Морфогенетическая активность дерморфина и его аналогов в различных клеточных популяциях
На правах рукописи
ФЛЕЙШМАН
Марина Юрьевна
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ ДЕРМОРФИНА И ЕГО АНАЛОГОВ
В РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Владивосток
2010
Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской
лаборатории ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный
медицинский университет Росздрава»
Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор
Тимошин Сергей Серафимович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Склянов Юрий Иванович
ГОУ ВПО «Новосибирский государственный
медицинский университет Росздрава»
доктор биологических наук
Вараксин Анатолий Алексеевич
ГУ Институт биологии моря, г. Владивосток
доктор медицинских наук, профессор
Елисеева Екатерина Валерьевна
ГОУ ВПО «Владивостокский государственный
медицинский университет Росздрава»
Ведущая организация: ГУ НИИ морфологии человека РАМН
(г. Москва)
Защита диссертации состоится 22 октября 2010 года
в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава» (690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Владивостокского государственного медицинского университета
по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2
Автореферат разослан «___»______________2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Г.В. Рева
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Регуляторные пептиды филогенетически самая древняя форма управления. Они обнаружены у прокариот и выявлены, фактически, во всех тканях млекопитающих. Это дало основание для положения, что, «все органы и ткани животных являются эндокринными и секретируют гормоны пептидной природы» (Панков Ю. А., 1996; 2005).
Семейство опиоидных пептидов наиболее многочисленное и самое изученное из представителей регуляторных пептидов (Зайцев С. В. и соавт. 1993; Ашмарин И. П., 2005). Выделение эндогенных опиоидных пептидов изменило представление о функционировании регуляторных систем. Рецепторы опиоидных пептидов были идентифицированы в нейронах, в клетках иммунной и эндокринной систем, в клетках ЖКТ и др. Способность клеток интегративной системы секретировать различные регуляторные пептиды, а также наличие на них рецепторов к этим пептидам обеспечивает «закольцованность» интегративных систем в единый регуляторный континуум (Koroleva S. V., Ashmarin I. P., 2002, 2006).
Высокая физиологическая активность РП послужила толчком для создания на основе их химических аналогов фармакологических препаратов. Список подобных лекарств исчисляется сотнями (Oliver K.R. et al., 2000; Brain S.D., Cox H.M., 2006; Delgado M., Ganea D., 2008). Это в полной мере относится к опиоидным пептидам.
Дерморфины – особый класс семейства опиоидных пептидов. У всех природных дерморфинов присутствует N-концевая последовательность Tyr-D-Ala-Phe, в которой между двумя ароматическими кольцами Tyr и Phe расположен D-аминокислотный остаток аланина, что обусловливает специфику биологической активности дерморфинов. Устойчивость дерморфина к действию эндогенных пептидаз, а также уникальная анальгетическая активность, превышающая этот показатель у морфина на два порядка, послужили предпосылкой для создания синтетических аналогов дерморфина.
Изучение биологической активности пептидов выявило их адаптогенные свойства, способность влиять на терморегуляцию, сон и оказывать антиалкогольное воздействие (Громова Е.А. и соавт., 1989; Ярова Е.П., 1990; Ковальзон В.М. и соавт., 2002; Емельянова Т.Г. и соавт., 2007; Reddy P. A. et al., 2009). В наших предыдущих исследованиях было установлено, что дерморфин и его аналоги вовлечены в регуляцию процессов клеточного деления.
Одна из тенденций современных фундаментальных исследований в биологии направлена на получение предпосылок к созданию на основе исследуемых эндогенных регуляторов фармакологических препаратов. В настоящее время на базе одного из аналогов дерморфина – седатина (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH), создается лекарственная форма. Препарат является официнальным в ветеринарии и готовится к клиническим испытаниям. Поэтому всестороннее изучение его влияния на различные цитофизиологические процессы имеет прикладное значение.
На момент начала настоящей работы оставались неизученными такие важные аспекты влияния дерморфинов, как участие в поддержании тканевого гомеостаза в условиях патологии, в частности, при НПВП-гастропатии. Неизвестны механизмы, посредством которых дерморфины реализуют свое цитопротективное действие в этих условиях. Ранее нами было изучено влияние дерморфинов на процессы пролиферации у крыс.
Вопрос о способности влияния представителей этого семейства опиатов на процессы регенерации у других представителей типа хордовых, в частности, у рыб, отсутствует. Не исследовалось влияние дерморфинов на ранние этапы онтогенеза и возможные долгосрочные эффекты аналогов дермофина.
Отсутствовали сведения о вовлеченности дерморфина и его аналогов в регуляцию процессов свободнорадикального окисления. В последние годы имеет место переосмысливание представлений о свободнорадикальном окислении, как важном факторе патогенеза и регуляции, в том числе, процессов клеточного деления.
Цель настоящего исследования:
Изучить влияние дерморфина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях.
Задачи исследования:
- Изучить характер влияния дерморфина и его аналогов, обладающих различным сродством к мю- и дельта- рецепторам, на процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях.
- Изучить характер влияния дерморфина и его аналогов на процессы синтеза ДНК при непосредственном воздействии (аппликации на роговицу и введении в культуру дермальных фибробластов).
- Изучить характер влияния различных доз аргининсодержащего аналога дерморфина – седатина на процессы синтеза ДНК в эпителии слизистой оболочки желудка и роговицы белых крыс.
- Изучить характер влияния аналогов дерморфина на процессы синтеза ДНК в СОЖ при НПВП-гастропатии.
- Изучить механизмы цитопротективного действия седатина при НПВП-гастропатии.
- Изучить характер влияния аналогов дерморфина на процессы морфогенеза осетровых рыб и оценить возможность отдаленных эффектов при обработке оплодотворенной икры пептидами.
- Изучить возможность использования аналогов дерморфина для оптимизации процессов разведения осетровых рыб.
Научная новизна:
Впервые установлена способность седатина стимулировать процессы синтеза ДНК в эпителии желудка в широком диапазоне доз.
Впервые установлена способность седатина осуществлять протективный эффект при нарушении целостности СОЖ, индуцированном производными ацетилсалициловой кислоты.
Впервые установлено участие системы Arg-NOS в протективном эффекте седатина при НПВП-гастропатии.
Впервые установлено, что обработка оплодотворенной икры осетровых рыб седатином оптимизирует процессы развития осетровых рыб.
Впервые разработан метод использования седатина для оптимизации процессов разведения осетровых рыб.
Практическая значимость:
- Установленная нами способность седатина – потенциального фармакологического препарата – оказывать цитопротективные эффекты при НПВП-гастропатии, может быть использована в клинической практике для профилактики нарушений целостности СОЖ при приеме нестероидных противовоспалительных препаратов.
- Разработанный нами метод оптимизации разведения осетровых рыб используется на рыборазводных предприятиях Дальнего Востока.
- Обнаруженные нами закономерности влияния аналогов дерморфина на процессы синтеза ДНК в норме и при патологии могут быть использованы при планировании направленного синтеза пептидов, обладающих цитопротективным действием.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Седатин уменьшает язвенно-эрозивные поражения, индуцированные в желудке нестероидными противовоспалительными препаратами.
- В реализации морфогенетических эффектов седатина важная роль принадлежит его способности ослаблять проявления окислительного стресса.
- Обработка икры осетровых рыб седатином оптимизирует процессы развития молоди.
Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 32 научных работ (из них 16 – в изданиях рекомендуемых Высшей Аттестационной Комиссией), 2 патента РФ, 4 статьи в международных журналах; 3 – тезисы докладов на конференциях с международным участием.
Апробация работы:
Основные положения диссертации представлены на 2-ом съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995); на научно-практической конференции с международным участием «Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке» (Хабаровск, 1997); на научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные и клинические аспекты охраны здоровья детского и взрослого населения Дальневосточного региона» (Хабаровск, 2003); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Хабаровск, 2010).
Внедрение результатов:
Полученные данные о характере влияния регуляторных пептидов (синтетических аналогов дерморфина) на состояние тканевого гомеостаза внедрены в курс лекций на кафедре нормальной физиологии ДВГМУ. Использование седатина по запатентованной нами схеме применяется на рыборазводных предприятиях Крайрыбакколхозсоюза, а также на Владимировском, Анюйском и Новоамурском предприятиях.
Объем и структура диссертации:
Диссертация состоит из оглавления, списка сокращений, введения, 6 основных глав, выводов и списка литературы, включающего ссылки на публикации 152 отечественных и 331 иностранных авторов. Объем диссертации составляет 201 страницы машинописного текста и включает 24 таблицы и 27 рисунков.
Содержание работы
Характеристика исследуемых веществ
Изучали влияние дерморфина и его аналогов на морфогенетические процессы у млекопитающих и рыб. Cинтез пептидов осуществлялся в лаборатории химии пептидов (Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН) профессором, д.м.н. В.И. Дейгиным и к.б.н. Е.П. Яровой. В настоящей работе исследовали дерморфин и пептиды, получившие условные названия в лаборатории и имевшие следующие структурные формулы:
«дерморфин» - Н-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2
«A-10» - H-Tyr-D-Orn-Phe-Gly-OH
«A-43» - H-Arg-Tyr-D-Arg-Phe-D-Ala-NH2
«A-17» - H-Arg-Tyr-D-Lys-Phe-Gly-OH
«седатин» - H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH
«седатин без аргинина» - H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH
Пептиды синтезировались с применением классического и твердофазного методов синтеза. Очистка и контроль производилась с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии) и тонкослойной хроматографии, в условиях, индивидуально подобранных для каждого аналога. Содержание пептидов в сухом веществе составляло не менее 97,5%. Вещества идентифицированы данными метода 1Н-ЯМР спектроскопии высокого разрешения (500 МГц.). Мы благодарим д.м.н., проф. В.И. Дейгина за предоставленные вещества.
По результатам биологического тестирования А10 и А43 относятся, в основном, к классу - агонистов (тест GPI). А17 и седатин проявляют подобные свойства в отношении - рецепторов, но, по сравнению с А10 и А43, активно взаимодействуют с - рецепторами (тест MVD).
В экспериментах, где применялся ингибиторный анализ, использовались вещества L-NAME и налоксон:
«L-NAME» - метиловый эфир NG-нитро-L-аргинина («ICN Biomedicals Inc.», USA) – неселективный ингибитор cNOS использовался в дозе 9,3х10-5 моль/кг (Boer R. et al., 2000).
«Налоксон» – налоксон-гидрохлорид (“Endo Lab.”, USA) – блокатор опиоидных рецепторов, использовался в дозе 5,5х10-4 моль/кг.
Экспериментальные животные, объекты
и методы исследования
Опыты проводили на белых крысах-самцах массой 160-210 г., и самцах белых мышей массой 25 – 30 г. Содержание животных и проведение экспериментов осуществлялось в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. Экспериментальные группы формировали из 8-12 животных, достоверно не различающихся между собой по показателю массы.
Животных содержали при температуре 18-20оС, естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Всего в работе использовано 1123 животных. Дерморфин и его аналоги исследовали в дозах 0,1 мкг/кг–1 мг/кг. В основной группе исследований пептид вводился в дозе 10–100 мкг/кг. Вещества вводили внутрибрюшинно с 11 до 12 часов дня. Контролем служили интактные животные, а также животные, подвергнутые инъекции эквиобъемного количества (0,1 мл на 100 г. массы тела) стерильного изотонического раствора хлорида натрия в соответствующем режиме.
Объектом исследования служили эпителиальные ткани лабораторных мышей и крыс. Изучали влияние пептидов на синтез ДНК в эпителии роговицы и слизистой оболочке фундального отдела желудка.
Кроме внутрибрюшинного введения дерморфина и его аналогов лабораторным мышам и крысам, исследовалась аппликация пептидов на роговицу и инкубация культуры фибробластов. В экспериментах с осетровыми породами рыб осуществлялась водная аппликация веществ (Лаптев В.И., 1981). В ряде экспериментов исследовали свойства пептидов в отношении заживления язв ЖКТ. На фоне пятидневного введения пептида в дозе 100 мкг/кг животные через желудочный зонд получали раствор нестероидных противовоспалительных препаратов (индометацина) в дозе 250 мг/кг, что вызывало повреждения СОЖ. Использовались зонды оригинальной конструкции (двух размеров – для мышей и крыс).
Морфометрическую оценку действия пептида осуществляли путем вычисления суммарной площади язв слизистой оболочки желудка. Использовали компьютерную морфометрическую приставку «МЕКОС-Ц»
Эвтаназию осуществляли посредством быстрой декапитации предварительно оглушенных крыс через 4 и 24 часа после заключительной инъекции пептида.
При оценке влияния аналогов дерморфина на развитие осетра амурского Acipenser schrenckii исследования проводили на икре и молоди. Получение половых продуктов и выращивание мальков амурского осетра осуществлялось в производственно-экспериментальных цехах рыболовецких колхозов «Новоамурский», Анюйский РЗ, Владимировский РЗ. Инкубацию осетровых осуществляли в стадии набухания оплодотворенной икры. Контрольные и подопытные образцы икры получены от одной самки для минимизации генетических различий. Каждая экспериментальная и контрольная группы включали около 30000 икринок. После вылупливания предличинок поштучно пересаживали по 2500 особей в бассейны на подращивание. Наблюдение за общим состоянием, поведенческими реакциями, а также анализ соматометрических показателей молоди осетра осуществляли в течение 2 месяцев (60 дней) – с момента выклева до периода помещения особей в естественную среду обитания. Массо-ростовые показатели, индекс упитанности по Фултону определяли на 22, 38, 60 сутки.
Процессы синтеза ДНК оценивали с помощью авторадиографии с 3Н-тимидином. Тимидин вводили в дозе 0,6 мкКu/г массы тела крысам и 1 мкКu/г массы тела мышам. Радиоавтографы изготавливали по принятой в лаборатории методике. Использовали фотоэмульсию двух видов: производства НИИХИМФОТО и KODAK Autoradigraphy Emulsion, (Type NTB, for Light Microscope Autoradiography). Индекс меченых ядер (ИМЯ) определяли на основании просмотра 2,5-3 тысяч клеток и выражали в процентах. Интенсивность метки (ИМ) подсчитывали как среднее количество зерен серебра над 50 мечеными клетками.
Определение морфометрических показателей ядрышек и ядра проводили, основываясь на работах Мамаева Н.Н. и соавт. (1989) и Цыганкова В.И. и соавт. (2004, 2006). Под притертые стекла, покрывающие депарафинированные и гидратированные срезы, вводили гель из смеси 1 части желатины, приготовленной на 1% растворе муравьиной кислоты и 2 частей 50% раствора азотнокислого серебра. Стекла выдерживали в термостате при 37o С 10-15 минут. Морфометрию ядрышек и ядер проводили на анализаторе изображения «МЕКОС–Ц», окуляр 7х, объектив 60х. Для определения содержания общего белка в мышцах рыб в препаратах, окрашенных амидочерным 10В, оценивали оптическую плотность мышечных волокон, служившую показателем концентрации суммарного белка. Измерения не менее 50 мышечных клеток каждой особи проводили на анализаторе изображения «МЕКОС-Ц». Проводили морфометрию средней и интегральной оптической плотности миоцитов, их площади и периметра.
Для интегральной оценки процессов свободнорадикального окисления гомогенатов тканей желудка и сыворотки крови использовали метод хемилюминесценции. Регистрацию ХЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER». Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХЛ исследовали по методу Владимирова Ю.А. (1991) и Арутюнян А.В. (2000). Определяли: светосумму за 1 мин. спонтанной ХЛ (Sсп.), величина которой коррелирует с интенсивностью генерации свободных радикалов; максимум быстрой вспышки (H1) индуцированной ХЛ, свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов, светосумму (Sинд.1) за 2 мин. после "быстрой" вспышки, отражающую скорость накопления перекисных радикалов липидной природы. Кинетику ХЛ, инициированную H2O2 в присутствии люминола анализировали по двум параметрам (Арутюнян А.В. и соавт., 2000): максимуму свечения (H2), указывающему на потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению, и светосумме за 2 мин. ХМЛ (Sинд.2), величина которой свидетельствует об активности антиоксидантной антирадикальной защиты. Интенсивность ХЛ, измеренную в милливольтах, рассчитывали на 1 г влажной ткани или в 1 мл сыворотки, выражали в относительных единицах.
Определение содержания гистамина в ткани желудка белых мышей проводили флюориметрическим методом (Сидельников Ю.Н., Сиворакша Г.А., 1994).
Исследования процессов пролиферации в культуре дермальных фибробластов белых крыс проводились на первичной культуре по методике, описанной Д.С. Саркисовым и соавт. (1995). Обработка регуляторными пептидами проводилась путем добавления раствора пептида в культуральную среду в концентрации 100 мкг/мл с последующей инкубацией в течение 3 часов. Затем, для приготовления радиоавтографов, клеточные монослои помещали в раствор 3Н-тимидина (1 мкКu/мл) на 1 час. После отмывки монослоев в растворе Хэнкса и фиксации в 96% этаноле производили приготовление радиоавтографов по принятой в лаборатории методике.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием компьютерной программы «Statistica 5.5». Данные подопытных и контрольных групп подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05 (Рокицкий П.Ф., 1961; Сепетлиев Д.А., 1968; Боровиков В.П., 1998).
Результаты исследования и их обсуждение
Собственные исследования подразделяются на три части:
1. Влияние дерморфина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях;
2. Влияние дерморфина и его аналогов на индуцируемое индометацином повреждение слизистой оболочки желудка;
3. Влияние аналогов дерморфина на ранние периоды развития рыб осетровых пород.
Влияние дерморфина и его аналогов на процессы синтеза ДНК
в различных клеточных популяциях
При однократом введении селективных мю-агонистов – дерморфина, А10 и А43 в дозе 10 мкг/кг имело место достоверное уменьшение ИМЯ в роговице через 4 и 24 часа после инъекции в 1,8 – 2,0 раза. Мю-дельта- агонисты седатин и А17 в этой дозировке не оказывали влияния на синтез ДНК в эпителии роговицы. Введение А10, А43, седатина и А17 привело к достоверному увеличению ИМЯ в эпителии фундального отдела желудка через 24 часа после введения пептидов. Аналогичная картина имела место при пятикратном введении пептидов в дозе 100 мкг/кг; при этом, мю-дельта-агонист седатин вызывал почти двукратное увеличение ИМЯ в эпителии роговицы. В эпителии желудка введение всех трех мю-агонистов (дерморфина, А10, А43) и введение мю-дельта-агонистов (седатина и А17) активировало синтез ДНК ( ИМЯ увеличивался в 1,4 – 1,5 раза). Это совпадает с данными литературы о том, что в тканях, где широко представлены мю-рецепторы, опосредующие аналгетический эффект, при введении лигандов этих рецепторов имеет место торможение процессов пролиферации (Радивоз М.И. и соавт., 1991; Тимошин С.С. и соавт., 1993). В энтодермальном эпителии желудка, где главным образом представлены дельта-рецепторы, мю-агонисты, взаимодействуя с ними, стимулируют пролиферативные процессы (Тимошин С.С. и соавт., 1993).
Другим существенным положением, основанным на данных этой группы экспериментов, было свойство остатка молекулы аргинина модифицировать способность опиатных пептидов оказывать влияние на пролиферативные процессы (рис. 1).
Рисунок 1. Влияние мю-агонистов опиатных рецепторов на
Рис. 1. Процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы через 4 часа после введения пептидов и желудка – через 24 часа после введения пептидов.
Примечание: * р<0,05 по отношению к контролю.
* * р<0,05 различия достоверны между подопытными группами.
Синтетические аналоги дерморфина А10 и А43 являются селективными мю-агонистами (Ярова Е.П., 1987), при этом в структуре А43 аргинин присутствует в С-концевом положении. Присутствие аргинина в молекуле аналога дерморфина привело к достоверно меньшей депрессии ИМЯ в эпителии роговицы и к более выраженной стимуляции в эпителии желудка по сравнению с «безаргининовым» А10.
Доказательством зависимости митогенного эффекта аналогов дерморфина от присутствия в структуре пептида остатка аргинина послужили результаты опытов по оценке влияния на пролиферацию седатина (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH) и его безаргининового аналога (H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH).
Пятикратное введение седатина в дозе 100 мкг/кг индуцировало выраженную стимуляцию процессов синтеза ДНК в эпителии СОЖ – ИМЯ увеличился в 1,6 раза, ИМ при этом не изменялась (табл. 1).
Таблица 1
Влияние пятикратного введения аналогов дерморфина на процессы синтеза ДНК в эпителии желудка белых крыс (M ± m)
| контроль | седатин | седатин без аргинина | |||
| ИМЯ% | ИМ | ИМЯ% | ИМ | ИМЯ% | ИМ |
| 10,19±0,62 | 7,59±0,87 | 16,32±0,99* | 9,41±1,56 | 10,35±0,93 | 6,98±0,72 |
Примечание: * p<0,05
Безаргининовый аналог не оказал влияния на процессы синтеза ДНК. Аналогичная картина имела место в опытах с другим аргининсодержащим опиатным пептидом даларгином. В то время, как даларгин (Tyr-DAla-Gly-Phe-Leu-Arg), стимулировал синтез ДНК в эпителии фундального отдела желудка, его безаргининовый аналог утрачивал эту способность (Животова Е.Ю и соавт., 2007). На примере даларгина было показано, что в начальный период метаболизма in vivo происходит отщепление остатка аргинина от молекулы пептида. Aргинин является важным фактором фунционирования системы NOS-NO, которая, в свою очередь, является ключевым фактором поддержания кровотока в желудке, обеспечивающего поддержание целостности СОЖ. Для оценки роли этого механизма в реализации митогенного действия седатина были проведены эксперименты с блокадой NOS с помощью L-NAME. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние пятикратного введения седатина и L-NAME на процессы синтеза ДНК в эпителии желудка белых крыс (M ± m)
| контроль | L-NAME | L-NAME+седатин | |||
| ИМЯ% | ИМ | ИМЯ% | ИМ | ИМЯ% | ИМ |
| 12,49±1,15 | 19,1±1,55 | 7,67±0,84* | 13,5±1,0* | 6,52±0,53* | 14,7±1,65* |
Примечание: * p<0,05
Наши данные совпадают с результатами исследований, в которых введение L-NAME приводило к угнетению синтеза ДНК в миокарде новорожденных крыс. При этом, в эпителии кожи и в мышечной оболочке кишечника синтез ДНК не изменялся (Сазонова Е.Н., Пикалова В.М., Тимошин С.С., 2002). Введение седатина на фоне L-NAME не оказало влияния на процессы пролиферации по сравнению с группой животных, получавших только L-NAME. Эти эксперименты подтвердили важную роль тонического влияния NO-NOS на поддержание тканевого гомеостаза в СОЖ. Блокада NOS привела к выраженному угнетению синтеза ДНК в СОЖ. ИМЯ уменьшился в 1,6 раза. Уменьшение числа ДНК-синтезирующих ядер сопровождалось уменьшением ИМ, свидетельствующим о замедлении скорости синтеза ДНК. Такая же закономерность имела место в эксперименте с даларгином. Введение его на фоне L-NAME отменяло способность стимулировать синтез ДНК в СОЖ (Животова Е.Ю и соавт., 2007).
Результаты этих исследований, в определенной степени, объясняют механизмы, через которые аргининсодержащие опиоидные пептиды реализуют свое воздействие на тканевой гомеостаз. Несмотря на наличие общих свойств у даларгина и седатина, некоторые физиологические и цитофизиологицеские эффекты различны. Оба пептида обладают антистрессорной активностью, при этом даларгин оказывает гипотензивное и релаксирующее влияние, а седатин повышает концентрацию внимания. В наших экспериментах седатин и его безаргининовый аналог не оказывали влияния на процессы синтеза ДНК в дермальных фибробластах in vitro. В опытах Е.Ю. Животовой (2010) даларгин стимулировал синтез ДНК в фибробластах. Аппликация седатина на роговицу не оказывала влияния на синтез ДНК, в то время, как даларгин в этих условиях оказывал стимулирующее влияние.
Особо следует подчеркнуть способность седатина стимулировать синтез ДНК в эпителии желудка в широком диапазоне доз от 0,1 мкг/кг до 1 мг/кг (табл. 3).
Таблица 3
Влияние пятикратного введения различных доз седатина
на процессы синтеза ДНК в эпителии желудка белых крыс (M ± m)
| Группа животных | Дозы пептида | ||||
| 0,1 мкг/кг | 1 мкг/кг | 10 мкг/кг | 100 мкг/кг | 1 мг/кг | |
| ИМЯ % через 24 часа после инъекции | |||||
| контрольная | 6,44±0,64 | 6,44±0,64 | 7,31±0,42 | 7,54±0,53 | 6,44±0,64 |
| подопытная | 10,73±1,13 | 9,13±0,31 | 11,10±0,51 | 11,61±1,11 | 13,02±1,57 |
Примечание: * р< 0,05
Индекс меченых ядер увеличивался в 1,42 - 2,02 раза. Дозы 0,1 мкг/кг и 1 мкг/кг приблизительно соответствуют 1,310-10 М/кг и 1,310-9 М/кг, что вполне сопоставимо со сверхнизкими дозами иммуноактивных пептидов, стимулировавших пролиферативные процессы в исследованиях Григорьева Е.И. и соавт. (2003).
Определенный вклад в стимуляцию пролиферативных процессов в СОЖ под влиянием седатина осуществляется за счет способности пептида оптимизировать процессы СРО в тканях желудка (табл. 4).
Таблица 4
Влияние введения седатина и безаргининового аналога седатина на показатели хемилюминесценции (в отн. ед.) гомогенатов желудка самцов белых крыс (M±m)
| Sсп. | Инд. ХМЛ (Fe2+) | Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2) | |||
| Н1 | S1инд. | H2 | S2инд. | ||
| Контроль Седатин Безарг. аналог седатина | 1,330±0,093 0,739±0,057* 1,450±0,081 | 2,280±0,077 1,500±0,093* 2,180±0,092 | 2,882±0,141 1,896±0,128* 2,209±0,121* | 2,150±0,106 1,77±0,09* 2,020±0,143 | 1,090±0.099 0,660±0,053* 1,060±0,094 |
Примечание: * p<0,05
Седатин проявил выраженные антиоксидантные антирадикальные свойства, о чем свидетельствует уменьшение значений S2инд, Н2 в 1,7 и 1,2 раза, соответственно. Это способствовало угнетению продукции свободных радикалов в целом (Sсп сократилась в 1,8 раза). Кроме того, наблюдалось снижение уровня гидроперикисей липидов (Н1) в 1,5 раза и торможение процессов образования и накопления перекисных радикалов (S1инд) в 1,5 раза. Введение безаргининового аналога седатина сопровождалось лишь снижением скорости образования свободных радикалов (S1инд снизилась в 1,3 раза).
Мы считаем, что наличие аргинина в синтетических аналогах опиоидных пептидов не определяет многообразия их биологических эффектов. Однако присоединение аргинина к лиганду опиоидных рецепторов приводит к модификации их морфогенетической активности.
Не универсальный митогенный эффект седатина в различных клеточных популяциях, сочетающийся с его способностью стимулировать синтез ДНК в эпителии СОЖ в широком диапазоне доз, опосредованность этого эффекта через активацию синтеза NO и ослабление проявления оксидативного стресса послужили предпосылками для применения пептида в целях профилактики НПВП-гастропатий.
Влияние дерморфина и его аналогов на индуцируемое индометацином повреждение слизистой оболочки желудка
НПВП-гастропатии у мышей моделировали посредством внутрижелудочного введения индометацина по описанной ранее методике. Средняя площадь язвенно-эрозивного поражения у животных, получавших индометацин без предварительного воздействия пептидов, составила 8,12±0,91 мм2. Введение дерморфина недостоверно снизило площадь повреждения СОЖ (7,10±1,10 мм2); пептид А10 утяжелил картину поражения слизистой (9,21±1,24 мм2), но различия также носили недостоверный характер. Результаты исследования состояния СОЖ у животных, получавших индометацин на фоне пятикратного введения седатина, свидетельствуют о протективном действии препарата в этих условиях (рис. 2). Об этом можно судить по уменьшению площади язвенно-эрозивных дефектов: в то время, как у животных, получавших индометацин, средняя площадь повреждения СОЖ составила 7,43±1,0 мм2, площадь язвенно-эрозивных дефектов СОЖ у мышей, получавших индометацин на фоне пятикратного введения седатина, уменьшилась до 4,24±1,12 мм2, то есть, поражение СОЖ уменьшилось в 1,75 раз.
Рис. 2: Влияние дерморфина и его аналогов на площади эрозивно-язвенного повреждения слизистой оболочки желудка белых мышей,
индуцируемые индометацином.
Примечание: * достоверное отличие от группы «индометацин» (р<0,05)
Одной из причин изъязвления СОЖ при воздействии НПВП считается угнетение процессов синтеза ДНК. В наших исследованиях наблюдалось достоверное уменьшение ИМЯ. В то время как показатель ИМЯ в контрольной группе составил 9,60 ± 0,34; у животных, получавших индометацин, ИМЯ уменьшился до 5,28 ± 0,20, то есть, в 1,8 раз (табл. 5). Другим важным показателем нарушения процессов пролиферации под воздействием индометацина является уменьшение ИМ, косвенно свидетельствующее об уменьшении скорости синтеза ДНК: в контроле ИМ составила 19,16 ± 0,70; под воздействием индометацина ИМ уменьшилась в 1,7 раз и составила 11,16 ± 0,90. Сочетание уменьшения количества ДНК синтезирующих клеток с уменьшением скорости прохождения клетками S-периода свидетельствует о выраженном нарушении процессов пролиферации.
Таблица 5
Влияние седатина и его безаргининового аналога на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых мышей, получавших индометацин (M±m).
| ИМЯ, % | ИМ | |
| контроль | 9,60 ± 0,34 | 19,16 ± 0,70 |
| индометацин | 5,28 ± 0,20* | 11,16 ± 0,90* |
| седатин пятикратно + индометацин | 7,92 ± 0,44 | 19,20 ± 1,17 |
| безаргининовый седатин пятикратно + индометацин | 5,38 ± 0,51* | 14,95 ± 1,69* |
Примечание: * р<0,05
Одним из механизмов протективного действия седатина при НПВП-гастропатиях, на наш взгляд, является его способность стимулировать пролиферативные процессы. Хотя ИМЯ в группе животных, получавших индометацин на фоне пятикратного введения седатина, оставался на уровне 7,92+0,44 (достоверно ниже показателя ИМЯ в группе интактного контроля), он достоверно – в 1,5 раза (р<0,05), превышал значение ИМЯ у животных из группы, получавшей только индометацин. Безаргининовый аналог седатина не оказал достоверного цитопротективного эффекта. Об этом свидетельствует отсутствие различий в величинах ИМЯ в СОЖ у животных в группах «индометацин» и «безаргининовый аналог седатина + индометацин».
Результаты ХМЛ анализа гомогенатов желудка животных, получавших НПВП, свидетельствуют о формировании выраженного оксидативного стресса. Все исследуемые показатели, характеризующие СРО, увеличивались, по сравнению с интактным контролем, в 2,7 – 4,8 раза (табл. 6).
Таблица 6
Влияние седатина и его безаргининового аналога на показатели
хемилюминесценции (в отн. ед.) гомогенатов желудка белых мышей,
получавших индометацин (M±m)
| Sсп. | Инд. ХМЛ (Fe2+) | Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2) | |||
| Н1 | S1инд. | H2 | S2инд. | ||
| контроль | 1,04±0,06 | 1,52±0,08 | 2,43±0,09 | 1,58±0,07 | 0,86±0,05 |
| индометацин | 3,26±0,24* | 4,17±0,22* | 9,32±0,60* | 5,94±0,37* | 4,12±0,20* |
| седатин + индометацин | 2,17±0,11* | 3,10±0,19* | 4,87±0,25* | 2,95±0,19* | 1,89±0,14* |
| седатин без аргинина + индометацин | 3,12±0,21* | 4,05±0,26* | 8,85±0,57* | 6,15±0,30* | 4,61±0,25* |
Примечание: * p<0,05
Полученные нами результаты соответствуют литературным данным о свободнорадикальных механизмах гастротоксичности нестероидных противовоспалительных препаратов (Евсеев М. А., 2007). Предварительное воздействие седатина вызывает коррекцию прооксидантно-антиоксидантного статуса тканей желудка у животных, получавших индометацин (табл. 6). Хотя ни один из исследуемых ХМЛ-показателей не достиг контрольного уровня, все они значительно приблизились к нему, достоверно изменившись в сравнении с показателями группы животных, получавших индометацин без коррекции – пятикратного введения седатина. Интенсивность СРО снижалась и за счет угнетения первичного этапа пероксидации липидов и замедления образования перекисных радикалов. Об этом свидетельствует уменьшение амплитуды Н1 – в 1,3 раза и величины S1 инд.. – в 1,9 раза, при сравнении показателей групп «индометацин» и «седатин + индометацин» (табл. 6). Подтверждением роли фланкирующего аргинина в реализации биологических эффектов седатина были результаты ХМЛ анализа (оценка действия седатина и безаргининового аналога седатина). Отсутствие в пептиде молекулы аргинина привело к потере антирадикальных свойств. Защитный эффект седатина при индометациновом повреждении СОЖ мог быть обусловлен селективной коррекцией нарушений в системе L-arginine-NOS-NO, играющей важную роль в формировании прооксидантно-антиоксидантного равновесия (Jones D.P., 2008).
Важным свойством седатина в реализации протективного действия по отношению к СОЖ, является сочетание в нем способности ослаблять выраженность оксидативного стресса и индуцировать образование NO. При оксидативном стрессе из NO образуется токсичный пероксинитрит (ONOO-), который, индуцирует процессы апоптоза и некроза. При нормализации прооксидантно-антиоксидантного равновесия NO осуществляет свои цитофизиологические эффекты, в частности, нормализует микроциркуляцию и стимулирует пролиферативные процессы в СОЖ (Ahmad R. et al., 2009).
Доказательством участия системы L-аrginine-NOS-NO в адаптации СОЖ являются результаты опытов с введением ингибитора NOS L-NAME. В то время, как у интактных животных ИМЯ в эпителии СОЖ составил 4,10±0,83, у животных, получавших L-NAME+ индометацин, он составил 2,33±1,60. Введение L-NAME животным, получавшим, наряду с индометацином, седатин, нивелировало цитопротективный эффект седатина. ИМЯ в СОЖ у животных, получавших «L-NAME+седатин+индометацин», был 2,92±0,61, достоверно не отличался от соответствующего показателя группы «L-NAME+ индометацин», и в обоих случаях величина ИМЯ была достоверно ниже величины ИМЯ интактного контроля. Полученные нами результаты, в определенной степени, подтверждают выводы наших предыдущих исследований о важной роли молекулы аргинина в реализации морфогенетических и антиоксидантных свойств седатина (Флейшман М.Ю. и соавт., 2007). Одним из возможных механизмов, через которые седатин опосредует свои защитные эффекты, является изменение концентрации гистамина в СОЖ (табл. 7).
В наших опытах, на фоне индуцируемых НПВП язв и эрозий, имело место более чем двукратное падение концентрации гистамина в тканях желудка. Это свидетельствует в пользу гипотезы о том, что дефицит гистамина является одним из факторов нарушения целостности СОЖ. Способность седатина нормализовать содержание гистамина помогает выявить еще один механизм его цитопротективного действия. Тот факт, что способностью нормализовать концентрацию гистамина, наряду с седатином, обладал его безаргининовый аналог, выводит полученные результаты из общей закономерности, согласно которой cедатин проявляет цитопротективные свойства только при наличии в структуре аргинина.
Таблица 7
Влияние пятикратного введения аналогов дерморфина в дозе 100 мкг/кг
на концентрацию гистамина в ткани желудка белых мышей (M ± m)
| группа животных | концентрация гистамина (мкг/г ткани) |
| контроль | 4,21±0,81 |
| изотон. р-р NaCl пятикратно + индометацин | 2,07±0,38 * |
| седатин | 5,91±0,88 * |
| седатин + индометацин | 3,37±0,44 * |
| седатин без аргинина | 4,24±0,58 * |
| седатин без аргинина + индометацин | 3,51±0,31 * |
Примечание: * р< 0,05
Результаты наших исследований о вовлеченности гистамина в процессы адаптации СОЖ к повреждающему действию НПВП, сопоставленные с данными литературы, могут служить в пользу представления об участии гистамина в профилактике и заживлении язв и эрозий в этих условиях. Следует отметить, что эти предположения требуют дальнейшего экспериментального исследования.
В желудках грызунов гистамин депонируется в тучных и ECL (энтерохромафинподобных) клетках. Гистамин через Н1 и Н3 рецепторы может оказывать выраженные морфогенетические эффекты. В частности, гипергастринемия, которая стимулирует пролиферативные процессы в СОЖ, реализует эти эффекты через гистамин ECL клеток (Nakamura E. et al., 2004). Согласно представлениям Parsons M. E. (1985), Hernndez-Angeles A. et al. (2001), Deyama Y. et al. (2002), гистамин является локальным митогеном. Процессы адаптации СОЖ к повторным воздействиям иммобилизационного стресса сопровождаются увеличением содержания гистамина в тканях желудка (Тимошин С. С. и соавт., 1991).
Влияние дерморфина на ранние периоды развития
рыб осетровых пород
Одним из облигатных условий апробации потенциальных фармакологических препаратов является подтверждение их эффектов и отсутствие токсических проявлений на нескольких видах животных объектов. Опиоидные пептиды присутствуют у рыб на эмбриональных, «донервных» стадиях развития (Яковлева Т.В. и соавт., 1986), а также в тканях развивающихся и взрослых особей (Папин А.А., Карелин А.А., 1984; Singh R., Rai U., 2009; Macho Sanchez-Simon F., Rodriguez R.E., 2009). Исследования проводились на икре и молоди осетра амурского (Acipenser schrenckii) на протяжении четырех рыборазводных сезонов. Инкубация оплодотворенной икры осетра амурского с раствором седатина (0,001-0,2 мг/л) в течение 1 часа приводила к увеличению процента выклева. Эффект зависел от использованной концентрации пептида (табл. 8).
Таблица 8
Влияние обработки оплодотворенной икры различными дозами седатина
на динамику выклева личинок осетра амурского
| Сроки наблюдения после проведения инкубации с пептидом | Экспериментальные группы (доля сформировавшихся предличинок в % от общего количества предличинок в группе) | ||||
| контроль | 0,001 мг/л | 0,01 мг/л | 0,1 мг/л | 0,2 мг/л | |
| 95 часов | 3,2% | 3,5% | 2,6% | 2,8% | 1,6% |
| 101 час | 22,3% | 32,1% | 29,8% | 29,5% | 26,1% |
| 113 часов | 38,5% | 38,5% | 32,8% | 52,4% | 51,0% |
| 118 часов | 12,9% | 9,1% | 14,1% | 8,2% | 11,7% |
| 125 часов | 18,7% | 13,8% | 18,2% | 6,7% | 8,2% |
| 130 часов | 4,4% | 3,0% | 2,5% | 0,4% | 1,4% |
| Общее количество предличинок (шт.) % выклева от количества оплодотворенных икринок | 3899 14,3+0,20 | 5198 17,1+0,21* | 9749 32,1+0,27* | 9541 31,4+0,27* | 7254 21,7+0,23* |
Примечание: * р<0,05
Максимальный эффект был зарегистрирован при использовании дозы пептида 0,01 и 0,1 мг/л. Увеличение концентрации седатина до 0,2 мг/л привело к уменьшению выраженности эффекта, что, возможно, является отражением «колоколообразной» зависимости «доза-эффект», характерной для РП.
Наряду с общими показателями количества сформировавшихся личинок, важным параметром является скорость выклева. Обеспечение «дружного» выклева является важной проблемой рыбоводства.
Воздействие седатина значительно увеличивало скорость выклева, особенно, в первые 24 часа (рис. 3).
Рис. 3. Влияние обработки оплодотворенной икры различными концентрациями седатина на скорость выклева предличинок осетра амурского.
Максимальная выживаемость мальков через 60 дней после обработки седатином имела место при воздействии пептидом 0,1 мг/л. Это позволило нам остановиться в последущих исследованиях на дозе 0,1 мг/л.
Наблюдение за общим состоянием, поведенческими реакциями, а также анализ соматометрических показателей мальков экспериментальных групп осуществляли в течение 2 месяцев (60 дней) с момента выклева до периода помещения особей в естественную среду обитания.
Однократное воздействие седатином в дозе 0,1 мг/л на оплодотворенную икру осетра амурского индуцировало увеличение массо-ростовых показателей подопытных особей по сравнению с контрольными параметрами (рис. 4).
Рис. 4. Влияние однократной обработки оплодотворенной икры осетра амурского раствором седатина на динамику соматометрических показателей мальков в постнатальном периоде (а – длина тела; б – масса тела; * р<0,05).
Результаты исследования сравнения эффектов безаргининового аналога седатина и седатина свидетельствуют в пользу ускоренного развития мальков, подвергнутых воздействию аргининсодержащего аналога дерморфина (табл. 9).
Таблица 9
Влияние обработки оплодотворенной икры синтетическими аналогами
дерморфина (седатин и седатин без аргинина) в дозе 100 мкг/л
на соматометрические показатели 60-суточных мальков осетра амурского
| контроль | седатин | седатин без аргинина | |
| масса (г) | 6,663 + 0,807 | 9,830 + 1,044 * р=0,038 | 7,873 + 0,859 |
| длина (см) | 11,46 + 0,53 | 12,98 + 0,48 * р=0,048 | 12,10 + 0,39 |
| индекс по Фултону | 0,431 + 0,008 | 0,442 + 0,013 | 0,436 + 0,013 |
Примечание: * р<0,05
Таким образом, обработка икры осетровых раствором седатина не вызывает негативных отклонений в последующие 2 месяца развития рыб. Более того, по данным соматометрии, имеют место признаки ускоренного развития подопытных мальков. Полученные результаты, судя по стабильности индекса упитанности по Фултону, свидетельствуют в пользу гармоничности процесса роста и развития мальков. Изменение структуры молекулы пептида удаление аминокислотного остатка аргинина (эксперимент с безаргининовым аналогом седатина), приводит к нивелированию эффекта седатина в отношении соматометрических показателей.
Активность процессов свободнорадикального окисления определяли в образцах оплодотворенной икры через 18 часов после проведения инкубации с пептидами. Установлено, что при воздействии седатина на инкубируемую икру осетра амурского активируются системы антиоксидантной антирадикальной защиты: в сравнении с контролем величина S2инд статистически значимо снизилась в 1,6 раза. Наблюдается увеличение перекисной резистентности (Н2 снизилась в 2,1 раза) и замедление процесса генерации перекисных радикалов (S1инд снизилась в 1,5 раза).
Анализ показателей хемилюминесценции (табл. 10) гомогенатов сердца и печени 60-суточных мальков, подвергнутых в антенатальном периоде развития однократной обработке седатином, продемонстрировал, что воздействие пептида увеличило буферную емкость антиоксидантной и антирадикальной системы защиты, а также перекисную резистентность в исследуемых тканях. Об этом свидетельствуют статистически значимое снижение амплитуды H2 (в 1,26 и 1,36 раза) и величины S2инд (в 1,31 и в 1,43 раза), соответственно. Выявленные изменения активности защитных систем не влияли на редокс-потенциал исследуемых тканей: величины S sp не имели достоверных отличий от контрольных уровней.
Таблица 10
Влияние однократной обработки оплодотворенной икры осетра амурского
седатином на показатели хемилюминесценции (в отн. ед.)
гомогенатов сердца и печени 60-суточных мальков
| Sсп | Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2) | ||
| H2 | S2инд | ||
| сердце | |||
| контроль | 10,37±0,12 | 9,08±0,18 | 12,71±0,29 |
| седатин | 11,08±0,18 | 7,69±0,21* | 9,74±0,30* |
| печень | |||
| контроль | 0,41±0,03 | 5,74±0,18 | 8,59±0,26 |
| седатин | 0,37±0,03 | 4,50±0,12* | 6,01±0,19* |
Примечание: * p<0.05
Представляет интерес тот факт, что изменения свободнорадикального статуса (повышение уровня антиоксидантной защиты), сохранились в тканях сердца и печени у 60-суточных мальков (таблица 10). Таким образом, действие седатина носит долгосрочный характер. Одним их возможных объяснений этому может быть эффект эмбрионального импринтинга, опосредуемого свободнорадикальными механизмами. Подобные изменения могут быть оценены как позитивные, поскольку способствуют повышению адаптируемости особей к негативным воздействиям внешней среды.
Анализ состояния ЯО осуществляли в ткани печени и миокарда сорокапятисуточных особей. Выбранный возраст определялся тем, что к этому времени у мальков полностью сформированы органы. С показателями контрольной группы сопоставляли показатели группы мальков, подвергнутых в зародышевом периоде воздействию седатина и его безаргининового аналога в концентрациях 0,1 мг/л. В наших исследованиях получены результаты, свидетельствующие о достоверном увеличении количества ЯО у подопытных особей группы «седатин», по сравнению с контрольными. Среднее число ядрышек в ядрах гепатоцитов в контрольной группе мальков составило 3,22 ± 0,15, в подопытной – 5,43 ± 0,30. У мальков, подвергнутых на ранних этапах развития воздействию «безаргининового» аналога седатина, изменения носили недостоверный характер. При анализе гистологических препаратов сердца подопытных особей молоди осетра амурского среднее число ядрышек в ядрах клеток миокарда в контрольной группе мальков составило 3,14±0,14. В подопытной группе количество ядрышек на ядро в среднем составило 5,03±0,29 (р<0,05).
Прямым доказательством воздействия седатина на белоксинтетическую активность были исследования по определению суммарного белка в поперечно-полосатых мышцах 60-суточных мальков. У рыб контрольной группы диаметр мышечных волокон составлял 22,28±0,71 мкм, а у подопытных он возрастал до 24,57±0,68 мкм, причем это увеличение было статистически значимым (р<0,05). Морфометрические измерения показали, что в мышцах контрольных рыб площадь ядер равнялась 57,38 ±1,48 мкм2. В мышцах подопытных рыб этот показатель возрастал до 60,50 ±2,33 мкм2, но это увеличение было статистически недостоверным. Средние величины числа ядрышек и ядрышко-ядерного отношения также статистически не отличались между собой, а вот суммарная площадь ядрышек, при обработке седатином, возрастала до 8,03±0,14 мкм2 (табл. 11).
Таблица 11
Изменения морфометрических параметров мышечных волокон
и ядерно-ядрышкового аппарата осетровых рыб под влиянием седатина (M ± m)
| группа | контроль | седатин |
| диаметр волокон, мкм | 22,28±0,71 | 24,57±0,68 * |
| оптическая плотность волокон | 0,403±0,012 | 0,514±0,012 * |
| площадь ядер, мкм2 | 57,38±1,48 | 60,50±2,33 |
| число ядрышек | 2,98±0,15 | 3,16±0,14 |
| площадь ядрышек, мкм2 | 7,32±0,14 | 8,03±0,14 * |
| ядерно-ядрышковое отношение | 0,128±0,004 | 0,134±0,006 |
Примечание: * р<0,05
Компьютерная морфометрия показала, что у контрольных рыб оптическая плотность мышечных волокон при окраске амидо-черным 10В составляла 0,403±0,012. У подопытных рыб она возрастала до 0,514±0,012, Причем, это возрастание было статистически достоверным (p<0,05).
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют, что под влиянием седатина у подопытных рыб, наряду с увеличением диаметра мышечных волокон и возрастанием ядрышковой активности, отмечается также увеличение концентрации суммарного белка в саркоплазме.
Вопрос о механизмах активации ЯО в различных клеточных популяциях у мальков, подвергнутых воздействию седатина, требует своего экспериментального решения. Тот факт, что эффект отсутствовал при обработке безаргининовым аналогом, свидетельствует в пользу рабочей гипотезы о нитроксидергическом механизме или компоненте в реализации эффектов седатина.
Подтверждением справедливости этого предположения служат данные литературы об активации оксидом азота факторов транскрипции. Как и в других исследовательских ситуациях, эффект NO на факторы транскрипции, зависит от дозы и ряда условий. Оксид азота может оказывать стимулирующий эффект на взаимодействие AP-I и молекулы ДНК – этот эффект опосредуется через активацию Jun-terminal Kinise (Van der Zwan L.P., et al. Kim H. et al., 2010). Кроме того, продемонстрирована возможность активации, посредством NO и его метаболитов, другого важного транскрипционного фактора – NF-B. Полученные нами свидетельства вовлеченности нитроксидергических механизмов в реализацию адаптивных свойств седатина, находят подтверждение в опытах (Chadzinska M. et al., 2009). Отсутствие в наших исследованиях положительного эффекта у безаргининового аналога седатина еще раз подтверждает обоснованность предположения о вовлеченности нитроксидергического компонента в оптимизацию процессов развития рыб. В связи с этим представляют интерес данные Cadet P. et al. (2007) о важной роли оксида азота в становлении и функционировании кардиоваскулярной системы на разных этапах онтогенеза. Применительно к личинкам и молоди рыб этот вопрос обсуждается в работах F.B. Eddy, (2005). При этом также как в исследованиях Chadzinska M. et al. (2009), оценивается роль NO, как стрессмодулятора молоди рыб. Важно отметить, установленное в наших исследованиях повышение активности антиоксидантной антирадикальной защиты. Эта перестройка является необходимым фактором адекватного функционирования оксида азота. Способность седатина активировать антиоксидантную и антирадикальную защиту во многом объясняет ускорение выклева предличинок под влиянием пептидов. Сохранение в ткани сердца и печени 60-дневных мальков позитивных сдвигов в обмене активных кислородных метаболитов находит частичное объяснение в данных Chadzinska M. еt al. (2009) о способности агонистов мю-рецепторов модулировать экспрессию генов цитокинов. Перестройка активности экспрессии генов на ранних этапах онтогенеза может быть еще одним фактором, обеспечивающим долгосрочные эффекты опиоидов. Особо следует выделить такой эффект воздействия седатина, как увеличение массы мальков на ранних стадиях развития.
Увеличение соматометрических показателей под влиянием седатина является важным критерием более высоких адаптационных способностей. Рыбы одного возраста, но меньшего размера (массы), выживают в меньшем количестве (Бойко Н.Е., 2008). Выживаемость молоди зависит от ее массы и это лежит в основе весовых стандартов при выпуске мальков. Начальное отставание в массе сохраняется в последующие периоды, независимо от условий выращивания (Бойко Н.Е., 2008).
Результаты исследования влияния седатина на выклев, рост и развитие молоди осетровых рыб, а также на ряд морфометрических показателей сердца, печени и мышц, легли в основу нового способа оптимизации развития рыб осетровых пород (Флейшман М.Ю., Тимошин С.С. и соавт., патент РФ № 2298921 от 20.05.2007). Этот метод используется на ряде рыборазводных предприятий Дальнего Востока.
При анализе возможных внутриклеточных путей реализации митогенных эффектов опиоидов мы рассматривали: во-первых, активацию экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста; и, во-вторых, G PI3K-Akt каскада. Кроме того, активно изучается третий путь, связанный с модуляцией активности NO (Tegeder I., Geisslinger G., 2004).
Ряд лигандов субпопуляций опиоидных рецепторов, через мю-3 рецепторы, могут индуцировать образование NO посредством активации системы G -PI3K- Akt. Akt способна стимулировать эндотелиальную NOS (Dimmeler S. et al., 1999; Fulton D. et al., 1999). В иммуноцитах морфин может индуцировать образование NO также посредством взаимодействия и активации мю-3 рецепторов (Fimiani C. et al., 1999, b).
Процессы активации ангиогенеза и вазодилятации, индуцируемые морфином, связывают с активацией мю-3 рецепторов (Bilfinger T.V. et al., 1998; Gupta K. et al., 2002). Мю-3 рецепторы представялют из себя сплайсинговый вариант, продуцируемый геном мю-опиатных рецепторов (Cadet P. et al., 2003). Экспрессия мю-3 рецепторов продемонстрирована в легочной ткани, при этом их активация приводит к освобождению NO (Fimiani C. et al., 1999). Способность морфина индуцировать образование NO в лейкоцитах, отменяемое L-NAME, показана в исследованиях (Mantione K.J. et al., 2008). Важную роль играют мю-3 опиатные рецепторы, регулирующие образование NO, что имеет место в процессах эмбриогенеза (Cadet P. et al., 2007). Согласно данным этих авторов, мю-3 рецептор экспрессируется на ранних стадиях развития раньше, чем, традиционные мю-1, дельта- и каппа- рецепторы. Это может служить одним из объяснений столь эффективному воздействию седатина на развитие молоди рыб при обработке им оплодотворенной икры. Однако следует иметь ввиду, что мю-3 рецепторы взаимодействуют с непептидными лигандами. При этом возможность взаимодействия седатина с мю-3 рецепторами в настоящее время обсуждается. В задачи нашего исследования не входило решение вопроса о том, с какой субпопуляцией опиатных рецепторов взаимодействует седатин. Эта характеристика пептида определяется другими методическими подходами и требует экспериментального решения. У нас нет прямых доказательств опосредованности этого эффекта через мю-3 рецепторы. При этом следует иметь в виду, что система NOS-NO может запускаться различными механизмами, а не только аргинином или активацией мю-3 рецепторов. Так, было установлено, что активация NOS-NO в СОЖ может осуществляться посредством глипролина (Pro-Gly-Pro), являющегося составной частью опиоидного пептида бета-казоморфина (Samonina G.E. et al., 2008; Мартынова К.В. и соавт., 2009).
Следует еще раз подчеркнуть, что в опытах с мальками, как и при заживлении деффектов СОЖ при НПВП-гастропатиях, активация нитроксидергической компоненты происходит на фоне усиления антиоксидантной и антирадикальной систем защиты. Это имеет принципиальное значение, так как образование NO при оксидативном стрессе приводит к появлению пероксинитрита ONOO-, обладающего высокой токсичностью (Xia Z. et al., 2010), и являющиегося индуктором апоптоза (Troy C.M. et al., 1996).
NO является важным компонентом запуска системы регенерации, вовлекая в него стволовые клетки (Madhusoodanan K. S. and Murad F., 2007). Внутриклеточное содержание оксида азота является суммой NO, синтезируемого самой клеткой, плюс NO, синтезируемый клетками ближайшего окружения. Изучению влияния NO на процессы регенерации в норме и при патологических процессах посвящены многочисленные исследования (Тищенко О.В. и соавт., 2002; Коновко О.О. и соавт., 2004; Kalinichenko S.G. et al., 2005; Matveeva N.Y. et al., 2007).
При оценке роли системы NOS-NO в регуляции процессов пролиферации, следует иметь в виду, что участие оксида азота в этом процессе лишь частично иллюстрирует его физиологическую активность. Данному направлению посвящены многочисленные сведения литературы. В качестве иллюстрации приведем лишь некоторые данные литературы последних лет. Обсуждается участие NOS-NO в процессах канцерогенеза и хронического воспаления (Kanwar J.R. et al., 2009). Имеются сведения участия NOS-NO в функционировании эндокринной системы (Cadenas J.L. et al., 2010), в процессах метаболизма (Fioramonti X. et al., 2010; Marsollier N. et al., 2009), в частности, метаболизма костной ткани (Sabanai K. et al., 2009); в процессах терморегуляции (Robertson R.M. and Sillar K.T., 2009; Lang J.A. et al., 2009), сперматогенеза (Lee N.P. and Cheng C.Y., 2008; Mauro A. et al., 2009); в процессах возбуждения – торможения в нервной системе (Le Roux N. et al., 2009) и в поведенческих реакциях (Rodrigues Pereira N. et al., 2010). Система NOS-NO, также, как и система циклических нуклеотидов, может служить примером универсальных функциональных блоков А.М. Уголева (1990). Согласно этой концепции, управление физиологическими процессами и реализация того или иного эффекта происходит не за счет специализированных регуляторных сигналов, а за счет универсальных функциональных блоков, образующих цепи, приспособленные для этих задач.
В качестве другого возможного функционального блока можно привести PI3k/Erk, или PI3k/Аkt каскад. Обсуждая неспецифичность активации PI3k/Erk, или PI3k/Аkt каскадов посредством G Schwindinger W.F. and Robishaw J.D., (2001) и Cheng K. et al., (2003) считают ростстимулирующий путь общей опцией G-протеинсвязанных рецепторов. Это имеет место с такими лигандами G-связанных рецепторов, как допамин (Narkar V.A. et al., 2001), серотонин (Adayev T. et al., 2003), каннабиоиды (Esposito G. et al., 2002), а также АТ-II и ЭТ-I (Lscher T.F., Barton M., 2000; Dzimiri N., 2002). Будет ли при этом усиливаться процесс пролиферации, зависит от целого ряда условий. Такими условиями могут быть различные композиции из G, G и участие G и, конечно, от типа клеток. Подчеркивается зависимость конечного эффекта от дозы лиганда (Singhal P.C. et al., 1998; Gupta et al., 2002).
Боль – стимул секреции опиоидов (Smith H.S., 2008; Janecka A. et al., 2010). Это, как правило, повреждение, а оно диктует включение восстановительных процессов. И если стресс – это время «получать раны», то постстрессорная активация опиоидной системы это время «зализывать раны».
Участие опиоидов в постстрессорной репарации включает в себя изменение целого ряда функций. Эта перестройка эндокринного фона, приводящая к уменьшению секреции кортикостерона и катехоламинов, угнетающих клеточное деление (Лишманов Ю.Б. и соавт., Радивоз М.И., 1998; Дейгин В.И. и соавт., патент РФ № 2155064 от 16.04.99). Эта активация функционирования NOS-NO, обсуждавшаяся нами ранее. Наряду со свойствами опиоидов оптимизировать процессы микроциркуляции, следует отдельно выделить их способность повышать сократительную активность лимфатических микрососудов (Хугаева В.К., 1992; Хугаева В.К., Ардасенов А.В., 1995). Особо следует отметить тесное взаимодействие опиоидов, в частности, аргининсодержащего аналога дерморфина DALDA, с системой цитокинов при восстановлении тканевого гомеостаза в условиях воспаления. Приводятся сведения о вовлеченности в этот процесс интерлейкина 4, TNF и INF (Philippe D. et al., 2006). При этом DALDA угнетает продукцию TNF при воспалительных заболеваниях толстого кишечника. Особо следует отметить способность седатина нормализовать или ликвидировать проявления оксидативного стресса.
Основным фактором, инициирующим возникновение оксидативного стресса, являются активные кислородные метаболиты АКМ. АКМ – это высокореактивные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода (Зенков Н.К. и соавт., 2001). В период формирования концепции универсальных функциональных блоков, активные кислородные метаболиты не рассматривались в таком широком аспекте, как это происходит в настоящее время. Отнесение АКМ к универсальным функциональным блокам не бесспорно, но, у А.М. Уголева (1990), есть представление о блоках комбинированных, энергезирующих и сигнальных. АКМ, продуцируемые клеточными источниками, традиционно считались побочным продуктом метаболизма, потенциально способными вызывать повреждения липидов, белков и ДНК. С филогенетической точки зрения, первоначальное, основное свойство АКМ заключалось в их способности защищать клетку от бактериальной агрессии. В процессе эволюции они обрели статус эффективного коммуникатора внутри и межклеточной коммуникации (Турпаев К.Т., 2002). Развернутые представления об участии АКМ в различных физиологических функциях представлены в работе В.Л. Воейкова (2001).
Значение АКМ, как фактора регуляции процессов клеточного деления у простейших представлены у T. Finkel (1998) и E. Ghosh et al. (2009). При оценке роли различных факторов в регуляции пролиферации высказывается предположение, что редокс-статус и регулирующие его АКМ являются филогенетически более древними, чем факторы роста (Меньщикова Е.Б. и соавт., 2008). При этом трудно не согласиться с авторами, что «Сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных процессов с участием АКМ. Мы не можем однозначно сказать, насколько токсичны АКМ или насколько они необходимы при развитии типовых патологических процессов» (цит. по Меньщикова Е.Б. и соавт., 2008).
Концепция, что АКМ являются сигнальными молекулами для процессов пролиферации, основывается на следующих положениях: 1. Факторы роста и цитокины способны генерировать АКМ в клетках различного типа. 2. Ингибиторы АКМ-генерирующих ферментных систем блокируют специфические рост-факторные эффекты. 3. Экзогенные оксиданты активируют рост-фактор опосредованные сигнальные пути (Thannickal V.J, Fanburg B.L., 2000). Кроме того, что АКМ могут выступать в качестве инициатора клеточного деления, они могут запускать процессы апоптоза – конечный результат зависит от соотношения регуляторного континуума, в частности, от соотношения прооксидантов и антиоксидантов (Лю М. Б. и др., 2005; Лю Б. Н. и др., 2006). Коррекция оксидативного стресса даларгином сопровождается нормализацией процессов пролиферации и заживлением язв при язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки и при атрофическом гастрите и НПВП-гастропатиях (Наумова Л.А., 2001; Болоняева Н.А. и соавт., 2005).
В наших исследованиях, выполненных совместно с Е.В. Ожеговым, показано, что даларгин нормализовал общие и локальные проявления оксидативного стресса при болезни Крона. При этом имела место нормализация процессов клеточного деления (Ожегов Е.В. и соавт. 2009; Ожегов Е.В., 2010).
Программа регенерации, «организуемая» лигандами опиатных рецепторов, включает в себя целый ряд универсальных функциональных блоков. Суммируя данные литературы и результаты собственных исследований, представим их. Это создание оптимального (для регенерации) эндокринного фона под воздействием опиатов, и седатина, в частности. Это формирование оптимального для регенерации цитокинового профиля (Philippe D., et al., 2006). Это включение нироксидергического компонента (Флейшман М.Ю. и соавт., 2009), имеющее место под воздействием других аргининсодержащих опиатов (Животова Е.Ю., Флейшман М.Ю. и соавт., 2009). Следствием этого является оптимизация процессов микроциркуляции (Сиротин Б.З. и соавт., 2002). Это поддержание оптимального уровня локального митогена гистамина, имеющее место под влиянием седатина и даларгина (Александрович А.Г. и соавт., 1989; Флейшман М.Ю. и соавт., 2004).
Отдельно следует подчеркнуть способность седатина стимулировать процесс синтеза ДНК, ключевой момент процессов регенерации. У седатина это свойство проявляется в широком диапазоне доз, в том числе, сверхнизких (Флейшман М.Ю. и соавт., 2004). Митогенный эффект, по-видимому, осуществляется за счет активации PI3K-Erk каскада, экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста, а также, за счет модуляции активности NO. Стимуляция процессов роста и регенерации, присущая седатину, может сохраняться в течение длительного времени при воздействии опиоидов на ранние этапы онтогенеза. Это проиллюстрировано нами в опытах с рыбами осетровых пород.
Способность седатина оптимизировать фон свободнорадикального окисления и индуцировать образование NO также является важной частью, или существенным функциональным блоком реализации программы регенерации (Флейшман М.Ю. и соавт., 2004; 2007). Это свойство опиатов усилено у седатина благодаря присутствию молекулы аргинина.
В настоящее время, соединение в препарате его основных свойств с нитроксидергичской составляющей, используется при создании новых классов лекарств. Это относится к статинам (Ongini E. et al., 2004), НПВП препаратам (Gao G. et al., 2005; Mackenzie I. et al., 2008) и к другим препаратам (Ашмарин И.П. и соавт., 2003; Schiller P.W., 2010). Целенаправленный синтез пептидов является одним из подходов современной молекулярной биологии и медицины.
ВЫВОДЫ
- В эктодермальном эпителии роговицы белых крыс агонист мю-рецепторов дерморфин и селективные мю-агонисты А10 и А43 вызывают угнетение процессов синтеза ДНК. В энтодермальном эпителии СОЖ дерморфин, А10 и А43, а также мю- дельта- агонисты седатин и А17 вызывают активацию синтеза ДНК.
- Аргининсодеражащий аналог дерморфина седатин вызывает активацию процессов синтеза ДНК в СОЖ в широком диапазоне доз (от 0,1 мкг/кг до 1 мг/кг).
- Введение седатина уменьшает проявления НПВП гастропатий и уменьшает площадь язвенно-эрозивного поражения СОЖ.
- Способность седатина уменьшать проявления НПВП-гастропатии складывается из нескольких факторов: повышение пролиферативного потенциала эпителия СОЖ; уменьшение проявлений оксидативного стресса; поддержание концентрации гистамина в тканях желудка. Безаргининовый аналог седатина не обладает этими свойствами. Введение ингибитора NOS L-NAME отменяет цитопротективное действие седатина.
- Обработка оплодотворенной икры осетровых рыб седатином повышает процент выклева и синхронизирует выклев, достоверно увеличивает массу мальков, что оценивается, как благоприятные прогностические признаки. Свидетельства позитивного воздействия седатина на процессы развития осетровых рыб прослеживается в течение 2 месяцев.
- Позитивные факторы развития мальков достигаются ослаблением проявлений окислительного стресса, увеличением активности ЯОР в печени, сердце и мышцах, увеличением содержания белка в мышцах мальков. Безаргиновый аналог седатина не обладает подобными свойствами.
- Морфогенетическая активность аналогов дерморфина зависит не только от сродства к той или иной популяции опиатных рецептров, но и от наличия в структуре лиганда аргинина.
- Результаты исследования влияния седатина на выклев, рост и развитие молоди осетровых рыб легли в основу нового способа оптимизации развития осетровых на рыборазводных предприятиях.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Влияние синтетических аналогов дерморфина на процессы клеточного деления эпителия роговицы и языка белых крыс / М.Ю. Флейшман, М.И. Радивоз, С.С. Тимошин, Е.П. Ярова, С.А. Кесельман // Бюлл. эскперим. биол. и мед. – 1994. – №11. – С. 508-510.
2. Влияние синтетического аналога дерморфина – седатина на процессы клеточного деления в эпителии роговицы и языка белых крыс / М.Ю. Флейшман, А.В. Кузнецов, М.И. Радивоз, С.С. Тимошин, Е.П. Ярова // Бюлл. эскперим. биол. и мед. – 1996. – №6. – С. 641-644.
3. Флейшман, М.Ю. Влияние синтетического аналога дерморфина – седатина на процессы клеточного деления эпителия белых крыс / М.Ю. Флейшман, А.В. Кузнецов // Тез. Итоговой научн.-иссл. конф. КГМА, посвященной 40-летию КГМА. - Кемерово, 1996.- С.158-160.
4. Влияние регуляторных пептидов на синтез ДНК в гладкой мышечной ткани двенадцатиперстной кишки белых крыс в раннем постнатальном онтогенезе / Е.Н. Сазонова, Е.Ю. Животова, О.Н. Сазонов, М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин //Бюлл. эскперим. биол. и мед. – 1999, №6. – С.65-69.
5. Флейшман, М.Ю. Апоптоз: различные аспекты общебиологического феномена / М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин //Дальневосточн. мед. журнал. – 2000. – № 2. – С. 109-112.
6. Применение ингибиторов АПФ у больных с сочетанными заболеваниями внутренних органов / С.А. Алексеенко, С.С. Тимошин, А.А. Авилова, В.Г. Ламехова, М.Ю. Флейшман // Гедеон Рихтер в СНГ. – 2002. – № 1. – С. 27 - 29.
7. Исследование пролиферативной активности и ядрышковых организаторов в эпидермисе у больных псориазом / К.Я. Терешин, В.И. Цыганков, М.Ю. Флейшман, Н.П. Мельникова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2002. – № 1. – С. 39-40.
8. Влияние аргининсодержащего мю- дельта- агониста опиатных рецепторов седатина на процессы синтеза ДНК в эпителии фундального отдела желудка белых крыс / М. Ю. Флейшман, А.В. Кузнецов, В.И. Дейгин, С.С. Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2004. – 137(3). – С. 235-237.
9. Флейшман, М.Ю. Некоторые аспекты оптимизации искусственного воспроизводства осетровых рыб /Е.Н. Сазонова, М.Ю. Флейшман, А.В. Соколов // Природные ресурсы Хабаровского края: проблемы науки и образования. – Хабаровск : изд-во ХГПУ, 2004. - С. 92-97.
10. Флейшман, М.Ю. Влияние регуляторных пептидов на состояние печени амурского осетра (Acipenser schrenckii) / А.В. Соколов, М.Ю. Флейшман, Е.Н. Сазонова // Природные ресурсы Хабаровского края: проблемы науки и образования. – Хабаровск : изд-во ХГПУ, 2004. – С. 115-119.
11. Флейшман, М.Ю. Некоторые аспекты оптимизации искусственного воспроизводства амурского осетра – Acipenser schrenckii / А.В. Соколов, Е.Н. Сазонова, М. Ю. Флейшман // Новые исследования (Биология. Экология. Образование). Вып. 5. – Хабаровск : изд-во ХГПУ, 2004. – С. 25-30.
12. Применение даларгина для профилактики и лечения НПВП-гастропатий /Н.А. Болоняева, Л.П. Исаенко, М.Ю. Флейшман, Е.Н. Сазонова, С.С. Тимошин // Дальневосточн. мед. журнал. – 2005. – № 2. – С. 62-66.
13. Влияние даларгина на состояние слизистой оболочки желудка пациентов, принимающих нестероидные противовоспалительные препараты / Н.А. Болоняева, Е.Ю. Животова, М.Ю. Флейшман, Е.Н. Сазонова // Сб. науч. трудов 6-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции «Клинико-эпидемиологические и этно-эко-логические проблемы заболеваний органов пищеварения», Красноярск, 2006. – С. 96.
14. Влияние седатина — синтетического аналога дерморфина — на развитие мальков осетра амурского / М.Ю. Флейшман, Е.Н. Сазонова, О.А. Лебедько, В.И. Дейгин, С.С. Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2007. – № 10. – С. 420.
15. Пролиферативные зоны мозга Амурского осетра. Взаимоотношение с нейромерами и миграцией вторичных матричных зон / Е.В. Пущина, М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин // Онтогенез. – 2007. – № 4. – С. 1-10.
16. Анализ механизмов влияния аргининсодержащего аналога дерморфина на процессы пролиферации в слизистой оболочке желудка белых крыс / М.Ю. Флейшман, Е.Ю. Животова, О.А. Лебедько, В.И. Дейгин, С.С. Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2007. – № 9. – С. 282-285.
17. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых крыс /Е.Ю. Животова, М.Ю. Флейшман, О.А. Лебедько, Е.Н. Сазонова, С.С. Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2007. – № 9. – С. 288-291.
18. Флейшман, М.Ю. Олигопептиды с опиоидной активностью и повышение эффективности искусственного воспроизводства амурских осетровых рыб /А.В. Соколов, М.Ю. Флейшман, Е.Н. Сазонова // Вестник ДВО РАН. – 2007. – №6. – С. 116-122.
19. Флейшман, М.Ю. Влияние морфиноподобных пептидов на нитроксидергическую и катехоламинергическую активность нейронов головного мозга молоди симы Onchorynchus masu / Е.В. Пущина, М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин //Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов : мат. междунар. научно-практической конференции. – М. : Россельхозакадемия /под ред. Микрякова В.Р. и др. – Борок-Москва, 17-20 июля. 2007. – С. 564.
20. Флейшман, М.Ю. Влияние регуляторных пептидов на NO-зависимые процессы в головном мозге молоди амурского осетра Acipencer schrenki /Е.В. Пущина, М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин // Функциональные системы организма в норме и при патологии : сб. научн. тр. / под ред. В.С. Улащика, А.Г. Чумака. – Минск : РИВШ, 2008. – С. 419-424.
21. Влияние дерморфинов на нейрональную пластичность и пролиферативную активность NO-продуцирующих нейронов головного мозга молоди амурского осетра Acipencer schrenсki / Е.В. Пущина, М.Ю. Флейшман, В.И. Цыганков, Д.К. Обухов, С.С. Тимошин / Актуальные вопросы функциональной межполушарной асиметрии и нейропластичности. Материалы Всероссийской конференции с международным участием. – М. : Научный мир, 2008. – С. 613-618.
22. Гастропротективный эффект даларгина при гастропатии, вызванной приемом нестероидных противовоспалительных препаратов / Е.Ю. Животова, М.Ю. Флейшман, Е.Н. Сазонова, О.А. Лебедько, С.С. Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2009. – № 4. – С. 422-426.
23. Протективное действие аналога дерморфина седатина на индуцируемое индометацином повреждение слизистой оболочки желудка / М.Ю. Флейшман, Е.Ю. Животова, О.А. Лебедько, В.И. Дейгин, С.С. Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2009. – № 7. – С. 72.
24. Опыт применения опиоидных пептидов для повышения эффективности искусственного воспроизводства амурских осетровых рыб / М.Ю. Флейшман, А.В. Соколов, В.М. Авласенко, О.А. Лебедько, Е.Н. Сазонова, И.Е. Хованский, С.С. Тимошин // Вопросы рыболовства. – 2009. – № 3(36). – С. 564-574
25. Применение даларгина в комплексной терапии болезни Крона / Е.В. Ожегов, С.А. Алексеенко, О.А. Лебедько, М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин // Дальневосточный медицинский журнал. – 2009. – № 2. – С. 11–13.
26. Патент «Способ стимуляции развития осетровых рыб» / М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин, Е.Н. Сазонова, Е.П. Ярова, В.И. Дейгин Номер публикации 2298921, заявка RU 2005130685/12, 2007.05.20
27. Патент «Способ ослабления эрозивно-язвенного повреждения слизистой оболочки желудка при воздействии ацетилсалициловой кислоты (АСК) с помощью пептида формулы Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly» / М.Ю. Флейшман, С.С. Тимошин, В.И. Дейгин, Е.П. Ярова Номер публикации 2303983, заявка RU 2005141112/14, 2007.08.10
28. Influence of synthetic Dermorphine analogues on proliferation processes of some types of epithelium and on Lipids Peroxide oxidation / M.Y. Fleishman, A.V. Kuznetsov // Problems Pharmacology and Pharmacy in the Far East. Summary. – Khabarovsk, 1997. – Р. 99.
29. Does angiotensin II cellular growth in gastric mucosa? / M. Fleishman, A. Avilova, E. Jivotova, S. Timoshin, S. Alexeenko // Br. J. Pharmacol. – 2002. – V. 53, N. 4. – P. 447-448
30. The influence of angiotensin II and enalapril on a DNA synthesis of gastric epithelium in white rats and in patients with arterial hypertension / S. Timoshin, S. Alexeenko, A. Avilova, M. Fleishman // J. of Gastroenterology and Hepatology. – 2002. – Vol. 17. – Suppl. A 185.
31. M(3) muscarinic receptors mediate contraction of human urinary bladder / C. Fetscher, M. Fleichman, M. Schmidt, S. Krege, M.C. Michel // Br. J. Pharmacol. – 2002 Jul., 136(5). – Р. 641-643.
32. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. / M. Fleichman, T. Schneider, C. Fetscher, M.C. Michel // J. Pharmacol Exp Ther. – 2004 Jan; 308(1). – Р.54-58.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А10, А17, А43 – условные рабочие названия синтетических аналогов дерморфина
АКМ – активные кислородные метаболиты
АТ-II – ангиотензин II
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИМЯ – индекс меченых ядер
ИМ – интенсивность метки
ОП – опиоидные пептиды
РП – регуляторые пептиды
СОЖ – слизистая оболочка желудка
СРО – свободнорадикального окисления
ХМЛ – хемилюминесценция
ЦОГ – циклооксигеназа
ЭТ-I – эндотелин I
ЯО – ядрышковый организатор
Erk – extracellular-regulated kinase-mitogen-activated protein (MAP) kinase
G, GTP-binding protein, and subunit
L-NAME – NG-nitro-L-arginine methyl ester
NF-B – nuclear factor kappa B
NO – nitric oxide
NOS – nitric-oxide synthase
PI3K – phosphatidylinositol 3-kinase
PKA, protein kinase A (cAMP-dependent protein kinase)
PKB/Akt-protein kinase B
PKC-protein kinase C
TNF-tumor necrosis factor
Флейшман Марина Юрьевна
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ ДЕРМОРФИНА И ЕГО АНАЛОГОВ
В РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Подписано в печать 28.06.2010
Формат 6090 1/16. Усл. п.л. 2,0.
Уч. изд. л. 1,85. Тираж 100 экз. Заказ 118
Отпечатано на участке оперативной полиграфии
редакционно-издательского отдела ГОУ ВПО ВГМУ
690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 4
