Роль пцр-диагностики в проблеме верификации диагноза лептоспироза
На правах рукописи
Пантюхова
Татьяна Николаевна
Роль ПЦР-диагностики в проблеме верификации диагноза
лептоспироза
14.00.10 – инфекционные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2006 г.
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии
им.И.М.Сеченова Росздрава
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова
Кандидат медицинских наук, научный сотрудник
Владимир Петрович Чуланов
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Галина Михайловна Кожевникова
Доктор медицинских наук, профессор Николай Дмитриевич Никифоров
Ведущее учреждение:
ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава
Защита диссертации состоится «____» декабря 2006г. в ____часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.05 при ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им.И.М.Сеченова Росздрава
Адрес: 119992, Москва, ул. Трубецкая, д.8, строение 2
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО ММА им.И.М.Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49)
Автореферат разослан «___»___________________2006г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова
Актуальность темы.
В последнее десятилетие в России отмечается выраженная и устойчивая тенденция к росту и заболеваемости людей лептоспирозами. Для Тульской области, где эта проблема актуальна в связи с природной очаговостью данной инфекции, в последние годы уровень заболеваемости лептоспирозом превышает таковой по России: в 2004 году он составил 21,13 на 100 тысяч населения в сравнении с 1,72 на 100 тыс по РФ. Повышенная заболеваемость обусловлена в первую очередь активностью природного очага лептоспироза серогруппы гриппотифоза, связанного с увеличением численности грызунов. (О.Л.Смольянинова, 2005).
Полиморфизм клинических проявлений лептоспироза обусловливает необходимость улучшения клинической и лабораторной диагностики заболевания. Наиболее перспективным является применение на практике молекулярно-генетических методов диагностики и прежде всего полимеразной цепной реакции, которая позволяет выявлять присутствие ДНК лептоспир в крови с начального периода заболевания до периода ранней реконвалесценции. (В.В. Лебедев и др., 2001; Е.Н. Есипов, 2004). В настоящее время в диагностике инфекционных заболеваний с целью увеличения чувствительности метода применяется формат ПЦР, при котором из клинического материала выделяется РНК микроорганизма. Циркуляция в крови РНК отражает острый инфекционный процесс, цельность активно размножающейся бактерии, поэтому обнаружение в материале РНК в полной мере отражает остроту заболевания и как нельзя более подходит для диагностики острого периода. (Higges J A et al, 1998). Выделение из материала ДНК возбудителя не может в полной мере служить доказательством активности инфекционного процесса, ввиду возможной циркуляция ДНК микроорганизма после острого заболевания и проведенного лечения еще в течение нескольких недель. (S.A.Morre et al,1998). Используемая в нашем исследовании методика ПЦР для выявления РНК лептоспиры в сыворотке крови, ликворе, аутопсийном материале является приоритетной среди отечественных и зарубежных авторов.
Количество исследований, посвященных изучению характера клинических проявлений лептоспироза в зависимости от серогруппы возбудителя, и в частности, серогруппы гриппотифоза, особенностей течения заболевания в периоде ранней и поздней реконвалесценции, очень ограничено. Нуждается также в уточнении диагностическая значимость РМА и ПЦР в различные периоды лептоспироза в зависимости от формы заболевания и серогруппы возбудителя.
Вышеизложенные данные обусловливают актуальность исследований, направленных на изучение клинико-лабораторной характеристики лептоспироза серогруппы гриппотифоза в динамике инфекционного процесса в сопоставлении с персистенцией возбудителя.
Цель исследования - изучить особенности персистенции возбудителя в крови у больных лептоспирозом различными клиническими формами, диагностическую ценность ПЦР (рРНК) и РМА для подтверждения лептоспироза на разных стадиях заболевания.
Задачи исследования:
1.Провести анализ этиологии и особенностей клинического течения лептоспироза на основе вспышки заболевания в Тульской области.
2.Провести серологическую верификацию диагноза лептоспироза методом РМА.
3.Исследовть динамику уровня специфических антител в крови методом РМА в периоде реконвалесценции лептоспироза.
4.Провести диагностику лептоспироза методом ПЦР(рРНК) в крови больных в различные периоды заболевания (острый, ранняя и поздняя реконвалесценция).
5.Сопоставить диагностическую значимость РМА и ПЦР(рРНК) в различные периоды лептоспироза.
Научная новизна:
Впервые на территории Тулы и Тульской области на большом клиническом материале прослежена вспышка лептоспироза в динамике инфекционного процесса.
Установлены особенности клинического течения лептоспироза в зависимости от формы заболевания, серогруппы возбудителя.
Впервые был проведен анализ диагностической значимости РМА и ПЦР(рРНК) в различные периоды заболевания лептоспирозом, вызванным серогруппой гриппотифоза.
Впервые установлена длительная персистенция лептоспиры серогруппы гриппотифоза в крови у больных после острой формы заболевания.
Впервые исследовалась рРНК лептоспиры в сыворотке крови, что при ее обнаружении гарантированно указывало на активную стадию процесса, проведен сравнительный анализ чувствительности метода по выявлению рРНК лептоспиры в сыворотке крови в сравнении с ДНК.
Практическая значимость:
Впервые определена длительность лептоспиремии серогруппы гриппотифоза методом ПЦР(рРНК) в крови, что позволило установить сроки оптимального применения РМА и ПЦР методов для верификации диагноза лептоспироза.
Впервые показано преимущество выявления рРНК лептоспиры в сыворотке крови методом ПЦР в сравнении с выявлением ДНК, что позволяет рекомендовать метод для диагностики как на ранних сроках заболевания, так и при обследовании лихорадящих больных, а также в качестве замены культуральному методу исследования.
Впервые установлено, что метод ПЦР(рРНК) может использоваться дополнительной верификации диагноза лептоспироза. Впервые проведенное исследование аутопсийного материала методом ПЦР с обнаружением рРНК позволяет рекомендовать его в качестве альтернативы бактериоскопическому методу.
Положения, выносимые на защиту:
1.Лептоспироз, вызванный возбудителем серогруппы гриппотифоза, в настоящее время занимает ведущее положение в структуре заболеваемости лептоспирозом в Тульской области.
2. Имеются клинико-лабораторные отличия течения острого периода заболевания, периодов ранней и поздней реконвалесценции в группах больных с желтушными и безжелтушными формами лептоспироза.
3. Методы ПЦР и РМА имеют различную диагностическую чувствительность при исследовании сывороток крови больных лептоспирозом в разные сроки заболевания.
4. Возбудитель лептоспироза серогруппы гриппотифоза характеризуется длительной персистенцией в крови, что подтверждается при исследованиях сывороток крови методом ПЦР (рРНК).
5. Подтверждено преимущество выявления в сыворотках крови больных лептоспирозом методом ПЦР рРНК в сравнении с выявлением ДНК.
6. В группе больных желтушными формами лептоспироза более длительная лептоспиремия в сравнении с группой больных безжелтушными формами лептоспироза.
Внедрение результатов исследования в практику.
Полученные практические и теоретические результаты используются в работе инфекционного отделения Тульской областной больницы, 2 Городской больницы г.Тулы, на кафедре инфекционных болезней ММА им.И.М.Сеченова.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании кафедры инфекционных болезней Московской Медицинской Академии им.И.М.Сеченова.
Материалы диссертационной работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (27 октября 2005 года, г. Новосибирск), научно-практической конференции «Молекулярно-генетические методы диагностики и принципы терапии социально обусловленных инфекционных болезней» (17 марта 2006 года, г.Казань), Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское оборудование на рубеже веков» (19 мая 2006 года, г. Алматы).
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 4 научные работы.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 173 страницах печатного текста и состоит из введения, двух частей - обзора литературы, собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (59 отечественных и 169 иностранных работ). Содержит 5 рисунков, 42 таблицы, 3 клинических примера. В приложении 7 иллюстраций.
Материалы и методы исследования.
Проведено обследование 94 больных лептоспирозом в период с 01.08.2004 по 10.08.2005 года в разные стадии заболевания - острый, период ранней и поздней реконвалесценции (через 1,2,3,6,12 месяцев от начала заболевания). Обследование проводилось на базе ГУЗ ТО Тульской областной больницы (ТОБ), МУЗ г.Тулы 2Городской больницы (2ГБ), лаборатории ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора г.Москвы.
Диагноз лептоспироза ставили на основании клинико-эпидемиологических, лабораторно-инструментальных данных и формулировали согласно клинико-патогенетической классификации лептоспироза, принятой в России (Приказ МЗ СССР от 13 ноября 1979 г. № 1152; Методические указания МЗ России «Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами» от 2002 г. МУ 3.1.1128 - 02). В динамике заболевания проводились следующие исследования: клинический анализ крови, клинический анализ мочи, определение биохимических показателей крови: билирубин общий, билирубин прямой, креатинин, мочевина, АЛТ, АСТ. В целях верификации диагноза проводилось определение специфических антител методом РМА в динамике инфекционного процесса, определение рРНК лептоспиры в крови методом ПЦР на 5,10,15 дни болезни, через 1,2,3,6,12 месяцев от начала заболевания. Лабораторные исследования проводились на базе клинической и биохимической лаборатории ТОБ и 2 ГБ по общепринятым методикам: клинический анализ крови (гематологический анализатор «Avacus», Австрия), клинический анализ мочи (анализатор мочи «Уротрон Клинитек», Россия), биохимические исследования (биохимический анализатор «Super-Z-818», Япония, биохимический анализатор «Конелаб», Россия) с использованием тест-систем одноименных фирм. Серологические исследования ( РМА ) проводились в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Тульской области» с использованием стандартного набора диагностических штаммов производства ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, молекулярно-генетические исследования (ПЦР) – на базе центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора с использованием тест-системы «Ампли-Сенс Leptospira» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора г.Москвы.
Дополнительно всем больным проводилось ЭКГ-исследование, по показаниям – рентгенологическое исследование, УЗИ органов брюшной полости.
Клинические и лабораторные показатели регистрировались в специально разработанной карте и обрабатывались методами вариационной статистики на персональном компьютере с применением программы «Statistica 5.0-A». Из параметрических методов статистики применялся критерий Стьюдента (t-критерий). При значительных колебаниях значений переменных внутри групп указывалась медиана и стандартное отклонение. Из непараметрических методов применялся критерий Вилкоксона с поправкой Йейтса на непрерывность – Z. Для статистической обработки качественных величин применялись критерий Фишера, Диксона, кластерный анализ и таблица сопряженности 2х2. Частотные признаки (число лиц с наличием или отсутствием признака) выражались в %.
Среди обследованных мужчин было 51 человек (54,2%), женщин – 43 (45,8%). Городских жителей - 74 (78,7%), сельских – 20 (21,3%). Возраст заболевших колебался от 15 до 72 лет (рис. 1).
Рис.1. Распределение больных лептоспирозом по возрасту
Желтушная форма лептоспироза диагносцирована в 33 (35,1%) случаях,
безжелтушная – в 61 (64,8%) случае. У 3 больных имел место менингит. В 11 случаях возникли рецидивы заболевания. У 92 больных заболевание закончилось выздоровлением, у 2-х имел место летальный исход.
Легкая форма заболевания наблюдалась у 4 (4,25%) больных, среднетяжелая безжелтушная – у 48 (51%), среднетяжелая желтушная – у 16 (17%), тяжелая безжелтушная – у 9 (9,5%), тяжелая желтушная – у 17 (18%) больных. Летальный исход имел место у 2 больных с тяжелой формой лептоспироза желтушной и безжелтушной формы (рис.2).
Рис.2. Распределение больных в зависимости от формы и
тяжести заболевания
У 89 (95%) из 94 диагноз был подтвержден при помощи РМА с десятью серогруппами лептоспир, наиболее распространенным в Тульском регионе - – grippotyphosa, canicola, australis, icterohaemorrhagiae, рomona, tarassovi, sejroe, javanica, autumnalis, bataviae, в разные сроки заболевания. Диагностическими считались титры 1:100 и выше. У 5 больных РМА была отрицательной, у 4х из них лептоспирозные антигены обнаружены при помощи ПЦР в крови, у одного – в постмортальном исследовании тканей. На основании бактериоскопического метода (окраска по Леватити) диагноз подтвержден у одной умершей больной обнаружением лептоспир в гепатоцитах и эпителии канальцев почек. Кроме того, всем больным исследовалась кровь методом ПЦР на 5,10,15 дни; 1,2,3,6,12 месяцев со дня болезни; рРНК патогенных лептоспир была обнаружена у 71 пациента из 94 (76%). У 1 больного была подтверждена специфическая природа менингита обнаружением рРНК лептоспиры в ликворе.
При анализе серологического пейзажа лептоспироза среди изученных больных определена доминирующая роль серогруппы гриппотифоза во время вспышки заболевания в Тульской области в 2004 году. У 77 из 89 (86,5%) серопозитивных больных были выявлены наиболее высокие титры антител к лептоспирам серогруппы grippotyphosa, в 12 случаях заболевание было вызвано лептоспирами других серогрупп: australis – у 7 человек, по одному случаю - sejroe и canicola, у 2-х больных выявлены высокие титры антител к двум серогруппам лептоспир - grippotyphosa и australis, у 1 больного – к sejroe и canicola. У 5 больных РМА была отрицательной на всех исследуемых сроках.
Эпидемиологический фактор заражения зарегистрирован у 98,9% больных.
Госпитализация больных в стационар осуществлялась со 2-го по 22-й день болезни, в большинстве случаев на 4-6-й день (рис.3). На 2-3 день заболевания поступило 9(9,57%) человек, на 4-6-й день – 52(55,3%) человека, на 7-9-й – 25(26,5%) человек, позже 10 дня – 8(8,63%) человек. Оба пациента с летальным исходом госпитализировались на 5-й день болезни. Средний койко-день для больных с благоприятным исходом заболевания составил 13,4±3,66 койко-дня.
Рис.3. Сроки госпитализации больных лептоспирозом в стационар
Сопутствующие (хронические) заболевания зарегистрированы у 56 (59,5%) из 94 наблюдавшихся больных лептоспирозом.
Все больные в соответствии с особенностями клинико-лабораторного течения лептоспироза разделены на две группы в соответствии с формами течения болезни – желтушной (33 человека) и безжелтушной (61 человек).
В результате проведенных исследований, на основании параметрических и непараметрических методов статистики, кластерного анализа мы установили, что в начальном периоде лептоспироза в группе больных с желтушной и безжелтушной формой заболевания наиболее частым являлось сочетание следующих симптомов: лихорадка (100%), озноб (84,4%), слабость (93,4%), головная боль (54,5%), инъекция сосудов склер (51,9%), боли в пояснице (55,8%), олигурия (50,6%), т.е. проявления интоксикационного и почечного синдромов (таблица 1).
Таблица 1
Наиболее часто встречающиеся симптомы у больных лептоспирозом
в начальном периоде заболевания
| Симптомы | Все больные n=94 | Безжелтушная форма n=61 | Желтушная форма n =33 | |||
| Абс. число | % | Абс. число | % | Абс. число | % | |
| Лихорадка | 94 | 100% | 61 | 100% | 33 | 100% |
| Озноб | 81 | 86,1% | 48 | 78,69% | 33 | 100%* |
| Слабость | 89 | 94,6% | 57 | 93,4% | 32 | 96,9% |
| Головная боль | 53 | 56,3% | 36 | 59% | 17 | 51,5% |
| Инъекция склер | 45 | 47,8% | 26 | 42,6% | 19 | 57,5% |
| Боли в пояснице | 54 | 57,4% | 31 | 50,8% | 23 | 70%* |
| Олигурия | 47 | 50% | 27 | 44,26% | 20 | 60,61%* |
При анализе течения начального периода лептоспироза у больных с безжелтушной и желтушной формой группах наблюдались достоверные отличия: у пациентов с желтушной формой достоверно чаще наблюдались такие симптомы, как озноб, мышечные боли, боли в правом подреберье, эпигастрии, пояснице, иктеричность склер, гиперемия зева, олигоурия и анурия, т.е. начальный период характеризовался более яркой клинической картиной. Интоксикационный синдром был более выражен, и уже в самом начале заболевания, сопровождался поражением не только почек, но и печени.
Кластерный анализ показал, что наиболее значимыми симптомами, определяющими тяжесть течения начала заболевания у больных безжелтушной формой лептоспироза, являются: лихорадка, слабость, анурия, нарушения зрения, эмоциональная лабильность, боли в области печени, гиперемия зева.
Наиболее значимыми симптомами, определяющими тяжесть течения в начальном периоде у больных желтушной формой лептоспироза, являются: нарушения зрения, менингеальные симптомы, эмоциональная лабильность, артралгии, боли в горле, кашель, сухие хрипы в легких, т.е. соматическая составляющая здесь обогащается патологией со стороны дыхательной системы, а неврологическая определяется еще и менингеальной симптоматикой. Все это вместе определяет более тяжелое течение желтушной формы лептоспироза.
В начальном периоде заболевания патологические изменения в общем анализе мочи наблюдались на 1-й неделе у 95% обследованных больных. Наиболее частой патологией являлась протеинурия (76%), лейкоцитурия (73,9%), гипоизостенурия (71,73%), чуть реже – эритроцитурия (56,52%). Наиболее характерными изменениями в общем анализе крови были увеличение СОЭ (86%), нейтрофильный сдвиг влево (73,4%), умеренный лейкоцитоз (46,8%), анемия (41%) с максимальными значениями 65 г/л, лимфопения (57%), моноцитопения (25,5%), эритроцитопения (39%).
Достоверные отличия в изменениях анализов мочи проявлялись в более частой встречаемости протеинурии, лейкоцитурии и эритроцитурии у пациентов с желтушной формой болезни. В биохимическом анализе достоверно выше у больных желтушной формой были показатели уровня билирубина и цитолиза гепатоцитов, что коррелировало с клинической картиной. Отличий в показателях азотемии и общем анализе крови в группах не выявлено.
В периоде разгара заболевания отмечалась вторая волна лихорадки после периода апирексии у 5 больных (4-х безжелтушной формой болезни, у 1 – с желтушной). Геморрагический синдром зарегистрирован у 4,3 % больных.
В равной степени в двух исследуемых группах выявлялись симптомы поражения нервно-психической сферы: двигательное возбуждение, или, наоборот, двигательная заторможенность, эмоциональная неустойчивость, которые наблюдались в рамках вторичной энцефалопатии или менингита с тенденцией к преобладанию указанных симптомов в группе больных с желтушной формой лептоспироза. В 3-х случаях у больных имел место серозный менингит.
В периоде разгара заболевания выявлялись симптомы поражения пищеварительной системы. Тошнота, рвота, боли или тяжесть в правом подреберье, увлечение размеров печени, подтвержденное и при ультразвуковой диагностике, у больных с желтушной формой лептоспироза встречались статистически достоверно чаще, чем в другой группе больных.
В группе больных с желтушными формами заболевания показатели уровня билирубина в периоде разгара заболевания достигали максимальной отметки пяти норм за счет прямого билирубина, в среднем составляли 2-3 нормы. Активность АЛТ и АСТ в среднем превышала норму в 2-2,5 раза.
В нашем исследовании явления острой почечной недостаточности наблюдались у 73 (77,6%) из 94-х больных. В группе с безжелтушной формой лептоспироза ОПН была зарегистрирована у 40 (65,5 %) пациентов из 61, в то же время как у больных с желтушной формой лептоспироза ОПН развивалась во всех 33 (100%) случаях. В группе больных с желтушной формой явления олигурии встречались достоверно чаще (78,8% против 59%). Длительность олигурической стадии ОПН составляла от 2 до 7 дней, в среднем 3 + 0,5 дня, далее наступали явления полиурии.
В клиническом анализе мочи на 2-3 неделях заболевания наиболее часто встречалась гипоизостенурия (84-85,7%), реже – протеинурия (44-20%), лейкоцитурия (36-34,2%), эритроцитурия (26,6-11,4%). На 3-й неделе достоверно чаще встречалась протеинурия в группе больных с желтушными формами лептоспироза. Высокие цифры креатинина сохранялись в 47-16% случаев соответственно, мочевины – у 40-24% пациентов.
Симптомы поражения сердечно – сосудистой системы в периоде разгара заболевания, подтвержденные ЭКГ-исследованием, верифицировались на ЭКГ как диффузное поражение миокарда, экстрасистолия, мерцательная аритмия, нарушений атриовентрикулярной проводимости. В 8-ми случаях развилась миокардиодистрофия, в 2-х - острая сердечно-сосудистая недостаточность. У больных с желтушной формой достоверно чаще встречалась мерцательная аритмия. Учитывая, что у пациентов этой группы заболевание протекало более тяжело, можно предположить, что токсины и лептоспиры проявляют тропность не только к клеткам печени, почек, но и к пейсмеккерам водителей ритма сердца. (De Brito et al., 1987)
У исследованных нами больных в разгаре заболевания инфекционно-токсический шок развился у 24 больных (26%). При этом ИТШ 1-й степени был у – 6 человек, из них у больных с безжелтушной формой лептоспироза – у 2(3,27%) человек, с желтушной формой – у 4(12%). ИТШ 2-й степени (наблюдался у 13 человек, из них у больных с безжелтушной формой лептоспироза – у 6(9,8%)больных, с желтушной формой – у 7(21,2%). ИТШ 3-й степени зарегистрирован у 5 пациентов, из них у больных с безжелтушной формой лептоспироза – у 2(3,27%) человек, с желтушной формой – у 3(9%). ИТШ развивался в среднем на 5-й день болезни. Гипотония наблюдалась у 18 больных, из них с безжелтушной формой лептоспироза – у 11(18%) человек, с желтушной формой – у 7(21,2%).
Достоверных отличий в группах по частоте выявления инфекционно-токсического шока не наблюдалось.
В своей работе мы выявили поражение легких у 8,5% больных с одинаковой частотой в обеих группах. Достоверных отличий между группами в частоте поражения дыхательной системы обнаружено не было.
Статистически достоверные отличия в клинической картине желтушной и безжелтушной форм лептоспироза в периоде разгара заболевания представлены в таблице 2.
Таблица 2
Достоверные отличия в клинической картине у больных с желтушной и безжелтушной формой лептоспироза в периоде разгара заболевания
| Симптом | Встречаемость симптома при безжелтушной форме (в %) | Встречаемость симптома при желтушной форме (в %) | Статистически достоверные отличия(по Фишеру) |
| Интоксикация | 6,1% | 29,5% | F=5,7; p<0,01 |
| Олигоанурия | 59% | 78,8% | F=4,7; p<0,01 |
| Адинамия | 1,6% | 15,15% | F=4,48; p<0,01 |
| Острая почечная недостаточность | 65,5% | 100% | F=3,8; p<0,01 |
| Гепатит | 22,9% | 100% | F=4.2; p<0,01 |
| Гепатонефромегалия | 9,8% | 24,24% | F=2,46; p<0,01 |
| Мерцательная аритмия | 4,9% | 15,15% | F=1,72; p<0,05 |
Проведенный кластерный анализ выявил, что симптомами, определяющими тяжесть течения в периоде разгара безжелтушной формы лептоспироза, являются изменения дыхательной (пневмонии), сердечно-сосудистой (миокардит, миокардиодистрофия, кардиомиопатия, мерцательная аритмия, острая сердечно-сосудистая недостаточность), нервной системы (энцефалопатия, психомоторное возбуждение). У больных желтушными формами лептоспироза тяжесть течения периода разгара определяют изменения со стороны пищеварительной (гепатит), мочевыделительной (острая почечная недостаточность), дыхательной (пневмонии), сердечно-сосудистой (миокардит, миокардиодистрофия, острая сердечно-сосудистая недостаточность,), центральной нервной системы (энцефалопатия, психомоторное возбуждение).
Таким образом, в клинической картине периода разгара лептоспироза, по сравнению с безжелтушной формой, при желтушной форме заболевания гепато-ренальный синдром в большей степени определяет тяжесть течения заболевания в совокупности с патологией сердца.
В периоде ранней реконвалесценции на фоне угасания клинической симптоматики лептоспироза с постепенным восстановлением функций пораженных органов у больных в обеих группах отмечалось обострение имеющихся хронических заболеваний: инфекции мочевых путей (в 6,89% у желтушных форм, в 2% у безжелтушных форм), бронхиальной астмы (в 1,2% у безжелтушных форм), хронического бронхита (в 6,89% у желтушных форм), хронического холецистита (в 3,4% у желтушных форм).
Лихорадка достоверно чаще встречалась в группе пациентов с безжелтушной формой лептоспироза (12,2 % против 0%, F=1.67, p<0.05), а также анемия (24,6 % против 6,89%, F=3.79, p<0.01).
Рецидивы лихорадки, имевшие место при безжелтушной форме лептоспироза в 6 случаях, у двух больных сопровождались развитием серозного менингита. В 4-х случаях не сопровождались какими-либо органными поражениями и длились 3-4 дня. В группе больных, перенесших желтушную форму лептоспироза, рецидивов заболевания в период реконвалесценции не отмечалось. Имелась тенденция к затяжному течению у больных с безжелтушной формой лептоспироза (в 5% против 0%) вследствие развития рецидивов.
Кластерный анализ показал, что при безжелтушной форме лептоспироза симптомами, определяющими тяжесть течения периода реконвалесценции, являются: анемия, астенический синдром и осложнения, возникающие в отдаленный период заболевания (полинейропатии, периартриты). При желтушной форме лептоспироза тяжесть заболевания в период реконвалесценции определяли: обострение хронических заболеваний, анемия, полинейропатии.
В периоде ранней реконвалесценции в клиническом анализе мочи в течение 1 месяца после перенесенного лептоспироза сохранялась гипоизостенурия у 57% больных, лейкоцитурия - у 57%, протеинурия – у 28%, эритроцитурия – у 14%, цилиндрурия - у 14%. Ко 2-му месяцу колическтво патологических изменений снижалось: гипоизостенурия наблюдалась у 28% больных, лейкоцитурия у 18,7%, протеинурия – 12,5%, цилиндрурия - в 11% случаев. Эти данные нашли подтверждение в исследованиях М.Г.Авдеевой,1998.
В клиническом анализе крови в течение 1 месяца после перенесенного лептоспироза сохранялась анемия у 64 % больных, лейкоцитоз - у 25 %, повышение СОЭ – у 64 %. Ко 2-му месяцу анемия наблюдалась у 60 %, лейкоцитоз - у 7 %, повышение СОЭ – у 60 % пациентов. В биохимических показателях в течение 1 месяца после перенесенного лептоспироза отмечалось нарушение обмена билирубина у 4% больных, повышение АЛТ – у 36 %, АСТ – у 20 %, креатинина – у 8 %, мочевины – у 4 % пациентов. Ко 2-му месяцу повышение АЛТ сохранялось у 31 % больных, АСТ – у 31 %, креатинина – у 6 %, мочевины – у 4 % пациентов. Достоверных отличий в группах по перечисленным показателям выявлено не было.
Период поздней реконвалесценции изучен нами через 6 месяцев у 49 больных, через 1 год после перенесенного заболевания – у 38 пациентов.
К 6 месяцам полностью регрессировала клиническая симптоматика, имевшая место в периоде ранней реконвалесценции. При анализе результатов диспансерного наблюдения каких-либо изменений со стороны внутренних органов, которые можно было бы связать с перенесенным лептоспирозом, зарегистрировано не было.
В лабораторных данных, полученных нами отмечены изменения в клиническом анализе крови и мочи, в то время как при исследовании сывороток крови методом ПЦР рРНК лептоспиры не была выявлена ни у одного из пациентов. Следовательно, через полгода после перенесенного лептоспироза общий анализ мочи исследован у 36 человек. Из них не отмечалось каких-либо патологических изменений у 23(63,8%) человек. У 13 (36%) пациентов встречались такие изменения, как гипоизостенурия (19,4%), лейкоцитурия (16,6%), протеинурия (2,77%) и эритроцитурия (8,3%). Через 1 год после перенесенного лептоспироза общий анализ мочи исследован у 34 человек. Из них не отмечалось каких-либо патологических изменений в общем анализе мочи у 21(61,7%) пациента. У 13(38,2%) пациентов сохранялись такие изменения, как гипоизостенурия (17,6%), протеинурия (11,7%) и эритроцитурия (11,7%).
Таким образом, при исключении пациентов, имеющих в анамнезе такие фоновые заболевания, как артериальная гипертония, мочекаменная болезнь, а также лиц, у которых анализы нормализовались, патологические изменения в общем анализе мочи, которые можно было бы связать с перенесенным лептоспирозом, в периоде поздней реконвалесценции сохранялись у 9 (29%) человек.
Сохранение этих изменений в клиническом анализе мочи позволили говорить о начале формирования у пациентов хронической патологии почек, которая была расценена нефрологами как консервативно-курабельная стадия хронической почечной недостаточности. Все больные взяты на учет и наблюдаютя совместно с нефрологами.
В периоде поздней реконвалесценции, через 6 месяцев от начала заболевания, наиболее длительно у больных сохранялись явления анемии-у 22% пациентов, через 1 год после перенесенного лептоспироза анемия зарегистрирована у 19% пациентов. Каких-либо отклонений в биохимических показателях в периоде отдаленной реконвалесценции выявлено не было.
С целью выявления особенностей течения лептоспироза в зависимости от серогруппы возбудителя, больные было выделено на две группы: 1-я группа – лептоспироз, вызванный серогруппой гриппотифоза (77 человек), 2-я группа – лептоспироз, вызванный другими серогруппами (17 человек).
При анализе особенностей клинического течения лептоспироза в зависимости от серогруппы возбудителя статистический анализ выявил достоверные различия: у пациентов второй группы уже в начальный период отмечается поражение печени и почек, в периоде разгара чаще встречается острая сердечная недостаточность и интоксикация, а в периоде реконвалесценции анемия чаще наблюдалась в первой группе. Можно отметить, что начало болезни у пациентов второй группы протекает тяжелее, что связано с преобладанием в ней желтушных форм, в то время как период разгара сходен в двух группах по своим клиническим проявлениям.
Реакция микроагглютинации и лизиса (РМА).
При помощи РМА в динамике заболевания определялся уровень специфических антител в крови всем 94 больным. Диагностическим считался титр 1:100 и выше. РМА была положительной у 89(95%) из 94 человек.
Результаты постановки РМА в динамике инфекционного процесса у наблюдавшихся нами больных представлены в таблице 3.
Таблица 3
Выявление специфических антител в РМА при безжелтушной
и желтушной формах лептоспироза в динамике инфекционного процесса.
| Дни болезни | Все больные n=94 | Безжелтушная форма n=61 | Желтушная форма n=33 | ||||||
| число иссл. | число (+) | % | число иссл. | число (+) | % | число иссл. | число (+) | % | |
| 1-7 | 16 | 1 | 6,2% | 6 | 1 | 16,6% | 10 | - | 0% |
| 8-14 | 62 | 19 | 30,6% | 43 | 13 | 30,2% | 19 | 6 | 31,5% |
| 15-21 | 66 | 54 | 81,8% | 42 | 37 | 88,1% | 24 | 17 | 70,8% |
| 22-28 | 12 | 8 | 66,6% | 7 | 4 | 57% | 5 | 4 | 80% |
| 29-35 | 8 | 7 | 87,5% | 6 | 5 | 83% | 2 | 2 | 100% |
| 36-63 | 17 | 13 | 76,4% | 10 | 9 | 90% | 7 | 4 | 57% |
| 64-90 | 10 | 9 | 90% | 6 | 6 | 100% | 4 | 3 | 75% |
| 91-120 | 11 | 8 | 72,7% | 4 | 3 | 75% | 7 | 5 | 71,4% |
| 121-218 | 51 | 49 | 96% | 35 | 34 | 97% | 16 | 15 | 93,7% |
| 219-360 | 26 | 20 | 76,9% | 15 | 13 | 86,6% | 11 | 9 | 81,8% |
Наименее информативна РМА в 1-ю неделю заболевания – ее диагностическая значимость не превышает 6,2%, во 2-ю неделю – 30,6%. Диагностическое значение постепенно нарастает с 3-й неделе заболевания 81,8%, достигая максимума к 6 месяцам – 96%.
Следовательно, выявление специфических антител методом РМА приобретает максимальные значения, только начиная с 3-й недели заболевания (81,8%).
Через 12 месяцев от начала заболевания уровень антител в РМА исследован у 26 пациентов. Положительные результаты сохранялись у 76,9%.
Статистическая обработка данных с использованием критерия Фишера позволила установить, что в группе больных безжелтушной формой лептоспироза достоверно выше процент больных с выявленными специфическими антителами на 3-й неделе заболевания, что свидетельствует о более быстром темпе нарастания антител у пациентов данной когорты. Это также косвенно свидетельствует о повышенной антигенной нагрузке в периоде разгара заболевания у больных желтушными формами лептоспироза и более позднем у них формировании точки эквивалентности, что нашло отражение в более тяжелой клинической картине заболевания у лиц с желтушных формами. Описанную картину можно объяснить поражением Купферовских клеток и стагнацией обменных процессов в печени (Playfair J.H.L.,1998).
Следовательно, полученные данные предполагают иные механизмы иммунопатогенеза у больных желтушными формами лептоспироза.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
При исследовании сывороток крови больных лептоспирозом (20 проб), взятых на ранних сроках, на предмет сравнительного выявления ДНК и рРНК лептоспиры методом ПЦР, была установлена концентрация рРНК в исследуемом материале, превышающая концентрацию ДНК в 3-100 раз в 85% случаев. Эти данные послужили основанием к выбору тест-системы на основе определения рРНК лептоспиры как наиболее верно отражающей остроту инфекционного процесса и с наибольшей вероятностью определяющую возбудителя ввиду его большей концентрации в крови.
Методом ПЦР для выявления в крови рРНК лептоспиры исследовались сыворотки всех 94 больных в разные сроки заболевания. В общей сложности рРНК патогенных лептоспир была обнаружена в крови 71 пациента из 94 (76%) в сроки с 3 по 79-й дни заболевания.
Динамика выявления лептоспир в крови методом ПЦР по дням болезни (таблица 4) позволила установить, что диагностическая чувствительность данной методики максимальна в первые 7 дней заболевания и составила в этот период 86%. Максимум выявляемости рРНК лептоспир методом ПЦР приходится на 1-ю неделю заболевания с резким падением к 15 дню болезни как при безжелтушных, так и при желтушных формах.
При статистической обработке результатов с использованием критерия Фишера, мы установили, что в группе больных желтушными формами лептоспироза достоверно выше был процент выявления рРНК лептоспир в крови методом ПЦР в периоде разгара заболевания (на 2-3 неделе), что определяется тяжестью процесса и коррелирует с клинической картиной, указывает на повышенную антигенную нагрузку у больных желтушными формами.
Таблица 4
Выявление рРНК лептоспиры в крови методом ПЦР при безжелтушной
и желтушной формах лептоспироза в динамике инфекционного процесса.
| Дни болезни | Все больные n=94 | Безжелтушная форма n=61 | Желтушная форма n=33 | ||||||
| число иссл. | число (+) | % | число иссл. | число (+) | % | число иссл. | число (+) | % | |
| 1-7 | 35 | 30 | 86% | 20 | 18 | 90% | 15 | 12 | 80% |
| 8-14 | 105 | 44 | 42% | 70 | 22 | 31,4% | 35 | 22 | 62,8% |
| 15-21 | 74 | 19 | 26% | 47 | 9 | 19,14% | 27 | 10 | 37% |
| 22-28 | 21 | 3 | 14,2% | 10 | 2 | 20% | 11 | 1 | 9% |
| 29-35 | 25 | 4 | 16% | 21 | 3 | 14,2% | 4 | 1 | 25% |
| 36-63 | 54 | 5 | 9,2% | 33 | 2 | 6% | 21 | 3 | 14% |
| 64-90 | 47 | 4 | 8,5% | 32 | 2 | 6,2% | 15 | 2 | 13% |
| 91-120 | 46 | - | 0% | 31 | - | 0% | 15 | - | 0% |
| 121-218 | 51 | - | 0% | 37 | - | 0% | 14 | - | 0% |
| 219-360 | 38 | - | 0% | 25 | - | 0% | 13 | - | 0% |
Максимальный сроки, на которых удалось выявить рРНК лептоспиры в крови больных серогруппы гриппотифоза, был 79-й день от начала заболевания. В периоде поздней реконвалесценции через полгода и год от начала заболевания результаты ПЦР были отрицательны у всех обследованных. Аналогичных данных в литературе по исследованию лептоспироза, вызванного серогруппой гриппотифоза, мы не встретили.
С целью исследования диагностических возможностей ПЦР, рРНК лептоспиры определялась не только в сыворотке крови, но и в других жидкостях. Для дополнительной диагностики лептоспироза метод ПЦР применялся для исследования ликвора от двух больных с серозным менингитом. Из них в одном случае в ликворе на 28-й день от начала болезни была обнаружена рРНК лептоспиры. Методом ПЦР исследовался аутопсийный материал, рРНК лептоспиры была обнаружена во всех исследуемых тканях (почки, печень, легкие, лимфоузлы, головной мозг).
Следовательно, имеющиеся результаты ПЦР по обнаружению рРНК в ликворе и аутоптате позволяют рекомендовать этот метод для верификации диагноза лептоспироза в случае невозможности применения серологических методов. Особенную актуальность приобретает метод при исследовании аутопсийного материала в связи с высокой стоимостью бактериоскопического исследования.
Таким образом, мы установили преимущество ПЦР-диагностики в ранние сроки по сравнению с РМА и подтвердили разную диагностическую значимость ПЦР и РМА в различные периоды заболевания.
Были установлены особенности иммуногенеза у больных желтушными и безжелтушными формами лептоспироза, выявлены достоверные различия в более поздних сроках появления специфических антител и более высоком проценте выявления рРНК лептоспиры в периоде разгара в группе с желтушными формами. Полученные данные косвенно свидетельствуют о повышенной антигенной нагрузке в периоде разгара заболевания у больных желтушными формами лептоспироза и более позднем у них формировании точки эквивалентности, что нашло отражение в более тяжелой клинической картине у лиц с желтушных формами. Полученные данные следует учитывать в диагностике лептоспироза. Диагностическая значимость ПЦР и РМА методов представлена на рис.4.
Рис.4. Диагностическая значимость РМА и ПЦР в разные сроки
заболевания
Выводы.
1. В этиологической структуре заболеваемости лептоспирозом в Туле и Тульской области наибольшее значение в настоящее время имеет серогруппа гриппотифоза, вызывающая вспышечную заболеваемость.
2. Сопоставление клинико-лабораторных данных в группах больных с желтушными и безжелтушными формами лептоспироза выявило достоверно более тяжелое течение заболевания у больных с желтушными формами, что коррелирует с данными исследований РМА и ПЦР(рРНК) в сыворотке крови.
3. К периоду поздней реконвалесценции у 29% больных, перенесших лептоспироз серогруппы гриппотифоза, сформировалась хроническая болезнь почек.
4. РМА недостаточно эффективна для диагностики лептоспироза в ранние сроки заболевания, так как у наблюдавшихся больных на 1-й неделе заболевания она была положительной лишь у 6,2% исследованных. Диагностическая эффективность РМА возрастает к 3-й неделе и достигает 81,8% к 6 месяцам.
5. В результате проведенного исследования была определена достаточно высокая диагностическая чувствительность ПЦР на основе выявления рРНК лептоспиры в сыворотке крови. Наиболее эффективен этот метод на первой неделе заболевания – чувствительность достигает 86%. Установлены сроки максимального выявления рРНК лептоспиры в сыворотке крови методом ПЦР для серогруппы гриппотифоза – 79-й день от начала заболевания.
6. Установлено, что в сыворотках крови больных, перенесших лептоспироз, в периоде поздней реконвалесценции (к 12 месяцам) рРНК лептоспиры методом ПЦР не выявлялась, в то время как специфические антитела при РМА анализе определялись как в высоких, так и в низких титрах длительностью до 1 года у 76,9%, что следует учитывать при обследовании лиц в очагах лептоспироза, а также у лиц с лихорадкой неясного генеза в эндемичных по лептоспирозу районах.
7. Выявление рРНК лептоспиры методом ПЦР в аутопсийном материале позволяет рекомендовать метод для дополнительной верификации диагноза, в том числе и как альтернативу бактериоскопическому исследованию.
Практические рекомендации:
1. С целью ранней диагностики лептоспироза целесообразно применять метод ПЦР с определением рРНК возбудителя в сыворотке крови.
2. Метод ПЦР с определением рРНК лептоспиры в сыворотке крови можно рекомендовать использовать, начиная с первых дней заболевания и до периода ранней реконвалесценции.
3.Начиная с 3-й недели заболевания и в периоде ранней и поздней реконвалесценции, особое значение при диагностике лептоспироза следует отводить методу РМА. При обследовании лиц в очагах лептоспироза, а также лихорадящих по невыясненным причинам больных в эндемичных по лептоспирозу очагах необходимо учитывать, что специфические антитела могут выявляться через 1 год после перенесенного лептоспироза как в низких, так и в высоких титрах.
4.Полученные результаты исследований по выявлению рРНК методом ПЦР позволяют рекомендовать метод для исследования аутопсийного материала в качестве альтернативы бактериоскопическому методу.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Пантюхова Т.Н., Карань Л.С., Чуланов В.П., Важненкова Н.С., Пантюхова.А., Волчкова Е.В. Значение молекулярных и иммунологических методов в диагностике лептоспироза. // Материалы российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней».- Новосибирск 2005г. – с.140-143.
2.Пантюхова Т.Н., Карань Л.С., Чуланов В.П., Важненкова Н.С., Пантюхова Р.А., Волчкова Е.В. Лептоспироз: диагностические возможности ПЦР и РМА методов. // Материалы Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское оборудование на рубеже веков».- Алматы 2006 г. – с.79-81.
3.Пантюхова Т.Н., Карань Л.С., Чуланов В.П., Важненкова Н.С., ПантюховаР.А., Волчкова Е.В. Возможности ПЦР и РМА в диагностике лептоспироза. // Сборник тезисов VП Российского съезда врачей-инфекционистов.- Нижний Новгород 2006г. – с.98.
4.Пантюхова Т.Н., Карань Л.С., Чуланов В.П., Важненкова Н.С., Пантюхова Р.А., Иванова И.В., Волчкова Е.В., Пак С.Г. Клинические особенности и современная лабораторная диагностика лептоспироза серогруппы гриппотифоза. // Терапевтический архив.-2006.-№11.-с.44-48.
Список сокращений
АЛТ - аланиловая трансаминаза
АСТ - аспарагиновая трансаминаза
ГРС - Гепаторенальный синдром
ДВС-синдром - Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания
ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота
ИТШ - Инфекционно-токсический шок
ОПН - Острая почечная недостаточность
ОППН - Острая почечно-печеночная недостаточность
ОРДС - Острый респираторный дистресс-синдром
ПЦР - Полимеразная цепная реакция
РМА - Реакция микроагглютинации
рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота
