Содержание растворимых маркеров воспаления и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови после стентирования коронарных артерий
На правах рукописи
ПОТЕХИНА АЛЕКСАНДРА ВИКТОРОВНА
СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМЫХ МАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ И СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПОСЛЕ СТЕНТИРОВАНИЯ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ
14.01.05 – Кардиология
03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в отделе хронической ишемической болезни сердца НИИ клинической кардиологии им. А. Л. Мясникова и лаборатории клеточной иммунологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ.
Научные руководители:
Академик РАН, РАМН Чазов Евгений Иванович
Кандидат биологических наук Арефьева Татьяна Игоревна
Официальные оппоненты:
Академик РАМН,
доктор медицинских наук,
профессор Мартынов Анатолий Иванович
Доктор медицинских наук,
профессор Мазуров Алексей Владимирович
Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет МЗ и СР РФ
Защита состоится 2011 года в 1330 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д.15а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.
Автореферат разослан 2011 года
Ученый секретарь
диссертационного совета, к.м.н. Т.Ю.Полевая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В последние десятилетия для лечения больных ИБС широко применяются чрескожные коронарные вмешательства (ЧКВ), прежде всего, стентирование коронарных артерий. Имплантация стента в суженный участок коронарной артерии позволяет эффективно расширить просвет сосуда, но в ответ на наносимую сосуду травму в стентированном участке возникает воспалительная реакция, сопровождающаяся формированием неоинтимы. Одним из ключевых участников этого процесса является моноцитарный хемотаксический белок (МСР-1), стимулирующий миграцию моноцитов в сосудистую стенку. В экспериментальных и клинических исследованиях показано участие МСР-1 в развитии и поддержании воспаления при атерогенезе и формировании неоинтимы после повреждения сосудистой стенки [Furukawa Y. et al., 1999, Sako H., Miura S, Iwata A et al 2008]. Системным проявлением локальной воспалительной реакции является повышение содержания в крови белков острой фазы воспаления и некоторых цитокинов в ранние сроки после ЧКВ. Высокие уровни С-реактивного белка (СРБ) и МСР-1 до, а также выраженность повышения СРБ после ЧКВ являются факторами риска развития сердечно-сосудистых осложнений [Iijima R. et al., 2009; Park D.W.et al., 2009; Saleh N., Svane B., Hansson L. et al., 2005]. В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, в частности, антагонистов МСР-1, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов [Lutgens E. et al., 2005; Egashira K. еt al., 2007; Liehn E.A. et al., 2010; Kaji M. et al., 2001 и др]. В ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ был разработан, синтезирован и протестирован в различных моделях воспаления у животных препарат пептидной природы, получивший название "Инграмон". Действующую основу препарата составляет додекапептид, являющийся фрагментом С-концевого домена структуры МСР-1. Инграмон препятствует развитию воспалительной реакции у грызунов и приматов, ингибируя миграцию лейкоцитов in vitro [Chazov E.I. et al., 2007; Красникова Т.Л. и др., 2010]. Представляет интерес изучение влияния терапии препаратом Инграмон на уровни маркеров воспаления, имеющих отрицательную прогностическую значимость при ИБС и ЧКВ, в крови больных, перенесших коронарное стентирование (КС).
До настоящего времени не изучено влияние имплантации в коронарную артерию стентов, в том числе стентов с лекарственным покрытием, на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови. Использование коронарных стентов с антипролиферативными покрытиями широко распространено в мировой и отечественной интервенционной кардиологии. Одним из наиболее эффективных в плане профилактики формирования рестеноза является покрытие рапамицином (сиролимусом) [Juwana B. et al., 2010] - антипролиферативным агентом, который приводит к изменениям в субпопуляционном составе лимфоцитов в культуре [Battaglia M, et al., 2006] и при терапии per os [Monti P. et al., 2008]. Изучение динамики субпопуляционного состава лимфоцитов после стентирования коронарных артерий представляется актуальным, т.к. позволяет более широко взглянуть на реакцию сосудистой стенки в ответ на имплантацию стента.
Целью работы явилось изучение динамики ряда маркеров воспаления (С-реактивного белка, фибриногена, хемотаксических цитокинов, растворимого рецептора ИЛ-2) и субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови у больных со стабильной стенокардией напряжения после стентирования коронарных артерий.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ динамики концентраций С-реактивного белка, определенного высокочувствительным методом (вчСРБ), фибриногена, хемотаксических цитокинов (MCP-1, ИЛ-8, MIG, IP-10) у больных стабильной стенокардией напряжения до и после стентирования коронарных артерий.
2. Изучить влияние нового противовоспалительного препарата пептидной природы Инграмон на уровни маркеров воспаления в периферической крови у больных со стабильной стенокардией напряжения после стентирования коронарных артерий.
3. Исследовать динамику субпопуляционного состава лимфоцитов (Т-, В- лимфоцитов, естественных киллеров, активированных эффекторных и регуляторных Т-клеток), а также содержания растворимого рецептора ИЛ-2 в крови у больных со стабильной стенокардией напряжения до и после проведения коронарного стентирования.
Научная новизна. Проведено подробное исследование динамики содержания белков острой фазы воспаления вчСРБ и фибриногена, а также хемотаксических цитокинов МСР-1, ИЛ-8, IP-10, и MIG в крови больных стабильной стенокардией напряжения после проведения коронарного стентирования.
Изучено влияние нового противовоспалительного препарата пептидной природы Инграмона на уровни маркеров воспаления в крови у больных стабильной стенокардией при проведении коронарного стентирования. Впервые продемонстрирован противовоспалительный эффект препарата Инграмон у больных стабильной ИБС после КС. На фоне терапии Инграмоном выявлено менее выраженное повышение содержания в крови больных вчСРБ и фибриногена, а также снижение концентрации МСР-1 в ранние сроки после коронарного стентирования, которые являются факторами риска развития осложнений после КС.
Установлено, что имплантация рапамицин-покрытых стентов (РПС) больным со стабильной стенокардией напряжения влияет на субпопуляционный состав лимфоцитов и уровень растворимого рецептора ИЛ-2 (sSD25) в периферической крови: Впервые показано накопление регуляторных Т-лимфоцитов и sCD25 в крови больных после имплантации РПС.
Практическая значимость. Результаты данной работы позволяют расширить представления об иммунном статусе больных ИБС после коронарного стентирования, а также о факторах, отражающих течение локальной воспалительной реакции в коронарной артерии в ответ на повреждение, вызванное ангиопластикой со стентированием. Снижение на фоне терапии Инграмоном в крови больных стабильной стенокардией, перенесших коронарное стентирование, концентрации некоторых маркеров воспаления (СРБ и МСР-1), являющихся факторами риска сердечно-сосудистых осложнений, позволяет рекомендовать Инграмон для дальнейших клинических испытаний с целью оценки влияния на клинический прогноз у больных ИБС после ЧКВ. Данные о возрастании уровня регуляторных Т-лимфоцитов в крови больных после имплантации РПС способствует перспективным исследованиям роли этой клеточной субпопуляции в течении и прогнозе заболевания.
Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в клиническую и научную практику отдела хронической ИБС Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.
Апробация диссертационной работы состоялась 7 апреля 2011 года на межинститутской конференции НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова и НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.
Публикации и сообщения по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 5 статей, 3 тезисов. Статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК. Основные положения диссертации были изложены на следующих международных конгрессах: «8th International Congress on Coronary Artery Disease», Октябрь 2009 11-14 (г. Прага, Чехия); 20th European Meeting on Hypertension. Июнь 18 - 21, 2010 (г. Осло, Норвегия); ESC Congress 2010, Август-Сентябрь 28 – 01, 2010 (г. Стокгольм, Швеция).
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего в себя 202 источника. Диссертация изложена на 97 стр., содержит 14 таблиц и 5 рисунков.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование. В исследование были включены 67 больных ИБС со стенозирующим коронарным атеросклерозом, стабильной стенокардией II-III ф.к., отобранные для проведения ангиопластики коронарных артерий с имплантацией 1-2 стентов. Из них группу КС на фоне терапии Инграмоном составили 33 пациента, подписавших информированное согласие на участие в исследовании по применению препарата Инграмон. Пациентам проводилось 6-ти кратное внутривенное введение препарата, 35 мкг/кг массы тела, в физиологическом растворе в объеме 5 мл. Введения выполнялись по следующей схеме: перед проведением КС, через 6 часов, далее 2 инъекции с интервалом 24 часа и 2 инъекции с интервалом 48 часов. Группу КС на фоне стандартной терапии составили 34 пациента, которым до и после КС проводилось только стандартное лечение. Для изучения связи между пункцией магистральной артерии и содержанием в крови воспалительных маркеров была дополнительно обследована группа больных (20 человек), которым выполнялась только коронароангиография (КАГ) без эндоваскулярных вмешательств. Основные клинические и ангиографические характеристики групп представлены в таблицах 1 и 2.
Критериями исключения являлись крупноочаговый инфаркт миокарда, операция коронарного шунтирования или ЧКВ менее чем за 6 месяцев до включения в исследование; острый коронарный синдром; наличие пороков сердца, неконтролируемой артериальной гипертензии, жизнеугрожающих нарушений ритма сердца, хронической почечной или печеночной недостаточности, злокачественных новообразований, системных заболеваний и других тяжелых сопутствующих заболеваний, самостоятельно влияющих на прогноз; сахарный диабет в фазе декомпенсации или требующий терапии инсулином; анемия (гемоглобин < 10 г/дл); ОНМК или черепно-мозговая травма в предшествующие 12 месяцев; острые воспалительные или инфекционные заболевания в предшествующие 2 месяца.
Таблица 1. Клиническая характеристика групп больных
| Пациенты (n 87) | |||
| КС + Инграмон | КС стандартное лечение | КАГ | |
| Количество пациентов | 33 | 34 | 20 |
| Пол, мужчины | 28 (84,8%) | 3 (88,2%) | 16 (80%) |
| Возраст, лет | 59,3+/-8,7 | 58,0+/-7,4 | 60,0+/-7,3 |
| Инфаркт миокарда в анамнезе | 16 (48,5%) | 18(52,9%) | 10 (50%) |
| Артериальная гипертензия | 24 (72,7%) | 26 (76,5%) | 17 (85%) |
| Сахарный диабет 2 типа | 4 (12,1%) | 8(23,5%) | 4 (20%) |
| Ожирение | 8 (24,2%) | 11 (32,4%) | 8 (40%) |
| Курение | 10 (30,3%) | 9 (26,5%) | 6 (30%) |
| Гиперхолестеринемия >4,5мМ | 15 (45,6%) | 16 (47,1%) | 10 (50%) |
| Общий холестерин, мМ | 4,82+/-0,90 | 4,93+/-1,2 | 5,08+/-1,31 |
| Глюкоза, мМ | 5,4+/-0,93 | 5,73+/-1,03 | 5,75+/-1,38 |
| Коронарное стентирование в анамнезе | 7 (21,2%) | 9 (26,5%) | 6 (30%) |
Примечание: по основным клиническим характеристикам, данным анамнеза и факторам риска группы больных были сопоставимы.
Таблица 2. Ангиографическая характеристика групп больных
| Пациенты (n 87) | |||
| КС +Инграмон | КС стандартное лечение | КАГ | |
| Количество пациентов | 33 | 34 | 20 |
| Количество пораженных сосудов | Один - 11(33,3%) Два - 21(63,6%) Три- 1(3,0%) | Один - 15(44,1%) Два - 17(50,0%) Три- 2(5,8%) | Нет – 5 (25,0%) Один – 7 (35,0%) Два – 5 (25,0%) Три – 3 (15,0%) |
| Количество и тип имплантированных стентов | Один РПС – 17 (51,5%) Два РПС - 6 (18,2%) Один РПС + один ГМС – 10 (30,3%) | Один РПС – 22 (64,7%) Два РПС -10 (29,4%) Один РПС + один ГМС – 2 (5,9%) | ___ |
| Длина стентированных участков, мм | 27,8+/-12,3 | 32,8+/-12,9 | ___ |
| Диаметр стентированных участков, мм | 2,66+/-0,39 | 2,81+/-0,40 | ___ |
| Стентируемая артерия ПНА/ОА/ПКА | 26/12/11 | 19/8/19 | ___ |
Примечание: РПС – рапамицин-покрытый стент, ГМС – голометаллический стент, ПНА – передняя нисходящая коронарная артерия, ОА – огибающая коронарная артерия, ПКА – правая коронарная артерия.
По числу гемодинамически значимо стенозированных коронарных артерий исходно группы больных были сопоставимы. Группы КС на фоне стандартной терапии и дополнительной терапии Инграмоном также были сопоставимы по количеству, диаметру и длине имплантированных стентов. Однако в группе терапии Инграмоном было имплантировано большее количество ГМС (р=0,01) по сравнению с группой стандартной терапии (таблица 2).
Пациенты всех трех групп получали стандартную для больных ИБС терапию: бета-блокаторы, аспирин, статины, при наличии показаний также назначались клопидогрел, иАПФ, антагонисты кальция, нитраты.
Исследование содержания хемокинов и белков острой фазы воспаления в периферической крови больных. Концентрацию МСР-1 в плазме крови измеряли иммуноферментным методом (МСР-1 ELISA kit, Bender MedSystems, Австрия). Определение концентрации вчСРБ в сыворотке крови выполняли нефелометрическим методом на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» (Bering Marburg GmbH, Dade, Германия - США). Содержание фибриногена в плазме крови определяли коагулогическим методом по Клауссу. Измерение концентрации ИЛ-8, IP-10 и MIG в плазме проводили иммунофлуоресцентным методом (наборы СВА, Becton Dickinson Biosciences, США) и цитофлюориметрии в потоке (FacsCalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США).
Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов и концентрации растворимого рецептора ИЛ-2 в периферической крови. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методами прямой иммунофлуоресценции и цитофлуориметрии в потоке. Были использованы конъюгированные с флуоресцентной меткой антитела: СD3-FITC/CD19-PE, СD3-FITC/CD4-PE, СD3-FITC/CD8-PE, СD3-FITC/CD(16+56)-PE, CD4-FITC (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США), CD25-PE (DakoCytomation, США), CD25-PC5, CD127-PE (BeckmanCoulter, США) и растворы для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США). Анализ связывания антител с клетками выполняли на поточном цитофлуориметре FacsCalibur с использованием программного обеспечения CellQuest. Определение концентрации sCD25 в сыворотке крови выполняли хемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC – Siemens, Германия, США).
Оценка данных контрольной коронароангиографии через 12 месяцев после стентирования. Контрольная КАГ через 12 месяцев после КС выполнялась больным в группе стандартного лечения (n=25) и в группе дополнительной терапии Инграмоном (n=26). На основании данных КАГ была определена частота развития следующих осложнений в стентированном сосуде: гемодинамически значимого рестенозирования стентированного участка сосуда, гемодинамически незначимой потери просвета стентированного участка сосуда и необходимости повторного вмешательства на ранее стентированном сосуде, не связанной с рестенозированием стентированного участка. Потеря просвета стентированного участка сосуда определялась как формирование повторного сужения просвета сосуда в стентированном ранее участке более чем на 30%, гемодинамически значимое рестенозирование – как стенозирование более 50% просвета сосуда.
Статистический анализ данных. Данные представлены как среднее + стандартное отклонение или как медиана и квартили (25-й – 75-й процентиль). В работе были использованы следующие критерии и методы анализа данных: критерий Шапиро-Уилка, t-критерий Стьюдента для зависимых выборок, t-критерий Стьюдента для независимых выборок, критерий Левена, W-критерий Уилкоксона, U-критерий Манна-Уитни, метод ANOVA, метод ANOVA по Краскалу-Уоллису, метод ANOVA по Фридмену, корреляционный анализ методом Пирсона и методом Спирмена, тест 2. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. В работе применялся пакет статистических программ Statistica 6,0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Динамика содержания белков острой фазы воспаления и хемокина МСР-1 в периферической крови в ответ на инвазивное вмешательство. Уровни белков острой фазы воспаления вчСРБ и фибриногена статистически значимо повышались в ответ на КС/КАГ, достигая максимума на 2-е сутки с постепенным снижением и возвращением к исходным значениям через 1 месяц (таблица 3). Через 6 месяцев после КС было отмечено статистически значимое снижение концентрации вчСРБ в крови относительно исходного уровня. Содержание вчСРБ и фибриногена на 1-е, 2-е и 7-е сутки было значимо выше у больных после КС по сравнению с больными, которым проводилась коронарография. Концентрация хемотаксического цитокина МСР-1 в крови больных в ответ на КАГ/КС значимо не изменялась (таблица 3).
Таблица 3. Содержание вчСРБ, фибриногена и МСР-1 в крови больных до и в разные сроки после КС на фоне стандартного лечения и после КАГ.
| до | 1 сут. | 2 сут. | 7 сут. | 1 мес. | 3 мес. | 6 мес. | |
| вчСРБ, пг/мл | |||||||
| КС стандартное лечение | 1,93 (1,41-2,70) | 3,99 (2,93-5,57)**# | 6,08 (4,72-7,35)**# | 3,60 (2,72-4,26)**# | 1,56 (0,99-2,12) | 1,38 (0,56-1,85) | 0,91* (0,44-1,07) |
| КАГ | 1,30 (0,92-1,69) | 1,87 (1,67-2,97)** | 3,03 (2,27-3,4)** | 2,13 (1,50-2,51)** | 1,01 (0,85-1,17) | 1,03 (0,97-1,60) | |
| Фибриноген, г/л | |||||||
| КС стандартное лечение | 3,6 (3,4- 3,8) | 4,1 (3,9-4,2)*# | 4,2 (4,0-4,4)**# | 4,0 (3,9-4,1)* | 3,5 (3,4- 3,6) | 3,5 (3,4- 3,6) | 3,3 (3,2- 3,5) |
| КАГ | 3,6 (3,3-3,9) | 3,7 (3,5-3,8) | 3,8 (3,5-3,9)* | 3,8 (3,6-3,9)* | 3,6 (3,4-3,8) | 3,6 (3,2-3,7) | |
| МСР-1, пг/мл | |||||||
| КС стандартное лечение | 100,7 +/- 30,4 | 92,5 +/- 34,9 | 91,4 +/- 40,8 | 99,9 +/- 33,5 | 97,4 +/- 36,8 | 100,6 +/- 30,4 | 96,0 +/- 31,0 |
| КАГ | 92,6 +/- 34,6 | 91,1 +/- 41,5 | 94,8 +/- 39,1 | 96,1 +/- 44,7 | 92,9 +/- 11,2 | 79,6+/- 10,7 | |
Примечание: * р<0,05, **р<0,01 относительно исходных данных, # p< 0,05 относительно данных в группе КАГ.
Влияние терапии Инграмоном на содержание белков острой фазы воспаления и хемокинов в крови больных после коронарного стентирования. Как видно из представленных в таблице 4 данных, терапия Инграмоном приводила к менее значительному повышению уровня вчСРБ и фибриногена на 1-е, 2-е и 7-е сутки у больных после КС. Через 6 месяцев после КС в обеих группах больных было отмечено значимое снижение концентрации вчСРБ в крови относительно исходного уровня. Содержание вчСРБ в крови больных, получавших Инграмон, было значимо ниже на 1-е, 2-е, 7-е после вмешательства по сравнению с больными, получавшими стандартную терапию. Концентрация фибриногена в плазме крови у больных, получавших Инграмон, также была ниже на 1-е и 2-е сутки после КС по сравнению с группой стандартного лечения (таблица 4).
В группе лечения Инграмоном отмечалось значимое снижение уровня МСР-1 на 1-е и 2-е сутки после начала терапии (таблица 4). Мы не обнаружили изменений в концентрации хемокинов ИЛ-8, MIG и IP-10 в крови больных после КС как в группе больных, получавшей только стандартную терапию, так и на фоне лечения Инграмоном.
Таблица 4. Содержание вчСРБ, фибриногена и МСР-1 в крови больных после КС на фоне стандартного лечения и на фоне лечения Инграмоном.
| до | 1 сут. | 2 сут. | 7 сут. | 1 мес. | 3 мес. | 6 мес. | |
| вчСРБ, пг/мл | |||||||
| КС +Инграмон | 1,28 (0,83-1,85) | 1,96 (1,36-2,24)**# | 2,32 (1,95-3,36)**# | 1,61 (1,07-2,11)**# | 0,98 (0,73-1,19) | 1,10 (0,96-1,48) | 0,99* (0,79-1,3) |
| КС стандартное лечение | 1,93 (1,41-2,70) | 3,99 (2,93-5,57)** | 6,08 (4,72-7,35)** | 3,60 (2,72-4,26)** | 1,56 (0,99-2,12) | 1,38 (0,56-1,85) | 0,91* (0,44-1,07) |
| Фибриноген, г/л | |||||||
| КС +Инграмон | 3,5 (3,3- 3,6) | 3,6 (3,5-3,9)*# | 3,8 (3,7-3,97)**# | 3,7 (3,70-4,0)* | 3,4 (3,3-3,5) | 3,5 (3,38-3,58) | 3,4 (3,3-3,4 |
| КС стандартное лечение | 3,60 (3,4- 3,8) | 4,1 (3,9-4,2)* | 4,2 (4,0-4,4)** | 4,0 (3,9-4,1)* | 3,5 (3,4- 3,6) | 3,5 (3,4- 3,6) | 3,3 (3,2- 3,5) |
| МСР-1, пг/мл | |||||||
| КС+Инграмон | 98,9+/- 48,3 | 83,2,0+/-33,2* | 85,2+/- 46,4* | 95,6+/- 45,4 | 90,7+/- 53,8 | 96,3+/- 53,0 | 92,7+/- 47,1 |
| КС стандартное лечение | 100,7 +/-30,4 | 92,5+/- 34,9 | 1,4+/- 40,8 | 99,9+/- 33,5 | 97,4+/- 36,8 | 100,6+/-30,4 | 96,0+/- 31,0 |
Примечание: * р<0,05, **р<0,01 относительно исходных данных, # p<0,05 относительно данных в группе КС на фоне стандартного лечения.
Результаты контрольной коронароангиографии через 12 месяцев после стентирования коронарных артерий у обследованных больных. Все больные, перенесшие КС (67 человек), находились под амбулаторным наблюдением в течение 12 месяцев после вмешательства. За этот период случаев развития инфаркта миокарда или смерти не было. Контрольная КАГ через 12 месяцев после вмешательства была выполнена 26 (78,9%) больным группы лечения Инграмоном и 25 (73,5%) группы стандартного лечения. На основании данных КАГ была определена частота развития осложнений в стентированном сосуде (таблица 5).
Таблица 5. Частота развития осложнений в стентированном сосуде по данным КАГ через 12 месяцев
| КС +Инграмон | КС стандартное лечение | |
| гемодинамически незначимая потеря просвета сосуда в участке стентирования (30-50%), % от кол-ва стентов | 6 (20,0%) | 5 (14,7%) |
| гемодинамически значимое рестенозирование (>50%) | 2 (6,7%) | 2 (5,8%) |
| необходимость повторного вмешательства на ранее стентированном сосуде, не связанная с рестенозированием стентированного участка | 1 (3,8%) | 1 (4,0%) |
По результатам настоящего исследования, включившего небольшое количество больных, при используемой схеме введения Инграмона группы больных, получавших только стандартную терапию и дополнительное лечение Инграмоном, по частоте развития указанных осложнений были сопоставимы.
Динамика показателей субпопуляционного состава лимфоцитов в ответ на инвазивное вмешательство. Как следует из данных таблицы 6, общее количество в крови лейкоцитов, лимфоцитов, основных субпопуляций лимфоцитов – Т- (CD3+), в том числе Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических (CD8+) Т-клеток, В-, NK-, NKT-клеток, - статистически значимо не изменялось после проведения КС или КАГ (таблица 6).
Таблица 6. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных до и в разные сроки после КС на фоне стандартной терапии (n=15) и после КАГ (n=15).
| Клетки, млн/мл | исходно | 1 сут | 2 сут. | 7 сут. | 1 мес. | 3 мес. | |
| Лейкоциты | КС | 7,66+2,33 | 8,02+1,98 | 8,32+1,50 | 7,06+1,53 | 7,43+2,08 | 6,12+0,98 |
| КАГ | 7,12+2,24 | 8,5+2,46 | 8,47+2,14 | 8,08+1,80 | 8,19+2,23 | 7,75+1,26 | |
| Лимфоциты | КС | 2,14+0,78 | 1,99+0,80 | 2,00+0,37 | 1,83+0,57 | 1,83+0,63 | 1,73+0,97 |
| КАГ | 2,23+0,86 | 2,10+0,93 | 2,33+0,75 | 2,16+0,74 | 2,61+0,69 | 2,18+0,40 | |
| CD3+ лимфоциты | КС | 1,48+0,52 | 1,34+0,42 | 1,40+0,18 | 1,39+0,48 | 1,32+0,49 | 1,28+0,70 |
| КАГ | 1,56+0,65 | 1,42+0,64 | 1,59+0,52 | 1,43+0,50 | 1,71+0,43 | 1,45+0,15 | |
| CD3+CD4+ Т-лимфоциты | КС | 0,88+0,45 | 0,82+0,32 | 0,80+0,24 | 0,77+0,32 | 0,85+0,36 | 0,87+0,54 |
| КАГ | 0,69+0,55 | 0,88+0,38 | 0,99+0,39 | 0,80+0,25 | 0,93+0,40 | 0,93+0,45 | |
| CD3+CD8+ Т- лимфоциты | КС | 0,66+0,35 | 0,53+0,18 | 0,61+0,22 | 0,62+0,29 | 0,55+0,27 | 0,44+0,20 |
| КАГ | 0,51+0,23 | 0,52+0,28 | 0,57+0,19 | 0,57+0,26 | 0,72+0,31 | 0,51+0,12 | |
| CD3+CD(16+56)+ NKT-лимфоциты | КС | 0,18+0,13 | 0,12+0,09 | 0,16+0,10 | 0,14+0,12 | 0,16+0,10 | 0,19+0,18 |
| КАГ | 0,12+0,07 | 0,12+0,05 | 0,15+0,07 | 0,15+0,08 | 0,17+0,07 | 0,11+0,08 | |
| CD3-CD(16+56)+ NK-лимфоциты | КС | 0,41+0,3 | 0,24+0,12 | 0,34+0,13 | 0,31+0,2 | 0,25+0,16 | 0,29+0,18 |
| КАГ | 0,34+0,2 | 0,36+0,2 | 0,47+0,3 | 0,46+0,3 | 0,49+0,3 | 0,39+0,2 | |
| CD19+ В-лимфоциты | КС | 0,21+0,13 | 0,22+0,15 | 0,22+0,14 | 0,14+0,1 | 0,13+0,06 | 0,15+0,09 |
| КАГ | 0,24+0,12 | 0,24+0,09 | 0,2+0,06 | 0,24+0,08 | 0,24+0,09 | 0,22+0,09 |
Содержание регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+CD25highCD127low) в периферической крови повышалось на 7-е сутки в группе больных после КС на фоне стандартного лечения, достигая максимума через 1 месяц с дальнейшим снижением через 3 месяца после вмешательства (рисунок 2А). В группе больных, где была выполнена только КАГ, статистически значимых изменений содержания регуляторных Т-клеток в крови выявлено не было. Значимых изменений содержания активированных CD4+CD25lowCD127high Т-лимфоцитов в ответ на вмешательство не было выявлено в обеих группах больных (рисунок 2Б).
Рисунок 2. А - динамика содержания регуляторных Т-лимфоцитов (Т-рег.) после КС на фоне стандартного лечения (n=15) и после КАГ (n=15); Б – динамика содержания активированных СD4+ Т-лимфоцитов после КС (n=15) и после КАГ (n=15); В – динамика содержания sCD25 после КС на фоне стандартного лечения (n=34) и КАГ (n=20); Г - анализ корреляционной взаимосвязи между абсолютным количеством регуляторных Т-лимфоцитов в крови и содержанием sCD25 через 1 месяц после КС (n=34). *p<0,05, **p<0,01 относительно исходных данных, #р<0,05 относительно данных в группе КАГ, r – коэффициент корреляции Пирсона.
В дальнейшем исследование содержания регуляторных и активированных Т-клеток в крови было выполнено всем больным в группе КС на фоне стандартного лечения (n=34) и в группе КАГ (n=20) до вмешательства и в точке максимального прироста регуляторных Т-клеток, выявленной ранее, т.е. через 1 месяц после вмешательства. Было отмечено повышение относительного количества регуляторных Т-клеток с высокой статистической значимостью через месяц после КС относительно исходных значений (7,23+/-2,56% от СD4+ лимфоцитов против 5,92+/-1,59%, р<0,001) и относительно их уровня в группе КАГ (p=0,012). В группе КАГ существенной динамики содержания регуляторных Т-клеток выявлено не было (5,69+/-1,7% против 5,93+/-1,97%, р=0,21). Значимых изменений относительного содержания активированных эффекторных CD4+ Т-лимфоцитов в обеих группах больных также выявлено не было (КС - 53,4+/-15,9% от СD4+ лимфоцитов против 49,8+/-12,3%, р=0,41; КАГ – 52,3+/-17,0% против 53,0+/-12,0%, р=0,77).
Изменение концентрации sCD25 в крови больных после КС имело аналогичный динамике регуляторных Т-клеток характер: наблюдалось значимое повышение уровня sCD25 в плазме крови через 7 суток и через 1 месяц после КС. Уровень sCD25 через месяц после КС был значимо выше, чем в группе КАГ (рисунок 2В). Была отмечена умеренная прямая корреляционная связь между плазменной концентрацией sCD25 и абсолютным количеством регуляторных Т-лимфоцитов в крови через 1 месяц после имплантации РПС (рисунок 5Г). Связи между изменением содержания в крови регуляторных Т-клеток или sCD25 и количеством имплантированных РПС обнаружено не было (r=-0,12, p=0,52; r=-0,08; p=0,68, соответственно).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В настоящее время не вызывает сомнения, что особенности течения воспалительной реакции в стенке сосуда, проявляющиеся системным повышением содержания маркеров воспаления, связаны с прогнозом течения ИБС и эндоваскулярных вмешательств. В многочисленных клинических исследованиях продемонстрирована связь высокого уровня вчСРБ до ЧКВ с частотой развития серьезных сердечно-сосудистых осложнений после ЧКВ как с имплантацией ГМС, так и РПС [Iijima R. et al., 2009; Park D.W. et al., 2007; Park D.W. et al., 2009; Delhaye C. et al., 2010]. В настоящей работе выявлено значительное возрастание содержания белков острой фазы воспаления (вчСРБ и фибриногена) в крови больных в раннем периоде после КС. Уровни этих маркеров значимо превосходили аналогичные показатели у больных, которым проводилась только КАГ, что может свидетельствовать о взаимосвязи между содержанием маркеров воспаления в крови после вмешательства и повреждением коронарной артерии при его проведении.
В литературе описаны попытки присоединения к стандартной терапии ИБС различных противовоспалительных препаратов с целью подавления воспалительной реакции в стенке сосуда. В НИИ экспериментальной кардиологии РКНПК был разработан препарат Инграмон, обладающий противовоспалительным действием in vivo и in vitro [Красникова Т.Л. и др., 2005; Сидорова М.В. и др., 2006; Chazov E.I. et al., 2007; Кухтина Н.Б., Баштрыков П.П. и др., 2008]. Механизм действия Инграмона обусловлен ингибированием связывания МСР-1 и, по-видимому, других хемокинов с молекулами ГАГ клеточных мембран и межклеточного матрикса, что препятствует созданию концентрационного градиента хемокинов и подавляет направленную миграцию лейкоцитов [Красникова Т.Л. и др., 2010]. В последние годы отмечается возрастающий интерес к разработке специфических ингибиторов взаимодействия хемокинов с ГАГ. Так, синтезированы мутантные формы МСР-1 и RANTES, которые неспособны к рецепторному взаимодействию, но препятствуют связыванию эндогенных хемокинов с ГАГ, подавляя in vivo миграцию лейкоцитов [Handel T.M. et al., 2008; Piccinini A.M. et al., 2010; Liehn E.A. et al., 2010]. Следует отметить, что, несмотря на большое количество опубликованных доклинических исследований, посвященных изучению действия антагонистов хемокинов, в том числе МСР-1, литература не располагает сведениями о препаратах, доказавших свою эффективность в клинических исследованиях. Препарат Инграмон после успешного прохождения 1 фазы клинических испытаний был допущен к клиническим исследованиям [выписка из протокола заседания Бюро ФГУ «Научный центр экпертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора от 15 ноября 2007 года]
В настоящем исследовании мы показали противовоспалительное действие Инграмона у больных ИБС, которое состояло в менее выраженном повышении концентрации вчС-РБ, фибриногена и снижении уровня МСР-1 в крови больных после КС. Отсутствие влияния терапии Инграмоном на содержание других хемокинов (ИЛ-8, IP-10, MIG) в системном кровотоке объясняется, вероятно, более сложными механизмами регуляции их синтеза и преимущественно паракринным действием.
Мы показали, что при добавлении к стандартной терапии Инграмон обладает положительным действием в отношении факторов риска осложнений ИБС и эндоваскулярных вмешательств. На основании данных КАГ, выполненной через 12 месяцев после КС, мы исследовали частоту развития некоторых осложнений в стентированном сосуде (таблица 6). По результатам настоящего исследования, включившего небольшое количество больных, при используемой схеме введения Инграмона группы больных, получавших только стандартную терапию и дополнительное лечение Инграмоном, по частоте развития указанных осложнений были сопоставимы. Учитывая выявленный противовоспалительный эффект Инграмона, проявляющийся в снижении концентрации в крови пациентов вчСРБ и МСР-1, для достижения клинического эффекта от его применения, возможно, следует изменить срок начала лечения (использовать при подготовке к вмешательству у больных с высоким уровнем вчСРБ) и кратность введения препарата в раннем периоде после КС. В соответствии с данными о сохранении противовоспалительного эффекта Инграмона в широком диапазоне доз [Chazov E.I. et al., 2007], свойственном препаратам пептидной природы, однократную дозу препарата увеличивать нецелесообразно.
Содержание в плазме крови белков острой фазы воспаления, по нашим данным, возвращается к исходным значениям к месяцу после вмешательства, что согласуется с литературными данными [Ferrante G. et al., 2008] и свидетельствует о разрешении острой воспалительной реакции, индуцированной имплантацией коронарного стента. В настоящей работе мы впервые продемонстрировали, что в относительно отдаленные сроки (1 месяц) после коронарного стентирования с установкой РПС в периферической крови значимо повышается содержание регуляторных Т-лимфоцитов, а также концентрация растворимой формы рецептора ИЛ-2 sCD25. Изменений со стороны основных макропопуляций лимфоцитов в ответ на КС зарегистрировано не было. Мы предполагаем, что изменения в содержании регуляторных Т-лимфоцитов связаны с иммуномодулирующим действием рапамицина.
После имплантации РПС концентрация рапамицина в системном кровотоке составляет 1-2 нМ и менее и сохраняется, по разным данным, от 7 суток до 1 месяца после вмешательства [Suzuki T. et al., 2001; Vetrovec G.W., et al., 2006; Otsuka Y. et al., 2005]. В тканях, окружающих стент, рапамицин присутствует в течение месяца, что продемонстрировано в моделях на животных. [Carter A.J. et al., 2004; Klugherz B.D. et al., 2002]. Strauss L. и др. [2009] показали, что культивирование лимфоцитов c 1 нМ рапамицина в течение 3-х недель приводит к постепенному накоплению регуляторных Т-лимфоцитов. Для достижения иммуносупрессорного эффекта при пероральном приеме используются большие дозы рапамицина (с достижением концентрации в плазме более 10 нМ). По-видимому, рапамицин в малых дозах оказывает иммуномодулирующее действие, влияя на количество регуляторных Т-лимфоцитов при отсутствии существенных изменений в содержании основных макропопуляций лимфоцитов крови, в том числе активированных эффекторных Т-лимфоцитов.
При изучении фармакокинетики рапамицина после имплантации РПС человеку было продемонстрировано, что его концентрация в системном кровотоке выше после имплантации двух РПС, нежели одного той же длины и диаметра, и составляла в среднем 1 и 0,6 нМ, соответственно. Параметры, описывающие высвобождение рапамицина из покрытия стента и его клиренс, не зависят от количества имплантированных стентов [Vetrovec G.W. et al., 2006]. В настоящей работе связи между изменением содержания в крови регуляторных Т-клеток и длиной имплантированных РПС как параметра, отражающего введенную дозу рапамицина, выявлено не было. По нашим предварительным данным, значимых различий в количестве регуляторных Т-клеток в культуре CD4+ лимфоцитов в присутствии 0,5 или 1 нМ рапамицина не обнаружено. Содержание рапамицина в периферической крови после имплантации РПС, в соответствии с нашей гипотезой, достаточно для накопления регуляторных Т-клеток, однако, ввиду узкого диапазона концентраций, выявить дозозависимый эффект не представляется возможным.
Традиционно считается, что появление в крови sCD25 является следствием протеолитического «шеддинга» («слущивания») рецепторов с поверхности активированных лимфоцитов [Rubin L.A. et al., 1986; Junghans R.P. et al., 1996]. Уровень sCD25 в крови повышается на несколько порядков при аутоиммунных и инфекционных заболеваниях и реакции отторжения трансплантата [Keystone E.C. et al., 1988; Murakami S. et al., 2004; Lun A. et al., 2002]. В настоящей работе мы обнаружили небольшое, но статистически значимое повышение концентрации sCD25 в крови через 1 месяц после имплантации РПС. Единственным изменением в субпопуляционном составе лимфоцитов при этом являлось повышение количества регуляторных Т-лимфоцитов. Pedersen A.E. и др. [2009] продемонстрировали, что активация обогащенной регуляторными Т-клетками популяции CD4+CD25+ Т-лимфоцитов сопровождается повышением содержания sCD25 в среде культивирования. По нашим данным, концентрация sCD25 в крови коррелирует с содержанием регуляторных лимфоцитов. На основании этого факта можно предположить, что регуляторные Т-лимфоциты, для которых характерна высокая мембранная плотность CD25, также могут быть источником sCD25 в крови.
Роль регуляторных Т-лимфоцитов в развитии атеросклеротических поражений сосудистой стенки является, на сегодняшний день, предметом исследований ведущих лабораторий. На моделях атеросклероза у мышей было показано участие регуляторных Т-клеток в подавлении атерогенеза и стабилизации атеросклеротических поражений [Mor A., et al., 2007; Gotsman I. et al., 2006; Ait-Oufella H. et al., 2006]. Считают, что такое действие регуляторных Т-лимфоцитов обусловлено супрессорной активностью в отношении «проатерогенных» эффекторных Т-лимфоцитов, подавлением дифференцировки Т-хелперов 0 типа в Т-хелперы 1 и 2 типов, а также с продукцией регуляторными Т-клетками противовоспалительных цитокинов. Специфическим маркером регуляторных Т-клеток является фактор транскрипции FOXP3 [Hori S. et al., 2003]. FOXP3+ лимфоциты выявлены иммуногистохимически в атеросклеротических бляшках сонных артерий человека [Patel S. et al., 2009], экспрессия FOXP3 обнаружена в образцах бляшек коронарных артерий [Соколов В.О. и др., 2009]. У больных с обострением ИБС выявлены изменения в содержании и функциональной активности регуляторных Т-клеток [Mor A. et al., 2006; Sardella G. et al., 2006; Hu Z. et al., 2007; Han S.F. et al., 2007; Cheng X. et al., 2008; Ammirati E. et al., 2010]. При стабильном течении ИБС также показано снижение содержания [Han S.F. et al., 2007; Cheng X. et al., 2008] и супрессорной активности [Mor A. et al., 2006] регуляторных Т-лимфоцитов. Изучение регуляторных Т-лимфоцитов при атеросклерозе и его осложнениях является весьма актуальной задачей, т.к. оно расширяет представления о патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и способствует разработке клеточных подходов к терапии ИБС.
ВЫВОДЫ
- У больных стабильной стенокардией напряжения в первые 7 суток после коронарного стентирования повышается содержание в крови вчСРБ и фибриногена с максимумом на 2-е сутки после вмешательства. Через 1 месяц после вмешательства уровни вчСРБ и фибриногена возвращаются к исходным значениям. Содержание хемотаксических цитокинов МСР-1, ИЛ-8, MIG и IP-10 не изменяется в ответ на проведение коронарного стентирования.
- На фоне дополнительной терапии Инграмоном концентрация вчСРБ, фибриногена и МСР-1 крови в ранние сроки после коронарного стентирования ниже, чем в случае только стандартной терапии.
- Содержание циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов и растворимого рецептора ИЛ-2 (sCD25) повышается через 1 месяц после коронарной ангиопластики с имплантацией рапамицин-покрытых стентов у больных стабильной ИБС. Отмечена умеренная прямая корреляционная взаимосвязь между содержанием регуляторных Т-лимфоцитов и sCD25 через 1 месяц после вмешательства.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Арефьева Т. И., Проваторов С. И., Потехина А. В., Соколов В. О., Кухтина Н. Б., Самко А. Н., Красникова Т. Л. Влияние имплантации содержащих рапамицин стентов в коронарные артерии на количество циркулирующих CD4+CD25high+ - регуляторных Т-клеток. Терапевтический архив. 2009; 81 (9): 33-37
2. Потехина А.В., Арефьева Т.И., Красникова Т.Л., Проваторов С.И., Масенко В.П., Осяева М.К., Ноева Е.А. Изменение концентрации моноцитарного хемотаксического белка-1 у больных нестабильной стенокардией на фоне терапии арикстрой. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010; 11 (150): 590-593. Статья отобрана для публикации в англоязычной версии журнала: Potekhina A. V., Arefieva T. I., Krasnikova T. L., Provatorov S. I., Masenko V. P., Osyaeva M. K., Noeva E. A. Changes in the Concentration of Monocytic Chemotaxic Protein-1 in Patients with Unstable Angina Treated with Arixtra. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011; 5 (150): 656-658, DOI: 10.1007/s10517-011-1215-1
3. Потехина А. В., Проваторов С. И., Арефьева Т. И., Кухтина Н. Б., Масенко В. П., Казначеева Е. И., Рулева Н. Ю., Ноева Е. А., Осяева М. К., Сидорова М. В., Беспалова Ж..Д., Красникова Т. Л. Влияние противовоспалительного пептидного препарата Инграмон на содержание белков острой фазы воспаления и хемокинов в крови больных после коронарного стентирования. Терапевтический архив 2010; 82(11): 58-63
4. Потехина А.В., Соколов В.О., Пылаева Е.А., Проваторов С.И., Масенко В.П., Босых Е.Г., Ноева Е.А., Красникова Т.Л., Арефьева Т.И. Изменение содержания регуляторных Т-лимфоцитов и концентрации растворимого рецептора ИЛ-2 в крови больных после ангиопластики коронарных артерий с имплантацией стентов с рапамициновым покрытием. Кардиология. 2011; 3(51): 47-53.
5. Potekhina A.V., Provatorov S. I., Sokolov V. O., Pylaeva E. A., Masenko V. P., Noeva E. A., Kukhtina N. B., Krasnikova T. L., Arefieva T. I. CD4+CD25highCD127low regulatory T-cells in patients with stable angina and their dynamics after intracoronary sirolimus eluting stent implantation. Human Immunology. 2011; № P:, DOI:10.1016/j.humimm.2011.03.015
6. Potekhina A., Sokolov V., Pylaeva E., Provatorov S., Kukhtina N., Krasnikova T., Arefieva T. Circulating CD25HIGHCD127LOW regulatory T-cells after coronary stenting with rapamycin-eluting stents. Abstract Disk of the 8th International Congress on Coronary Artery Disease. 2009. № 1034
7. Sokolov V., Potekhina A., Pylaeva E., Provatorov S., Kukhtina N., Krasnikova T., Arefieva T. Circulating CD4CD25highCD127low regulatory T-cells after intracoronary implantation of rapamycin-eluting stents. Journal of Hypertension. 2010; 28: e69
8. Pylaeva E., Potekhina A., Sokolov V., Provatorov S., Masenko V., Kukhtina N., Krasnikova T., Noeva E., Arefieva T. The dynamics of blood lymphocyte subpopulations after coronary stenting with rapamycin eluting stents. European Heart Journal. 2010; 31: 224
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГАГ - гликозаминогликаны
ГМС – голометаллический стент
ИБС – ишемическая болезнь сердца
ИЛ – интерлейкин
КАГ - коронароангиография
КС – коронарное стентирование
РПС – рапамицин-покрытый стент
СРБ – C-реактивный белок, вчСРБ – СРБ, определенный высокочувствительным методом
ЧКВ – чрескожные коронарные вмешательства
СD – cluster differentiation - кластер дифференцировки
FITC – флуоресцеинизотиоцианат
FOXP3 - forkhead box P3- фактор транскрипции, специфичный для регуляторных Т-лимфоцитов
IP-10 - interferon gamma-induced protein 10 kDa - индуцированный ИФН- белок-10
MCP-1 – monocyte chemotactic protein-1 - моноцитарный хемотаксический белок-1
MIG – Monokine Induced by Gamma interferon - монокин, индуцируемый ИФН-
NK – клетки – natural killers, естественные киллеры
NKT – клетки – клетки, экспрессирующие Т-клеточный маркер CD3 и фенотипические маркеры естественных киллеров
PC5 – фикоэритрин цианин 5
PE - фикоэритрин
sCD25 – soluble CD25 - растворимый CD25
