009 мг/г. Далее с 11-х по 12-е сутки следует снижение концентрации на 0,06 мг/г, а с 12-х по 13-е происходит её нарастание на 0,07 мг/г. С 13-го по 15-й дни инкубации содержание натрия снижается, между 13-ми и 14-ми сутками на 0,05 мг/г, а между 14-ми и 15-ми – на 0,06 мг/г. Следующее увеличение содержания натрия наблюдается на 17-е сутки, после чего, на 18-е, количество элемента снижается на 0,06 мг/г, достигая значения 0,31±0,008 мг/г. В целом, с 6-х по 20-е сутки включительно, отмечается тенденция посуточного чередования увеличения и снижения содержания натрия в эмбриональном гомогенате.
Содержание магния в эмбриональном гомогенате колеблется от 0,04±0,003 мг/г до 0,11±0,005 мг/г. Максимальное значение достигается на 5-е – 0,11±0,005 мг/г и 18-е – 0,11±0,005 мг/г, а минимальное на 10-е сутки – 0,04±0,003 мг/г. С 5-х по 6-е сутки содержание магния снижается с 0,11±0,005 мг/г до 0,07±0,004 мг/г (на 0,04 мг/г). Далее, незначительно колеблясь, содержание элемента остаётся примерно на одном уровне до 17-х суток. В период между 17-ми и 18-ми сутками наблюдается увеличение содержания элемента на 0,04 мг/г, а между 18-ми и 19-ми сутками инкубации содержание магния снова падает, достигая значения 0,08±0,004 мг/г.
Содержание марганца с 5-х по 20-е сутки увеличивается. Исключение составляют два периода, между 8-ми и 9-ми, а также 13-ми и 14-ми сутками инкубации, в которые происходит достоверное снижение концентрации элемента. Минимальное значение отмечено на 5-е сутки – 0,7±0,03 мкг/г, максимальное на 20-е – 7,5±0,06 мкг/г. Между 11-ми и 12-ми сутками наблюдается максимальный прирост концентрации марганца, равный 1,2 мкг/г. Минимальное суточное увеличение концентрации (на 0,2 мкг/г) отмечено дважды, между 5-ми и 6-ми, и 7-ми и 8-ми суткам (рис. 2).
В отличие от динамики марганца содержание железа и цинка с 5-х по 20-е сутки неоднократно ступенчато изменяется (рис. 2).
Содержание цинка с 5-х по 7-е сутки увеличивается на 6,92 мкг/г. С 7-х суток содержание цинка снижается на 3,32 мкг/г, достигая на 8-е сутки 4,81±0,08 мкг/г. Максимальное повышение содержания цинка отмечено между 13-ми и 14-ми сутками – 6,28 мкг/г. Начиная с 14-х суток его содержание снова снижается. Такая тенденция сохраняется до 17-х суток включительно, после которых отмечается увеличение концентрации этого металла. С 17-х на 18-е сутки прирост его уровня составил 0,86 мкг/г, а с 18-х на 19-е – 2,48 мкг/г. С 19-х по 20-е сутки его содержание снижается на 0,8 мкг/г, достигая значения 11,4±0,09 мкг/г.
Рис. 2. Динамика содержания железа, цинка и марганца
в эмбриональном гомогенате.
Максимальный уровень содержания железа отмечен на 19-е сутки, минимальный – на 13-е. Причём с 7-х по 13-е сутки наблюдается неоднократное снижение концентрации железа, даже по сравнению с содержанием этого металла на 5-е сутки эмбриогенеза, чередующееся с выраженным подъёмом его концентрации. Между 18-ми и 19-ми сутками наблюдалось максимальное увеличение содержания металла, равное 4,5 мкг/г. Минимальное суточное увеличение уровня железа отмечено между 17-ми и 18-ми сутками – 0,55 мкг/г. Максимальное суточное снижение содержания элемента зафиксировано в период между 12-ми и 13-ми сутками – 5,62 мкг/г. В целом в эмбриогенезе, содержание железа в эмбриональном гомогенате возрастает.
Таким образом, все исследуемые элементы присутствуют в курином эмбрионе на разных этапах эмбрионального развития, их содержание не постоянно и характеризуется различными по времени и по амплитуде колебаниями концентрации, что вероятно связано с различной интенсивностью химических процессов, происходящих в организме.
ВЫВОДЫ
1. АФП присутствует на всех этапах развития куриного эмбриона с 5-х по 20-е сутки. Динамика содержания АФП в супернатанте гомогената эмбриона волнообразна и характеризуется повышением вплоть до 12-х суток, с последующим снижением к концу инкубации практически до исходного уровня. Выявлено четыре пика повышения уровня АФП. Максимальное абсолютное значение АФП (42,8±0,286 МЕ/мл) в эмбриогенезе отмечено на 12-е сутки, а минимальное (1,12±0,004 МЕ/мл) – на 9-е сутки.
2. С 5-х по 20-е сутки эмбриогенеза кур содержание АФП с разной степенью положительной корреляции связано с уровнем общего белка в супернатанте эмбрионального гомогената. До 14-х суток коэффициент корреляции колеблется, после чего закономерно снижается. Максимальный коэффициент корреляции отмечен на 5-е, а минимальный – на 20-е сутки развития. Максимальное (1,4110-4 %) содержание АФП в составе общего белка отмечено на 12-е, а минимальное (0,0410-4 %) – на 20-е сутки эмбриогенеза.
3. Для куриного эмбриона на каждые сутки инкубации характерны различные абсолютные значения восьми индексов физического развития, использование которых в комплексе с показателями массы тела и органов и линейными размерами тела, позволяет характеризовать рост и развитие как целостный пространственно организованный процесс, направленный на достижение видоспецифической формы. Индекс Кетле I закономерно посуточно возрастает, а индекс «степени» закономерно – снижается. Индексы Кетле II, Ливи, Борргната I и Эрисмана в целом в онтогенезе увеличиваются, а индекс Рорера снижается, однако закономерности их посуточной динамики не отмечено. Индекс гармоничного морфологического развития в онтогенезе меняется незначительно.
4. Коррелятивная зависимость уровня АФП с массой и длиной тела куриного эмбриона наиболее четко выражена с 5-х по 12-е сутки онтогенеза. Максимальный коэффициент корреляции с массой тела отмечен на 12-е сутки (0,739 – тесная), а с длиной тела – на 5-е сутки (0,501 – выраженная). Начиная с 12-х суток, коэффициент корреляции АФП с обоими показателями закономерно снижается, достигая к 20-м суткам развития минимальных значений, свидетельствующих о слабой взаимосвязи. Слабая коррелятивная зависимость АФП с массой тела отмечается уже с 16-х, а с длиной – с 15-х суток.
5. С 10-х по 20-е сутки развития уровень АФП в гомогенате куриного эмбриона коррелятивно взаимосвязан с массой печени, сердца и лёгких. В течение всего этого периода коэффициент корреляции АФП с массой печени наиболее высок по сравнению с другими органами. Для всех исследуемых органов после 12-х суток развития характерно постепенное снижение степени корреляционной зависимости массы с уровнем АФП, однако степень коррелятивной взаимосвязи с массой печени вплоть до 20-х суток остаётся высокой (0,439 – заметная). На 12-е сутки развития с массой печени отмечена функциональная корреляция (0,943), а с массой лёгких и сердца – выраженная (0,541 и 0,672 соответственно).
6. В гомогенате куриного эмбриона с 5-х по 20-е сутки развития обнаружены натрий, калий, кальций, магний, железо, цинк, марганец и медь. Селен выявлен с 11-х, а хром и кобальт – с 18-х суток развития. Содержание всех минеральных элементов на протяжении онтогенеза изменчиво, посуточная динамика не закономерна и характеризуется различными по времени и по амплитуде колебаниями концентрации.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Полученные результаты могут быть использованы в качестве дополнительной информации при составлении учебно-методических материалов по биологии развития, гистологии, эмбриологии.
2. Результаты исследования могут быть учтены в научной и практической деятельности биологов широкого профиля в качестве дополнительных критериев, характеризующих эмбриогенез кур, а также в практике специалистов ветеринарной медицины и сельского хозяйства при антенатальном прогнозировании здоровья и качества птицы, оптимизации процесса инкубации, определении путей регуляции роста и развития куриных эмбрионов.
3. Сведения о содержании АФП в гомогенате куриного эмбриона, его динамике, взаимосвязях с уровнем белка, а также данные о динамике минеральных элементов в отдельные периоды эмбриогенеза, расширяют сырьевые возможности эмбрионально-яичной массы и могут использоваться биотехнологами при разработке белковых, в том числе АФП-содержащих и содержащих минеральные элементы биологически активных препаратов. Двенадцатые сутки развития куриного эмбриона рекомендуются в качестве оптимального срока для использования эмбрионального гомогената в биотехнологических целях при получении АФП-содержащих субстанций.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Тимченко, Л.Д. Содержание альфа-фетопротеина (АФП) в эмбрионах кур на ранних стадиях эмбриогенеза / Л.Д. Тимченко, А.П. Трунова, В.Н. Стрекалова, С.В. Черников // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: мат-лы научной конференции / СГУ. – Ставрополь, 2007. – С. 245-246.
- Тимченко, Л.Д. Взаимосвязь массы печени с содержанием альфа-фетопротеина в крови куриных эмбрионов в процессе развития / Л.Д. Тимченко, А.П. Трунова, С.В. Черников, В.Н. Стрекалова, Р.В. Горбовский // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: мат-лы 53-й научно-метод. конф. «Университетская наука – региону». – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2008. – С. 182-184.
- Тимченко, Л.Д. Содержание альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона и его взаимосвязь с морфометрическими показателями роста и развития организма / Л.Д. Тимченко, А.П. Пономаренко, С.В. Черников // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». – 2009. – № 3. – С. 70-73.
- Черников, С.В. Динамика калия и натрия в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / С.В. Черников // Пятая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: тезисы докладов. – Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 2009. – С. 43-44.
- Черников, С.В. Содержание кальция и магния в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / С.В. Черников, А.П. Пономаренко, С.С. Аванесян // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: мат-лы 54-й научно-метод. конф. «Университетская наука – региону». – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2009. – С. 79-82.
- Черников, С.В. Содержание АФП в гомогенате куриного эмбриона в процессе развития / С.В. Черников // Сборник трудов молодых учёных: мат-лы 54-й науч.-метод. конф. «Университетская наука – региону». – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2009. – С. 165-167.
- Тимченко, Л.Д. Взаимосвязь уровня альфа-фетопротеина и апоптоза в процессе развития куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, С.В. Черников, Г.Н. Блажнова // Аграрная Россия. Научно-производственный журнал. – 2010. – № 5. – С. 53-54.
- Тимченко, Л.Д. Показатели физического развития куриного эмбриона / Л.Д. Тимченко, Д.А. Арешидзе, С.В. Черников, Г.Н. Блажнова // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». – 2011. – №. 3. – С. 98-101.
- Тимченко, Л.Д. Динамика уровня общего белка в гомогенате куриного зародыша в процессе развития / Л.Д. Тимченко, С.В. Черников, Г.Н. Блажнова // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: мат-лы научной конференции / СГУ. – Ставрополь, 2011. – С. 148-151.
- Черников, С.В. Использование иммуноферментного метода для определения уровня альфа-фетопротеина в гомогенате куриного эмбриона / С.В. Черников // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: мат-лы 56-й научно-метод. конф. – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011. – С. 181-185.
- Черников, С.В. Содержание железа и цинка в гомогенате куриного эмбриона / С.В. Черников // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: мат-лы 56-й научно-метод. конф. – Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011. – С. 186-188.
- Черников, С.В. Содержание марганца, селена, хрома и кобальта в гомогенате куриных эмбрионов в процессе развития / С.В. Черников // Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК: мат-лы междунар. научно-практ. конф. – Нальчик, 2011. – С. 147-149.
