Клинико-морфологические особенности формирования патологии почек у детей
На правах рукописи
ПОГОДАЕВА
татьяна Викторовна
Клинико-морфологические особенности формирования патологии почек у детей
14.01.08-педиатрия; 03.03.04-клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток - 2012
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Владивостокский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития
Российской Федерации»
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Лучанинова Валентина Николаевна
доктор медицинских наук, профессор Каредина Валентина Семеновна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук
Щербавская Эльвира Анатольевна
Дальневосточный филиал ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН
доктор медицинских наук, профессор
Маркина Людмила Дмитриевна
ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
Ведущее учреждение: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Защита диссертации состоится «29» мая 2012 года в 13 часов
на заседании диссертационного совета К 208.007.01 при ГБОУ ВПО
ВГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 690002,
г. Владивосток, проспект Острякова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Владивостокского Государственного медицинского университета
Автореферат разослан «26» апреля 2012 года.
Ученый секретарь диссертационного Совета,
Кандидат медицинских наук, доцент Шестакова Н.В.
Общая характеристика работы
Актуальность. В последние годы возросло внимание исследователей к проблеме почечной патологии у новорожденных, что связано с увеличением числа нефропатий в этом возрасте. Данные о частоте поражения почек у новорожденных крайне противоречивы (Маковецкая Г.А, 2000; Папаян А.В., 2008). Это связано с тем, что верификация диагноза нефропатии у новорожденных проводится довольно редко даже при наличии клинических проявлений. Причиной тому являются трудности проведения исследований, так как не все методы, используемые в нефрологии, применимы у новорожденных. У детей, перенесших тяжелую гипоксию, имеющих сопутствующие заболевания, получавших массивную терапию, частота поражения почек возрастает (Куликова Н.Ю., 2010). А у новорожденных, находившихся на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии, патология почек развивается примерно у трети больных, при этом острая почечная недостаточность диагностируется в 6% - 58% случаев (Baskin E., 2005; Чугунова О.Л., 2007). Одновременно у новорожденных детей стали чаще встречаться латентные формы нефропатий, связанные с почечным дизэмбриогенезом (Папаян А.В. и др., 2002; Игнатова М.С., 2011).
К факторам риска развития патологии мочевой системы у новорожденных относят, кроме врожденных и наследственных заболеваний, состояния, при которых имеет место хроническая фетоплацентарная недостаточность (Байбарина Е.Н., 2010). При этом, основным патогенетическим фактором, вызывающим повреждение почек плода, является хроническая внутриутробная гипоксия. Из всех органов именно гистогенез почек наиболее страдает при гипоксии (Наточин Ю.В. 2011). Нарушение гистогенеза может проявиться пороками развития почки (у 1/5 части новорождённых) и другими достоверными критериями морфо-функциональной незрелости почек – органная дисплазия (Зеленцова В.Л., 2003). В связи с этим, очевидно, что значительное число пороков развития почек остаётся недиагностированными при рождении, а при дальнейшем росте и развитии ребёнка (увеличением метаболической нагрузки) проявляются тяжёлой патологией. Учитывая возможность эволюционного резерва созревания морфологических структур, при своевременном прогнозировании формирования патологии возможно создание условий для созревания нефрогенной ткани, а значит, предупреждение развития тяжёлых заболеваний (Игнатова М.С., 2011). В связи с этим необходимы новые диагностические приёмы, позволяющие проводить пренатальную диагностику и выделять среди новорождённых группу риска по развитию почечной патологии. Вышеизложенное определило цель и задачи исследования.
Цель исследования: разработать алгоритм определения группы риска формирования патологии почек у новорожденных детей на основании изучения анамнестических, клинических, морфологических, иммунных и биохимических критериев.
Задачи:
- Провести анализ частоты заболеваний органов мочевой системы у детей и новорожденных в Приморском крае.
- Определить факторы риска развития патологии почек у новорожденных.
- Дать клиническую характеристику состояния новорожденных с учетом наиболее значимых перинатальных факторов риска.
- Исследовать морфологические характеристики и взаимосвязь циркулирующих и тканевых мастоцитов. Оценить роль тучно-клеточной популяции в формировании заболеваний почек.
- Изучить иммунные и биохимические характеристики нарушения функции почек у новорожденных детей.
- Составить прогностическую модель формирования патологии органов мочевой системы у новорожденных детей.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка факторов риска формирования патологии почек у новорожденных, относящиеся к перинатальному периоду. Выбраны критерии для количественной комплексной оценки степени гипоксии, перенесенной плодом и новорожденным. Доказана прогностическая значимость критериев для выделения среди новорождённых группы высокого риска формирования патологии почек. Впервые получены доказательства связи активности тучных клеток с процессами васкуляризации почек, сроком гестации и наличием патологии почек у беременной женщины. При этом установлена корреляционная связь между гейтом тучных клеток и базофилами крови, что определяет клеточный, тканевый и организменный уровень регуляции развития почек и возможность возникновения патологических изменений в эмбриональном периоде. Разработан протокол иммунохимического скрининга определения группы высокого риска повреждения почек у новорожденных на основании оценки уровня почечных аутоантител в крови детей, рожденных от женщин с установленным диагнозом патологии почек. Впервые выявлена взаимосвязь биохимических показателей нарушения функций почек после перенесенной гипоксии по оценке чувствительности и специфичности. Установлены их информативные и прогностические границы. Впервые разработан новый методологический подход к прогнозированию и диагностике патологии почек у новорожденных на основании математической прогностической модели и оценочных прогностических таблиц и научно обоснована концепция профилактики заболеваний почек.
Практическая значимость. Разработанные информативные критерии комплексной клинической оценки степени перенесенной гипоксии положены в основу выделения новорожденных в группу риска повреждения почек. Оценка активности мастоцитов и тканевых базофилов, их реакции на воздействие повреждающих факторов расширяет понимание базовых механизмов формирования патологии почек у детей. Полученные данные о повышенной продукции аутоантител к антигенам ткани почек позволило использовать их в качестве прогностического критерия патологии почек и для составления протокола иммунохимического скрининга. Новые сведения, полученные при биохимическом исследовании крови и мочи новорождённых, могут служить дополнительными диагностическими критериями поражения почек. Выявленные закономерности, характеризующие корреляционную связь анамнестических, клинических и биохимических критериев позволили составить прогностическую математическую модель и оценочные прогностические таблицы для выделения группы риска по формированию патологии почек у новорожденных. Разработан алгоритм и составлена программа наблюдения за детьми раннего возраста из группы риска развития почечной патологии.
Положения, выносимые на защиту
- Оценка оптимальности течения беременности по шкале Кайнер, внутриутробного состояния плода по данным кардиотокографии, степени тяжести асфиксии по шкале Апгар - основание для разработки системы комплексной оценки степени перенесенной гипоксии в антенатальном периоде и выделения группы риска формирования ишемической нефропатии у новорожденных (высокого и низкого).
- Функциональная активность тучных клеток в почке идет в направлении: ворота – капсула – паренхима в соответствии со сроком гестации и продолжительностью жизни плода. Этот процесс связан с этапами ангиогенеза, васкулогенеза, артериогенеза и определяет участие тучно – клеточной популяции в развитии патологии почек на фоне гипоксии.
- Патология почек у матери отражается на изменении уровня иммунного статуса ребенка, что проявляется повышением уровня аутоантител к антигенам почек в крови. Это подтверждает факт иммунного импринтинга и определяет риск формирования патологии почек в катамнезе.
- Биохимические показатели крови и мочи (креатинин, лактат, скорость клубочковой фильтрации, микроальбумин и карбоангидраза, электролиты - Na+, K+, Cl-) являются маркерами повреждений канальцевого и клубочкового эпителия нефрона, вызванных перенесенной гипоксией. Оценка чувствительности и специфичности этих тестов позволила выделить наиболее диагностически значимые и использовать их при составлении автоматизированной прогностической математической модели определения группы риска формирования патологии почек у новорожденных.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научных конгрессах, конференциях и симпозиумах регионального, российского и международного уровней: XV-ом Конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011); Республиканской научно-практической конференции «Современные тенденции в здравоохранении: новый взгляд» (Якутск, 2011); VIII-й межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров «Здоровье детей – наше будущее!» (Томск, 2011); I-м международном Конгрессе по перинатальной медицине, посвящённого 85-летию академика В.А. Таболина (Москва, 2011); Российском форуме «Педиатрия Санкт-Петербурга: опыт, инновации, достижения» (Санкт-Петербург, 2011); X-м Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2011); XII и XIII-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2011, 2012); XVI-м Конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2012); Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Н. Новгород, 2012); Межрегиональной научно-практической конференции (Архангельск, 2012).
Внедрение результатов исследования: Оформлена заявка на изобретение «Способ прогнозирования риска развития патологии почек у новорожденных» (приоритетная справка №1022501895877). Зарегистрированы три рационализаторских предложения. Оформлено пять актов внедрения в практическое здравоохранение. Материалы исследования внедрены в учебном процессе студентов 4-6 курсов, интернов, ординаторов, аспирантов и врачей ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России. Работа удостоена 2-го места в конкурсе молодых ученых на лучшую научную работу, проводимого в рамках X-ого Российского конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2011г.)
Публикации: по теме диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах и 16 тезисов, в том числе 2 в международной печати.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из 280 источников, в том числе 190 отечественных и 90 зарубежных авторов. Текст содержит 27 таблиц, 16 рисунков и приложение.
Исследование имеет заключение независимого междисциплинарного этического комитета ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России, протокол № 2 от 15.11.2011г.
Автор выражает глубокую благодарность д.м.н., профессору Мотавкину Павлу Александровичу за научную идею, ставшую основой настоящего исследования.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объем и материалы исследования. Исследование выполнено на базе кафедр ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России: факультетской педиатрии (зав., д.м.н., проф. Е.В. Крукович) и кафедры биологии, ботаники и экологии (зав., д.м.н., проф. В.С. Каредина). Клинико-лабораторное исследование и наблюдение новорождённых проводилось на базе акушерского отделения КБУЗ «Краевая клиническая больница №1 (ККБ№1)» (гл. врач А.В. Кузьмин) и МУЗ «Городской клинический родильный дом №3 (ГКРД №3) г. Владивостока (гл. врач Е.В. Новицкая). Комплексное эпидемиологическое, клеточно-молекулярное и клинико-лабораторное исследование состоит из двух разделов: ретроспективного и проспективного.
I раздел исследования – ретроспективный анализ медицинской документации.
1. Для оценки частоты и структуры заболеваний почек среди детского населения Приморского края изучены «Отчёты о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения (форма 12/у ПКМИАЦ) за период с 2001 по 2010 гг.
2. Проведена ретроспективная оценка структуры перинатальной смертности по данным 2103 протоколов детских вскрытий за 2001-2010 гг. (сплошная выборка) и 517 вскрытий детей за 2007-2010 гг. выборочно от женщин с патологией органов мочевой системы (ОМС). Исследование проводилось на базе учебно-научно-практического комплекса «Приморский институт региональной патологии» (руководитель, д.м.н., проф. Ю.В. Каминский).
3. С целью определения факторов риска развития патологии почек у детей было проведено ретроспективное сравнительное исследование 110 детей, страдающих заболеваниями ОМС, и 110 здоровых детей в возрасте от 10 до 15 лет. Исследование проведено на базе детских поликлиник г. Владивостока.
4.С целью оценки значимости патологии почек у матери для прогноза здоровья ребенка, осуществлен ретроспективный анализ 2184 истории родов и историй новорожденных. Данные из медицинской документации вносили в специально разработанные анкеты. Группы сравнения: основная (новорожденные от женщин с заболеваниями почек) – 355 чел.; контрольная (новорожденные от женщин без заболеваний почек) – 1829 человек.
II раздел – проспективное исследование. 1. Для выявления информативных критериев комплексной клинической оценки степени перенесенной гипоксии группа новорожденных из 70 человек была разделена на основную (57) и контрольную (13) группы. В первую (основную) вошли дети, рожденные от матерей с патологией органов мочевой системы. Контрольную группу составили новорожденные, матери которых по совокупности анамнестических, клинических и лабораторных данных не имели признаков заболеваний органов мочевой системы. По другим показателям группы были референтными.
2. С целью изучения тучно-клеточной популяции у плодов и умерших новорожденных исследовали участки почечной ткани (капсула, паренхима, ткань в области ворот), полученные у 6 плодов и 10 умерших новорожденных (проживших от нескольких часов до 1 месяца) с различным гестационным возрастом (от 22 до 38 недель гестации). Основная группа: образцы ткани 8 плодов от женщин с патологией ОМС; контрольная группа – образцы ткани 8 плодов и умерших новорожденных от женщин без патологии ОМС. Исследование проведено на базе кафедры клеточной биологии, цитологии, гистологии (зав., д.м.н., проф. П.А. Мотавкин) и ЦНИЛ (зав., д.м.н. И.В. Дюйзен) ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России.
3. Популяция базофилов крови и их реакция на воздействие патогенных факторов изучалась в 18 образцах пуповинной крови новорожденных: основная группа - новорожденные от женщин с патологией почек (8 образцов) и контрольная - от здоровых женщин (10 образцов). Исследование проведено на базе ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН» (зав. отделом молекулярной иммунологии, д.б.н., проф. П.А. Лукьянов).
4. Иммунохимическое исследование (определение уровня аутоантител к антигенам ткани почек) проводилось у 157 новорожденных: основная группа – 113 детей от женщин с патологией почек и контрольная – 44 чел. от здоровых женщин. Исследование выполнено на базе МИЦ «Иммункулус», Москва (научный руководитель, зав. лабораторией молекулярной медицины, д.м.н., проф. А.Б. Полетаев).
5. Для исследования биохимических показателей функции почек группа наблюдения состояла из 53 человек. Основная группа (40 человек) состояла из новорождённых, перенесших асфиксию. Контрольная группа (13 человек) включала здоровых новорожденных детей. Исследование проведено на базе ГАУЗ «Краевой диагностический центр» (главный врач Э.В. Лучанинов).
Таким образом, всего изучено 16 образцов ткани плодов и умерших новорождённых и проведено клинико-лабораторное обследование 298 новорождённым. Общий объем исследований представлен в таблице №1.
Таблица № 1
Объем проведенных исследований
| № | Наименование исследований | Число исследований |
| 1. | «Отчёты о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения (форма 12/у Приморского краевого медицинского информационно-аналитического центра» за период с 2001 по 2010 гг. | |
| Медицинская документация: | ||
| 2. | Истории родов (ф№096/у) и протоколы детских вскрытий (ф№013/у) | Всего-2103/2103 Основная-517 Контрольная-1586 |
| 3. | Истории родов (ф№096/у) и истории новорожденных (ф№097/у). | Всего-2184/2184 Основная-355 Контрольная-1829 |
| Цитологическое исследование: | ||
| 4. | Морфологическое исследование тучных клеток в почках плодов и умерших новорожденных (образцы ткани) | Всего-16 Основная гр. – Контрольная гр. – 8 |
| 5. | Исследование популяции циркулирующих базофилов методом проточной цитометрии в крови новорожденных (образцы крови) | Всего – 18 Основная – 8 Контрольная – 10 |
| Клинико-лабораторное исследование: | ||
| 6. | Клиническая оценка (человек) | Всего-70 Основная-57 Контрольная-13 |
| 7. | Иммунохимическое исследование (образцы крови) | Всего-157 Основная-113 Контрольная- 44 |
| 8. | Биохимическое исследование (человек/ образцы крови и мочи) | Всего- 53/106 Основная-40/80 Контрольная-13/26 |
Методы исследования. 1. Новорожденные находились под наблюдением с момента рождения до 3-х суток жизни. Клиническое исследование включало объективный осмотр по известным в неонатологии методикам с использованием шкал Кайнер (оценка оптимальности течения беременности),
Апгар, шкалы NTISS (Neonatal Therapeutic Intervention Scoring System, неонатальная шкала степени терапевтического вмешательста). При комплексной оценке состояния новорожденного использовался анализ данных кардиотокографии (КТГ) плода.
2. Морфологическое исследование мастоцитов в структурах почек проводилось после окрашивания препаратов по методу Леффлера. Для определения NADPH – диафоразы использовали гистохимический метод по прописи Норе, Vincent (1989). Визуализацию изображения всех микропрепаратов на компьютере получали с помощью видео-компьютерной системы, смонтированной на микроскопе Axioscop (Karl Zeiss). Для описания активности тучных клеток (ТК) использовался расчет индекса дегрануляции (ИД): ИД=А/К, где А – количество дегранулирующих клеток, К – общее количество ТК в поле зрения и величины профильного поля (ВПП): ВПП=Dmax х Dmin, где Dmax – максимальный диаметр, Dmin – минимальный диаметр клетки. Исследование базофилов проводили в течение 12 часов от момента забора крови, определяя содержание CD117, 34 положительных клеток методом проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (BD, USA). Использовался протокол, прилагаемый к реактивам Dako Citomation (FITC conjugated – CD34; RPE conjugated – CD117).
3. Иммунологическое исследование (уровни естественных аутоантител) проводили в пробах сыворотки крови (0,2 мл), используя сертифицированные тест-системы (производства МИЦ «Иммункулус», Москва) - «ЭЛИ-Висцеро-Тест», «ЭЛИ-Нефро-Тест». Анализ полученных данных осуществлялся с помощью пакета прикладных программ, прилагаемых к тестам.
4. Биохимическое исследование включало показатели, изменяющиеся при ишемии и нарушении функции почек (креатинин в крови и моче, лактат в крови и моче, скорость клубочковой фильтрации, микроальбумин в моче, электролиты (Na+, K+, Cl-) в крови и моче). Их определяли с помощью системы ARCHITECT cSystems и AEROSET. Уровень карбоангидразы в моче тестировался с использованием иммуноферментного набора для количественного определения концентраций человеческой карбоангидразы IX (CA9) в супернатанте клеточных культур, сыворотке, плазме и моче. Кат.№ DCA900-96 определений, версия: 751682.1 01/07.
5. Статистическая обработка выполнена методами параметрического и непараметрического анализов (Реброва О.Ю., 2003). Из показателей описательной статистики рассчитывали средние арифметические значения (М, P), стандартные ошибки среднего значения (m, mp). При осуществлении сравнительного анализа применяли параметрический параметр Стьюдента (t) с определение коэффициента вероятности ошибки (р) и непараметрический критерий Манна-Уитни (U). Для оценки степени взаимосвязи признаков выполнен корреляционный анализ по Спирмену (рассчитывали коэффициент корреляции R). Для определения факторов риска применяли метод вычисления коэффициентов относительного и атрибутивного рисков (ОР и АР) каждого изучаемого признака в соответствии с рекомендациями ВОЗ (Женева, 1984). Для подсчёта прогностической значимости показателей применялся метод «Латинского квадрата» или четырехпольная таблица «2х2» (Власов В.В., 2001). Математическая модель и прогностические оценочные таблицы для прогнозирования вероятности наступления «события» по имеющимся данным (факторам риска) построены с использованием метода логистического регрессионного анализа (Э. Ллойд и др., 1990). Статистические величины, полученные во всех расчетах, оценивались с помощью соответствующих критериев с пороговым уровнем достоверности не ниже 95% (р=0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I раздел исследования. В Приморском крае за период 2001 – 2010 гг. болезни мочеполовой системы у детей характеризовались выраженной тенденцией к росту (темп среднегодового прироста 6,8%). Среди заболеваний новорожденных г. Владивостока за 2006 – 2010 гг. патология органов мочевой системы (ОМС) диагностирована в среднем у 18,7 – 27% детей. В структуре младенческой смертности пороки ОМС в 2001 – 2010 гг. выявлены в 2,66 % случаев с прогнозом увеличения их частоты в последующие 5 лет (рис. 1).
Рис. 1 Тенденция частоты выявления врожденных пороков развития почек
Анализ 517 протоколов аутопсийных исследований определил, что у плодов от женщин с патологией почек достоверно чаще встречались врожденные пороки развития мочеполовой системы, желудочно – кишечного тракта, а также множественные врожденные пороки развития (P = 0,002). Ретроспективный анализ 2184 истории родов и историй новорожденных выявил высокую частоту женщин с патологией ОМС (16,3%), из них преждевременные роды произошли в 35,5% случаев. Из 586 умерших детей у 106 (18%) обнаружена патология ОМС у матери. Итак, данные ретроспективного раздела работы выявили высокую частоту патологии почек в онтогенезе. Выделены значимые факторы риска, определяющие высокий риск формирования патологии почек у детей: синдром соединительно-тканной дисплазии (АР = 64,6 %), заболевания почек у матери (АР =60,2 %), экстрагенитальные заболевания (АР = 43,8%). На основании данных сравнительной клинической оценки групп наблюдения выявлены дополнительные факторы: наличие или отсутствие у женщины вредных привычек, наступила беременность естественным путем или в результате ЭКО. Полученные данные использованы в составлении алгоритма комплексной оценки выявления группы риска по развитию патологии ОМС.
II раздел исследования. В таблице 2 представлена клиническая характеристика групп сравнения. На основании анализа отличий выбранных клинических критериев разработана формализованная система клинико-функциональной оценки риска повреждения почек у новорожденных: низкий риск при суммарной оценке 0 баллов, высокий риск – 1 и более баллов. При этом чувствительность комплексной оценки (Se) равна 100%; специфичность (Sp) - 50% (приоритентая справка на изобретение №1022501895877).
Таблица № 2
Сравнительная оценка состояния здоровья новорожденных от женщин с патологией и без патологии органов мочевой системы
| Критерии оценки | Основная группа, n=57 | P + mp% | Контрольная группа, n=13 | P + mp% | t | p |
| Гестационный возраст, недели | 30-39 | 37-39 | ||||
| Здоровые 37-39 недель | 18/57 | 31,58 ±1,23 | 7/13 | 58,33± 14,23 | 1,83 | 0,06 |
| Оценка по шкале Кайнер > 19 баллов | 11/57 | 19,3± 5,36 | 9/13 | 75± 12,5 | 4,12 | 0,0001 |
| КТГ < 8 баллов | 4/57 | 7,01± 2,81 | 0/13 | 0 | - | 0,02 |
| Апгар < 7 баллов | 24/57 | 42,11± 7,04 | 3/13 | 25 ±12,5 | 1,06 | 0,32 |
Исследования роли функциональной активности тучных клеток показали, что мастоциты с различной степенью активности (дегранулирующие и недегранулирующие) встречались во всех анатомических отделах почек (паренхиме, воротах и капсуле). Наибольшей функциональной активностью отличалась популяция мастоцитов, локализующаяся в воротах и паренхиме почек живорожденных плодов, проживших несколько суток (от 2-х до 30 суток). В почках мертворожденных плодов популяции ТК были малочисленны и встречались, главным образом, периваскулярно в воротах и капсуле (от 2,33± 0,58/мм2 до 13,67±1,15/мм2 у мертворождённых плодов и новорождённых, проживших менее суток и от 6,0±1,0/мм2 до 23, 67±4,04/мм2 у новорождённых, проживших более суток) (рис.2). В образцах, окрашенных для выявления NADPH – диафоразы, диафоразно-активные клетки встречались редко на фоне «теней» интактных мастоцитов (рис. 3). Выявлена закономерность: увеличение численности популяции ТК в области ворот наиболее выражено в группе плодов женщин с патологией почек и у новорождённых с большей продолжительностью жизни (к 1 месяцу жизни). При этом, в клетках ворот определялись довольно крупные гранулы (ИД равен 0,66 – 0,82) (рис.4).
Базофильные гранулоциты крови и тучные клетки являются структурными элементами целостной системы клеток, влияющие на микроциркуляцию и трофику тканей, поэтому их считают регуляторами тканевого гомеостаза (Гафарова Р.К., 2009 г.; Жданов В.В., 2007 г.). Установлена сильная и умеренная отрицательная корреляционная связь между количеством базофилов в крови и количеством ТК в разных отделах почки: субкапсулярно (r = - 0,75; р = 0,04), воротах (r = - 0,60; р = 0,03). Это указывает на закономерность миграции периферических базофилов крови в ткани почек и их дифференцировку в зрелые мастоциты. Среднее содержание CD 117, 34-положительных тучных клеток в крови составило 47,52 ±12,78 % в основной группе против 9,07 ± 5,97 % в контрольной, U=0,004, p<0,05 (рис. 5). Анализ полученных данных подтвердил гипотезу о том,что предшественники ТК и тканевые мастоциты реагируют на негативное влияние условий, в которых находится плод. Итак, дизэмбриогенез почки формируется под воздействием главного негативного фактора – гипоксии, и в этом процессе ТК - популяция принимает участие (Козлов В.А. и др., 2011; Наточин Ю.В., 2011).
Сравнительный анализ показателей уровней естественных ауто-АТ к антигенам различных органов и систем, в том числе, к почечным антигенам показал значение иммунного импринтинга в формировании патологии почек.
Рис 2. Почка мертворожденного плода Рис.3. Почка новорождённого 37-и
32-ух недель гестации. Тучная клетка в состоянии недель гестации, прожившего 5 суток. дегрануляции в области ворот Диафораз-активная тучная клетка и «тени» (окраска метиленовый синий, ув. 25х0,5х0,8) интактных мастоцитов в воротах
(метод Норе, Vincent, ув. 25х0,5х0,8).
Рис.4 Динамика численности ТК популяции Рис.5 Соотношение численности популяции
в разных анатомических отделах почки базофилов в группах наблюдения.
в зависимости от продолжительности жизни
плода.
В-ворота; 1- образец почки плода, прожившего менее суток;
П-паренхима; 2- образец почки плода, прожившего до 15 суток;
К-капсула;. 3- образец почки плода, прожившего более 18суток.
Гестационный возраст плодов 28 – 38 недель.
Так, в основной группе (дети от матерей с патологией почек) по сравнению с контрольной выявлено больше детей с общей иммунодепрессией и меньше с нормальным уровнем иммунореактивности (p=0,05). В то же время детей с повышенным уровнем ауто-АТ к белкам паренхимы почек достоверно больше встречалось в основной группе (0,24 против 0,17 в контрольной, p=0,03).Выявленная закономерность использована в качестве прогностического критерия. На основании показателей аутоиммунитета составлен протокол иммунохимического скрининга для выделения группы риска формирования патологии почек у новорожденных.
Оценка анамнестических и клинических данных группы новорожденных, перенесших асфиксию – основная группа, и здоровых - контрольная установила, что в только основной группе были новорожденные от курящих женщин (19,3%). У матерей этой же группы детей беременность в 8,77 % наступала методом экстрокорпорального оплодотворения (ЭКО) и у 47,5 % родоразрешение происходило Кесаревым сечением. Дети обеих групп отличались также по физиометрическим и функциональным параметрам, которые в дальнейшем использовались для проведения корреляционной связи с биохимическими показателями в крови и моче. Исследование биохимических параметров в группах сравнения установило достоверные различия между большинством из них (табл. 2). Все показатели с достоверностью 1 <LR+ < 3,5 были разделены на три уровня специфичности. Первый уровень включил признаки со значением Sp 90%. Это креатинин крови (Sp = 100%), креатинин мочи (Sp = 100%), лактат мочи (Sp = 100%) и электролиты мочи: Na+, К+, Cl- (Sp = 100%). Во второй уровень – со значением 70% Sp 90% вошли следующие признаки: NTISS (Sp = 85%), Cl- крови (Sp = 76%), микроальбумин мочи (Sp = 84%), карбоангидраза мочи (Sp = 76%). К третьему уровню специфичности отнесены признаки со значением 50% Sp 70%. Это анамнез по Кайнер (Sp = 56%), Na+ крови (Sp = 56%), К+ крови (Sp = 64%).
Таким образом, выделены единые прогностические критерии, основанные на принципах научно-обоснованной (доказательной) медицинской практики, которые необходимо учитывать при проведении своевременной диагностики патологии органов мочевой системы у новорожденных. С помощьюлогистического нелинейного регрессионного анализа построена автоматизированная математическая прогностическая модель:
Таблица № 3
Биохимические показатели крови и мочи новорождённых
в группах сравнения, М ± m (min – max)
| Показатели (референсные значения) | Основная группа, n=40 | Контрольная группа, n=13 | Достоверность (р) |
| Исследование крови | |||
| СКФ,мл/мин, ( 46,3±4,0) | 23,92±11,17 (7,59-42,45) | 48,63±17,73 (21,25-69,32) | 0,001 |
| Креатинин, мкмоль/л (до106 мкмоль/л) | 69,65±24,17 (32-188,2) | 47,11±8,84 (33,1-65,0) | 0,169 |
| Лактат, ммоль/л (до 4,4 ммоль/л) | 8,6±6,16 (1,4-22,6) | 6,08±3,6 (2,98-14,26) | 0,012 |
| Na+, ммоль/л (135 - 145 ммоль/л) | 143,2±8,24 (112,0-157,0) | 135,54±11,74 (111,0-159,0) | 0,011 |
| К+, ммоль/л (3,6 - 6,0 ммоль/л) | 6,07±1,79 (3,6-10,0) | 6,02±1,78 (3,3-10,0) | 0,877 |
| Cl-, ммоль/л (97 - 108 ммоль/л) | 103,18±8,0 (86,0-130,0) | 102,77±8,75 (93,0-124,0) | 0,128 |
| Общий билирубин, мколь/л (до 52 мкмоль/л при рождении) | 45,17±23,33 (22,8-103,0) | 34,76±10,82 (22,6-50,10) | 0,342 |
| Исследование мочи | |||
| Креатинин, мкмоль/л (8 -15 мг/кг/сут) | 1,49±1,64 (0,44-9,11) | 2,0±1,72 (0-5,29) | 0,342 |
| Лактат, ммоль/л (0,6-1,3 ммоль/л) | 0,21±0,5 (0,01-3,66) | 0,08±0,07 (0,01-0,29) | 0,447 |
| Микроальбумин, мг/л (до 30 мг/сут) | 46,88±92,9 (7-500) | 10,92±5,21 (3-22) | 0,797 |
| Микроальбумин/ креатинин, усл. ед. | 33,62±29,67 (4,01-133,33) | 14,72±30,27 (0-17,82) | 0,053 |
| Карбоангидраза, ед/мл (до 30 ед/мл ) | 217,47±367,6 (0-737,1) | 6,2± 11,65 (0-29,8) | 0,045 |
| Карбоангидраза /креатинин, усл.ед. | 84,32±124,57 (5,3-133,3) | 3,53±9,4 (0-33,4) | 0,024 |
| Na+, ммоль/л (0 - 340 ммоль/л) | 50,3±30,61 (20,0-122,0) | 27,08±11,02 (20,0-59,0) | 0,010 |
| К+ мочи, ммоль/л (0 - 100 ммоль/л) | 21,29±14,61 (3,1-65,4) | 20,09±3,58 (15,0-26,8) | 0,773 |
| Cl- мочи, ммоль/л (150 -2500 ммоль/сутки) | 41,3±20,44 (20,0-101,0) | 36,15±12,04 (21,0-51,0) | 0,395 |
P=(
)*100, где e – константа (loge);
P - вероятность наступления исследуемого события, Y – логит-преобразование, 
- значение признака «гестационный возраст», 
- значение признака «Na крови, ммоль/л», 
- значение признака «микроальбумин, мг/л», 
- значение признака «карбоангидраза/креатинин мочи», 
- значение признака «непрямой билирубин».
Рис. 6 Алгоритм выделения новорожденных высокого риска развития патологии почек. Схема наблюдения на первом году жизни.
Полученный результат выражается в %, степень риска определяется в соответствии с установленными границами: < 25 - низкий; 25 50 - средний; > 50 высокий риск развития патологии почек. Наличие сопряженности с достоверностью составляет 96%.
Таким образом, персонифицированный прогноз развития патологии почек возможен на основании автоматизированной прогностической модели и оценочных прогностических таблиц. Модель и таблицы могут быть использованы в повседневной практике врача-неонатолога и педиатра. В результате проведенного исследования разработан новый методологический подход прогнозирования развития патологии почек у новорожденных (алгоритм) (рис.6) и научно обоснована концепция профилактики заболеваний почек у детей в онтогенезе.
Выводы
- В структуре младенческой смертности по Приморскому краю пороки развития почек в 2001 – 2010 гг. выявлены в 3% случаев. Анализ протоколов аутопсийных исследований выявил, что у плодов от женщин с патологией почек достоверно чаще встречались врожденные пороки развития мочеполовой системы, желудочно – кишечного тракта, а также множественные врожденные пороки развития (p = 0,002).
- Разработана формализованная система клинико-функциональной оценки риска повреждения почек у новорожденных: низкий риск при суммарной оценке 0 баллов, высокий риск – 1 и более баллов. При этом чувствительность комплексной оценки (Se) равна 100%; специфичность (Sp) - 50%.
- Определена роль тучно-клеточной популяции в формировании патологии почек в зависимости от степени перенесенной гипоксии, срока гестации и продолжительности жизни новорожденного. Так с увеличением гестационного возраста и продолжительности жизни ребёнка число тучных клеток возрастало от 3,67 ± 1,15 до 12,33 ± 2,52/мм2 у мертворожденных плодов и от 6,0±1,0 до 23, 67±4,04/ мм2 у новорождённых, проживших более суток и подвергавшихся продолжительному воздействию гипоксии. Выявлена сильная положительная корреляционная связь между сроком гестации и количеством мастоцитов в капсуле (r = 0,86; р < 0,03), в паренхиме (r = 0,99; р < 0,02) и диафоразной активностью (r = 0,77; р < 0,04), а также сильная отрицательная корреляция между гестационным возрастом и индексом дегрануляции клеток в капсуле (r = -0,77; р < 0,04), в паренхиме (r = -0,80; р < 0,03).
- Установлена взаимосвязь популяции циркулирующих базофилов и тканевых мастоцитов: умеренная положительная корреляция между количеством базофилов в крови и тучных клеток в капсуле (r = 0,42; р = 0,05 и в воротах почки (r = 0,61; р = 0,04). Таким образом, установлена активность тучно-клеточной популяции на различных уровнях (клеточном, тканевом, организменном).
- Обнаружены достоверные изменения уровня естественных ауто-АТ к антигенам тканей почек с одновременным нарушением общей иммунореактивности у новорожденных от женщин с патологией почек.
- Доказана информативная и прогностическая значимость биохимических тестов крови и мочи новорожденных детей в диагностике ишемического повреждения почек (креатинина, лактата, микроальбумина, Na+, К+ и карбоангидразы) на основании расчета их степени чувствительности и специфичности.
- Разработаны формализованная и автоматизированная математическая модель и оценочные прогностические таблицы выделения групп риска формирования патологии почек у новорождённых на основе прогностически значимых клинико-лабораторных показателей. Наличие сопряженности с достоверностью прогнозирования составляет 96%.
Практические рекомендации
- Для прогнозирования исхода беременности рекомендуется использовать выявленные значимые факторы риска (болезни почек и экстрагенитальные заболевания у матери, вредные привычки, беременность в результате ЭКО) и клинико-функциональные информативные критерии (оценка анамнеза по шкале Kainer, состояние плода по данным КТГ и новорожденного по шкале Апгар, степень медикаментозной нагрузки по шкале NTISS), позволяющие оценить степень риска повреждения почек у плода и выделить среди новорождённых группы риска по развитию патологии мочевой системы.
- Выявленная взаимосвязь популяций циркулирующих и тканевых базофилов и их реакции на перенесенную гипоксию даёт возможность предположить роль тучных клеток в созревании структурно-функциональных элементов нефрона почки с учётом мастоцитарной функциональной активности в отношении регуляции микроциркуляции и ангиогенеза. Это может быть использовано в дальнейших научных исследованиях базовых механизмов формирования патологии почек.
- Исследование уровня аутоантител к тканям почки с использованием тест-систем «ЭЛИ-Висцеро-Тест» и «ЭЛИ-Нефро-Тест» и некоторых биохимических тестов крови и мочи новорожденных детей (креатинина, лактата, микроальбумина, Na+, К+ и карбоангидразы) необходимо включить в протокол обследования новорожденных и детей первого года жизни.
- С целью раннего выявления пре- и перинатального повреждения почек предлагается использовать алгоритм, математическую прогностическую модель и оценочные прогностические таблицы отбора новорожденных в группу высокого риска формирования нефрологической патологии для составления индивидуальной программы наблюдения в течение первого жизни.
Список научных работ,
опубликованных по теме диссертации
- Лучанинова В.Н. Анализ структуры и факторы риска развития патологии почек у плодов / В.Н.Лучанинова, Т.В. Погодаева, А. Ни // Уральский медицинский журнал. – 2011. - № 7 (85). – С. 97 – 102.
- Лучанинова В.Н. Нитроксидпродуцирующая функция почек у детей при хроническом пиелонефрите с нефрогенной артериальной гипертензией / В.Н. Лучанинова, Е.Г. Агапов, Т.В. Погодаева // Клиническая нефрология, 2011. - № 4.- С.50 – 54.
- Лучанинова В.Н. Значимые факторы риска перинатального периода в формировании патологии почек у детей / В.Н. Лучанинова, Т.В. Погодаева, Е.В. Новицкая, Г.А. Моторина, Р.А. Гармаш // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2011. - № 4. – С.59 – 60.
- Лучанинова В.Н. Иммунохимический скрининг с целью определения предрасположенности к патологии почек у новорождённых / В.Н. Лучанинова, Т.В. Погодаева // Нефрология. – 2012. - № 1. – С.82 – 88.
- Погодаева Т.В. Морфофункциональная характеристика тучных клеток почек на разных стадиях онтогенеза человека / Т.В. Погодаева, В.С. Каредина, В.Н. Лучанинова //Молекулярная медицина. – 2012. - № 3. – С.54 – 60.
- Лучанинова В.Н. Региональные факторы риска формирования патологии органов мочевой системы в Приморском крае / В.Н.Лучанинова, Т.В. Погодаева, О.В. Семешина, А. Ни // Педиатр, 2011. – Т.2. - № 1. – С.71 – 72.
- Morphofunctional characteristic of mast cells at different stages of kidney human ontogenesis / V. Luchaninova, T. Pogodaeva, V. Karedina // Abstract of the ISN Forefronts Symposium on Systems Biology and the Kidney. Ann Arbor. – 2012. – P. 216.
- Cellular mechanisms of the kidney pathology formation / V. Luchaninova, T. Pogodaeva, V. Karedina // Pediatric Nephrology. 2012.Vol.26, №9. – P. 1645 – 1646.
- Лучанинова В.Н. Актуальность определения морфологических и биохимических критериев формирования врождённых пороков мочевыводящей системы / В.Н. Лучанинова, Т.В. Погодаева, О.В. Семешина, А.Ни // Сборник материалов XV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии». Москва. – 2011. – С.524.
- Погодаева Т.В. Прогнозирование формирования патологии органов мочевыделительной системы / Т.В. Погодаева // Сборник научных трудов VIII межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров «Здоровье детей – наше будущее!». Томск: СГМУ. – 2011. – С. 84 – 85.
- Погодаева Т.В. Об эффективности ультразвукового скрининга у детей с врожденной патологией мочевыводящей системы / Т.В. Погодаева, Н.В. Селиванова, Л.В. Мельникова // Современные тенденции в здравоохранении: новый взгляд: сборник материалов республиканской научно-практической конференции. Якутск: СВФУ, 2011. – С. 61 – 62.
- Погодаева Т.В. Показатели аутоиммунитета у новорождённых как биомаркёры риска развития патологии. / Т.В. Погодаева, В.Н. Лучанинова, А.В. Выхрестюк // Материалы I международного Конгресса по перинатальной медицине, посвящённого 85-летию академика В.А. Таболина. – Москва, 2011. – С.135 – 136.
- Погодаева Т.В. Определение причин формирования морфо-функциональных нарушений почек у новорождённых / Т.В. Погодаева, В.Н. Лучанинова // Материалы Российского форума «Педиатрия Санкт-Петербурга: опыт, инновации, достижения». – СПб, 2011. – С131 – 132.
- Погодаева Т.В. Естественный аутоиммунитет - доклинический биомаркер патологии у новорожденных / Т.В. Погодаева, В.Н. Лучанинова, Г.Ф. Погорелова, А.В. Выхрестюк // Материалы X Российского конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». – Москва, 2011. – С.177.
- Погодаева Т.В. Определение прогностически значимых факторов риска формирования патологии почек у детей / Т.В. Погодаева, В.Н. Лучанинова, Е.В. Новицкая // Материалы X Российского конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва, 2011. – С. – 216 – 217.
- Погодаева Т.В. Актуальность диагностики почечной патологии у новорожденных от матерей с заболеваниями почек / Т.В. Погодаева, Р.А. Гармаш, А.И. Перцова, Г.О. Моторина, Е.В. Гущина // Тезисы докладов XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». Владивосток: Медицина ДВ. – 2011. – С. 170 – 171.
- Погодаева Т.В. Методика оценки прогноза жизни новорожденных / Т.В. Погодаева // Сборник материалов XVI Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии». – Москва, 2012. – С. 590.
- Погодаева Т.В. Диагностика предрасположенности к патологии почек у новорождённых / Т.В. Погодаева // Тезисы докладов XIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». Владивосток: Медицина ДВ. 2012. С. 235.
- Погодаева Т.В. Прогнозирование развития лекарственной нефропатии у новорожденных / Т.В. Погодаева // Тезисы докладов XIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». Владивосток: Медицина ДВ. 2012. – С. 236.
- Погодаева Т.В. Исследование биохимических показателей гипоксического поражения почек у новорожденных / Т.В. Погодаева, Н.А. Сырцова, Е.Ф. Топорова, Е.М. Осташкова // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Здоровые дети – здоровое будущее» с международным участием. Н. Новгород: НГМА, 2012. – С. 30 – 31.
- Лучанинова В.Н. Морфофункциональная характеристика тучных клеток почек плодов и базофилов крови новорожденных / Лучанинова В.Н., Каредина В.С, Погодаева Т.В. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Здоровые дети – здоровое будущее» с международным участием. Н. Новгород: НГМА, 2012. – С. 37 – 38.
- Лучанинова В.Н. Факторы риска заболеваний органов мочевой системы у детей / В.Н Лучанинова, Т.В. Погодаева, О.В. Семешина, А. Ни, В.К. Ковальчук // Сборник научных трудов межрегиональной научно-практической конференции. Архангельск: СГМУ, 2012. – С. 60 – 61.
Перечень рационализаторских предложений: 1. Использование критериев оценочной шкалы NTISS для прогноза жизни новорожденных (№2790, 15.11.2011г.). 2. Определение уровня карбоангидразы в моче как метод ранней диагностики ишемического поражения почек у новорожденных (№ 2796, 20. 03. 2012 г.). 3. Иммунохимический скрининг с целью определения предрасположенности к патологии почек у новорожденных (№ 2797, 20. 03. 2012 г.).
Перечень информационных писем: 1.Иммунохимический скрининг с целью определения предрасположенности к патологии почек у новорождённых.
2. Определение уровня карбоангидразы в моче как метод ранней диагностики ишемического поражения почек у новорожденных.
Список Используемых сокращений
CD117, CD34 - кластеры дифференцировки
NTISS - Therapeutic Intervention Scoring System – шкала оценки степени терапевтического вмешательства
ААТ – аутоантитела
АД – артериальное давление
АР – атрибутивный риск
ВПП – величина профильного поля
ВПР – врожденные пороки развития
ГВ – гестационный возраст
ИД – индекс дегрануляции
ОМС – органы мочевой системы
СКФ – скорость клубочковой фильтрации
ТК – тучные клетки
Работа выполнена в рамках научного направления ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России: «Разработка современных технологий профилактики, диагностики и лечения неинфекционных заболеваний» и при поддержке государственного контракта № 16.512.11.2072 Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме НИР: «Разработка методов неонатального скрининга и/или персонифицированной терапии».
