Реактивность макрофагальной системы при фибропластических процессах воспалительного генеза: оценка, механизмы регуляции и патогенетическое значение

На правах рукописи

ШВАРЦ

Яков Шмульевич

РЕАКТИВНОСТЬ МАКРОФАГАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ФИБРОПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ГЕНЕЗА: ОЦЕНКА, МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

14.03.03. – Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Душкин Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Меньщикова Елена Брониславовна

доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна

доктор медицинских наук,

профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ (г. Томск)

Защита диссертации состоится “_15_”__февраля__2011 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117.

Тел/факс: 8(383) 333–64–56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан “___”___ноября_____2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Н.А. Пальчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы патогенеза и лечения поствоспалительных фиброзов обусловлена их широчайшей распространенностью, тяжелым прогредиентным течением, неэффективностью существующих средств терапии, высокой инвалидизацией и летальностью. Например, цирроз печени среди причин смертности от болезней органов пищеварения занимает первое место, ежегодно в мире от него умирает около 2 млн. человек (Кислый Н.Д., 2003); нефросклероз вызывает терминальные стадии ХПН и является одной из основных причин смертности (Земченков А.Ю. и др., 2004); атеросклероз, своеобразный хронический воспалительный процесс с фибросклеротическим компонентом, в XX веке принял характер эпидемии и остается ведущей причиной заболеваемости и смертности в большинстве развитых стран (Липовецкий Б.М., 2004); интраабдоминальное спайкообразование развивается у 90% пациентов после хирургических операций, является причиной примерно 1% обращений за хирургической помощью, отвечает за 20-40% случаев бесплодия, 40-80% тазовых болей (Вербицкий Д.А., 2004; Попов А.А. и др., 2005). Активный фиброгенез имеет место не только при самых разнообразных органосклерозах, таких как цирроз печени, нефро-, кардио-, пневмо-, ото-, атеросклероз, спаечные процессы, анкилозы, макулярная дегенерация, миелофиброз и т.д., не только при заживлениях ран или при больших и малых коллагенозах, но, фактически, при любых повреждениях ткани (T.A.Wynn, 2007). Однако, усиленная продукция компонентов соединительнотканного матрикса, вызванная альтерацией и воспалительной реакцией, как правило, сбалансирована его ускоренной деградацией и при формировании рубцовой ткани заканчивается ее эффективным ремоделированием с восстановлением структуры органа. Какие ключевые регуляторные механизмы детерминируют уровень фиброзного ответа и тем самым, исход воспаления, остается неясным.

По современным представлениям, ключевую роль в патогенезе поствоспалительного фиброза играют мононуклеарные фагоциты, способные выделять ТФР- и другие факторы, стимулирующие пролиферативную, миграционную и коллагенсинтетическую функции фибробластов. С другой стороны, провоспалительная стимуляция макрофагов (Мф) вызывает интенсивную секрецию матриксных металлопротеиназ и лизосомальных гидролаз, которые с высокой скоростью расщепляют соединительнотканный матрикс, смещая равновесие от накопления к распаду соединительной ткани (Fallowfield J. et al., 2007). Вместе с тем, функциональная активность Мф на разных стадиях процесса изучена крайне слабо, а механизмы перехода от про- к антифиброзным функциям, и наоборот, не исследованы.

Мононуклеарные фагоциты костного мозга, крови, и периферических органов, объединенные в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ), связаны единством гистогенеза и общностью моноцитпоэтической и функциональной регуляции (Маянский Д.Н., 1991; Hume D., 2008). Взаимодействие центральных и периферических отделов СМФ может влиять на течение и исход поствоспалительного фиброгенеза. Однако, реакция СМФ как целого при общепатологических процессах и, в частности, при органосклерозах практически не исследована.

В последние годы сформировались представления о дискретных функциональных фенотипах мононуклеарных фагоцитов, таких как классически и альтернативно активированный Мф, M1-, M2- и M3-фенотипы. Сохраняются представления о примировании Мф, о макрофаге, находящемся в состоянии эндотоксиновой толерантности и др. Эти динамические функциональные состояния характеризуются различной способностью макрофагов отвечать на стимул и генерировать совершенно разные спектры медиаторов и цитокинов (Cavaillon J.M., 2006; Mosser D., 2008). Однако как меняются реактивные свойства мононуклеарных фагоцитов при развитии поствоспалительного фиброза и какова роль этих фенотипов в фиброгенезе – на момент исследования не было известно, практически не были изучены механизмы формирования/регуляции реактивности СМФ в фибропластическом процессе.

Одним из важнейших элементов системного ответа на воспалительный стимул является нарушение липопротеинового обмена и формирование гиперлипидемий. При этом самым существенным образом перестраивается липид-зависимый метаболизм клеток макрофагальной системы (Khovidhunkit W. et al., 2004). В недавних исследованиях выявлены молекулярные механизмы интеграции сигнальных путей регуляции липидного обмена и воспалительного ответа в макрофагах (Rigamonti E. et al., 2008). Показано участие окисленных производных холестерина и других агонистов ядерных гормональных рецепторов в контроле экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов. Имеются единичные работы о возможном участии в регуляции макрофагальных функций метаболитов мевалонатного метаболического пути (Mach F., 2004). Вместе с тем, исследования возможной связи липид-зависимой регуляции с формированием дискретных макрофагальных фенотипов и с регуляцией реактивности СМФ отсутствуют. Неизвестно, связаны ли активность ядерных рецепторов и мевалонатного пути с экспрессией и продукцией антивоспалительных и фиброгенных цитокинов, меняется ли концентрация нейтральных липидов, холестерина (ХС), его окисленных производных и других агонистов ядерных рецепторов и регуляторов активности мевалонатного пути в очагах воспаления и фиброгенеза. Не изучена роль этих сигнальных и метаболических путей в макрофагах при хронических воспалительных фибропролиферативных процессах в условиях in vivo.

Цель исследования: Изучить функциональную активность и реактивные свойства макрофагальной системы при развитии хронического поствоспалительного фиброзного процесса, исследовать ключевые механизмы их регуляции и роль в формировании фиброза.

Задачи исследования:

1. В модели гранулематозного воспаления у мышей разных линий выявить основные различия в реакции макрофагов на фиброгенный (SiO2) и нефиброгенный (зимозан) стимул, и оценить взаимоотношения миелопоэтического, инфильтративно-гранулематозного и фиброгенного ответов у животных, оппозитных по эффективности регуляции 3-гидрокси-3-метил-глютарил-СоА редуктазы, ключевого фермента мевалонатного метаболического пути.

2. Изучить функциональное состояние и реактивные свойства макрофагов печеночной и внепеченочных локализаций в динамике экспериментального CCl4-гепатофиброза и выявить системные механизмы регуляции реактивности СМФ в этом процессе. Оценить возможную роль хронической системной эндотоксинемии в развитии гиперхолестеринемии и формировании реактивных свойств СМФ, характерных для гепатофиброза.

3. Провести сравнительное изучение функционального состояния и реактивных свойств макрофагальной системы у больных с острыми и затяжными вирусными гепатитами (вирусные гепатиты А и В) при стимуляции СМФ бактериальным липополисахаридом (ЛПС) и оценить гепатопротективный эффект данной стимуляции.

4. Оценить влияние гиперхолестеринемии (ХС диета) на функциональную активность и реактивные свойства макрофагальной системы (по уровням цитокинового, гранулемогенного, и миелопоэтического ответов) в условиях ее стимуляции бактериальным ЛПС или зимозаном

5. Исследовать возможную роль гиперлипидемий, характерных для системного воспалительного ответа, и липопротеинов крови (ЛП) разных классов в связывании бактериальных ЛПС и образовании ЛПС-ЛП комплексов, оценить роль этих комплексов в выведении ЛП низкой плотности (ЛПНП) из кровотока, захвате и аккумуляции ЛПНП в макрофагах, обратном транспорте холестерина, в накоплении ЛПНП в артериальной стенке и в формировании атеросклеротических поражений.

6. Оценить возможную зависимость между содержанием в атеросклеротических бляшках артериальных сосудов человека ХС, его эфиров и окисленных производных и выраженностью в бляшках фибросклеротических изменений

7. Изучить влияние гиперхолестеринемии (ХС диета) на содержание триглицеридов, холестерина, его эфиров и окисленных производных в ткани печени в моделях хронического макрофаг-зависимого диффузного (CCl4-интоксикация) и гранулематозного (зимозан) воспаления, и оценить возможную зависимость между содержанием в воспалительно измененной ткани холестерина и его окисленных производных, экспрессией в макрофагах печени трансформирующего фактора роста бета (ТФР-) и уровнем фиброгенного ответа.

8. Оценить возможную роль мевалонатного метаболического пути в детерминации уровней провоспалительного и фиброзного ответов путем ингибирования или отмены эффектов ингибирования этого пути: а) в моделях гранулематозного (зимозан-индуцированного) и диффузного (CCl4-индуцированного) гепатита, б) в моделях нефросклероза (индуцированного рабдомиолизом или унилатеральной обструкцией мочеточника), в) в модели зимозан-индуцированного асептического перитонита.

9. Оценить возможную роль активности мевалонатного метаболического пути и ядерных гормональных рецепторов LXR, FXR, RXR в воспалительно-индуцированной экспрессии и продукции про- и антивоспалительных фиброгенных цитокинов в культуре перитонеальных макрофагов

10. Оценить возможную роль мевалонатного метаболического пути и ТФР- в формировании макрофагальной эндотоксиновой толерантности.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование функциональной активности и реактивных свойств СМФ в различных экспериментальных моделях поствоспалительного фиброза, и выявлены характерные для фибропролиферативных процессов ранее неизвестные общие закономерности перестройки функций и реактивности мононуклеарных фагоцитов.

Впервые обнаружено, что фиброгенный агент (SiO2) вызывает провоспалительный ответ мононуклеарных фагоцитов, существенно более низкий, чем нефиброгенный агент (зимозан). При этом, как показано на инбредных мышах С57Bl/6, C57BR, CBA/Lac, Balb/с, C3H/F уровень гранулематозного ответа и выраженность фиброза, вызванного фиброгенным агентом, зависят от продукции ГМ-КСФ и характера миелопоэтического ответа. Показано, что межлинейные различия гранулемогенеза, будучи обусловлены различиями миелопоэтического ответа, имеют универсальный характер: не зависят от природы агента, его дозы и локализации процесса. Впервые продемонстрировано, что мыши с оппозитной чувствительностью ГМГР/мевалонатного биохимического пути к регуляторным воздействиям (С57Bl/6 и Balb/с) оппозитны по уровню фиброгенного ответа, миелопоэтической и гранулемогенной реакции.

Впервые проведено сочетанное исследование печеночного и внепеченочных отделов макрофагальной системы в динамике развития гепатофиброза и обнаружено, что СМФ ведет себя как единое целое - все отделы макрофагальной системы – центральный (Мф и их прекурсоры в костном мозге), транспортный (моноциты крови), Мф органа поражения (клетки Купфера), внепеченочные (перитонеальные, легочные, селезеночные) претерпевают координированную перестройку: происходит снижение функциональной активности Мф печени с компенсаторной гиперплазией и повышением функциональной активности Мф внепеченочных локализаций. Впервые при развитии гепатофиброза изучена способность Мф различных отделов СМФ реагировать на стимуляцию и установлена зависимость реактивности Мф от стадии процесса. Показано, что одним из важнейших механизмов гипореактивности СМФ при развитии гепатофиброза является хроническая системная эндотоксинемия, индуцирующая гиперхолестеринемию, накопление в Мф липидов и оксистеролов. У больных затяжными вирусными гепатитами продемонстрировано снижение реактивности СМФ, отменяемое введением ЛПС, что сочетается с улучшением функций печени.

Обоснована гипотеза об атерогенной роли комплексов бактериальных ЛПС с липопротеинами (ЛП). Обнаружено, что гиперхолестеринемия, формирующаяся при эндотоксинемии и воспалительном ответе, способствует образованию избыточного количества комплексов ЛПС-ЛП низкой плотности (ЛПНП). Показано, что ЛПС в сыворотке крови оказывает ингибирующее действие на лецитин-холестерин-ацилтрансферазу (ЛХАТ), один из ключевых ферментов обратного транспорта ХС. Впервые исследована судьба частиц ЛПНП в составе ЛПС-ЛПНП комплексов и показано, что образование комплексов модифицирует свойства ЛПНП, уменьшает время их полужизни в кровообращении и резко усиливает их связывание и захват в макрофагах и в артериальной стенке.

Показано универсальное значение гиперхолестеринемии в фиброгенезе: в разных вариантах воспаления (диффузное и гранулематозное) в паренхиматозных (печень, почки) и непаренхиматозных (артерии, брюшная полость) органах в разных моделях гепатофиброза, нефросклероза, при атерогенезе и при интраабдоминальном спайкообразовании, а также в моделях in vitro продемонстрировано ХС-индуцированное усиление фиброзного ответа и повышение продукции ТФР- в Мф. Кроме ХС показано фиброгенное действие других ингибиторов мевалонатного метаболического пути (аторвастатин, кальцитриол). Продемонстрирована отмена фиброгенных эффектов ХС и других ингибиторов этого пути под действием мевалоната.

Впервые с использованием культуральных моделей исследованы взаимоотношения между реактивностью Мф, мевалонатным метаболическим путем и фиброгенезом. При анализе продукции провоспалительных цитокинов и оксида азота установлено, что ХС и его окисленные производные индуцируют гипореактивность мононуклеарных фагоцитов, и эта гипореактивность зависит от снижения активности мевалонатного метаболического пути. Аналогично, в воспалительно рекрутированных Мф обнаружено, что ХС стимулирует продукцию ТФР-1, и эта продукция связана с пониженной активностью мевалонатного пути. Показано, что макрофагальная гипореактивность, вызванная повторными введениями мышам эндотоксина, приводит к накоплению в Мф оксистеролов и, одновременно, стимулирует продукцию ТФР-1. Таким образом, впервые показано, что ингибирование активности мевалонатного пути может быть системным фактором снижения реаактивности мононуклеарных фагоцитов и, одновременно, фактором усиления поствоспалительного фиброгенеза. В свою очередь, макрофагальная гипореактивность, индуцированная повторным/хроническим поступлением в кровоток эндотоксина, вызывает одновременно накопление в Мф ингибиторов мевалонатного пути (оксистеролов) и значительное усиление продукции ТФР-1. Впервые исследовано действие агонистов ядерных гормональных рецепторов на продукцию антивоспалительных профиброзных цитокинов (ТФР-1). Показано, что в Мф, рекрутированных в очаг воспаления, 25-гидрокси-ХС, фарнезол, и 9-цис-ретиноевая кислота снижают секрецию ТФР-1, исходно повышенную под действием воспалительного стимула. Иными словами, впервые продемонстрировано, что ХС-индуцированная активация фиброгенеза, опосредованная ТФР-, непосредственно не связана с активностью ядерных рецепторов. Таким образом установлено, что гипореактивность Мф, зависимая от ядерных рецепторов, и ТФР--индуцированный фиброгенез находятся под разным регуляторным контролем.

Научно-практическая значимость. Полученные данные дают основание связывать прогрессирование фиброзного процесса и его слабую обратимость с функциональной депрессией органотипических Мф и низкой способностью макрофагальной системы отвечать на провоспалительную стимуляцию. Это позволяет искать новые пути предупреждения и лечения патологических фибропролиферативных процессов на основе своевременной модуляции функций органотипических Мф и СМФ в целом.

Данные о сопряженных функциональных перестройках разных популяций макрофагальной системы в динамике гепатофиброза дают основание рассматривать мононуклеарные фагоциты как реальный инструмент межорганных взаимосвязей, позволяют предполагать наличие Мф-зависимых экстрагепатических осложнений и искать новые пути их терапии. Соответствие изменений СМФ фазам развития гепатофиброза позволяет по функциям и реактивности мононуклеарных фагоцитов оценивать характер течения процесса, его динамику и прогноз, контролировать эффективность лечения. Связанность функциональных перестроек печеночного и внепеченочных популяций СМФ дает основание судить о патологическом процессе в печени по Мф внепеченочных локализаций. В клинике на основе анализа функционального состояния и реактивности внепеченочных моноцитов-макрофагов возможна разработка обоснованных рекомендаций по применению стимуляторов СМФ в лечении гепатитов и циррозов. В соответствии с нашими данными о роли хронической эндотоксинемии в формировании гипореактивных свойств Мф при развитии гепатофиброза одними из маркеров и мишеней для модуляции функционального состояния и реактивности СМФ могут стать находящиеся в циркуляции бактериальные ЛПС.

Данные о том, что хроническая системная эндотоксинемия является одним из важнейших патогенетических механизмов атерогенеза потенциально позволяют рассматривать хроническую Грам-отрицательную инфекцию и находящиеся в кровообращении бактериальные ЛПС как прогностические маркеры и новые мишени для профилактического и терапевтического вмешательства при развитии атеросклероза.

Согласно данным о профиброзной роли высоких уровней ХС при хроническом воспалении в паренхиматозных и непаренхиматозных органах гиперхолестеринемия может явиться в будущем одним из критериев прогноза выраженности поствоспалительных фибропролиферативных преобразований.

Установленная зависимость между ингибированием мевалонатного метаболического пути и поствоспалительным фиброгенезом позволяет искать среди промежуточных продуктов этого пути конкретные молекулярные мишени для управления фибропластическим процессом. Точно также, выявленная зависимость между ингибированием активности мевалонатного пути и снижением реактивности Мф обеспечивает возможность поиска новых модуляторов макрофагальной реактивности среди соединений, влияющих на активность этого пути. Это, в свою очередь, позволяет искать новые пути управления течением и исходом воспалительных реакций.

Положения, выносимые на защиту. 1. В процессе развития индуцированного воспалением фиброзного ответа происходит закономерная перестройка системы мононуклеарных фагоцитов с формированием функциональной депрессии органотипических Мф и приобретением низкой способности макрофагальной системы отвечать на провоспалительную стимуляцию. В свою очередь, функциональное состояние СМФ в значительной мере определяет течение воспалительного процесса и уровень поствоспалительного фиброгенного ответа. В условиях сниженной реактивности СМФ воспалительный ответ принимает затяжное течение, ассоциированное с фиброгенезом, а стимуляция СМФ, позволяет корригировать нарушенные в ходе воспалительного процесса функции мононуклеарных фагоцитов, что сопровождается нормализацией функций печени.

2. Одним из важнейших механизмов гипореактивности СМФ при развитии гепатофиброза и атеросклероза является хроническая системная эндотоксинемия – неотъемлемый фактор атерогенеза и вторичного поражения печени. Наряду с другими ЛПС-зависимыми механизмами, существенный вклад эндотоксинемии в супрессию реактивности Мф вносит ЛПС-индуцированная гиперлипидемия, которая способствует формированию ЛПС-липопротеиновых комплексов и нейтрализации биологической активности ЛПС и, одновременно, приводит к модификации липопротеинов, нарушению обратного транспорта холестерина, тем самым резко усиливая аккумуляцию триглицеридов, холестерина, его эфиров и окисленных производных в Мф/очагах воспаления. Холестерин и оксистеролы изменяют функциональный фенотип Мф, индуцируя гипореактивность этих клеток.

3. Усиление гиперхолестеринемии и аккумуляции холестерина в мононуклеарных фагоцитах при хроническом воспалительном ответе значительно повышает экспрессию и продукцию ТФР-1 в Мф и увеличивает выраженность фиброза в паренхиматозных и в полых органах и в артериальных сосудах. Холестерин увеличивает продукцию ТФР-1 в воспалительных Мф, тогда как агонисты ядерных гормональных рецепторов LXR, RXR и FXR ингибируют продукцию и провоспалительных цитокинов, и ТФР-1.

4. Холестерин-зависимая индукция гипореактивности СМФ и усиление фиброгенеза/продукции ТФР-1 связаны с ингибированием 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А редуктазы, ключевого фермента мевалонатного биохимического пути, и с уменьшением пула нестерольных изопреноидов, образующихся за счет активности этого пути. Мевалоновая кислота, повышая внутриклеточный пул нестероидных изопреноидов, отменяет эндотоксиновую толерантность макрофагов, блокирует продукцию ТФР-1 и переключает функциональный фенотип мононуклеарных фагоцитов на гиперреактивный, высокоотвечающий на воспалительную стимуляцию продукцией провоспалительных цитокинов и оксида азота.

Апробация материалов диссертации. Основные положения работы были представлены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме с международным участием «Система мононуклеарных фагоцитов в норме и патологии» (г. Новосибирск, 1990); Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (г. Москва, 1991); Симпозиуме Международной ассоциации по биологической стандартизации (г. Аннеси, 1991); Междунаpодном симпозиуме по аллеpгологии и клинической иммунологии (г. Алма-Ата, 1992); I съезде иммунологов России (г. Новосибирск, 1992); IV, V и VI международных симпозиумах по клеткам печеночного синусоида (г. Титизее, 1988, г. Туксон, 1990, и г. Антверпен, 1992); III и VI конференциях международного эндотоксинового общества (г. Хельсинки, 1994, и г. Париж, 2000); IV, V и XIII ежегодных международных конференциях Скандинавского общества по атеросклерозу (г. Хумлебек, 1997, 1998, 2006); XI международном симпозиуме по атеросклерозу (г. Париж, 1997); 70-м конгрессе Европейского общества по атеросклерозу (г. Женева, 1998); III международном конгрессе по патофизиологии (г. Лахти, 1998); I Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию А.Л.Мясникова (г. Москва, 1999); V и VI отчетной сессии НИИКИ СО РАМН (г. Новосибирск, 1999 и 2003); II Всероссийском симпозиуме "Хроническое Воспаление" (г. Новосибирск, 2000); Всероссийских конференциях «Фундаментальные и клинические аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (г. Новосибирск, 2002, 2007, 2009); II международном симпозиуме по уязвимой атеросклеротической бляшке (г. Таормина, 2004); Спетсевской летней школе по ядерным гормональным рецепторам «От молекулярных механизмов к интегративной физиологии» (о. Спетсес, 2007); VII конференции иммунологов Урала (г. Архангельск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 научных работ, в том числе одна коллективная монография, 25 статей в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени доктора наук, 1 методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 389 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 92 отечественных и 1444 зарубежных источника, иллюстрирована 42 таблицами и 64 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 320 крысах породы Вистар с исходной массой тела 180-200 г. и 780 мышах линий С57Bl/6, CBA/Lac, BALB/c, C57BR и C3H/F с массой 20-25 г. При работе с экспериментальными животными соблюдали принципы гуманности, изложенные в Хельсинкской декларации.

Также обследовано 59 больных, мужчин в возрасте 18-50 лет, с желтушной формой вирусного гепатита А или В средней степени тяжести с острым (47 чел) и затяжным (12 чел) течением. Включенные в обследование больные дали информированное согласие на участие в исследовании, которое соответствовало этическим стандартам, разработанным в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и приказами Минздрава РФ. Обследование проведено на базе Инфекционной клинической больницы №1 г. Новосибирска. Постановка диагноза, отбор больных для исследования, назначение лечения и клиническое ведение больных осуществлялось врачами отделения вирусных гепатитов под руководством заведующего кафедрой инфекционных болезней НГМУ проф. Г.Ф. Белова.

Цирроз печени у крыс вызывали внутрижелудочным введением 10% раствора CCl4 на растительном масле в дозе 2,5 мл на кг массы тела 2 раза в неделю в течение 14 недель. У мышей такой же раствор вводили внутрижелудочно в дозе 5,0 мл на кг массы тела 2 раза в неделю в течение 6 нед.

Для индукции нефросклероза у мышей C57Bl/6 пользовались моделью рабдомиолиз-индуцированной нефропатии, которую вызвали по W.Lieberthal et al. (2000) внутримышечными инъекциями глицерина 1 раз в неделю в течение 3 нед. Дополнительно для индукции нефросклероза пользовались моделью унилатеральной обструкции мочеточника, которую воспроизводили согласно рекомендациям Taconic URELIG-R/SU041 у мышей C57Bl/6.

Для индукции асептического перитонита у мышей C57Bl/6 использовали стандартную модель зимозан-индуцированного воспаления в брюшной полости (T.S.Rao et al., 1994). Интраабдоминальное спайкообразование вызывали сочетанным внутрибрюшинным введением зимозана и холестерина, который вводили в суспензии в дозе 50 мг/мышь.

Атеросклеротический процесс индуцировали у мышей C57Bl/6 холестериновой диетой по B.Paigen et al. (1990) с модификациями L.Vergnes et al. (2003) и K.Yu et al. (2004). У части животных в данной модели на фоне ХС диеты мыши внутрибрюшинно 2 раза в неделю в течение 3 мес. получали инъекции ЛПС в дозе 0,25 мг/кг массы тела.

Модуляция активности ГМГР/мевалонатного биохимического пути in vivo. Для индукции гиперхолестеринемии и ингибирования активности мевалонатного биохимического пути мыши C57Bl/6 получали 2,5% ХС диету по H-S.Jenke (1981). В качестве фармакологических ингибиторов ГМГР мыши ежедневно внутрижелудочно получали аторвастатин, либо кальцитриол в дозе 5 мг/кг и 0,5 мкг/кг массы тела соответственно. Для отмены эффекта ингибирования использовали лактон мевалоновой кислоты, который вводили ежедневно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг.

Для стимуляции СМФ крысам и мышам внутривенно однократно вводили зимозан в дозе соответственно 100 и 50мг/кг массы тела. В отдельных экспериментах для индукции гранулематоза мышам однократно вводили частицы SiO2 - внутривенно в дозах 100 или 200, и подкожно - в дозе 500 мг/кг массы тела. Кроме того, внутрибрюшинно вводили ЛПС S.marcescens, E.Coli 0111:B4 или E.Coli 0127:B8 в дозе 50 мкг/кг массы тела. Для лечения больных вирусными гепатитами ЛПС S.marcescens вводили внутримышечно в дозах 25 и 50 мкг. В культурах Мф ЛПС E.Coli 0111:B4 добавляли в среду инкубации в концентрациях 0,1-1,0 мкг/мл.

Для постановки модели эндотоксиновой толерантности у мышей использовали стандартную схему многократного введения эндотоксина в течение нескольких дней (A.S.Cross et al., 2002).

Для морфологического исследования образцы ткани фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин, готовили гистологические срезы и окрашивали гематоксилин-эозином или пикросириусом красным. Часть фиксированных образцов замораживали, готовили криостатные срезы и окрашивали Суданом III. Для электронно-микроскопического исследования ткань фиксировали 2,5% глютаральдегидом с постфиксацией 1% OsO4, заливали в эпон-аралдит, готовили ультратонкие срезы, контрастировали их уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали под электронным микроскопом JEM-100B. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и исследовали под световым микроскопом. Объемную и численную плотность структур в ткани печени и легких определяли с помощью микроскопа с окулярной вставкой с регулярной тестовой решеткой (Г.Г.Автандилов и др,, 1981). В почечной ткани выраженность изменений оценивали полуколичественно по балльным шкалам.

Исследование периферической крови и кроветворных органов. Формулу крови и абсолютное содержание форменных элементов оценивали общепринятыми лабораторными методами (В.В.Меньшиков и др., 1987). Абсолютное число и дифференциальный подсчет клеток в костном мозге и селезенке, число гранулоцит-макрофагальных и эритроидных колоние-образующих единиц и количество Мф(-) и Мф(+) гемопоэтических островков оценивали по Е.Д.Гольдберг с соавт. (1992). Данный фрагмент работы выполнен совместно с сотрудником НГМУ Росздрава д.м.н. А.А.Зубахиным.

Перитонеальные и альвеолярные макрофаги выделяли и подсчитывали по И.Я.Учитель (1978). В случае получения перитонеальных Мф для последующих культуральных работ клетки элиситировали внутрибрюшинным введением 4% гидратированного крахмала и выделяли методом прилипания к подложке.

Определение поглотительной активности макрофагов. Поглотительную активность КК и СМФ в целом оценивали по клиренсу коллоидного угля методом Biozzi с соавт. (1953). Количество Мф, поглотивших коллоидный уголь, подсчитывали на гистологических срезах печени и легких и в мазках-отпечатках селезенки. Фагоцитарную активность перитонеальных и альвеолярных Мф определяли по поглощению в монослое микрочастиц метакрилата.

Активность окислительного метаболизма макрофагов и нейтрофилов оценивали с помощью НСТ-теста (М.Е.Виксман и др., 1977). Также индуцибельность респираторного взрыва оценивали во взвеси перитонеальных Мф хемилюминесцентным методом по интенсивности люминол-зависимой зимозан- или SiO2-индуцированной люминисценции на хемилюминесцентном анализаторе «Скиф-0306М» (СКТБ "Наука", г.Красноярск) (В.М.Земсков и др., 1988). Исследование хемилюминесценции проведено совместно с сотрудником НИИКИ СО РАМН д.м.н. Д.Д.Цырендоржиевым.

Продукцию окиси азота в культурах перитонеальных макрофагов оценивали по содержанию в среде инкубации нитритов с реагентом Griess (Promega Bulletin TB229).

Миграционную активность моноцитов–макрофагов определяли у больных вирусными гепатитами в тесте кожного окна по J.W.Rebuck et al. (1960) за 1-2 дня до и на 3-й день после первой инъекции продигиозана.

Удельную активность катепсина Д (КФ 3.4.23.5) определяли в гомогенатах печени спектрофотометрически по A.J.Barret (1972). Концентрацию белка в гомогенате определяли по O.H.Lowry et al. (1951).

Коллагенолитическую активность ткани печени определяли методом радиальной диффузии по J.Yankeelov с соавт. (1997).

Уровни аланинаминотрансферазы, билирубина, мочевины, креатинина, холестерина, триглицеридов, и альбумина в сыворотке крови определяли унифицированными методами с помощью коммерческих наборов реагентов «Biocon» (Германия) согласно инструкции производителя.

Содержание липидов в ткани печени, аорты и в перитонеальных макрофагах определяли после выделения тотальных липидов из гомогенатов ткани по J.Folch et al. (1957), из монослоев перитонеальных Мф - по М.И.Душкину и др. (1990). Липид-содержащую фазу сушили под током азота, растворяли хлороформом, основные липидные фракции разделяли методом ТСХ по М.Кейтс (1975), ЭХС и ХС определяли спектрофлюориметрически по L.L.Rudel (1973), а ТГ – методом S.P.Gottfried (1973). Для определения содержания оксистеролов липидные экстракты сапонифицировали по I.Bjorkhem et al. (1994), стерольную фракцию экстрагировали по J.Folch et al. (1957), концентрировали под током азота, очищали ТСХ по A.Gupta (1986) и H.Zhang (1990), затем оксистеролы экстрагировали хлороформом и анализировали методом ВЭЖХ в обращенной фазе по Saucier S. et al. (1985) на хроматографе типа “Миллихром А-02”

Содержание ПГЕ2 в ткани печени определяли с помощью наборов для радиоиммунного анализа Travenol Diagnostics (США) согласно инструкции производителя.

Экспрессию мРНК ТФР- в ткани печени оценивали методом ОТ-ПЦР (Т.Маниатис и др., 1984). Суммарную РНК выделяли по Chomczynski и Sacchi (1987). Прямыми и обратными праймерами TФР-1 служили соответственно ACCGCAACAACGCCATCTAT и GCAACAATTCCTGGCGTTAC; -актина –TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG и TTTGATGTCACGCACGATTTCC. Амплификат разгоняли в агарозном геле, окрашивали бромистым этидием, денситометрировали и и величину экспрессии TФР-1 представляли как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена к интенсивности -актин-специфической полосы. ПЦР-исследование проведено совместно с сотрудницей НИИМББ СО РАМН Е.В. Воронцовой.

Содержание цитокинов в сыворотке крови и в культуральной среде определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов фирм Biosource, BMS, R&D Systems и ООО "Протеиновый контур" согласно инструкциям производителя. В части экспериментов концентрацию ФНО- и ИЛ-1 в сыворотке крови оценивали методом биологического анализа соответственно по D.Flick и G.Gifford (1984) и по С.Хант (1990).

Влияние модуляторов активности мевалонатного пути и агонистов ядерных рецепторов на продукцию цитокинов в культуре перитонеальных макрофагов оценивали в монослоях, преинкубированных с ХС (5 мкг/мл), оксистеролами (5 мкг/мл), 9-цис ретиноевой кислотой (5мкМ), с фарнезолом (10мкМ), или с аторвастатином (5мкМ/л) в присутствии или отсутствии лактона мевалоновой кислоты (2мМ), затем инкубированных в свежей среде с или без ЛПС (0,2-1,0 мкг/мл) с последующим определением содержания цитокинов инкубационной среде.

ЛПС-связывающую способность разных фракций липопротеинов (ЛП) определяли с высокоочищеным ЛПС Salmonella minnesota R595, который радиойодировали по R.Ulevitch et al. (1978), затем инкубировали с сыворотками крови больных с нормо- и гиперлипидемиями, и после формирования [125I]ЛПС-ЛП комплексов выделяли основные фракции ЛП ультрацентрифугированием по F.Lindgren (1975). Далее в каждой фракции определяли удельную радиоактивность.

Влияние ЛПС на активность ЛХАТ определяли по включению [1,2-3H2]холестерина в эфиры ХС сывороток крови, преинкубированных с Re ЛПС S.minnesota по J.Glomset (1968).

Для получения 125I-ЛПНП-ЛПС комплексов фракцию ЛПНП выделяли ультрацентрифугированием по F.Lindgren (1975), очищали методом гель-фильтрации и радиойодировали по A.S.McFarlane (1958) в модификации Bilheimer et al. (1972). Комплексы 125I-ЛПНП-ЛПС получали в присутствии делипидированной сыворотки согласно A.V. Victorov et al. (1989).

Клиренс 125I-ЛПНП и 125I-ЛПНП-ЛПС определяли у крыс Вистар, которым внутривенно вводили меченые ЛПНП или ЛПНП-ЛПС комплексы, через определенные интервалы времени забирали образцы крови и измеряли радиоактивность проб. Время полувыведения метки подсчитывали по G.Biozzi et al. (1953).

Связывание и включение 125I-ЛПНП и 125I-ЛПНП-ЛПС в эксплантаты аорты крыс оценивали по R.Fumagalli et al. (1979).

Связывание и деградацию 125I-ЛПНП и 125I-ЛПНП-ЛПС в культуре перитонеальных макрофагов оценивали в монослоях, инкубированных с или без 125I-ЛПНП или 125I-ЛПНП-ЛПС при 0° С (связывание) и при 37°C (деградация). Для определения связывания после инкубации монослои отмывали, клетки снимали и измеряли в них радиоактивность. Деградацию оценивали по приросту величины радиоактивности в среде инкубации по методу J. Goldstein et al. (1980).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента при нормальном распределении и критерия Манна-Уитни при распределении, отличающимся от нормального. Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. Различия считали статистически значимыми при величине р<0,05. Расчеты выполняли, используя программное приложение Microsoft Office Excel и пакет программ Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. РЕАКТИВНОСТЬ СМФ ПРИ РАЗНЫХ ВАРИАНТАХ ГЕПАТОФИБРОЗА

1.1. Реактивность мононуклеарных фагоцитов при развитии CCl4-гепатофиброза,

Функциональную активность и реактивные свойства СМФ исследовали в динамике развития CCl4-гепатофиброза. Для оценки реакции СМФ как целого одновременно изучали функциональные изменения мононуклеарных фагоцитов печени, периферической крови, селезенки, костного мозга, перитонеальной полости и легких. При изучении печеночного звена СМФ оценивали численность и поглотительную активность фагоцитирующих КК, особенности их ультраструктуры, экспрессию мРНК ТФР-1, содержание ПГЕ2, активность катепсина Д и коллагенолитических ферментов в ткани печени. При исследовании внепеченочных отделов СМФ оценивали численность и фагоцитарную активность макрофагов, активность в них окислительного метаболизма, продукцию провоспалительных цитокинов, миелопоэтический ответ в костном мозге.

Было показано, что изменения функциональной активности различных отделов СМФ при развитии цирроза имеют фазовый характер. В инфильтративной стадии процесса (1-2 нед) происходит рост численности фагоцитарно активных КК, повышение захвата в печени коллоидных частиц и усиление клиринговой функции СМФ. При этом во внепеченочных отделах СМФ численность и функциональная активность макрофагов уменьшаются.

При дальнейшем развитии гепатофиброза количество нагруженных коллоидным углем КК уменьшается примерно в 4 раза, скорость клиренса крови от коллоидного угля – почти в 2 раза, зимозан-индуцированная инфильтрация – в 50 раз. Одновременно резко усиливается фиброгенная активность КК. На фоне дисфункции КК во внепеченочных отделах СМФ численность и функциональная активность Мф заметно возрастают. Количество Мн крови увеличивается в 1,7 раза, клеток моноцитарного ряда костного мозга – в 1,2 раза, Мн-Мф селезенки – в 1,8 раза, в бронхоальвеолярной жидкости – в 1,5 раза. Количество захватывающих уголь Мф селезенки повышается вдвое, интерстициальных Мф легких – примерно в 4 раза; поглощение интерстициальными Мф частиц коллоидного угля (КУ) увеличивается более чем в 10 раз. Восстановление НСТ и поглощение метакрилатных гранул альвеолярными Мф также возрастает. В сыворотке крови при сформированном циррозе наблюдается 2-кратное по сравнению с базальным уровнем увеличение содержания ТНФ- и ИЛ-1.

Одна из основных характеристик функционального состояния/фенотипа мононуклеарных фагоцитов - реактивность этих клеток, т.е. их способность отвечать на стимул. При воспалительном ответе данная характеристика предопределяет спектр и уровень продукции про- и антивоспалительных медиаторов и цитокинов и, тем самым, в значительной степени - течение и исход воспалительного процесса. Реактивность клеток СМФ оценивали по их ответу на стимуляцию зимозаном (Z) или эндотоксином. У контрольных животных введение зимозана вызывало формирование гранулем, резкий рост поглотительной активности КК и численности фагоцитарно активных КК, повышение скорости очищения крови от коллоидного угля в 4 раза, коллагенолитической активности – в 2 раза, удельной активности катепсина Д – более чем в 2 раза. Развитие фиброза сопровождалось прогрессивным снижением способности печеночных Мф реагировать на стимуляцию. Так, к 14 нед. CCl4-интоксикации клиринговая функция КК и численность фагоцитарно активных Мф печени под действием зимозана не менялись, очаги мононуклеарной инфильтрации не формировались, активность лизосомальных ферментов и коллагенолитическая активность ткани печени не возрастали, эффективность ЛПС-стимулированной генерации ПГЕ2 в Мф печени падала в 2,6 раза. При сформированном CCl4-циррозе во внепеченочных популяциях СМФ, так же, как и в печеночном отделе, развивалась гипореактивность Мф, т.е. их стимуляция оказывалась малоэффективной (рис. 1).

Рис. 1. Формирование гипореактивности СМФ при CCl4-индуцированном циррозе печени. За 100% приняты значения показателей у нестимулированных контрольных животных. Серые столбцы – показатели при стимуляции контрольных животных, черные – при стимуляции животных с циррозом печени. * - различия статистически значимы по сравнению с нестимулированным контролем при p < 0,05, ** - при p < 0,01, *** - при p < 0,001. 1 – Vv Z-инфильтрации в печени; 2 –содержание ТНФ- и 3 – содержание ИЛ-1 в сыворотке крови при стимуляции ЛПС; 4 – Z-стимулированная фагоцитарная активность Мф печени; 5 – ЛПС-стимулированная секреция ПГЕ2 Мф печени; Z-стимулированные 6 – активность катепсина Д в печени; 7 – коллагенолитическая активность ткани печени; 8 – численность Мн крови; 9 – численность мононуклеарных фагоцитов селезенки; 10 – число фагоцитарно активных мононуклеарных фагоцитов селезенки; 11 - численность мононуклеарных фагоцитов в костном мозге; 12 – пролиферативная активность прекурсоров моноцитопоэза; 13 – численность альвеолярных Мф; 14 – фагоцитарная активность интерстициальных Мф легких; 15 – восстановление НСТ альвеолярными Мф; 16 – численность перитонеальных Мф; 17 – фагоцитарная активность перитонеальных Мф.

1.2. Роль хронической эндотоксинемии в формировании гиперхолестеринемии и гипореактивности СМФ

Системное снижение реактивности мононуклеарных фагоцитов позволило предположить, что при гепатофиброзе в системном кровообращении появляются толерогенные факторы. В наших опытах получены доказательства того, что толерогенным фактором при гепатофиброзе является хроническая системная эндотоксинемия. Было показано, что при CCl4-циррозе развивается депрессия костномозгового компартмента СМФ, которая отменяется элиминацией циркулирующего эндотоксина полимиксином-B.

Длительное или повторяющееся поступление ЛПС в кровообращение вызывает состояние макрофагальной эндотоксиновой толерантности (Cross A.S., 2002). Было обнаружено, что повторяющиеся введения ЛПС животным вызывают резкое повышение содержания ЛПНП в сыворотке крови, появление в Мф липидных включений и рост содержания в них окисленных производных ХС (оксистеролов). Было предположено, что толерогенное действие хронической эндотоксинемии связано с развитием гиперхолестеринемии и с аккумуляцией в Мф ХС и оксистеролов.

1.3. Реактивность мононуклеарных фагоцитов при развитии гранулематозного воспаления, индуцированного частицами SiO2 или зимозана.

В моделях гранулематозного воспаления, вызванного в/в введением частиц SiO2 или зимозана мы показали, что SiO2-гранулемы персистируют в ткани печени в течение месяцев и претерпевают выраженную фиброзную трансформацию, тогда как зимозан-индуцированные гранулемы существуют лишь 1-2 нед. и не вызывают отложений СТ. Большое количество макрофагов SiO2-гранулем инфильтрировано липидными включениями. В наших опытах в суспензии перитонеальных Мф продемонстрировано, что способность частиц SiO2 вызывать провоспалительный ответ существенно ниже, чем у частиц зимозана. Морфометрически обнаружено, что гипореактивность мононуклеарных фагоцитов при гепатосиликозе связана с SiO2-индуцированным, по-видимому апоптоз-опосредованным, уменьшением численности Мф печени (аналогично снижению численности Мф в печени при CCl4-гепатофиброзе). Таким образом, гипореактивность Мф при SiO2-гранулематозе ассоциирована с фиброзными преобразованиями и с аккумуляцией липидов в Мф.

Рис. 2. Люминол-зависимая хемилюминесценция перитонеальных макрофагов, индуцированная добавлением в среду инкубации разных концентраций частиц зимозана и SiO2.

1.4. Реактивность мононуклеарных фагоцитов при затяжных вирусных гепатитах человека.

Ассоциация гипореактивности Мн-Мф с хронизацией воспалительного поражения печени, как правило эволюционирующего в цирроз, показана нами также при вирусных гепатитах (ВГ) человека: содержание Мн в крови было уменьшено по сравнению с нормой в 2 раза, способность Мн-Мф мигрировать в очаг воспаления (индекс дермограммы в тесте кожного окна) – в 2,5-10 раз. При стимуляции ЛПС S.Marcescens (продигиозан) у больных острым ВГ число Мн крови возрастало почти в 2,5 раза, тогда как у больных затяжным течением оно практически не менялось. При остром ВГ индекс дермограммы возрастал под действием ЛПС на 2,2, а при затяжном – только на 0,59; плотность миграции клеток увеличивалась соответственно на 1376 и на 208 кл/мм2. Очевидно, гипореактивность Мф является фактором хронизации болезни, и так же, как при экспериментальных гепатитах, важным механизмом ее формирования является эндотоксинемия, характерная для хронических форм ВГ (Chen C. et al., 2007). При затяжном течении ВГ развивается гиперлипидемия с атерогенным профилем ЛП и стеатоз печени (Fabris C. et al., 1997), причем обязательным условием этих нарушений липидного обмена при ВГ является эндотоксинемия (Yoshimatsu et al., 2004). ЛПС-стимуляция СМФ корригировала нарушенные функции Мн-Мф и улучшала функциональное состояние печени.

2. РЕАКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПРИ АТЕРОГЕНЕЗЕ

2.1. Хроническая эндотоксинемия и формирование ЛПС-липопротеиновых комплексов как факторы аккумуляции ХС и его производных в Мф, гипореактивности СМФ и атерогенеза.

Атеросклероз считается своеобразным хроническим Мф-зависимым воспалительным процессом с выраженным фибропластическим компонентом (Stoll G. et al., 2006). Мы предположили, что эндотоксинемия - один из важнейших патогенетических факторов атеросклероза, причем ключевую роль в атерогенезе играет формирование комплексов ЛПС с ЛПНП. Формирование ЛПС-ЛП комплексов не только инактивирует циркулирующий ЛПС, выступая внеклеточным фактором гипореактивности Мф (Feingold et al.,1995), но и усиливает захват и аккумуляцию липидов в Мф, включая Мф артериальной стенки.

В исследовании, проведенном с использованием метода последовательного ультрацентрифугирования сывороток крови больных с нормолипидемией и гиперлипидемиями IIa и IV типа, преинкубированных с [125I]-ЛПС, мы установили, что ЛП крови связывают до 60% ЛПС, причем при атерогенном профиле ЛП максимальное количество эндотоксина связывают апо В-содержащие ЛП – в большей степени ЛПНП. Заключили, что при воспалительно/эндотоксин-индуцированной гиперхолестеринемии создаются условия для формирования повышенного количества ЛПС-ЛПНП комплексов.

Учитывая значительный вклад ЛП высокой плотности (ЛПВП) в связывание ЛПС и возможное влияние ЛПС на функции ЛПВП, исследовали действие разных концентраций ЛПС на активность одного из ключевых ферментов обратного транспорта ХС, лецитин-холестерин-ацилтрансферазы (ЛХАТ). Установлено, что добавление ЛПС к сыворотке крови дозо-зависимо снижает активность ЛХАТ. Таким образом, формирование ЛПС-ЛПВП комплексов ингибирует ЛХАТ-индуцированную эстерификацию на поверхности ЛПВП, тем самым нарушая акцепцию свободного ХС из тканей, включая Мф, и являясь существенным фактором атерогенности.

Исследование клиренса крови от ЛПНП при формировании ЛПНП-ЛПС комплексов в экспериментах in vivo на крысах Вистар показало что связывание ЛПС с 125I-ЛПНП приводит к резкому – более чем на порядок -ускорению выведения ЛПНП из кровотока, очевидно, за счет модификации и усиленного поступления в Мф через скавенджер-рецепторы. Одновременно образуется малая субфракция ЛПНП-ЛПС, которая выводится значительно медленнее, чем свободные ЛПНП. Следовательно, связывание эндотоксина с ХС-богатыми ЛП приводит к образованию атерогенных ЛПНП, бльшая часть которых быстро аккумулируется в Мф.

Возможность повышенного связывания и деградации 125I-ЛПНП-ЛПС мононуклеарными фагоцитами по сравнению со свободными 125I-ЛПНП изучали в культуре перитонеальных Мф (соответственно при 0° и при 37°С). Было продемонстрировано, что связывание комплексов по сравнению со свободными 125I-ЛПНП повышается в 1,7 раза, а деградация, в значительной степени отражающая захват ЛП – в 7 раз. Очевидно, увеличение связывания и захвата ЛПНП при формировании ЛПНП-ЛПС комплексов при эндотоксинемии способствует аккумуляции ХС-богатых ЛП в Мф и их трансформации в пенистые клетки.

Атерогенность ЛПС-ЛПНП комплексов была подтверждена на эксплантатах аорты крысы, инкубированных с 125I-ЛПНП или с 125I-ЛПНП-ЛПС. Продемонстрировано более чем 6-кратное увеличение связывания (0° С) и 2-кратное увеличение захвата (37° С) ЛПНП-ЛПС комплексов по сравнению со свободными ЛПНП (табл.1).

Таблица 1.

Накопление 125I-ЛПНП и 125I-ЛПНП-ЛПС (200 мкг/мл среды) тканью

аорты крыс при инкубации in vitro (M ± m)

Условия инкубации	Липопротеины	Накопление ЛП (нг ЛПНП/мг веса аорты)
0°С	125I-ЛПНП	69 ± 13
	125I-ЛПНП-ЛПС	438 ± 66**
37°С	125I-ЛПНП	503 ± 87
	125I-ЛПНП-ЛПС	1169 ± 154*

* - различия по сравнению с 125I-ЛПНП статистически значимы при р < 0,01;

** - при р < 0,001

Доказательства атерогенности ЛПС-ЛПНП комплексов in vivo получены на мышах C57Bl/6 в модели атерогенеза, индуцированного ХС диетой и длительным (3 мес.) интраперитонеальным введением эндотоксина. Обнаружено, что и хроническая эндотоксинемия, и ХС диета вызывают накопление в аорте ХС и его эфиров. Сочетание диеты с эндотоксинемией оказывает наиболее выраженный эффект. Поскольку ХС и, особенно, эфиры ХС - основной молекулярный субстрат, депонирующийся в атеросклеротических бляшках, можно утверждать, что получены прямые доказательства атерогенности хронической эндотоксинемии in vivo.

2.2. Аккумуляция ХС и его окисленных производных в атеросклеротических бляшках при их фибросклеротической трансформации.

Эволюция бляшки может приводить к ее фибросклеротической трансформации. Используя в качестве объекта пораженные атеросклерозом коронарные артерии человека, полученные при аортокоронарном шунтировании, оценивали взаимосвязь между накоплением ХС и оксистеролов в сосудистой ткани и фиброзными изменениями. В образцах нормальной артериальной ткани, атеросклеротических бляшек на стадии липидного пятна и бляшек на стадии фибросклеротической трансформации определялось содержание свободного ХС, эфиров ХС и двух наиболее представленных у человека, оксистеролов: 7-кето-ХС и 27-ОН-ХС. Было показано, что в нормальной артериальной ткани эфиры ХС и 7-кето-ХС практически отсутствуют, а свободный ХС и 27-ОН-ХС обнаруживаются в низкой концентрации. На стадии липидного пятна и фиброзной бляшки происходит рост уровня ХС соответственно в 2,5 и 6,6 раза по сравнению с нормальной артерией. Уровень эфиров ХС в липидных бляшках по сравнению с нормой значительно повышается, а в фиброзных – возрастает еще в 2,8 раза. Концентрация 27-ОН-ХС в липидных бляшках увеличивается в 20 раз, а в фиброзных еще более чем вдвое, уровень 7-кето-ХС в фиброзных бляшках возрастает по сравнению с липидными в 6 раз. Таким образом, можно полагать, что повышенная аккумуляция ХС и его производных в зонах атеросклеротического воспаления индуцирует профиброзный функциональный фенотип Мн-Мф.

3. РОЛЬ МЕВАЛОНАТНОГО МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ В РЕГУЛЯЦИИ РЕАКТИВНОСТИ СМФ И В ФИБРОГЕНЕЗЕ В МОДЕЛЯХ IN VIVO

3.1. Влияние модуляторов активности мевалонатного метаболического пути (ХС диета, аторвастатин, кальцитриол, мевалоновая кислота) на выраженность фиброзного ответа при разных вариантах гепатофиброза.

Так как во всех исследованных моделях наблюдали ассоциацию поствоспалительного фиброгенеза и гипореактивности СМФ с гиперхолестеринемией и накоплением липидов в Мф/очагах воспаления (в том числе опосредованном ЛПС-ЛПНП комплексами), мы предположили, что аккумуляция ХС и его окисленных производных в Мф играет значительную роль в индукции фиброгенного ответа и снижении реактивности мононуклеарных фагоцитов. Поскольку ХС и оксистеролы – мощные ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А редуктазы (ГМГР), предположили, что фиброгенный ответ и гипореактивность Мф во многом обусловлены ингибированием мевалонатного метаболического пути, точнее, образующимся дефицитом его промежуточных метаболитов.

Для проверки этих предположений в моделях хронического Мф-зависимого диффузного (CCl4-индуцированного) и гранулематозного (зимозан-индуцированного) гепатита у мышей в качестве ингибиторов ГМГР использовали 2,5% ХС диету или внутрижелудочное введение ингибиторов – аторвастатина или кальцитриола. Для отмены эффектов ингибирования часть животных с CCl4- или с зимозан-индуцированным гепатитом вместе с ХС или аторвастатином или кальцитриолом (или без них) ежедневно внутрибрюшинно получала мевалонат. В исследовании установлено, что и при обоих вариантах воспаления в печени происходит увеличение содержания свободного ХС (соответственно в 1,3 и в 1,4 раза), его эфиров (в 1,9 и 1,2 раза) и окисленных производных (в 1,4/1,5 раза), а ХС диета вызывает дополнительную значительную (еще в 1,5-2,5 раза) аккумуляцию стеролов. На фоне индуцированного ХС диетой роста концентрации ХС и его производных фиброзная трансформация печени драматически усиливается, содержание коллагена в печени при CCl4-гепатофиброзе повышается вдвое, а при гепатите, вызванном зимозаном – в 1,7 раза (Табл. 2). В области зимозановых гранулем количество коллагена увеличивается в 10 раз и происходит их инкапсуляция, тогда как в контроле при зимозан-индуцированном гранулемогенезе признаков фиброзирования вообще не наблюдается. Мощное усиление фиброзирования под действием ХС диеты не было обусловлено усилением повреждения печени, так как данная диета не повышала уровня аминотрансфераз в сыворотке крови и выраженность морфологических признаков альтерации. Оксистеролы и, особенно, ХС – это мощные транскрипционные и, одновременно, посттранскрипционные ингибиторы ГМГ-редуктазы, ключевого фермента мевалонатного метаболического пути. Более «мягкие» ингибиторы ГМГР, аторвастатин и кальцитриол, также вызывали тенденцию к росту отложений коллагена в печени при зимозановом гепатите.

Таблица 2.

Содержание свободного ХС, ЭХС, оксистеролов, ТГ и коллагена в печени мышей с CCl4- или зимозан (Z)-индуцированном гепатитом, получавших ХС диету

Группы животных	ХС мкг/мг белка	ЭХС мкг/мг белка	ТГ мкг/мг белка	Оксистеролы (нг/мг белка)		Объемная плотность отложений коллагена (у.е.)
				25-OH-ХС	7-кето-ХС
Контроль	9,0 ± 0,8	7,5 ± 1,1	24,7 ± 1,3	17,1 ± 1,7	-	25,4 ± 1,0
ХС	21,0 ± 1,6***	18,4 ± 1,2***	32,6 ± 2,4*	32,8 ± 4,4**	8,0 ± 0,6	27,4 ± 1,04
Z	12,2 ± 1,4	9,0 ± 0,7	30,9 ± 1,5*	25,1 ± 3,6	6,1 ± 1,1	27,6 ± 1,81
ХС + Z	17,3 ± 1,9**#	13,3 ± 1,5**#	34,2 ± 3,6**	64,9 ± 5,2***	12,6 ± 2,7##	47,1 ± 3,2***###
CCl4	11,5 ± 1,3	14,3 ± 1,7**	45,6 ± 2,7***	23,2 ± 2,0	25,0 ± 1,2	53,5 ± 8,2***
ХС + CCl4	16,7 ± 0,9**&	12,6 ± 0,9**	49,0 ± 3,6***	52,5 ± 3,9***	42,4 ± 3,7&&&	104,7±10,6&&&

* - различия статистически значимы по сравнению с контролем, # - с группой Z, & - с группой CCl4 при *, #, & р <0,05, **, ## - р <0,01, ***, ###, &&& - при р <0,001

У животных, получавших одновременно с ХС диетой мевалонат, отменяющий эффекты ингибирования ГМГР, фиброгенный эффект ХС уменьшался: при зимозановом гепатите в 1,4 раза, при CCl4-гепатофиброзе – в 1,2 раза. ХС-зависимая индукция фиброгенеза при обоих типах гепатита оказалась ассоциирована с индукцией в печени экспрессии мРНК ТФР-1.

3.2. Влияние ингибирования активности мевалонатного пути (ХС диета) на реактивность СМФ.

Наряду с фиброгенным эффектом ХС диеты мы показали ее способность индуцировать гипореактивность СМФ, что проявлялось в снижении по сравнению с контролем ЛПС-стимулированного подъема уровня ТНФ- в сыворотке крови животных, уровней зимозан-индуцированных гранулемогенного миелопоэтического ответов. Так, на фоне ХС диеты уровень ТНФ- в ответ на введение мышам ЛПС поднимался в 6,2 раза, а в контроле – в 16 раз. В контроле зимозан вызывал увеличение относительного количества мононуклеарных фагоцитов в костном мозге в 3 раза, число гранулоцитарно-макрофагальных колоний возрастало в 1,4 раза, число незрелых гранулоцитарных элементов - на 56%. На фоне ХС диеты под действием зимозана численность мононуклеарных фагоцитов, количество миелоидных прекурсоров и число гранулоцитарно-макрофагальных колоние-образующих единиц не изменялось, численность зрелых гранулоцитов резко (в 1,8 раза) падала, что на фоне отсутствия стимуляции пролиферации свидетельствует о нарушении их дифференцировки. Слабый ответ миелопоэза на зимозановую стимуляцию сопровождался снижением численности КК и уменьшением объемной плотности зимозановых гранулем в печени в 1,5 раза. Поскольку ингибирование мевалонатного пути ХС диетой вызывает усиление фиброгенеза и гипореактивность СМФ, мы предположили, что отмена эффектов ингибирования мевалонатом не только отменяет усиление фиброгенного ответа, но и индуцирует повышение реактивности Мн-Мф.

3.3. Влияние модуляторов активности мевалонатного метаболического пути (ХС диета, мевалоновая кислота) на выраженность фиброзного ответа и реактивность мононуклеарных фагоцитов при разных вариантах нефросклероза.

Гипотезу о возможной роли мевалонатного пути в модуляции реактивности/фенотипа Мф и фиброгенезе верифицировали также в двух моделях нефросклероза. В качестве основной модели использовали хроническое поражение почек у мышей, вызванное глицерин-индуцированным рабдомиолизом. Второй моделью было поражение почек у мышей, вызванное унилатеральной обструкцией мочеточника. ГМГР ингибировали ХС диетой, а отмену ингибирования/повышение активности мевалонатного пути вызывали введением мевалоната. Функцию почек оценивали по уровню альбумина, мочевины и креатинина, а нарушения липидного обмена – по уровню ХС и триглицеридов сыворотки крови. Выраженность воспаления и фиброза оценивали на гистологических срезах морфометрически. Было установлено, что у интактных животных ХС диета и мевалонат практически не влияют на структуру и функции почек, однако при рабдомиолизном поражении почек ХС диета значительно усиливала нефросклероз, не влияя на альтернативно-инфильтративный процесс. Мевалонат, наоборот, не влиял на фиброгенез, но усиливал альтерацию. При совместном введении мевалонат уменьшал фиброгенное действие ХС диеты. Принципиально сходные данные были получены в модели обструкции мочеточника: ХС диета приводила к увеличению отложений коллагена, тогда как мевалонат отменял этот эффект.

Функциональное состояние СМФ при нефропатии оценивали по спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции NO в перитонеальных Мф. ЛПС вызывал рост продукции NO в Мф интактных мышей и животных с рабдомиолизом соответственно в 7,6 и 17,8 раза. У контрольных животных, находившихся на ХС диете, ЛПС-стимулированная продукция NO была в 1,6 раза ниже, чем в интактной группе. Мевалонат, наоборот, повышал эту продукцию в 1,8 раза. Наиболее разительное снижение реактивности Мф ХС диета вызывала у мышей с рабдомиолизом: ЛПС практически не влиял на генерацию NO, т.е. под действием ХС формировалось состояние толерантности Мф. Ингибирование продукции NO в Мф животных, получавших ХС, объясняется, очевидно, ХС-стимулированной продукцией этими клетками TGF-1. Мевалонат усиливал ЛПС-стимулированную генерацию NO, найденную при рабдомиолизном поражении, в 1,8 раза. На фоне ХС диеты мевалонат отменял толерогенный эффект ХС (Рис. 3). Поскольку мевалонат усиливает синтез ХС в почках (Zager et al., 2002), заключили, что отмена вызванной холестерином гипореактивности Мф обусловлена промежуточными продуктами мевалонатного пути.

Рис. 3. Влияние холестериновой диеты и введения мевалоната на ЛПС-индуцированную продукцию NO перитонеальными макрофагами мышей C57Bl/6 при нефропатии, вызванной 3-кратным глицерин-индуцированным рабдомиолизом на 38 сут эксперимента. Показаны репрезентативные данные одного из трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде концентрации нитрита в инкубационной среде (мкМ).

Таким образом, в условиях in vivo не только в печени, но и в других паренхиматозных органах мевалонатный метаболический путь играет существенную роль в формировании фенотипа Мф и детерминации течения и исхода фибропролиферативного процесса. Очевидно, изменение пула промежуточных метаболитов мевалонатного пути может послужить новым подходом к поиску мишеней для лечения органосклерозов.

3.4. Влияние ингибирования мевалонатного пути (в/б введение ХС) на выраженность фиброзного ответа и реактивность мононуклеарных фагоцитов при асептическом перитоните.

Исследование ХС-индуцированной модуляции Мф реактивности in vivo и величины фиброгенного ответа проводили и на модели асептический перитонита, вызванного интраперитонеальной инъекцией зимозана, на фоне которого для моделирования спаечного процесса в брюшной полости внутрибрюшинно вводили ХС. Введение зимозана или ХС не вызывало образования спаек, тогда как их совместное введение приводило через 10 сут. к формированию 4-5 мощных спаек. В перитонеальных Мф, выделенных на 11-е сутки после совместного введения зимозана и ХС, способность отвечать на стимуляцию резко снижалась: продукция ТНФ- уменьшалась на 30%, продукция ИЛ-1 падала на порядок, тогда как уровни ИЛ-10 и ТФР-1 менялась незначительно, что в целом смещало цитокиновый профиль Мф от продукции провоспалительных к антивоспалительным/фиброгенным цитокинам. Таким образом, ХС индуцирует поствоспалительный фиброгенез в брюшной полости, в основе чего лежит изменение Мф фенотипа с формированием гипореактивности.

3.5. Выраженность фиброзного ответа и реактивность СМФ у инбредных мышей с разной чувствительностью ГМГР к регуляторным воздействиям при SiO2- или зимозан-индуцированном гранулематозе.

Эффективность регуляции активности ГМГР генетически детерминирована, отличаясь у инбредных мышей ряда линий в десятки раз: у мышей линии C57Bl/6 способность ГМГР отвечать на ингибирующие (ХС) и активирующие (статины, секвестранты желчных кислот) агенты очень высока, у BALB/c низка и у C3H – минимальна (Hwa J.J. et al., 1992). Представляло интерес выяснить, существует ли взаимосвязь между линие-специфическими особенностями ГМГР с одной стороны и уровнем реактивности СМФ и фиброгенного ответа - с другой. Межлинейные различия оценивали в динамике в моделях подкожного SiO2-индуцированного гранулематоза у мышей линий C57Bl/6, C57BR, BALB/c, CBA и C3H, зимозан- и SiO2-индуцированного гранулематозного гепатита у мышей линий C57Bl/6, CBA и BALB/c.

Во всех моделях независимо от природы частиц, вводимой дозы и локализации воспаления были обнаpужены четкие межлинейные pазличия в величине гpанулемогенного ответа: у линии C57Bl/6 ответ максимален и инфильтpаты пеpсистиpовали наиболее долго, CBA занимали пpомежуточное положение, а у BALB/c ответ был минимален. При подкожном силикозе была представлена также линия C3H, у которой гранулематозная реакция оказалась еще более кратковременной и слабовыраженной, чем у BALB/c. Таким образом, способность линий к гранулемогенезу уменьшается в таком же ряду C57BL/6-BALB/c-С3H, в каком снижается стимулированная активность ГМГР. Оценка миелопоэтического ответа у мышей C57Bl/6, CBA и BALB/c показала, что у всех линий введение SiO2 вызывает рост лейкоцитоза в крови и общей клеточности и числа ГМ-прекурсоров в костном мозге. При этом у C57Bl/6 почти 2-кратно более высокий, чем у CBA и BALB/c фоновый уровень численности ГМ-прекурсоров под действием SiO2 возрастал еще в 3 раза, тогда как у CBA и у BALB/c - только в 2,3 и в 1,8 раза. Межлинейные различия в содержании коллагена в печени и в формировании гранулем были сходны. На последних сроках эксперимента (4 мес) у всех линий снижалась выраженность инфильтрации, а фиброз продолжал прогрессировать. Межлинейных различий численности фагоцитарно активных КК и продукции ПГЕ2 в печени не было.

Активность ГМГР в острой фазе воспалительного ответа резко повышается (Feingold K. et al., 1989; Fon Tacer K et al., 2007), обеспечивая провоспалительные функции Мн-Мф и формирование инфильтрации. Поэтому обнаруженные межлинейные различия в величине миелопоэтического ответа и инфильтративной реакции могут быть обусловлены различиями активности ГМГР/мевалонатного пути. Высокая фиброгенная реакция при SiO2-гранулематозе у мышей C57BL/6 и более низкая у BALB/c может объясняться, соответственно, высокой и низкой эффективностью ХС-индуцированной даун-регуляции активности ГМГР, а также фиброгенными эффектами ГМ-КСФ (Chen J. Et al., 2003) и бльшей индуцибельностью апоптоза Мф мышей C57BL/6 (Hamilton R. et al., 2006), вероятно, зависимой от ингибирования мевалонатного пути (Vamvakopoulos J.E., 2005). Поскольку мыши линии C57BL/6 – классические прототипные респондеры Th1-типа, а BALB/c –Th2-типа, Th1Th2 поляризация в наших опытах с SiO2-гранулематозом не является определяющей для величины фиброгенного ответа. Заключили, что центральным звеном в механизмах регуляции инфильтративного и фиброгенного ответов может быть активность мевалонатного пути.

4. РОЛЬ МЕВАЛОНАТНОГО МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ В РЕГУЛЯЦИИ РЕАКТИВНОСТИ МФ И ПРОДУКЦИИ ТФР- В СИСТЕМАХ IN VITRO

4.1. Влияние модуляторов активности мевалонатного метаболического пути (ХС, оксистеролы, аторвастатин, мевалоновая кислота) на реактивность культивируемых макрофагов.

Поскольку хроническая эндотоксинемия или многократное введение ЛПС животным вызывают гипореактивность мононуклеарных фагоцитов, и одновременно, гиперхолестеринемию, липидную инфильтрацию и накопление в Мф оксистеролов, мы исследовали способность ХС и оксистеролов индуцировать гипореактивность Мф в культуре. Оценивали ЛПС-индуцированную экспрессию и продукцию провоспалительных цитокинов в культуре перитонеальных Мф, преинкубированных с 25-ОН-ХС, 27-ОН-ХС, 7-кето-ХС и ХС. Преинкубация со стеролами проводилась в присутствии или отсутствии мевалоната. Кроме того, в этих же экспериментах оценивали действие аторвастатина. Было показано, что преинкубация Мф с 25-ОН-ХС (но не с ХС и не с 7-кето-ХС) снижала ЛПС-стимулированную экспрессию мРНК ИЛ-1 и ТНФ-. Преинкубация Мф с ХС, оксистеролами или аторвастатином снижала ЛПС-индуцированную секрецию ТНФ-, а мевалонат полностью или частично отменял этот эффект.

Рис. 4. Действие холестерина, оксистеролов и аторвастатина на ЛПС-индуцированную продукцию ТНФ- в культуре перитонеальных макрофагов в присутствии и отсутствии мевалоновой кислоты. За 100% принят уровень ЛПС-индуцированной продукции ТНФ- в макрофагах, инкубированных без мевалоната. * - различия по сравнению с соответствующим ЛПС-контролем статистически значимы при р < 0,05, *** - при р < 0,001.

Отсутствие влияния ХС (в отличие от оксистеролов) на экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов, и, одновременно, его ингибирующий эффект в отношении их продукции означает, что толерогенное действие ХС на Мф осуществляется преимущественно посттранскрипционно. Наиболее эффективно мевалонат восстанавливает ЛПС-стимулированную продукцию провоспалительных цитокинов при действии ХС, 7-кето-ХС и аторвастатина, и много менее эффективно – при действии 25- и 27-ОН-ХС. Это свидетельствует о зависимости толерогенных свойств ХС от мевалонатного пути, а 25- и 27-ОН-ХС – от LXR.

Данные in vivo и in vitro хорошо согласуются между собой: ХС и оксистеролы во всех моделях индуцируют гипореактивность Мф, а мевалонат отменяет толерогенный эффект ХС и повышает реактивность Мф. Сходство эффектов стеролов, аторвастатина и мевалоната в моделях воспаления in vivo и в культуре Мф указывает на то, что мононуклеарные фагоциты – основные клетки-акцепторы и эффекторы мевалонат-модулирующих сигналов при воспалении, и что в реальных условиях хронического воспаления ХС и его производные являются такими сигналами.

4.2. Влияние модуляторов активности мевалонатного метаболического пути и агонистов ядерных гормональных рецепторов (аторвастатин, ХС, оксистеролы, фарнезол, 9-цис ретиноевая кислота, мевалоновая кислота) на продукцию ТФР-1 в культуре макрофагов.

По нашим данным аккумуляция ХС и его окисленных производных в воспалительно измененной ткани и в Мф ассоциирована не только с гипореактивностью мононуклеарных фагоцитов, но и с резким усилением фиброгенного ответа, который ассоциирован с повышенной экспрессией ТФР-1, ключевого профиброзного цитокина, основным клеточным продуцентом которого в очаге хронического воспаления являются Мф. В культуре -гликан- и/или ЛПС-стимулированных перитонеальных Мф определяли влияние мевалоната на продукцию ТФР-1 под действием ХС, 7-кето-ХС и агонистов ядерных гормональных рецепторов LXR (25-ОН-ХС), FXR (фарнезол) и RXR (9-цис ретиноевая кислота). Повышенная продукция ТФР-1 в Мф, рекрутированных в брюшную полость -гликаном, возрастала ещё больше после их инкубации с ХС. Напротив, агонисты ядерных рецепторов снижали повышенную при рекрутировании секрецию ТФР-1 - наиболее эффективно фарнезол и 25-ОН-ХС, менее эффективно – ретиноевая кислота. 7-кето-ХС, неспособный взаимодействовать с LXR, не снижал продукцию ТФР-1. Следовательно, усиление функции ядерных рецепторов может блокировать рост не только про-, но и антивоспалительных молекул цитокинового каскада. Культивирование воспалительных Мф в присутствии мевалоната снижало продукцию ТФР-1 в контроле и при инкубации с ХС, 7-кето-ХС и с 25-ОН-ХС. Мы заключили, что эффекты воспаления, холестерина и оксистеролов на продукцию ТФР-1 существенно зависят от активности мевалонатного метаболического пути. При инкубации клеток с фарнезолом или с ретиноевой кислотой (которая, согласно Holstein S.A. et al., 2002, не только лиганд для RXR, но и структурный аналог фарнезил-пирофосфата,) мевалонат не оказывал эффекта. Уменьшить продукцию ТФР-1 в воспалительных Мф, уже сниженную фарнезолом, мевалонат неспособен, т.е. его эффекты в значительной мере опосредованы фарнезолом - одним из промежуточных продуктов мевалонатного пути.

Мы предположили, что ХС не только в среде инкубации, но и поступающий в организм, повышает продукцию ТФР-1 в воспалительно стимулированных перитонеальных Мф. Клетки инкубировались в присутствии или отсутствии мевалоната и/или ЛПС без добавления в среду инкубации стеролов и агонистов ядерных рецепторов. Данные, полученные на животных, находившихся на ХС диете, в целом были аналогичны таковым, полученным в системе in vitro: диета приводила к резкому росту продукции ТФР-1 в Мф, инкубация этих клеток с ЛПС не влияла, а с мевалонатом снижала продукцию ТФР-1. Совместное добавление ЛПС и мевалоната в среду инкубации также существенно снижало эту продукцию.

4.3. Роль ТФР-1 и активности мевалонатного метаболического пути в формировании макрофагальной эндотоксиновой толерантности.

В отдельных экспериментах воспалительные перитонеальные Мф получали от животных с индуцированной ЛПС эндотоксиновой толерантностью. Было показано, что продукция ТФР-1 в Мф при этом состоянии очень высока, в то время как при 1-кратном введении ЛПС продукция ТФР-1 снижается. В использовавшейся в этих экспериментах классической модели ЛПС-толерантности была обнаружена эффективная отмена усиленной продукции ТФР-1 мевалонатом. Принимая во внимание Мф-деактивирующие функции ТФР-1, мы заключили, что повышенная продукция ТФР-1 при эндотоксиновой толерантности – это аутокринный механизм ее формирования и поддержания. Следовательно, не только фиброгенный процесс, “двигателем” которого является ТФР-, сам по себе вызывает ТФР-опосредованную гипореактивность Мф, но и собственно эндотоксиновая толерантность, индуцируя ТФР-, тем самым, “движет” фиброзный процесс, т.е. явления гипореактивности Мф и фиброгенеза взаимопотенцируют друг друга. Обнаруженная зависимость продукции ТФР-1 от мевалоната ясно показывает, что и фиброгенез, и состояние ЛПС-толерантности зависят от синтеза продуктов мевалонатного пути.

В данной работе изучены интегральные регуляторные механизмы трех фундаментальных процессов: хронического воспаления, липидного метаболизма и фиброза. Показано, что ключевым звеном, связывающим эти процессы являются мононуклеарные фагоциты, от реактивности которых кардинальным образом зависит уровень фиброгенного ответа. Установлено, что наряду с активностью ядерных гормональных рецепторов, одним из важнейших механизмов регуляции макрофагальной системы является активность мевалонатного метаболического пути, промежуточные метаболиты которого являются, по сути, молекулярными переключателями реактивности Мф. Очевидно, применение производных продуктов мевалонатного пути при фиброзных процессах может стать новым подходом в лечении органосклерозов. Эффективными антифиброгенными средствами могут стать также агонисты ядерных гормональных рецепторов.

Результаты работы позволяют обосновать новую концепцию регуляции воспаления и фиброгенного ответа, согласно которой одним из ключевых механизмов контроля выраженности мононуклеарной инфильтрации и фиброза является величина внутримакрофагального пула нестерольных изопреноидов. Величина этого пула зависит от активности мевалонатного метаболического пути, увеличивается за счет активации ГМГР в острую фазу воспаления, а затем по механизмам отрицательной обратной связи снижается вследствие аккумуляции в Мф ХС и его окисленных производных. Это обусловливает переход от острой фазы воспаления к последующим, индуцирует гипореактивность мононуклеарных фагоцитов и продукцию в них фиброгенных цитокинов. При длительной аккумуляции ХС и оксистеролов в Мф на фоне продолжающейся их стимуляции развивается фиброзная трансформация органа (Рис. 5).

Восп. агент гХС, ЛПНП, ЛПС-ЛП комплексы, ЬЛХАТ

(ЛПС и др.) гиперхолестеринемия

Провоспалительные

МФ медиаторы и МФ

цитокины

гОксистеролы гипореактивность МФ

гГМГР гХС

гНестерольные

изопреноиды дГМГР ТФР

дНестерольные

изопреноиды

ОСТРАЯ ФАЗА ХРОНИЗАЦИЯ ФИБРОЗ

ВОСПАЛЕНИЯ

Рис. 5. Схема влияния активности мевалонатного пути на формирование гипореактивности макрофагов, смену фаз воспаления и индукцию хронического воспалительного и фиброгенного ответа

ВЫВОДЫ

1. Способность гранулемогенных частиц (SiO2 и зимозан) вызывать фиброгенный ответ и стимулировать биоцидно-окислительный провоспалительный ответ находятся в обратной зависимости. Низкий провоспалительный ответ мононуклеарных фагоцитов на фиброгенные частицы SiO2 по сравнению с нефиброгенным зимозаном ассоциирован с истощением инфильтративного потенциала системы мононуклеарных фагоцитов и с ScR-зависимым токсико-апоптотическим действием SiO2 на макрофаги.

2. Различия в величине гранулемогенного ответа у инбредных мышей разных линий не зависят от природы и дозы воспалительного агента (SiO2 или зимозана) и от локализации фокусов мононуклеарной инфильтрации, а детерминируются продукцией ГМ-КСФ в костном мозге и уровнем миелопоэтического ответа, который прямо коррелирует с линиеспецифической способностью к up-регуляции 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А редуктазы (ГМГР). Уровень SiO2-индуцированного фиброзного ответа не определяется генетической склонностью линий мышей к Th1- (С57Bl/6) или Th2- (Balb/с) поляризации, может не коррелировать с величиной гранулемогенной реакции, но совпадает по вектору с линиеспецифической способностью к даун-регуляции ГМГР.

3. Развитие CCl4-гепатофиброза ассоциировано с функциональной депрессией печеночного компартмента системы мононуклеарных фагоцитов при одновременной активации внепеченочных отделов СМФ. При этом способность всех отделов СМФ реагировать на провоспалительный стимул уменьшается. Данные эффекты в значительной мере зависят от развития хронической системной эндотоксинемии, которая индуцирует гиперлипидемию и накопление холестерина (ХС) и его окисленных производных в макрофагах.

4. У больных вирусными гепатитами А или В содержание моноцитов в крови и показатели миграционно-инфильтративной активности моноцитов-макрофагов снижены по сравнению с нормой, причем при затяжном течении это снижение более выражено, чем при остром. Функциональная недостаточность СМФ у больных с острым и, особенно, затяжным течением корригируется стимуляцией макрофагов ЛПС, что сочетается со значительным улучшением функций печени.

5. При эндотоксинемиях в сочетании с гиперлипидемиями, характерными для воспалительной реакции (типы IIа и IV по D.S.Fredrickson) создаются условия для формирования большого количества ЛПС-липопротеиновых комплексов, что приводит к модификации частиц ЛПНП и к нарушению активности лецитин-холестерин ацилтрансферазы, одного из ключевых ферментов обратного транспорта холестерина. ЛПС-ЛПНП комплексы гораздо более эффективно, чем свободные липопротеины, захватываются и аккумулируются в макрофагах и накапливаются артериальной стенке. При избыточном поступлении холестерина в организм хроническая системная эндотоксинемия ускоряет накопление холестерина и его эфиров в сосудистой стенке.

6. При хроническом воспалении в ткани печени и артериальных сосудов (CCl4, зимозан, атеросклероз) накапливаются нейтральные липиды, холестерин и оксистеролы. Избыточное поступление холестерина в организм (ХС-диета, в/б введение) резко усиливает аккумуляцию этих соединений в зоне воспаления, стимулирует экспрессию ТФР-1 и повышает фиброгенный ответ при разных вариантах воспаления в печени, почках, артериальных сосудах и в брюшной полости. Аналогично, присутствие холестерина в среде инкубации воспалительно рекрутированных макрофагов усиливает продукцию ТФР-1.

7. Холестериновая диета и аккумуляция холестерина и оксистеролов в воспалительно-измененной ткани в моделях гепатофиброза, нефросклероза, атеросклероза и интраабдоминального спайкообразования вызывают гипореактивность СМФ, которая проявляется в значительном уменьшении способности мононуклеарных фагоцитов продуцировать в ответ на стимуляцию провоспалительные медиаторы и цитокины (ТНФ-, ИЛ-1, NO), в снижении зимозан-индуцированного гранулемообразования и миелопоэтического ответа в костном мозге. Эксперименты по экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов в культуре макрофагов подтверждают способность холестерина и оксистеролов снижать провоспалительный ответ мононуклеарных фагоцитов.

8. А) Стимуляция поствоспалительного фиброгенеза и продукции ТФР-1 в Мф связана с даун-регуляцией активности/дефицитом промежуточных продуктов мевалонатного пути, что проявляется в профиброзном действии ингибиторов ГМГР (ХС, аторвастатин. кальцитриол) и отмене этого действия мевалоновой кислотой в моделях гепатита, нефросклероза, а также в межлинейных различиях гепатосиликоза у инбредных мышей с оппозитным типом реагирования ГМГР (C57Bl/6 и Balb/c). Аналогично, в экспериментах in vitro в культуре макрофагов мевалонат отменяет холестерин-индуцированное усиление продукции ТФР-1.

Б) Агонисты ядерных гормональных рецепторов LXR (25-OH-ХС), FXR (фарнезол) и RXR (9-цис-ретиноевая кислота), в противоположность холестерину, даун-регулируют продукцию ТФР-1 в воспалительно стимулированных макрофагов, что также свидетельствует о реализации фиброгенного эффекта холестерина не через LXR и другие ядерные рецепторы, а, главным образом, через мевалонатный путь. Эффекты мевалоната на продукцию ТФР-1 в значительной мере опосредованы нестерольными изопреноидами, в том числе фарнезолом.

9. Снижение реактивности мононуклеарных фагоцитов при воспалении, хронической эндотоксинемии и формировании эндотоксиновой толерантности в значительной мере обусловлено ингибированием мевалонатного пути, а также активацией LXR и других ядерных рецепторов, вызванных индукцией гиперхолестеринемии и накоплением в макрофагах холестерина и его окисленных производных. Зависимость формирования гипореактивности мононуклеарных фагоцитов от активности/дефицита промежуточных продуктов мевалонатного пути проявляется в снижении экспрессии и продукции в макрофагах ТНФ-, ИЛ-1 и NO под действием ингибиторов ГМГР (холестерин, оксистеролы, аторвастатин) и в стимуляции продукции этих медиаторов и цитокинов мевалонатом в культуре макрофагов и у экспериментальных животных в моделях эндотоксиновой толерантности и рабдомиолиз-индуцированного нефросклероза. Об этом же свидетельствует холестерин-индуцированная даун-регуляция миелопоэтического и гранулемогенного ответа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих отечественных рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных перечнем ВАК для публикации результатов докторских диссертационных работ

1. Шваpц Я.Ш. Новые подходы к диагностике и пpогнозу оpганосклеpозов // Бюлл. СО РАМН. N 4. 1992. C. 100-103.
2. Душкин М.И., Шваpц Я.Ш., Вольский Н.Н., Мусатов М., Веpещагин Е.И., Рагино Ю.И., Пеpминова О.М., Козлов В.А. Иммунодепpессивная активность оксистеpолов // Иммунология. 1998. N 1. С. 21-24.
3. Душкин М.И., Веpещагин Е.И., Гребенщиков А.Ю., Сафина А.Ф., Шваpц Я.Ш. Влияние оксистеролов на экспрессию генов воспалительных цитокинов и их содержание в макрофагах, толерантных к эндотоксину // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 1999. т. 127, N1. С. 71-74.
4. Шварц Я.Ш., Зубахин А.А., Устинов А.С., Душкин М.И., Рагино Ю.И. Формирование SiO2-индуцированных гранулем у инбредных мышей разных линий // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2000. т.129, №1. С. 20-24.
5. Шварц Я.Ш., Зубахин А.А., Душкин М.И. Депрессия кроветворения при CCl4- индуцированном гепатофиброзе: роль системной эндотоксинемии // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2000. т.130, №8. С. 172-175.
6. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Эндотоксинемия и атеросклероз // Российский кардиологический журнал. 2001. №4(30). С. 83-92.
7. Кузнецов П.О., Сафина А.Ф., Шварц Я.Ш., Цыpендоpжиев Д.Д., Зубахин А.А., Душкин М.И. Влияние стимуляции и ингибирования функции макрофагов на развитие гиперхолестеринемии у крыс // Вопросы мед. химии. 2002. т. 48, вып. 2. С. 180-188.
8. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Формирование эндотоксин-липопротеиновых комплексов как фактор атерогенеза: ассоциация с гиперлипидемиями и с активностью лецитин-холестерин-ацилтрансферазы // Биохимия. 2002. т. 67, №7. 901-908.
9. Душкин М.И., Перминова О.М., Сафина А.Ф., Вольский Н.Н., Шварц Я.Ш., Козлов В.А. Влияние активации клеток иммунной системы на параметры липидного обмена в макрофагах // Журн. Микробиол. 2004. № 6. С. 52-56.
10. Душкин М.И., Хощенко О.М., Шварц Я.Ш., Кудинова Е.Н. Влияние оксистеролов и аторвастатина на липополисахарид-индуцированную секрецию фактора некроза опухоли и интерлейкина-10 макрофагами мыши // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2006. 141, №2. С. 194-197.
11. Кудинова Е.Н., Салахутдинов Н.Ф., Фоменко В.В., Вольский Н.Н., Перминова О.М., Хощенко О.Н., Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Влияние синтетического производного резорцина кариофиллена на биосинтез холестерина и на функциональную активность клеток иммунной системы // Химико-фармацевтический журнал. 2006. т.40, № 10. С. 20-23.
12. Душкин М.И., Кудинова Е.Н., Шварц Я.Ш. Интеграция сигнальных путей регуляции липидного обмена и воспалительного ответа // Цитокины и воспаление. 2007. № 2. С. 18-25.
13. Душкин М.И., Хощенко О.М, Посохова Е.Н., Шварц Я.Ш. Агонисты PPAR-a, PPAR-g и RXR ингибируют образование пенистых клеток из макрофагов при воспалении у мышей // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2007. 144, №11. С. 556-559.
14. Шварц Я.Ш., Поляков Л.М., Душкин М.И., Пивоварова Е.Н. Модификация и клиренс липопротеинов низкой плотности при формировании эндотоксин-липопротеиновых комплексов // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2008. 145, №4. С. 408-410.
15. Шварц Я.Ш., Душкин М.И., Комарова Н.И., Воронцова Е.В., Кузнецова И.С. Холестерин-индуцированная стимуляция поствоспалительного гепатофиброза // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2008. 145, №6. С. 638-641.
16. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Аккумуляция комплексов эндотоксин-липопротеины низкой плотности макрофагами и артериальной стенкой в моделях in vitro // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2009. 147, №2. С. 148-151.
17. Шварц Я.Ш., Хощенко О.М., Душкин М.И., Феофанова Н.А. Действие холестерина и агонистов гормональных ядерных рецепторов на продукцию трансформирующего фактора роста- в макрофагах // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2009. 148, №9. С.294-297.
18. Шварц Я.Ш., Белогородцев С.Н., Филимонов П.Н., Селедцова Г.В. Действие модуляторов активности мевалонатного биохимического пути на реактивность макрофагов при экспериментальном нефросклерозе // Мед. иммунология. 2009. 11, №6. С. 499-508.

Статьи в зарубежных рецензируемых научных журналах и изданиях, включенных в системы цитирования, рекомендованные перечнем ВАК для публикации результатов докторских диссертационных работ

19. Mayanski D.N., Kutina S.N., Schwartz Y.Sh.,Tsyrendorjiev D.D. Kupffer cell responsiveness during CCl4-induced fibrosis in rat liver // Cells of Hepatic Sinusoid. v.2. /Eds. Wisse E., Knook D.L., Decker K. Kupffer Cell Foundation. Rijswijk, Netherlands. 1989. P. 88-90.
20. Mayanski D.N., Schwartz Y.Sh., Kutina S.N., Zubakhin A.A., Mayanskaya N.N., Tsyrendorjiev D.D. Mononuclear phagocyte system responsiveness in CCl4-induced liver cirrhosis // Int. J. Exp. Path. 1993. v. 74 P. 229-236.
21. Dushkin M.I., Schwartz Y.Sh. Effect of verapamil and nifedipine on cholesteryl ester metabolism and low density lipoprotein oxidation in macrophages // Biochem. Pharmacol. 1995. v.49, N3. P. 389-397.
22. Dushkin M.I., Safina A.F., Vereschagin E.I., Schwartz Y.Sh. Carboxymethylated beta 1,3-glucan inhibits the binding and degradation of acetylated low density lipopriteins in macrophages in vitro and modulates their plasma clearance in vivo // Cell biochem. and function. 1996. v.14. P. 209-217.
23. Vereschagin E.I., Schwartz Y.Sh., Tsyrendorjiev D.D., Korolenko T.A., Sandula J. Carboxymetyl-beta-1,3-D-glycan has potent protective effect against acute massive hemorrhage // In: MOF, MODS and SIRS - Concepts, Clinical Correlates and Therapy. v.2. /Ed. Prof. E.Faist. Pabst Science Publishers. 1996. P. 1033-1037.
24. Dushkin M.I., Schwartz Y.Sh., Volsky N.N., Musatov M., Vereschagin E.I., Ragino J.I., Perminova O.M., Kozlov V.A. Effects of oxysterols upon macrophage and lymphocyte functions in vitro // Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 1998. v.55, N 4. P. 219-236.
25. Vereschagin E.I., van Lambalgen A.A., Dushkin M.I., Schwartz Y.Sh., Poljakov L.M., Heemskerk A., Huisman E., Thijs L.G., van den Bos G.C. Soluble glucan protects against endotoxin shock in the rat: the role of the scavenger receptor // Shock. 1998. v.9, N 3. P. 193-198.

Материалы конференций и тезисы докладов

1. Schwartz Y.Sh., Kutina S.N., Tsyrendorjiev D.D., Zubakhin A.A. Chronic inflammation: the role of macrophage reactivity// Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states/ Ed. Kozlov V.A. Novosibirsk. 1990. p. 128-130.
2. Mayanski D.N., Kutina S.N., Zubakhin A.A., Schwartz Y.Sh. Kupffer cell-dependent hepatocytes damage resistance // 5th Int. Symp. on Cells of Hepatic Sinusoid. Abstracts. Tucson, USA. 1990. p.87.
3. Шваpц Я.Ш., Маянский Д.Н. Пеpспективы исследования поствоспалительных фибpозов //Межд. конфеp. Патогенез хpонического воспаления. Тезисы докл. Новосибиpск. 1991. С. 124-128.
4. Шваpц Я.Ш., Цыpендоpжиев Д.Д. О взаимоотношениях печеночного и легочного отдела системы мононуклеаpных фагоцитов пpи фибpозе печени // Там же. С. 128-131.
5. Kutina S.N., Schwartz Y.Sh. Macrophages in postinflammatory fibrosis pathogenesis // Constituent Congr. Int. Soc. for Pathophysiology. Abstacts. Moscow. 1991. P.284.
6. Шваpц Я.Ш. Гепатопpотективный эффект стимулятоpов СМФ зависит от их pаствоpимости //Механизмы патологических pеакций. Матеpиалы Объединенного пленума Сибиpского общества патофизиологов СО АМН СССР. Иpкутск. 1991. С.75-76.
7. Schwartz Y.Sh., Vereschagin E.I., Zubakhin A.A., Mayanski D.N. Protective effect of polyglucans with different solubility // Symp. of the Int. Association of Biological Standartization. 1991. Annecy, France.
8. Шваpц Я.Ш., Пивоваpова Е.Н. О макpофаг-зависимом гипеpсклеpотическом статусе как ваpианте иммунного ответа // Междунаpодный симпозиум по аллеpгологии и клинической иммунологии. Тез. докл. 2-й pаздел (Клин. иммунол.). Алма-Ата. 1992. С.338.
9. Шварц Я.Ш., Пивоварова Е.Н. О макрофаг-зависимой готовности к склеpотическому пpоцессу // 1-й Съезд иммунологов России. Тез. докладов. Новосибирск, 1992. С. 551-552.
10. Mayanski D.N., Tsyrendorjiev D.D., Schwartz Y.Sh., Zubakhin A.A., Plustch I. On the role of Kupffer cell conditioning in birth and growth of granulemes // 6th Int. Symp. on Cells of Hepatic Sinusoid. Antwerp, Belgium. 1992. P.117.
11. Schwartz Y.Sh., Zubakhin A.A. Bone marrow hemopoiesis insufficiency in mice with liver fibrosis is caused by concurrent endotoxinemia // J. Endotoxin Research. 1994. v.1. Suppl.1. P.41.
12. Dushkin M.I., Schwartz Y.Sh., Grebenschikov A.U. Oxysterols modulate lipid metabolism and inflammatory function in macrophages by their transformation into foam cells // Abstracts of 4th Annual Scandinavian Atheroslerosis Conference an International Meeting. Humlebak. Copenhagen. 1997. P.44.
13. Safina A.F., Dushkin M.I., Vereschagin E.I., Schwartz Y.Sh. Carboxymethylated beta-1,3-glucan (CMG) as a modulator of scavenger receptor function // Ibidem. P.60.
14. Dushkin M.I., Schwartz Y.Sh., Grebenschikov A.U. Role of oxysterols in transformation of macrophages into foam cells // Atherosclerosis. 1997. v. 134, N 1,2. P.230.
15. Schwartz Y.Sh., Dushkin M.I., Safina A.F. Cytokine-induced enchancement of lipid biosynthesis in macrophages // Ibidem. P.236.
16. Schwartz Y.Sh., Dushkin M.I., Safina A.F. Inflammatory cytokines are able to induce macrophage-derived foam cell formation via lipid biosinthesis enhancement // Abstracts of the 5th Annual Scandinavian Atheroslerosis Conference an International Meeting. Humlebak, Copenhagen. 1998. P. 65.
17. Dushkin M., Schwartz Ya., Safina A., Ragino Yu. Inflammatory cytokines stimulate cholesterol esterification in murine macrophages in vivo and in vitro // Abstracts of the 70th European Atherosclerosis Society. Geneva, Switzerland. 1998. P.31.
18. Safina A.F., Dushkin M.I., Vereschagin E.I., Schwartz Y.Sh. Protective effects and mechanism of action of chemically modified glucans during atherosclerosis // Pathophysiology. 1998. v. 5, Suppl. 1. (Abstracts of the 3rd Internatl. Congress of Pathophysiology. Lahti, Finland. 1998). P.49.
19. Душкин М.И., Шварц Я.Ш., Рагино Ю.И., Сафина А.Ф. Повышенный синтез липидов в воспалительных макрофагах: возможная роль цитокинов в образовании пенистых клеток // Материалы 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию А.Л.Мясникова. Москва. 1999. С. 54.
20. Шварц Я.Ш., Душкин М.И., Сухенко Т.Г., Верещагин Е.И., Комарова Н.И., Кузнецова И.С. Аутоокисленные оксистеролы как медиаторы воспаления при атерогенезе // Материалы 5-й отчетной сессии НИИКИ СО РАМН (под ред. чл.-корр. РАМН, проф. В.И.Коненкова). Новосибирск. 2000. С.154.
21. Душкин М.И., Шварц Я.Ш., Перминова О.М., Кузнецов П.О. Липопротеин-независимый путь трансформации макрофагов в пенистые клетки: возможная роль цитокинов // Там же. С. 29-30.
22. Шварц Я.Ш., Душкин М.И.. Атеросклероз как эндотоксин-зависимый процесс: новая концепция атерогенеза // Материалы Симп. Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза (Секция по Изучению Атеросклероза Ассоциации Кардиологов СНГ). Москва. 2000. С. 48-49.
23. Душкин М.И., Шварц Я.Ш., Кузнецова И.С., Комарова Н.И., Кузнецов П.О., Сафина А.Ф., Бахтина И.А., Антипьева Е.В. Содержание оксистеролов в атеросклеротических бляшках и их влияние на функции макрофагов // Там же. С. 13.
24. Schwartz Y.Sh., Dushkin M.I., Kuznetsova I.S. Chronic endotoxemia enhances atherogenesis // J. Endotoxin Research. 2000. v.6, № 2. P. 113-114.
25. Dushkin M.I., Vereschagin E.I., Schwartz Y.Sh, Safina A.F., Grebenschikov A.Yu., Kuznetsova I.S., Komarova N.I. Macrophage endotoxin tolerance is associated with intracellular accumulation of oxysterols // Proceedings of the 5th World Congress on Trauma, Shock, Inflammation and Sepsis: Pathophysiology, Immune Cosequences and Therapy. /Ed. prof.E.Faist. Monduzzi Editore. Italy-Medimond USA. 2000. P. 43-47.
26. Цырендоржиев Д.Д., Зубахин А.А., Щербаков В.И., Кутина С.Н., Макарова О.П., Шварц Я.Ш., Шварц Я.Ш., Шишкина Л.Н., Плющ И.В., Воронина Н.П. Жизнь и творчество профессора Д.Н.Маянского // Фундаментальные и клинические аспекты хронического воспаления. Тез. докладов 2-го Всероссийского симпозиума "Хроническое Воспаление". Новосибирск. 2000. С. 3-4.
27. Кузнецова И.С., Шварц Я.Ш., Душкин М.И., Пешков Е.М., Комарова Н.И., Бахтина И.А. Фиброгенное действие холестеринемии при гранулематозном воспалении // Там же. С.39.
28. Душкин М.И., Шварц Я.Ш., Кузнецова И.С., Комарова Н.И., Кузнецов П.О., Сафина А.Ф., Бахтина И.А., Антипьева Е.В. Накопление оксистеролов в тканях при различных вариантах хронического воспаления // Там же. С. 104.
29. Кузнецов П.О., Сафина А.Ф., Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Влияние стимуляторов системы мононуклеарных фагоцитов на холестериновый обмен в моделях развития гиперлипидемии и гиперхолестеринемии // Там же. С. 105.
30. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Липидный обмен и реактивность макрофагов: новая концепция для воспаления и поствоспалительного фиброза // Там же. С. 109-111.
31. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Атеросклероз как эндотоксин-зависимый неспецифический воспалительный ответ: новая концепция атерогенеза // Там же. С. 112-113.
32. Кузнецова И.С., Шварц Я.Ш., Комарова Н.И., Сафина А.Ф., Кузнецов П.О., Душкин М.И. Оксистеролы как маркеры развития атеросклеротической бляшки и образования макрофагальной пенистой клетки // Актуальные вопросы кардиологии. Тез. докладов юбилейцного симпозиума, посвященного 20-летию НИИ Кардиологии ТНЦ. Томск. 2000. С. 77.
33. Пешков Е.М., Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Влияние холестериновой диеты на развитие гепатофиброза при CCl4- и зимозан-индуцированном гепатите у мышей // Тез. докладов научной сессии, посвященной 65-летию Новосибирской государственной медицинской академии. Новосибирск. 2000. С. 197.
34. Шварц Я.Ш., Зубахин А.А., Душкин М.И. Влияние гиперхолестеролемии на гемопоэз в модели зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления // Актуальные проблемы заболеваний терапевтического профиля в Сибири. Труды юбилейной научной сессии НИИ Терапии СО РАМН. Новосибирск. 2001. С. 55-60.
35. Душкин М.И., Шварц Я.Ш., Сафина А.Ф. Атерогенные свойства оксистеролов // Там же. С. 50-55.
36. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Формирование ЛПС-Липопротеиновых комплексов при гиперлипидемиях и их влияние на активность ЛХАТ // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты. Материалы Всероссийской конференции. Новосибирск. 2002. С. 112-113.
37. Шварц Я.Ш., Душкин М.И., Сафина А.Ф. Клиренс комплексов липопротеины низкой плотности-бактериальные липополисахариды и их включение в артериальную стенку // Там же. С. 113-114.
38. Шварц Я.Ш., Душкин М.И., Сафина А.Ф. Связывание и захват комплексов эндотоксин-липопротеины низкой плотности в культуре перитонеальных макрофагов // Там же. С. 114-115.
39. Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Роль эндотоксин-липопротеиновых комплексов в атерогенезе: некоторые экспериментальные доказательства // Иммунология, иммуногенетика, иммунопатология. Материалы 6-й отчетной сессии НИИКИ СО РАМН. Новосибирск. 2003. С. 238-241.
40. Schaar J.A., Muller J.E., Ambrose J., Badimon J.J., Boersma E., Botnar R., Casscells S.W., Colombo A., Daemen M., van Es G.-A., Falk E., Feinstein S.B., de Feyter P.J., Gijsen F., Giuffrida G., Gurfinkel E.P., Hamm C., Heistad D.D., Herrera V.L., Herrmann J., Hofman A., Kyung-Jang I., Kapadia S., Kipshidze N., de Kleijn D., Koenders M.J.,.Krams R, Lerman A., Lind L., Mallis E., Mastik F., Mizuno K., Morel M.-A., Moreno P.R., Newby A., Pasterkamp G., Regar E., Sangiorgi G., Schmermund A., Schoenhagen P., Schoelkens B.A., Schwartz Y., Serruys P.W., Stefanadis C.I., Stone G.W., Tamburino C., Tuin J., Vallabhajosula S., Verheye S., Vince G., Virmani R., Vranckx P., van der Wal A.C., Wald J.D., Wickline S., Wilensky R.L., Zalewski A., Zeiher A.M., van der Steen A.F. Consensus Statement of Second International Vulnerable Plaque Meeting. June 7-8, 2004. Taormina, Italy. URL: http://publishing.eur.nl/ir/repub/asset/6764/050610_Schaar.pdf
41. Khoshchenko O.M., Dushkin M.I., Schwartz Y.Sh., Effect of oxysterols and atorvastatin on TNF- and IL-10 production in murine peritoneal macrophages // Abstracts of 13th Annual Scandinavian Atheroslerosis Conference an International Meeting. Humlebak, Copenhagen. 2006. P.144.
42. Шварц Я.Ш., Хощенко О.М., Феофанова Н.А. Действие холестерина на ЛПС-индуцированную продукцию ТНФ- в культуре моноцитов-макрофагов // Материалы третьей Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных реакций». Симпозиум «Молекулярно-клеточные механизмы воспаления» посв. памяти проф. Д.Н.Маянского. Новосибирск. 2007. Сибирский Консилиум №7 (62). 2007. С. 87.
43. Шварц Я.Ш., Хощенко О.М., Феофанова Н.А., Душкин М.И. Действие холестерина и лигандов к гормональным ядерным рецепторам на продукцию ТФР-1 в культуре макрофагов // Там же. С. 87-88.
44. Шварц Я.Ш., Хощенко О.М. Холестериновая диета индуцирует продукцию ТФР-1 в макрофагах // Там же. С. 88.
45. Khoshchenko O.M., Dushkin M.I., Posokhova E.N., Schwartz Y.Sh. PPAR-&, and RXR agonists inhibit macrophage foam cell formation in inflammation in mice // In: Spetses Summer School on Nuclear Receptor Signalling: From Molecular Mechanisms to Integrative Physiology. Island of Spetses, Greece. August 26-31. 2007. P. 45.
46. Шварц Я.Ш., Хощенко О.М., Часовских М.И. Холестерин-индуцированный спаечный процесс в брюшной полости // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» /под ред. акад. РАМН, проф. В.А. Шкурупия. Новосибирск: НГУ. 2009. С. 291-292.
47. Хощенко О.М., Душкин М.И., Часовских М.И., Шварц Я.Ш. Интеграционные изменения содержания ядерных гормональных рецепторов PPAR, LXR, RXR и баланса про- и антивоспалительных цитокинов в макрофагах в динамике воспалительного процесса // Там же. С. 279-280.
48. Белогородцев С.Н., Шварц Я.Ш., Филимонов П.Н., Селедцова Г.В. Влияние активности мевалонатного пути на фенотип макрофагов и развитие нефросклероза // Вестник Уральской медицинской академической науки. №2/1 (24). 2009. С. 76-77.

Коллективные монографии

1. Шварц Я.Ш. Гипотеза о возможной роли эндотоксинемии в атерогенезе // В кн.: Вопросы атерогенеза (под ред. акад. РАМН Ю.П.Никитина). Новосибирск, 2005, 372 с.

Методические рекомендации

1. Маянский Д.Н., Шваpц Я.Ш., Кутина С.Н., Хаснулин В.И., Лебензон С.С., Гавpилова Н.И., Белов Г.Ф. Стимуляция системы мононуклеаpных фагоцитов в комплексном лечении затяжного виpусного гепатита // Методические pекомендации МЗ РСФСР. Новосибиpск. 1989. 16 С.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГ - вирусный гепатит с острым (ОВГ) и затяжным течением (ЗВГ)

ГМГР - 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А редуктаза

ГМ-КСФ - гранулоцит-макрофагальный колоние-стимулирующий фактор

КК - клетки Купфера

КУ - коллоидный уголь

ЛП - липопротеины низкой (ЛПНП) и высокой (ЛПВП) плотности

ЛПС - липополисахарид

ЛХАТ - лецитин-холестерин-ацилтрансфераза

Мн - моноцит

Мф - макрофаг

НСТ - нитросиний тетразолий

ПГ - простагландин

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

СТ - соединительная ткань

ТГ - триглицериды

ТФР- - трансформирующий фактор бета

ФНО- - фактор некроза опухоли альфа

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ХС - холестерин

25-ОН-ХС - 25-гидрокси-холестерин (27-ОН-ХС - 27-гидрокси-холестерин)

ScR - скавенджер-рецепторы

XR - ядерные X-рецепторы фарнезоидные (FXR), печеночные (LXR), ретиноидные (RXR)

Z - зимозан

Соискатель: Шварц Я.Ш.