Ферменты метаболизма эстрогенов и их рецепторы при раке молочной железы
На правах рукописи
ШАШОВА Елена Евгеньевна
ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА ЭСТРОГЕНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
14.00.14 – онкология
14.00.16 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
ТОМСК - 2007
Работа выполнена в ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН.
Научные руководители:
доктор медицинских наук Кондакова Ирина Викторовна
доктор медицинских наук, профессор Слонимская Елена Михайловна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор,
заслуженный деятель науки Удут Владимир Васильевич
доктор медицинских наук, профессор Степовая Елена Алексеевна
Ведущая организация: ФГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва.
Защита состоится «___» февраля 2007 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.032.01 при НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН (634009, Россия, г. Томск, пер. Кооперативный 5).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН.
Автореферат разослан ____ декабря 2006 г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Злокачественные новообразования молочных желез занимают лидирующее место в структуре онкологических заболеваний среди женского населения. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака молочной железы (РМЖ). В мире выявляют около 1 млн. новых случаев за год, к 2010г. прогнозируется рост числа заболевших до 1,45 млн [Давыдов М. И, Аксель Е. М., 2001]. Отмечается неуклонный рост численности больных, увеличение показателей смертности и возникновение злокачественных новообразований этой локализации в более раннем возрасте по сравнению с прошлыми десятилетиями [Писарева Л.Ф., 2002]. Развитие и биологические характеристики РМЖ во многом определяются метаболизмом эстрогенов [Берштейн Л.М., 2000]. Показан широкий спектр важных функций, которые регулируют эстрогены, связываясь с внутриклеточными рецепторами и активируя экспрессию различных генов [Suzuki T., et al. 2005]. К наиболее значимым проявлениям действия эстрогенов относят активацию пролиферации [Han H., et al., 2006], ингибирование процесса апоптоза, а так же стимуляцию выработки факторов роста (трансформирующий фактор роста, эпидермальный фактор роста) [Seeger H., 2006]. Вышеперечисленные эффекты могут обуславливать развитие пролиферативных гиперпластических процессов и рака в эстроген-звисимых тканях, в которых имеются рецепторы эстрогенов.
В молочной железе эстрогены могут образовываться в тканях или захватываться из циркулирующей крови. Внутриорганная выработка эстрогенов преимущественно осуществляется ароматазой, которая способствует конверсии андрогенов в эстрогены, а также стероидсульфатазой, преобразующей неактивный эстрон сульфат в эстрон [Nakata T., et al., 2003]. Влияние эстрогенов на клетки опосредовано их взаимодействием с рецепторами. Комплекс гормона с рецепторами транслоцируется в ядро, активирует соответствующие гены и стимулирует пролиферацию ткани молочной железы, а также ингибирует апоптоз. В процессе пролиферации увеличивается вероятность появления мутаций и ограничивается время, необходимое для репарации повреждений, что играет важную роль в развитии злокачественных опухолей. Не связавшиеся с рецепторами эстрогены и их метаболиты обладают генотоксическим эффектом [Seeger H., 2005; Zhao Z., 2006]. Инактивация эстрогенов включает их гидроксилирование 2,4- эстрогенгидроксилазами и коньюгирование в реакциях, катализируемых катехол-О-метилтрансферазой (КОМТ) и глютатион-S-трансферазой (ГSТ). Снижение активности ферментов метаболизма эстрогенов может приводить к накоплению высокоактивных промежуточных метаболитов и повреждению внутриклеточных структур, главным образом ДНК. Усиление процессов пролиферации и непосредственное генотоксическое действие эстрогенов является важным патогенетическим звеном в канцерогенезе, развитии первичной опухоли, дальнейшей опухолевой прогрессии РМЖ [Zhu B.T., Conney A.H., 1998].
В настоящее время при определении прогноза заболевания и выбора наиболее адекватной тактики лечения больных РМЖ основываются на ряде факторов, определяющих как особенности организма (возраст, состояние менструальной функции), так и биологические характеристики самой опухоли (размер опухоли, наличие метастазов в регионарные лимфоузлы, тип опухолевого роста, гистологическая принадлежность, степень злокачественности, инвазия кровеносных и лимфатических сосудов, уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона и др.). Однако результаты лечения далеко не всегда являются удовлетворительными, и в настоящее время ведется поиск новых, более информативных параметров, позволяющих адекватно учитывать молекулярные механизмы развития опухолевого процесса.
Все сказанное определяет актуальность исследования метаболизма и рецепции эстрогенов в тканях при раке молочной железы, а также их связи с основными клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом заболевания.
Цель и задачи исследования:
Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в неизмененной, опухолевой ткани, лимфогенных метастазах и оценить их прогностическую значимость.
- Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов (ароматазы, стероид сульфатазы, 2-/4-эстрогенгидроксилаз, катехол-О-метилтрансферазы и глутатион-S-трансферазы) у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой ткани и лимфогенных метастазах.
- Оценить содержание рецепторов эстрогенов и прогестерона у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой тканях, лимфогенных метастазах и сопоставить с активностью ферментов метаболизма эстрогенов.
- Исследовать взаимосвязь между активностью ферментов метаболизма эстрогенов в изучаемых тканях и основными клинико-морфологическими параметрами у больных РМЖ.
- Оценить прогностическую значимость активности ферментов метаболизма эстрогенов и содержания рецепторов стероидных гормонов в тканях при РМЖ.
Научная новизна:
Впервые в комплексе изучены метаболизм и рецепция эстрогенов в неизмененной, опухолевой ткани и лимфогенных метастазах у больных раком молочной железы. Показано, что синтез эстрогенов в опухоли обеспечивается стероидсульфатазой, а в перифокальных тканях превалирует ароматазный путь. В опухолях наблюдается недостаточная инактивация метаболитов эстрогенов за счет сниженной активности КОМТ, а в ткани лимфогенных метастазов метаболизм эстрогенов ингибирован из-за снижения активности и КОМТ и ГSТ. Впервые показано, что метаболизм эстрогенов опухолей и перифокальных тканей находится в тесной взаимосвязи.
Получены новые данные фундаментального характера, касающиеся различных путей метаболизма эстрогенов у больных РМЖ в различные возрастные периоды. Результаты исследования показали, что у женщин моложе 40 лет нарушены процессы инактивации эстрогенов за счет высокой активности 2,4-эстрогенгидроксилаз, низкой активности ГSТ и КОМТ, что, вероятно, обуславливает более агрессивное течение злокачественного процесса. У пациенток старше 50 лет наблюдались высокий уровень локального синтеза эстрогенов, их инактивации и рецепции, что оказывает влияние на развитие более благоприятного течения РМЖ.
Впервые получены данные о прогностической значимости активности ароматазы, 2,4-эстрогенгидроксилаз и ГSТ в опухоли. Установлено, что низкая активность ароматазы (менее 20 фмоль андростендиона/мг белка в час), высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз (более 230 пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час) являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении возникновения рецидива заболевания, а низкая активность ГSТ (менее 40 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин) является значимым критерием риска развития отдаленных метастазов при РМЖ.
Теоретическая и практическая значимость:
Изучение активности ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов женских половых гормонов расширило представление о патогенезе развития РМЖ и об их вкладе в процесс метастазирования. Новые данные фундаментального характера, касающиеся различных путей метаболизма эстрогенов у больных РМЖ в различные возрастные периоды, могут служить основой для дальнейшего изучения механизмов канцерогенеза и прогрессирования опухолевого процесса.
Выявленные изменения активности ферментов метаболизма эстрогенов могут рассматриваться в качестве параметров, характеризующих биологические особенности опухоли. Высокая активность ароматазы и стероидсульфатазы, низкая активность ГSТ сопряжены с большим размером опухоли (Т3) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (N2-3). Низкая активность ГSТ наблюдается при большей степени злокачественности (G3). Доказано, что недостаточная инактивация метаболитов гормонов связана с наличием наиболее злокачественного фенотипа опухоли. Данные о прогностической значимости активности ароматазы, эстрогенгидроксилаз, ГSТ в опухоли свидетельствуют о целесообразности использования изучаемых параметров в качестве дополнительных прогностических критериев при РМЖ.
Положения, выносимые на защиту
- Активность ферментов метаболизма эстрогенов имеет свои отличия в ряду «неизмененная ткань – опухоль –лимфогенные метастазы». В опухоли синтез эстрогенов обеспечивается стероидсульфатазой, а в перифокальных тканях молочной железы превалирует ароматазный путь. Ингибирование процессов инактивации метаболитов эстрогенов в опухолевой ткани обусловлено снижением активности КОМТ, а в ткани лимфогенных метастазов - и КОМТ, и ГSТ.
- Активность ферментов метаболизма эстрогенов может использоваться в качестве критериев, характеризующих биологические особенности опухоли. Высокая активность ароматазы и низкая активность ГSТ сопряжены с большим размером опухоли (Т3) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (N2-3). Низкая активность ГSТ наблюдается при большей степени злокачественности (G3).
- Активность ферментов метаболизма эстрогенов можно рассматривать в качестве дополнительных прогностических критериев. Активность ароматазы менее 20 фмоль/мг белка в час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль/мг белка в час являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении возникновения рецидива заболевания, а активность ГSТ менее 40 мкмоль/мг белка в мин является значимым критерием риска развития отдаленных метастазов при РМЖ.
Апробация диссертации:
Основные положения и результаты научных исследований были доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии», г.Томск (2004); конференции молодых ученных НИИ Онкологии „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии ”, г.Томск (2004); на региональной конференции молодых ученых НИИ Онкологии „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”, г.Томск (2006); на 13 международном конгрессе с международным участием по приполярной медицине г.Новосибирск (2006); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Онкология сегодня. Успехи и перспективы», г. Казань (2006).
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 2 статьи в центральной печати.
Объем и структура диссертации:
Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, материал и методы исследования, главы с изложением собственных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 163 источника, из них 42 отечественных, 121 зарубежный. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 24 рисунками.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследование было включено 85 больных РМЖ Т1-4N0-3М0 в возрасте 30-69 лет (средний возраст 53,62±1,08 лет), которые проходили лечение в отделении общей онкологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН с 2002 по 2005 год. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Лечение включало в себя проведение 2 – 4 курсов неоадьювантной химиотерапии по схемам CMF, CAF, FAC с последующим выполнением хирургического вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. В послеоперационном периоде проводилось 4-6 курсов адьювантной химиотерапии по одной из вышеуказанных схем, лучевая и антиэстрогенная терапия по показаниям. В представленном исследовании 8% составили лица моложе 40 лет, 31% в возрасте 41-50 и 61% больных - старше 50 лет. Характеризуя распределение больных в зависимости от состояния менструальной функции отмечено, что 35% пациенток находились в репродуктивном периоде, 15% в перименопаузе и 50% в состоянии постменопаузы. У 9% больных размер первичной опухоли был до 2 см в диаметре (Т1), у 58% размер первичной опухоли был от 2 до 5 см (Т2), у 21% наблюдалась Т3 стадия, когда опухоль была больше 5 см в диаметре и у 12% наблюдалось прорастание опухоли на близлежащие ткани (Т4). Лимфогенные метастазы (N0) отсутствовали у 37%, у 35% метастазами было поражено до 4 регионарных лимфоузлов (N1), у 26% обнаружено от 5 до 10 метастатических лимфоузлов (N2), и у 2% было поражено метастазами более 10 лимфоузлов (N3). Вторая степень злокачественности опухоли отмечалась у 68% больных, и у 32% была третья степень злокачественности.
Срок наблюдения за больными, включенными в исследование составил от 3 до 42 месяцев. Прогрессирование процесса было отмечено у 10 (12%) больных за счет развития рецидивов опухоли и у 19 (22%) пациентов были выявлены отдаленные метастазы.
Активность ферментов метаболизма эстрогенов и их рецепторов изучали в тканях больных раком молочной железы. Для этого из операционного материала брали образцы опухолевой, неизмененной тканей молочной железы, находящейся на расстоянии 1 – 5 см от первичной опухоли, а также лимфоузлы с метастазами и без, очищали от участков некроза, кровоизлияний и помещали в жидкий азот.
Методы исследования:
Активность ароматазы оценивали по образованию тяжелой воды из меченного тритием в 1--положении андростендиона [Ларионов А.А., 1998]. Cчет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в фмоль андростендиона/мг белка в 1 час.
Активность стероидсульфатазы оценивали по количеству образующегося [3H]-эстрона из [3H]-эстрон сульфата [Barth A., 2000]. Cчет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в фмоль эстрон сульфата/мг белка в час.
Определение суммарной 2,4-эстрогенгидроксилазной активности проводили радиометрическим методом [Theron, C.N., Russel V.A., Taljard J.J., 1986] с использованием S-Аденозил-L-[метил 3H]метионина молярной радиоактивностью 15 Ci/mmol (“Amersham Biosciences”, Великобритания) в качестве субстрата. Cчет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час.
Активность катехол-о-метилтрансферазы определяли радиометрическим методом [Zurcher G., Da Prada M., 1982] с использованием в качестве субстрата S-Аденозил-L-[метил 3H] метионина с молярной радиоактивностью 15 Ci/mmol (“Amersham Biosciences”, Великобритания). Cчет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в мкмоль гвоякола/мг белка в час.
Активность глютатионтрансферазы оценивали спектрофотометрическим методом. Принцип метода основан на образовании хромогенного комплекса восстановленного глютатиона с хлординитробензолом (ХДНБ), регистрируемого спектрофотометрически при длине волны 340 нм. [Keen et al. 1976]. Образование комплекса катализируется глутатионтрансферазой (ГST). Измерение оптической плотности проводилось на спектрофотометре «SPECORD М40» (Carl Zeiss JENA - Германия). Активность фермента выражали в мкмоль хлординитробензола/мг белка в мин.
Рецепторы эстрогенов и прогестерона определяли радиолигандным методом [Бассалык Л.С., 1987]. В работе использовались [2, 4, 6, 7-3H]-Oestradiol и [1,2,6,7 – 3H]-Progesteron (“Amersham Biosciences”, Великобритания). Содержание рецепторов стероидных гормонов в цитозоля тканей выражали в фмоль гормона, специфически связанного 1 мг цитозольного белка. Рецепторположительными считали ткани, в цитозолях которых содержалось более 10 фмоль специфически связанного эстрадиола или 10 фмоль специфически связанного прогестерона на 1мг белка.
Содержание белка в исследуемых тканях определяли по методу Лоури.
Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ «STATISTICA 6.0». Характер распределения исследуемых выборок проводился по критерию Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Наличие связи между изучаемыми признаками проводили с использованием корреляционного анализа и оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена (R). Для оценки прогностической значимости статуса рецепторов стероидных гормонов и активности ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы использовали однофакторный анализ прогностической значимости признаков, который был выполнен с использованием критерия Гехана-Вилкоксона (Survival Analysis, Statistica 6.0). Показатели 2-летней безрецидивной и безметастатической выживаемости анализировали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Сравнение показателей выживаемости в группах проводили по критерию Гехана-Вилкоксона [В. П. Боровиков, П. П. Боровиков, 1998].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для выявления особенностей метаболизма эстрогенов, характерных для разных тканей при раке молочной железы, была изучена активность ферментов синтеза и деградации эстрогенов в неизмененной, опухолевой тканях и лимфогенных метастазах.
При исследовании особенностей метаболизма эстрогенов было обнаружено, что активность ароматазы в неизмененной ткани в 1,5 раз выше, чем в опухолевой (р<0,01). В лимфогенных метастазах активность ароматазы достоверно не отличалась от опухолевой ткани. Активность стероидсульфатазы увеличивалась в ряду: «неизмененная ткань – опухоль – лимфогенные метастазы» (р<0,05). Это свидетельствует о высоком локальном образовании эстрогенов в неизмененной, опухолевой ткани молочной железы и в лимфогенных метастазах (рис.1).
Можно пологать, что высокий локальный синтез эстрогенов в перифокальных тканях за счет ароматазы обусловлен тем, что опухолевая ткань использует для своей жизнедеятельности эстрогены из окружающей ткани, что подтверждается литературными данными [Miller W.L., 2001]. Высокая активность стероидсульфатазы в опухоли связана с превалированием в ней процессов десульфатирования над ароматизацией.
Рис. 1. Активность ферментов синтеза эстрогенов в тканях при раке молочной железы.
Примечание: * - значимая достоверность различий по отношению к неизмененной ткани.
При изучении ферментов деградации эстрогенов наблюдалось снижение активности КОМТ в ряду «неизмененная ткань – опухоль – лимфогенные метастазы». Активность глютатионтрансферазы была выше в опухолях по сравнению с неизмененной тканью (р<0,01) и тканью лимфогенных метастазов (р<0,05) (рис.2).
Таким образом, синтез эстрогенов в опухоли обеспечивается стероидсульфатазой, а ароматазный путь превалирует в перифокальных тканях. Инактивация эстрогенов в опухоли сопровождается высокой активностью эстрогенгидроксилаз и ГSТ, а также снижением активности КОМТ по сравнению с неизмененными тканями молочной железы. Вероятно, инактивирование активности КОМТ в опухолевой ткани может являться фактором, способствующим недостаточному метаболизму высокоактивных катехолэстрогенов, что может приводить к генотоксическому эффекту, обеспечивающему появление более злокачественного опухолевого фенотипа. Подтверждением этого предположения является дальнейшее ингибирование инактивации катехолэстрогенов за счет активности как КОМТ, так и ГSТ при развитии метастазов в регионарных лимфоузлах. По-видимому, это свидетельствует о том, что эстрогены принимают участие не только в канцерогенезе, но и в опухолевой прогрессии.
Рис. 2. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы.
Примечание: * - значимая достоверность различий по отношению к неизмененной ткани; ** - по отношению к опухолевой ткани.
В проведенном нами исследовании были получены результаты о низком соответствии статуса рецепторов стероидных гормонов в первичных опухолях и метастазах, что возможно обусловлено изменением уровня стероидных рецепторов при прогрессии заболевания. Изменение рецепторного статуса лимфогенных метастазов по сравнению с первичной опухолью отмечалось в 43% случаев, причем у 31% статус ЕР метастазов менялся на отрицательный по сравнению с ЕР+ опухолью. Тождественность рецепторного статуса первичной опухоли со статусом в ткани лимфогенных метастазов была показана в 57%. Вероятно, конверсия ЕР с (+) в опухолях до ЕР(-) в метастазах может быть причиной неудач гормонотерапии в адьювантном режиме.
Было показано, что активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолевой ткани не изменяется в зависимости от статуса рецепторов эстрогена или прогестерона. Наши данные согласуются с результатами других исследователей [Prost O., 1984; Silva M.C., et al 1989; Colovai A.I.,1992; Evans T.R., 1994; Imoto S., 1997]. Однако, изучая другие ткани, вовлеченные в опухолевый процесс, было обнаружено, что при отрицательном ЕР статусе опухоли, активность ароматазы в перифокальных тканях была на 33% ниже (р<0,05), по сравнению с ЕР-положительными опухолями. Полученные данные свидетельствуют о превалирующем воздействии статуса рецепторов эстрогена опухолевой ткани на синтез гормонов в неизмененной ткани.
В онкологической практике к группе прогностических факторов, определяющих возможный исход рака молочной железы, относят такие клинические признаки, как возраст, состояние менструальной функции, размер первичного очага, метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, степень злокачественности и гистологический тип опухоли. Однако, как показывает анализ литературных данных по этой проблеме, использование только клинических признаков не всегда позволяет ответить на вопросы, связанные с прогнозом заболевания, а, следовательно, и назначением адекватного лечения [Герштейн Е. С., 2002; Киселев В.И., 2005; Kroman N., 2000].
К числу стандартных клинических факторов, которые могут в существенной мере определять характер течения заболевания и обязательно учитываются при планировании комплексного лечения больных раком молочной железы, относятся возраст пациенток и состояние менструальной функции.
В нашем исследовании было отмечено достоверное увеличение в 2,2 раза активности фермента локального синтеза эстрогенов - ароматазы в ткани опухоли у больных старше 50 лет по сравнению с молодыми пациентками (до 40 лет) (р<0,05). При изучении ферментов деградации эстрогенов в опухолевой ткани наблюдалось прогрессирующее снижение суммарной 2/4-эстрогенгидроксилазной активности на 59% у больных РМЖ в возрасте 41-50 лет и и на 64% у больных старше 50 лет по сравнению с пациентками моложе 40 лет (р<0,05). Активность КОМТ, напротив, увеличивалась в 1,5 раза у больных в возрасте старше 50 лет, по сравнению с пациентами средней возрастной группы (р<0,05). Активность ГSТ увеличивалась в возрасте 41 – 50 лет, по сравнению с больными до 40 лет в 2,3 раза, и в 1,6 раз по сравнению с пациентами старше 50 лет (р<0,05) (рис.3).
Рис. 3. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолях больных раком молочной железы в зависимости от возраста.
Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с больными в возрасте до 40 лет; ** - по сравнению с больными в возрасте 41 - 50 лет.
Кроме этого, у пациенток в возрасте до 40 лет в 60% случаев были обнаружены ЕР(-) новообразования, тогда как у больных старше 50 лет чаще встречались ЕР(+) опухоли (67%). Полученные нами данные позволяют предположить, что развитие РМЖ у женщин моложе 40 лет связано, преимущественно, с гентоксическим путем канцерогенеза, обеспечиваемого нарушением процессов инактивации эстрогенов. Вероятно, для этих пациенток характерно наличие значительного количества эстрогенов, не связавшихся с рецепторами стероидных гормонов из-за недостатка полноценно функционирующих ЕР [Бассалык Л.С., 1982; Цырлина Е.В., 1984], в результате чего гормоны метаболизируются через 2,4-эстрогенгидроксилазный путь, производя в большом количестве мутагенные катехолэстрогены, которые не обезвреживаются полностью путем метилирования КОМТ и коньюгирования с глутатионом в реакции ГSТ. Катехолэстрогены, не инактивированые на этом этапе, через ряд превращений могут оказывать ДНК-повреждающее действие, усугубляя течение опухолевого процесса. У женщин старше 50 лет, напротив, преобладали ЕР-положительные опухоли, а также наблюдался высокий уровень синтеза и инактивации эстрогенов. В связи с чем, вероятно, у этих пациенток генотоксический путь канцерогенеза менее выражен, и наблюдается превалирование промоторного пути, при котором эстрогены проявляют свое биологическое действие через связывание с рецепторами.
При сопоставлении активности ферментов метаболизма эстрогенов с менструальной функцией было показано, что активность ферментов локального синтеза эстрогенов в опухоли достоверно не изменялась в зависимости от состояния менструальной функции, в то время как активность ферментов деградации женских половых гормонов существенно зависит от этого признака. Так, суммарная 2/4-эстрогенгидроксилазная активность была снижена на 25% у больных РМЖ, находящихся в состоянии постменопаузы по сравнению с пациентками репродуктивного периода (р<0,05). Активность КОМТ, напротив, достоверно увеличивалась в 1,8 раза в перименопаузе, и в 1,5 раза в постменопаузе, по сравнению с больными репродуктивного периода (р<0,05) (рис.4).
Рис. 4. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолях больных РМЖ в зависимости от состояния менструальной функции.
Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с больными в репродуктивном периоде.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что для больных РМЖ в репродуктивном периоде характерна высокая суммарная 2/4 – эстрогенгидроксилазная активность и низкая активность КОМТ, по сравнению с пациентками, находящимися в пери- и постменопаузе. Обращает на себя внимание тот факт, что в перименопаузальном периоде активность ферментов деградации эстрогенов – ГSТ и КОМТ выше при меньшем образовании катехолэстрогенов за счет 2/4-эстрогенгидроксилазы, по сравнению с пациентками, находящимися в постменопаузе. Вероятно, это связано с постепенным угасанием функции яичников, истощением запасов системного уровня эстрогенов и перестройкой метаболизма гормонов, что и отражается на биологических характеристиках опухолей, развившихся в этом периоде.
Одним из наиболее значимых факторов, определяющих прогноз заболевания и тактику лечения рака молочной железы, является стадия заболевания, отражающая размер первичного новообразования и состояние регионарных лимфоузлов. В ходе нашего исследования было выявлено, что по мере увеличения размера первичной опухоли происходит повышение активности ароматазы и снижение активности ферментов их инактивации – ГSТ и КОМТ (рис.5).
Рис. 5. Активность ферментов синтеза эстрогенов (А) и их деградации (Б) в зависимости от размера первичной опухоли.
Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с группой Т1; ** - по сравнению с группой Т2.
Кроме того, если размер первичной опухоли был более 5 сантиметров, в неизмененной ткани молочной железы наблюдалось достоверное снижение активности КОМТ и ГSТ, по сравнению с новообразованиями меньших размеров. Таким образом, высокая активность ароматазы и низкая активность КОМТ и ГSТ в опухолевой ткани является неблагоприятным признаком, сопряженным с большим размером новообразований.
Важным клиническим показателем, характеризующим распространенность опухолевого процесса, является наличие или отсутствие метастазов в регионарных лимфатических узлах. Показано, что при обширном лимфогенном метастазировании (3) активность ароматазы была выше в 2,4 раза и в 2,5 раз, а активность СС выше в 1,3 раза и в 2 раза по сравнению с 1 и 2, соответственно (р<0,05) (рис. 6). Активность 2/4 – эстрогенгидроксилаз снижалась в 1,4 раза, а активность ГSТ в 1,9 раз (р<0,05) при увеличении вовлеченности в опухолевый процесс лимфатических узлов с N1 до N2. Еще более выраженное снижение активности 2/4 – эстрогенгидроксилаз - в 5 раз, ГSТ - в 1,6 раз и увеличение активности КОМТ - в 2 раза наблюдалось при обширном метастатическом поражении лимфоузлов - с N2 до N3.
Рис. 6. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухоли больных РМЖ в зависимости от характера лимфогенного метастазирования.
Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с N1; ** - по сравнению с N2.
Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс метастазирования в регионарные лимфатические узлы сопровождается увеличением активности ферментов локального синтеза эстрогенов и снижением активности ферментов их инактивации (2,4-эстрогенгидроксилаз и ГSТ) в опухолевой ткани. Можно полагать, что выявленные нарушения метаболизма эстрогенов связаны с опухолевой прогрессией и развитием лимфогенных метастазов.
Значимым критерием, характеризующим агрессивность новообразований, является степень злокачественности опухоли (G). Изучая активность ферментов метаболизма эстрогенов было показано, что при G2 активность ГSТ в опухолевой ткани была в 2,5 раза выше, чем при G3 (табл.1). Данный факт указывает на то, что снижение активности ГSТ в опухоли является неблагоприятным фактором, который обуславливает более агрессивный характер течения опухолевого процесса. Для неизмененной ткани, окружающей опухолевый очаг, было характерно снижение активности ароматазы более чем на 50% и снижение суммарной 2/4-эстрогенгидроксилазной активности на 68% при опухолях 3 степени злокачественности. Полученные данные свидетельствуют о возможном влиянии окружающих опухоль тканей на формирование более злокачественного фенотипа опухолей.
Таблица 1
Активность ферментов метаболизма эстрогенов в тканях больных раком молочной железы в зависимости от степени злокачественности
| Ферменты | Показатели активности ферментов | ||
| 2 степень злокачественности | 3 степень злокачественности | ||
| Опухолевая ткань | Ароматаза, фмоль андростендиона/ мг белка в 1 час | n=40 24,46±3,27 | n=9 19,78±5,21 |
| Стероидсульфатаза, фмоль эстрон сульфатаата/мг белка в 1 час | n=18 121,99±18,51 | n=5 107,41±13,41 | |
| 2,4-эстроген гидроксилаза, пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в 1 час | n=20 249,82±57,83 | n=7 134,34±88,83 | |
| Глютатионтрансфераза, мкмоль ХДНБ/ мг белка в 1 минуту | n=38 34,57±4,35 | n=9 14,07±3,07* | |
| КОМТ, мкмоль гвоякола/ мг белка в 1 час | n=39 245,19±25,09 | n=9 249,08±39,21 | |
| Неизмененная ткань | Ароматаза, фмоль андростендиона/ мг белка в 1 час | n=35 38,30±3,44 | n=6 15,11±4,66* |
| Стероидсульфатаза, фмоль эстрон сульфатаата/мг белка в 1 час | n=12 81,04±21,51 | n=5 86,17±3,74 | |
| 2,4-эстрогенгидроксилаза, пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в 1 час | n=24 246,52±41,16 | n=7 79,04±25,83* | |
| Глютатионтрансфераза, мкмоль ХДНБ/ мг белка в 1 минуту | n=37 16,94±2,82 | n=7 13,83±3,47 | |
| КОМТ, мкмоль гвоякола/ мг белка в 1 час | n=37 295,44±59,59 | n=9 284,31±139,52 | |
Примечание: *- значимая достоверность различий по отношению к больным со 2 степенью злокачественности опухоли
При оценке прогностической значимости активности ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы было выявлено, что статистически значимыми факторами в отношении 2-летней безрецидивной выживаемости, являются активность ароматазы и 2,4-эстрогенгидроксилазы в опухоли (рис. 7, 8). Так, при активности ароматазы в опухоли более 20 фмоль андростендиона/мг белка в 1 час ни у одной больной не было выявлено признаков местного прогрессирования заболевания. Все рецидивы РМЖ были выявлены только у тех пациентов, активность ароматазы в опухоли которых была ниже 20 фмоль/ мг белка в 1 час (р<0,05).
Рис. 7. Показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от активности ароматазы в опухоли.
Активность 2,4-эстрогенгидроксилаз в опухоли менее 230 пмоль метоксиэстрогенов/ мг белка в час явилась благоприятным фактором прогноза в отношении безрецидивной выживаемости. Ни у одной больной с активностью 2,4- эстрогенгидроксилаз менее 230 пмоль метоксиэстрогенов / мг белка в час не было выявлено признаков рецидивирования РМЖ и продолжительность жизни составила 100%, тогда как при активности фермента более 230 пмоль/мг белка в час показатели выживаемости составили 80% (р<0,05).
Рис. 8. Показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от суммарной активности 2,4-эстрогенгидроксилаз в опухоли.
Статистически значимым критерием, сопряженным с показателями безметастатической выживаемости, явилась активность ГSТ в опухоли (рис.9). При активности ГSТ выше 40,0 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин показатели 2-летней безметастатической выживаемости составили 85%, а при активности данного фермента менее 40 мкмоль, этот показатель был значимо ниже и составил 68% (р<0,05).
Рис. 9. Показатели 2-летней безметастатической выживаемости в зависимости от активности ГSТ в опухоли.
Полученные в работе данные позволяют рассматривать активность ароматазы в опухоли менее 20 фмоль андростендиона/мг белка в 1 час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль метоксиэстрогенов/ мг белка в 1 час и активность глютатионтрансферазы менее 40 мкмоль ХДНБ/ мг белка в 1 мин в качестве критериев, свидетельствующих о возможном неблагоприятном исходе РМЖ. Следует отметить, что эти результаты являются принципиально новыми, поскольку в литературе практически нет данных о взаимосвязи между активностью ферментов синтеза и инактивации эстрогенов и показателями выживаемости у больных РМЖ.
Таким образом, выполненное исследование cвидетельствует о том, что ферменты метаболизма эстрогенов играют важную роль в патогенезе рака молочной железы, оказывают значимое влияние на характер течения и прогноз заболевания, а также могут использоваться в качестве дополнительных критериев, характеризующих биологические особенности опухоли.
Выводы:
- При раке молочной железы в ткани опухоли локальный синтез эстрогенов осуществляется преимущественно стероидсульфатазой, а в неизмененной – ароматазой. Ингибирование процессов инактивации эстрогенов в опухолевой ткани происходит за счет снижения активности катехол-О-метилтрансферазы, а в лимфогенных метастазах – и катехол-О-метилтрансферазы, и глютатион-S-трансферазы.
- В опухолевой ткани содержание рецепторов женских половых гормонов выше, по сравнению с неизмененной тканью и тканью лимфогенных метастазов. В опухоли активность ферментов метаболизма эстрогенов не зависит от рецепторного статуса. В перифокальных тканях активность ароматазы была на 33% ниже (р<0,05) при отрицательном ЕР статусе новообразования, по сравнению с ЕР-позитивными опухолями.
- У пациенток в возрасте до 40 лет в ткани опухоли выявлено снижение активности ароматазы на 45% и 60%, глутатион-S-трансферазы на 60% и 20%, а также повышение активности 2,4-эстрогенгидроксилаз на 60% и 65% по сравнению с больными 41 - 50 и старше 50 лет (р<0,05), соответственно, что обуславливает недостаточную инактивацию высокореакционоспособных метаболитов эстрогенов и может характеризовать более агрессивное течение РМЖ в молодом возрасте.
- Ферменты метаболизма эстрогенов могут рассматриваться в качестве критериев, характеризующих биологическую агрессивность РМЖ. Высокая активность ароматазы и низкая активность глутатион-S-трансферазы сопряжены с большим размером опухоли: (активность ароматазы при Т1 - 14,66±4,50; при Т3 - 26,51±5,38 фмоль /мг белка в ч; (р<0,05); активность ГSТ при Т1 - 51,81±21,36; при Т3 - 21,58±3,69 мкмоль/мг белка в мин (р<0,05)) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (активность ароматазы при N1- 21,08±2,98; при N3- 51,5±34,21 фмоль/мг белка в час (р<0,05); активность ГSТ при N1- 48,75±9,19; при N3- 16,83±3,78 мкмоль/мг белка в мин, (р<0,05)).
- Низкая активность ароматазы в опухоли (менее 20,0 фмоль/мг белка в час) и высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз (более 230,0 пмоль/мг белка в час) являются неблагоприятными факторами в отношении риска возникновения рецидивов. Для новообразований с низкой активностью глютатион-S-трансферазы (менее 20,0 мкмоль/мг белка в мин) характерен неблагоприятный прогноз в плане развития отдаленных метастазов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в ткани рака молочной железы. // Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии. Материалы VI конференции молодых онкологов Украины. – Киев. – 2003. - с. 54-55. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Кокориной Ю.Л., Красулиной Н.А).
2. Гормонозависимые опухоли и активность ферментов метаболизма эстрогенов. // III съезд онкологов и радиологов СНГ. - часть II. – Минск. – 2004. - с. 289. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
3. Ферменты метаболизма эстрогенов и рецепторы как факторы риска развития и прогноза при раке молочной железы. // Сибирский онкологический журнал. – 2004. - №1(9). –с.34-43. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М.).
4. Роль ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе рака молочной железы. // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. Материалы Российской научно - практической конференции, посвященной 25 - летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. -Томск. – 2004. - Часть I. - с. 225-226. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
5. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы. // VIII российский онкологический конгресс. Материалы конференции. – Москва. – 2004. - с. 195-196. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
6. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы: особенности опухолевой, нормальной и метастатической тканей // Физиология и медицина. Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей. - Санкт-Петербург. -2005. - с.137. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
7. Ферменты метаболизма эстрогенов в злокачественных новообразованиях молочной железы: протоколы общества онкологов. // Сибирский онкологический журнал. – 2005. - № 2. - с. 64. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М.).
8. Ферменты метаболизма эстрогенов в опухолевой и нормальной тканях молочной железы. // Актуальные проблемы онкологии. Материалы I конгресса онкологов республики Узбекистан. Ташкент. – 2005. - с.195-196. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
9. Рак молочной железы: значение ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе и прогнозе данного заболевания. // Практическая медицина. – 2006. - №3. - с.5-6. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Бочкаревой Н.В.).
10. Ферменты метаболизма эстрогенов в гормонозависимых опухолях. // IХ российский онкологический конгресс. Материалы конференции. – Москва. – 2005. - с. 215. (в соавт. с Кондаковой И.В., Бочкаревой Н.В, Коломиец Л.А, Слонимской Е.М.).
11. Enzyme of estrogen metabolism in breast cancer: features of tumoral, normal and metastatic tissues. // 5th Biennial International meeting of the FGOG Endocrine treatment & prevention of breast and gynaecological cancers. Belgium, Brussels. – 2006. - p.168 (with I.V. Kondakova, E.M. Slonimskaya, S.A.Gluschenko).
12. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы: особенности опухолевой, нормальной и метастатической тканей. // Лечение рака в XXI веке. Материалы II-ой научно-практической конференции молодых специалистов-онкологов УрФО. – Челябинск. – 2006. - c.85. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
13. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в тканях рака молочной железы и их влияние на исход заболевания. // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии. Материалы региональной конференции молодых ученых. – Томск. - 2006. - с. 66-67. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
14. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы: особенности опухолевой, нормальной и метастатической тканей и их влияние на исход заболевания. // Проблемы фундаментальной и прикладной медицины. Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине. – Новосибирск. – 2006. - с.51-52. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М.).
15. Активность ферментов метаболизма эстрогенов при раке молочной железы и их взаимосвязь с клинико-морфологическими параметрами. // Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи. Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2006.- с. 242. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).
16. Рак молочной железы: значение ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе и прогнозе данного заболевания. // Онкология сегодня. Успехи и перспективы. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Казань. – 2006. - с.35-37. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Бочкаревой Н.В).
Список сокращений
ГSТ – глютатион-S-трансфераза
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ЕР – рецепторы эстрогена
ЕР(-) - рецепторы эстрогена отрицательные
ЕР(+) – рецепторы эстрогена положительные
КОМТ – катехол-О-метилтрансфераза
ПР – рецепторы прогестерона
ПР(-) – рецепторы прогестерона отрицательные
ПР(+) – рецепторы прогестерона положительные
2-ОНЕ2 – 2- гидроксиэстрадиол
4-ОНЕ2 – 4 гидроксиэстрадиол
РМЖ – рак молочной железы
СС – стероид сульфатаза
ХДНБ - хлординитробензол
R – коэффициент корреляции Спирмена
