Биологическая активность регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю

На правах рукописи

Доржаева Дыжитма Доржиевна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЛЕГКИХ И ПЛАЗМЫ КРОВИ ЖИВОТНЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ ОСТРУЮ КРОВОПОТЕРЮ

14.03.03. – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Чита - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Цыбиков Намжил Нанзатович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Степанов Александр Валентинович

кандидат медицинских наук Колесниченко Лариса Романовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Новосибирский государственный

медицинский университет Росздрава»

(г. Новосибирск)

Защита диссертации состоится «___» _______ 2010 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия Росздрава» (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия Росздрава» (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

Автореферат разослан «___» _______ 2010 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.118.01.

доктор медицинских наук, профессор И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Конец двадцатого и начало двадцать первого столетия ознаменовались многочисленными техногенными катастрофами и локальными военными конфликтами. Острая массивная кровопотеря стала одной из актуальных проблем современной медицины (Клигуненко Е.Н., Краковец О.В., 2005). Значение крово-плазмопотери при ранениях и травмах чрезвычайно велико, успешная борьба с ней во многих случаях определяет исход лечебных мероприятий. Поэтому основное внимание исследователей традиционно сконцентрировано на двух патогенетических механизмах – снижении объема циркулирующего кислородоносителя и уменьшении объема крови. Именно на этих двух положениях и строится вся тактика терапии острой массивной кровопотери. Активацию свертывающей системы крови и процесса тромбообразования, реакции сердечно-сосудистой системы, восстановление белкового состава крови, устранение дефицита форменных элементов относят к адаптивным механизмам компенсации кровопотери. При подобном подходе изучение данных разделов патогенеза острой кровопотери отодвигается на второй план, а механизмы коррекции остаются малоизученными (Воробьев А.И., Городецкий В.М., Васильев С.А., 2001; Валетова В.В. 2008).

В последние годы появилось немало сообщений, свидетельствующих о том, что при гнойной хирургической инфекции, а также при термической и механической травме возникают выраженные сдвиги в состоянии основных защитных систем организма - врожденного и адаптивного иммунитета (Цыбиков Н.Н. и др., 1991; Кузник Б.И. и др., 1999, 2002, 2004, 2008; Fedi S., 1999; Витковский Ю.А. и др., 2000; Хавинсон В.Х. и др., 2001; Гаин Ю.М., 2001; Булава Г.В. и др., 2002; Козлов В.К., 2002; Лиханов И.Д., 2002; Степанов А.В. и др., 2002; Завада Н.В. и др., 2003; Цепелев В.Л. и др., 2003; Абакумов М. М. и др., 2007; Гординская Н.А., 2007; Марченко В.И. и др., 2007). Изучение изменений иммунной системы при острой кровопотере остается темой менее исследованной.

Одним из перспективных направлений исследования адаптационных реакций организма в ответ на острую кровопотерю является изучение свойств эндогенных регуляторных пептидов (цитомединов). Эти соединения способны переносить от клетки к клетке специфическую информацию, закодированную в последовательном расположении аминокислот. Цитомедины влияют на течение репаративных процессов, являются модуляторами клеточного и гуморального иммунитета, обладают антиоксидантным действием и нормализуют свертываемость крови и фибринолиз (Ашмарин И.П., 1984; Кузник Б.И. и др., 1981, 1998, 2001; Цыбиков Н.Н. и др., 1991; Морозов В.Г. и др., 1996, 2000; Степанов А.В. и др., 2002; Патеюк А.В. и др., 2003; Цепелев В.Л. и др., 2003).

В связи с вышесказанным представляется интересным изучить биологические эффекты пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, оценить меру их влияния на основные защитные системы организма: иммунитет и гемостаз.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение биологических свойств цитомединов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. В связи с этим решались следующие задачи:

1. Изучить влияние цитомединов на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей и больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.
2. Исследовать коагулирующие, фибринолитические свойства регуляторных пептидов.
3. Оценить действие цитомединов на агрегацию тромбоцитов.
4. Определить влияние цитомединов на лимфоцитарно-тромбоцитарную, эритроцитарно-тромбоцитарную и лейкоцитарно-эритроцитарную адгезию.

Научная новизна. Показано, что биологическая активность цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, отлична от свойств регуляторных пептидов, полученных от интактных животных.

Показано, что пептиды, полученные из легких животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию CD8+, CD16+-маркеров лимфоцитов, взятых от больных с вторичными иммунодефицитными состояниями, а пептиды из плазмы крови – CD4+. Пептиды из легких и плазмы крови интактных животных в аналогичных опытах увеличивают экспрессию CD4+, CD8+, CD16+, а также CD3+-маркеров лимфоцитов. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, не влияют на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови доноров.

Установлено, что цитомедины, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, проявляют антикоагулянтный эффект. Этим свойством в большей степени обладают пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю. Цитомедины плазмы крови активируют эуглобулиновый и ингибируют каолиновый фибринолиз, что в большей степени характерно для пептидов интактных животных. Цитомедины, выделенные из легких интактных и перенесших кровопотерю животных, не меняют эуглобулиновый и каолиновый фибринолиз.

Доказано, что «постгеморрагические» пептиды увеличивают скорость и степень агрегации кровяных пластинок, а также лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию в большей степени по сравнению с «интактными». Пептиды из легких животных, подвергшихся кровоизвлечению, увеличивают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.

Теоретическая и практическая значимость. В работе получены новые сведения о биологических свойствах цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. Показано, что опытные пептиды изменяют экспрессию CD-маркеров лимфоцитов, обладают антикоагулянтным и фибринолитическим потенциалом, способны увеличивать скорость и степень агрегации тромбоцитов, а также усиливать адгезивные свойства форменных элементов. Результаты проведенного исследования показывают, что больные, перенесшие острую кровопотерю, вне зависимости от причины, могут нуждаться в реабилитационных мероприятиях, заключающихся в назначении препаратов обладающих иммуномодулирующим и антиагрегантным действием.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитомедины, выделенные из легких и плазмы крови интактных животных, обладают свойством стимулировать экспрессию CD-маркеров на лимфоцитах крови больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, в значительной степени теряют эту способность. Все исследуемые пептиды не влияют на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови доноров.

2. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, изменяют фибринолитический потенциал крови, проявляют антикоагулянтный эффект, который в большей степени выражен у «постгеморрагических» пептидов.

3. Под действием «интактных» и, в большей степени, пептидов, выделенных из животных перенесших острую кровопотерю, усиливаются адгезивные свойства клеток крови, увеличивается агрегабельность тромбоцитов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 1 в ведущем рецензируемом журнале, определенном ВАК Министерства образования и науки РФ, методическая рекомендация, монография.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 80-летию Г.Е. Мункоевой (г. Улан-Удэ, 2007г.); на Всероссийской конференции, посвященной 30-летию МУЗ «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи им. В.В. Ангапова» (г. Улан-Удэ, 2008г.); на III Международной конференции «Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития» (г. Улан-Удэ, 2008г.); на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 15-летию кафедры терапии №2 ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей» (г. Иркутск, 2008г.); на конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика К.Р. Седова (г. Иркутск, 2008г.); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» (г. Чита, 2008г.).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 101 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 171 источник, из которых 23 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 12 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение регуляторных пептидов. Для получения регуляторных пептидов были взяты ткань легкого и плазма крови баран. Животные были разделены на две группы: опытные, которым за пять дней до забоя выводилась кровь путем пункции яремной вены в объеме 20% ОЦК и контрольные - без предварительного кровопускания. Животные содержались в стандартных условиях вивария ГОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия» на обычном рационе, при температуре (+) 21 – 22°С и естественном световом дне. Умерщвление проводилось в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение 4 к Приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77.). Выделение регуляторных пептидов проводилось методом уксуснокислой экстракции с последующим осаждением комплекса пептидов ацетоном.

Методы изучения иммунного статуса. Иммуноактивные свойства цитомединов исследовали на 24 образцах крови доноров, а также 30 образцах крови больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Обе группы были сопоставимы по возрасту и полу. Группа больных представлена пациентами Республиканского клинического госпиталя для ветеранов войн, Республиканской клинической больницы г. Улан-Удэ. У всех больных диагностирована хроническая обструктивная болезнь легких, эмфизематозный или бронхитический тип, среднетяжелое течение, стадия обострения. ДН II-III степени. Диагноз выставлен на основании жалоб, данных анамнеза, объективного осмотра, а также лабораторных и инструментальных методов исследования согласно современным стандартам обследования. Наличие вторичного иммунодефицитного состояния выявлялось по результатам иммунологического исследования.

Перед проведением исследования цитомедины растворяли в соотношении 100,0 мкг в 1,0 мл физиологического раствора. Для инкубации с лимфоцитами бралось 0,1 мл раствора. Длительность инкубации 60 минут. Подсчет общего числа лейкоцитов крови, лейкоцитарной формулы проводили стандартным методом в камере Горяева (Frimel X., 1979; Меньшиков В.В., 1987). Выявление поверхностных маркеров лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ и CD16+) проводили c помощью моноклональных антител реакцией иммунофлюоресценции (РИФ). Использовались моноклоны производства «МедБиоспектр» (г. Москва). В качестве контроля проводили аналогичные опыты с введением физиологического раствора.

Методы исследования системы гемостаза. Для изучения коагуляционной активности цитомединов, последние, в конечной концентрации 10,0 мкг/мл, инкубировали с кровью доноров при температуре 37°С в течение 60 минут. Коагуляционный гемостаз оценивали по следующим тестам: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время, тромбиновое время, каолиновое время (Баркаган З.С., 1985); эуглобулиновый и хагеманзависимый фибринолиз (Kowarzyk H., Buluk K., 1954; Веремеенко К.Н., 1978). В качестве контроля проводили аналогичные тесты с введением физиологического раствора.

Изучение агрегационной активности тромбоцитов. Для изучения влияния цитомединов на агрегационную активность тромбоцитов, пептиды, в конечной концентрации 10,0 мкг/мл, инкубировали с кровью доноров при температуре 37°С в течение 60 минут. Исследование агрегации тромбоцитов крови доноров производили на модели отечественного агрегометра марки «Биола». Использовалась методика предложенная G. Born (1962). В качестве контроля проводили аналогичные тесты с введением физиологического раствора.

Оценка лимфоцитарно-тромбоцитарной, эритроцитарно-тромбоцитарной и лейкоцитарно-эритроцитарной адгезии. Исследуемые пептиды, в конечной концентрации 10,0 мкг/мл, инкубировали с цитратной кровью доноров 60 минут, затем центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут. Использовалась методика предложенная Д.И. Бельченко (1993). Осадок ресуспензировали, наносили на предметное стекло и окрашивали по Романовскому-Гимза. Подсчитывали число коагрегатов на 100 клеток. В качестве контроля проводили аналогичные тесты, используя кровь доноров, инкубируемую с физиологическим раствором.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в исследовании структуры пептидов. ВЭЖХ пептидов, полученных из легких и плазмы животных, проводили по методу А. Хеншена (1988).

Статистическая обработка материала. Значения полученных данных были обработаны статистически общепринятыми методами с применением пакета прикладной программы «BIOSTAT» и программы статистического анализа Microsoft Excel, версия XP. Исследуемые параметры приведены в виде средних величин со стандартным отклонением (М ± SD). Достоверность различий параметров оценивались по парному критерию Стьюдента для нормально распределенных переменных.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови

Известно, что введение регуляторных пептидов в организм способно существенным образом менять иммунологический потенциал. Это связано с тем, что цитомедины влияют на течение реакций как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Мы решили оценить способность регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови как интактных, так и перенесших кровопотерю животных, влиять на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов. Причем, лимфоциты-индикаторы выделяли из крови, как доноров, так и пациентов с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Таблица 1

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови доноров (M±SD)

Изучаемый показатель (103 кл/мкл)	Лимфоциты доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=24	Пептиды интактных животных (опыт I) n=24	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=24
Т лимфоциты СD3+	0,57±0,09	0,53±0,09 р1> 0,05	0,48±0,09 р1> 0,05 р2> 0,05
Т хелперы СD4+	0,45±0,02	0,55±0,04 р1< 0,05 *	0,44±0,09 р1> 0,05 р2> 0,05
Цитотоксические Т-лимфоциты СD8+	0,32±0,07	0,35±0,04 р1> 0,05	0,33±0,07 р1> 0,05 р2> 0,05
В лимфоциты СD22+	0,30±0,09	0,30±0,04 р1> 0,05	0,27±0,07 р1> 0,05 р2> 0,05
NK CD16+	0,36±0,12	0,35±0,04 р1> 0,05	0,31±0,12 р1> 0,05 р2> 0,05

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II.

* - значимые отличия.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, пептиды, выделенные из легких, практически не оказывают эффекта на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей. Следует лишь указать, что цитомедины из легких интактных животных усиливают экспрессию CD4+ (р<0,05). Несколько иная картина обнаруживается при анализе результатов исследований, представленных в таблице 2. Оказалось, что пептиды, выделенные из легких животных, перенесших острую кровопотерю, усиливают экспрессию маркеров CD8+ (р<0,02) и CD16+ (р<0,002). Вместе с тем, цитомедины, выделенные из легких животных без предварительного кровопускания, усиливают экспрессию CD3+ (р<0,05), CD4+ (р<0,02), CD8+ (р<0,02), а также CD16+ (р<0,05).

Таблица 2

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких, на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови больных (M±SD)

Изучаемый показатель (103 кл/мкл)	Лимфоциты больных
	Физиологический раствор (контроль) n=30	Пептиды интактных животных (опыт I) n=30	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=30
Т лимфоциты СD3+	0,63±0,09	1,02±0,17 р1<0,05 *	0,86±0,14 р1> 0,05 р2> 0,05
Т хелперы СD4+	0,40±0,05	0,79±0,15 р1<0,02 *	0,57±0,07 р1> 0,05 р2> 0,05
Цитотоксические Т-лимфоциты СD8+	0,24±0,02	0,45±0,08 р1<0,02 *	0,4±0,06 р1<0,02 * р2> 0,05
В лимфоциты СD22+	0,26±0,05	0,42±0,18 р1> 0,05	0,25±0,09 р1> 0,05 р2> 0,05
NK CD16+	0,23±0,02	0,47±0,10 р1<0,05 *	0,45±0,06 р1<0,002 * р2> 0,05

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II.

* - значимые отличия.

Цитомедины, полученные из плазмы крови животных, не изменяют экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей. Вместе с тем, если лимфоциты выделялись из крови больных с вторичными иммунодефицитными состояниями, а затем инкубировались с цитомединами из плазмы крови, то мы регистрировали резкие изменения в экспрессии CD-маркеров лимфоцитов. Это в полной мере относится к цитомединам, полученным из плазмы крови интактных животных, где отмечена динамика показателей CD3+ (р<0,05), CD4+ (р<0,002), CD8+ (р<0,001), CD16+ (р<0,01). Цитомедины, полученные из плазмы крови животных, перенесших кровопотерю, достоверно изменяли показатели CD4+ относительно контрольных данных (р<0,05) и результатов опыта I (р<0,05), а также CD8+ - относительно результатов опыта I (р<0,001).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляторные пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, способны менять экспрессию CD-маркеров в большей степени на лимфоцитах, выделенных из крови людей с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, в значительной степени теряют эту способность.

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких и плазмы крови, на коагуляционный гемостаз, фибринолиз

Известно, что цитомедины способны менять течение ферментативных реакций в организме, в том числе протеазных систем, активирующихся по типу «каскада». Это в полной мере относится к системе свертывания крови.

Цитомедины, полученные из легких интактных животных (табл. 3), удлиняют АЧТВ (р<0,001) и каолиновое время (р<0,002) относительно контрольных данных. Вместе с тем пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю, еще в большей степени удлиняют АЧТВ (р<0,001), каолиновое (р<0,001), а также тромбиновое время (р<0,05). Отмечено достоверное отличие между результатами опыта I и опыта II. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что цитомедины, полученные из легких животных, перенесших острую кровопотерю, определенным образом модифицируются, что усиливает их антипротеазный потенциал, а, следовательно, и антикоагулянтные свойства.

Таблица 3

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких, на коагуляционный гемостаз доноров (M±SD)

Изучаемый показатель (сек.)	Плазма доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=7	Пептиды интактных животных (опыт I) n=7	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=7
АЧТВ	40,71±1,13	72,06±2,34 р1<0,001 *	81,14±2,04 р1<0,001 * р2<0,05 *
Каолиновое время	53,57±2,07	66,43±1,71 р1<0,002 *	72,06±2,08 р1<0,001 * р2<0,05 *
Тромбиновое время	15,43±0,97	16,86±1,34 р1> 0,05	21,42±2,10 р1<0,05 * р2> 0,05
Протромбиновое время	12,00±1,20	12,10±1,44 р1> 0,05	14,20±1,20 р1> 0,05 р2> 0,05

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;

* - значимые отличия.

Таблица 4

Влияние регуляторных пептидов, полученных из плазмы крови, на коагуляционный гемостаз доноров (M±SD)

Изучаемый показатель (сек.)	Плазма доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=7	Пептиды интактных животных (опыт I) n=7	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=7
АЧТВ	40,71±1,13	53,43±2,20 р1<0,01 *	55,00±2,16 р1<0,002 * р2> 0,05
Каолиновое время	53,57±2,07	62,06±1,57 р1<0,02 *	64,06±2,90 р1<0,05 * р2> 0,05
Тромбиновое время	15,43±0,97	16,00±2,44 р1> 0,05	16,71±3,57 р1> 0,05 р2> 0,05
Протромбиновое время	12,00±1,20	12,00±1,68 р1> 0,05	12,30±0,96 р1> 0,05 р2> 0,05

Условные обозначения: как к табл. 3.

Несколько иные результаты были получены при исследовании пептидов, полученных из плазмы крови животных (табл. 4). Оказалось, что «интактные» цитомедины удлиняют АЧТВ (р<0,01) и каолиновое время (р<0,02), а «постгеморрагические» пептиды оказывают аналогичный эффект только по отношению к контрольным данным.

Таблица 5

Влияние регуляторных пептидов, полученных из плазмы крови, на фибринолиз доноров (M±SD)

Изучаемый показатель (мин.)	Плазма доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=7	Пептиды интактных животных (опыт I) n=7	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=7
Фибринолиз эуглобулиновый	190,0±14,13	91,0±11,92 р1<0,001 *	106,4±12,15 р1<0,01 * р2> 0,05
Фибринолиз каолиновый	8,0±1,41	22,43±3,51 р1<0,01 *	14,57±1,71 р1<0,05 * р2<0,05 *

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;

* - значимые отличия.

Цитомедины, выделенные из легких не меняют время эуглобулинового и каолинового фибринолиза. Вместе с тем, цитомедины, выделенные из плазмы крови (табл. 5), в значительной степени активируют эуглобулиновый фибринолиз и тормозят каолиновый. Последнее, вероятно, объясняется тем, что пептиды, обладая антипротеазным эффектом, интенсивно ингибируют активный фактор Хагемана, другая часть проявляет эффект активаторов плазминогена.

Влияние регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови, на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

Одним из параметров характеризующих гомеостаз и резистентность организма является нормальное функционирование тромбоцитов и состояние микрососудов. Этим и определяется наше желание оценить влияние регуляторных пептидов, полученных из легких и плазмы крови, на агрегацию тромбоцитов.

При проведении опытов с пептидами из легких максимальные значения СРА остались практически одинаковыми, правда, при явном увеличении скорости агрегации СРА относительно контрольных данных (0,42±0,01 ед/мин) более чем в 2 раза: 1,07±0,14 ед/мин. в опыте I и 1,0±0,16 ед/мин. в опыте II. Оказалось, что «интактные» пептиды увеличивают степень приращения СП по сравнению с контрольными данными (1,19±0,08%) в 2 раза (2,41±0,39%), а пептиды, полученные из легких животных перенесших кровопотерю, более чем в 13 раз (15,99±0,20%), при возрастании скорости СП в 5 раз (в опыте I) и в 2 раза (в опыте II).

Введение регуляторных пептидов из плазмы крови (табл. 6) увеличивало степень СРА и скорость их образования, а также приращение СП (степень и скорость) по сравнению с контрольными данными. Результаты данной серии опытов вновь свидетельствуют о влиянии регуляторных пептидов на агрегацию тромбоцитов, в данном случае с четкой закономерностью более выраженного эффекта у цитомединов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

Таблица 6

Влияние пептидов, выделенных из плазмы крови, на спонтанную агрегацию тромбоцитов доноров (M±SD)

Изучаемый показатель	Плазма доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=7	Пептиды интактных животных (опыт I) n=7	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=7
СРА. Степень агрегации (ед)	1,28±0,15	7,92±0,23 р1<0,001 *	2,52±0,37 р1<0,001 * р2<0,02 *
СРА. Скорость агрегации (ед/мин)	0,42±0,01	1,62±0,11 р1<0,001 *	1,98±0,42 р1<0,001 * р2> 0,05
СП. Степень агрегации (%)	1,19±0,08	4,2±0,22 р1<0,001 *	9,06±0,3 р1<0,001 * р2<0,001 *
СП. Скорость агрегации (%/мин)	2,59±0,30	10,05±0,37 р1<0,001 *	27,66±2,14 р1<0,001 * р2<0,001 *

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;

* - значимые отличия.

Таким образом, параметры агрегации по кривой СРА на введение пептидов реагируют противоречиво, но с явной тенденцией нарастания показателей по сравнению с контрольными данными. Приращение СП изменяется более закономерно: во всех опытах отмечается статистически достоверное изменение значений по сравнению с контрольными данными, между результатами опыта I и опыта II с явной тенденцией увеличения показателей в опытах с «постгеморрагическими» пептидами.

Влияние регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови, на лимфоцитарно-тромбоцитарную, эритроцитарно-тромбоцитарную и лейкоцитарно-эритроцитарную адгезию

В последние годы установлено, что в физиологических условиях в кровотоке происходит формирование разнообразных агрегатов клеток крови (ЛТА, ЭТА, ЛЭА). Поскольку предпочтительным местом образования этих агрегатов является венозное русло, то основным «органом-мишенью» являются легкие. Поэтому, понятен наш интерес к изучению влияния пептидов из легких, плазмы крови на формирование ЛТА, ЭТА и ЛЭА.

Таблица 7

Исследование активности пептидов, выделенных из легких, на ЛТА, ЭТА и ЛЭА (M±SD)

Изучаемый показатель (число агрегатов на 100 кл.)	Кровь доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=7	Пептиды интактных животных (опыт I) n=7	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=7
Лимфоцитарно-тромбоцитарные розетки	10,57±1,9	23,43±2,64 р1<0,01 *	26,43±2,07 р1<0,001 * р2>0,05
Эритроцитарно-тромбоцитарные розетки	2,71±0,76	2,29±0,49 р1>0,05	2,29±0,49 р1>0,05 р2>0,05
Лейкоцитарно-эритроцитарные розетки	3,57±0,53	5,57±0,97 р1>0,05	7,57±0,98 р1<0,01 * р2>0,05

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;

* - значимые отличия.

Таблица 8

Исследование активности пептидов, выделенных из плазмы крови, на ЛТА, ЭТА и ЛЭА (M±SD)

Изучаемый показатель (число агрегатов на 100 кл.)	Кровь доноров
	Физиологический раствор (контроль) n=7	Пептиды интактных животных (опыт I) n=7	Пептиды животных после кровопотери (опыт II) n=7
Лимфоцитарно-тромбоцитарные розетки	10,57±1,9	24,43±3,31 р1<0,01*	34,29±1,26 р1<0,01* р2>0,05
Эритроцитарно-тромбоцитарные розетки	2,71±0,76	2,57±0,79 р1>0,05	2,86±0,9 р1>0,05 р2>0,05
Лейкоцитарно-эритроцитарные розетки	3,57±0,53	5,29±1,11 р1>0,05	4,43±1,27 р1>0,05 р2>0,05

Условные обозначения: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;

* - значимые отличия

Нами установлено (табл. 7), что пептиды, выделенные из легких интактных животных, увеличивают ЛТА (р<0,01). Вместе с тем цитомедины, выделенные из животных перенесших кровопотерю, имеют тенденцию к еще более выраженной стимуляции ЛТА (р<0,001), а также влияют на ЛЭА (р<0,01). Пептиды, выделенные из плазмы крови интактных животных (табл. 8), увеличивают ЛТА в крови доноров (р<0,01) и этот эффект имеет тенденцию к нарастанию при добавлении пептидов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

Полученные результаты не должны вызывать удивление. Увеличение в проводимых опытах ЛТА, ЛЭА под влиянием регуляторных пептидов из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, отражает с одной стороны активацию системы гемостаза, а с другой – иммунитета.

Определение структуры пептидов методом ВЭЖХ

При анализе пептидограмм полученных методом ВЭЖХ установлено, что после острой кровопотери в пептидах, полученных их ткани легкого, отчетливо контурируется дополнительный пик, обозначенный на пептидограмме под номером три, а также исчезает пик номер восемь, визуализированный на контрольной пептидограмме.

Рис. 1. Пептидограмма цитомединов, выделенных из легких интактных животных.

Рис.2. Пептидограмма цитомединов, выделенных из легких животных, перенесших острую кровопотерю.

Таким образом, получены доказательства изменения не только функциональной активности опытных пептидов, но и обнаружены структурные отличия. Последнее может быть связано с изменением гомеостаза, интенсификации метаболизма, модификацией протеолитических реакций в клетках и, в частности, катепсиновой активности. Это находит отражение в изменении структуры пептидов и их биологической активности.

ВЫВОДЫ

1. Цитомедины, полученные из легких интактных животных, увеличивают экспрессию CD4+-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей и повышают экспрессию CD3+, CD4+, CD8+ и CD16+-маркеров лимфоцитов полученных от больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию CD8+ и CD16+-маркеров лимфоцитов крови больных.

2. Цитомедины из плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных не изменяют экспрессию CD-маркеров отдельных клонов лимфоцитов здоровых людей. «Интактные» регуляторные пептиды увеличивают экспрессию CD3+, CD4+, CD8+ и CD16+-маркеров лимфоцитов больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию CD4+-маркеров лимфоцитов больных.

3. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, проявляют антикоагулянтный эффект. Этим свойством в большей степени обладают пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю. Цитомедины, выделенные из легких интактных и перенесших кровопотерю животных, не меняют время эуглобулинового и каолинового фибринолиза. Цитомедины, выделенные из плазмы крови, активируют эуглобулиновый и ингибируют каолиновый фибринолиз, данные свойства проявлены меньше у пептидов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

4. Исследуемые пептиды увеличивают скорость и степень агрегации кровяных пластинок. Этот эффект в большей степени выражен у пептидов из плазмы крови животных, перенесших кровопотерю.

5. Цитомедины, полученные из легких и плазмы крови интактных и, в большей степени, перенесших кровопотерю животных, увеличивают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Пептиды из легких животных, подвергшихся кровоизвлечению, увеличивают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование влияния щелочных полипептидов, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопускание на динамику СД-рецепторов / В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, Д.Д. Доржаева, И.Н. Есаулова // Развитие специализированной терапевтической помощи населению Республики Бурятия: материалы науч.-практической конф., посвящ. 80-летию Г.Е. Мункоевой (г. Улан-Удэ, 20 декабря 2007 г.). - Улан-Удэ, 2007. - С. 233 - 236.
2. Динамика CD-рецепторов лимфоцитов под влиянием щелочных пептидов, полученных из внутренних органов кроликов, подвергшихся кровопусканию / Н.Н. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2007. - №5 (57). – С. 180 -181.
3. Влияние щелочных полипептидов (цитомединов), полученных из легких и плазмы животных, перенесших кровотечение, на динамику СД-рецепторов лимфоцитов / Н.Н. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Улан-Удэ, 2008. - №3 (61). - С. 186.
4. Влияние щелочных полипептидов (цитомединов), полученных из легких и плазмы животных перенесших кровопускание на динамику СД-рецепторов / Н.Н. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // III Международная конф. «Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития» (18-22 августа 2008 Россия, Улан-Удэ). - Улан-Удэ, 2008. - С. 82.
5. Биологическая активность веществ, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопускание на динамику лимфоцитов / Н.Н. Цыбиков, В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова, Д.Д. Доржаева // III Международная конф. «Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития» (18-22 августа 2008 Россия, Улан-Удэ). - Улан-Удэ, 2008. - С. 81 - 82.
6. Иммунологические аспекты формирования специфической резистентности организма при дробном кровопускании в условиях эксперимента / В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, Д.Д. Доржаева, И.Н. Есаулова // Актуальные вопр. терапии: материалы межрегиональной науч.-практической конф., посвящ. 15-летию кафедры терапии №2. 23 октября 2008 г. Улан-Удэ-Иркутск: Иркутский государственный институт усовершенствования врачей. – Улан-Удэ, 2008. - С. 130 - 132.
7. Анализ биологической активности цитомединов, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопускание / В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Традиции и современность: материалы конф., посвящ. 90-летию со дня рождения академика К.Р. Седова. - Иркутск, 2008. - С. 194 - 196.
8. Динамика СД-рецепторов лимфоцитов в ответ на влияние цитомединов из легких и плазмы животных перенесших кровопотерю / Н.Н. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной мед.: материалы всероссийской науч.-практической конф., посвящ. 55-летию Читинской государственной медицинской академии. Чита, 1-2 октября 2008 г. - Чита, 2008. - С. 226.
9. Влияние цитомединов из легких и плазмы животных, перенесших кровопотерю, на динамику CD-рецепторов лимфоцитов / Д.Д. Доржаева, Н.Н. Цыбиков, В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Сибирский мед. журн., - Иркутск, 2009. – Т.84, №1. - С.37 - 39.
10. Современное представление о кровопускании в традиционной медицине / В.А. Тарнуев, И.Н. Есаулова, Д.Д. Доржаева – Улан-Удэ: Республиканская типография, 2009. – 168 с.
11. Лечение кровопусканием: метод. рекомендации / И.Н. Есаулова [и др.]. - Иркутск: РИО ИГИУВа, 2009. – 19 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДН – дыхательная недостаточность

ЛТА – лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

ЛЭА – лейкоцитарно-эритроцитарная адгезия

ОЦК – объем циркулирующей крови

СРА – средний размер агрегатов тромбоцитов

СП – светопропускание

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

ЭТА – эритроцитарно-тромбоцитарная адгезия

CD – cell differentiation antigens или cluster definition – антигены кластеров дифференцировки клеток.

pH – potential hydrogeni – водородный показатель