Диагностическая значимость метода полимеразной цепной реакции при генотипировании helicobacter pylori у детей с хронической гастродуоденальной патологией

На правах рукописи

МИШКИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ГЕНОТИПИРОВАНИИ HELICOBACTER PYLORI У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКОЙ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

14.00.09 - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена на кафедре педиатрии №2 с курсом гастроэнтерологии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Александрова Валентина Александровна

профессор

Научный консультант:

доктор медицинских наук Суворов Александр Николаевич

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Романюк Федор Петрович,

заведующий кафедрой педиатрии №3 с курсом неонатологии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

доктор медицинских наук, профессор Эрман Лев Владимирович,

заведующий кафедрой поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова»

Защита состоится « » ____________________2007 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.089.05. при ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., д. 41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образо-вания Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 195196, Санкт-Петербург, Заневский пр., д.1/82.

Автореферат разослан « » _____________ 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор В.В. Кирьянова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Хронические заболевания верхних отделов гастродуоденального тракта являются наиболее частой патологией, встре-чающейся как у взрослых, так и у детей (Мазурин А.В., Запруднов А.М.,1995). Ведущее место среди этиологических факторов развития патологии желудочно-кишечного тракта в настоящее время занимают болезни органов пищеварения, ассоциированные с Нelicobacter Рylori (HP). За прошедший период с 1983 года (Warren J.R., Marshall B.J., 1983) были изучены его свойства, описаны многие звенья патогенеза заболеваний, развивающихся при инвазии НР (Григорьев П.Я., Яковенко А.В., 2001, Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003, Chuan Z., Nobutaka Y., 2005), определены методы диагностики и оптимальные схемы лечения. Особое место занимают исследования НР-ассоциированных заболе-ваний у детей (Корсунский А.А.). Остается дискутабельным ряд вопросов, касающихся степени патогенности этого микроорганизма, особенностей пато-генеза, эпидемиологии. Еще ждут своего решения проблемы профилактики инвазии, показаний к применению антибактериальных средств у НР(+) лиц без клинических проявлений, а также у пациентов, инфицированных одновременно несколькими штаммами хеликобактера (Корсунский А.А., Щербаков П.П., Исаков В.А., 2002). Гастродуоденальные заболевания, ассоциированные с Нeli-cobacter Рylori, отличаются большим разнообразием эндоскопических, морфологических и клинических проявлений. Вопрос о том, что предопреде-ляет развитие той или иной формы заболевания, сложен и до настоящего време-ни не решен. Большинство исследователей высказывают предположение о ве-дущем значении внутривидового разнообразия штаммов данного микроба (Корсунский А.А., Щербаков П.П., 2002; Marshall B.J., 1991), генетической предрасположенности (Аруин Л.И.,1997; Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., 1997), длительности заболевания (Аруин Л.И., Григорьев П.Л., 1993), степени обсемененности НР слизистой оболочки желудка (Говорун В.М., Гущин А.Е., 2000), характера иммунного ответа (Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., 1997). В пос-леднее время во многих научных работах изучается роль особенностей мак-роорганизма в патогенезе хеликобактериоза (Циммерман Я.С.,2000, Павленко Н.В., 1999, Аруин Л.И., 2007, El Omar, 2001). Многими исследователями ведет-ся настойчивый поиск штаммов НР, специфичных для развития определенных гастродуоденальных заболеваний. Сообщения о роли различных штаммов весь-ма противоречивы (Yamaoka Y.,1999, 2006, Mahaboob A., 2001, Van Doorn L., 1998). По мнению отдельных авторов в природе не существует «ульцеро-генных» штаммов НР. Однако зарубежные и отечественные публикации (Gormally S.M., 1996, Hardicar W., 1996 Kolho K.L., 1999, Корсунский А.А., 2002, Корниенко Е.А.,1999), посвященные генотипированию хеликобактера в детском возрасте, не позволяют согласиться с подобным мнением.

В настоящее время с использованием технологии ПЦР проводится огром-ное количество молекулярно-эпидемиологических исследований НР на пред-мет присутствия в геноме специфических генов вирулентности, в которых поми-мо генов «острова патогенности», определяют присутствие определенных алле-лей гена vacA, iceA (Takahico K., Graham D.L., 2004). Крайне актуальна диаг-ностика не только наличия инфекции НР, но и молекулярно-генетических ха-рактеристик микроорганизма, так как в настоящее время именно его гене-тическим особенностям отводится ведущая роль в развитии НР-ассо-циированных заболеваний (Yamaoka Y., 2001, 2002, 2005). Все вышесказанное указывает на необходимость проведения исследования генетических осо-бенностей НР в детском возрасте и, исходя из полученных данных, определения дальнейшей тактики ведения пациента.

Цель исследования: определение специфичности генотипов Helicobacter pylori с помощью метода полимеразной цепной реакции с целью оценки их значимости в развитии определенных хронических гастродуоденальных забо-леваний у детей.

Задачи исследования:

1. Сопоставление диагностической значимости метода полимеразной цепной реакции и стандартных методов исследования НР.

2. Оценка диагностической значимости метода полимеразной цепной реак-ции для определения НР в различных биологических субстратах (биоптат, зубной налет, копрофильтрат).

3. Исследование частоты встречаемости НР у детей с хроническими забо-леваниями верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

4. Проведение генотипирования НР в биоптате слизистой оболочки желуд-ка с помощью метода полимеразной цепной реакции у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями.

5. Выявление взаимосвязи между определенными клинико-эндоскопи-ческими проявлениями и генотипами НР.

6. Исследование состояния инфицированности хеликобактером родителей обследованных детей.

7. Определение уровня устойчивости штаммов НР к кларитромицину.

Научная новизна. Доказана специфичность генотипов НР (cagAcagH-vacAs1, cagAcagHvacAs2) для развития определенных хронических гастродуо-денальных заболеваний в детском возрасте. Выявлено преобладание диагнос-тической значимости метода полимеразной цепной реакции при генотипировании НР в биоптатах СОЖ по сравнению с их определением в других биологических субстратах (зубной налет, копрофильтрат). Установлена высокая степень инфицирования НР в семьях детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями. Выявлено повышение уровня резис-тентности НР к макролидам у детей Санкт-Петербурга с хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны с помощью метода полимеразной цепной реакции.

Практическая значимость. Обнаруженная взаимосвязь определенных за-болеваний гастродуоденального тракта у детей с генотипами НР, позволяет дифференцировано подходить к лечению и прогнозу хронических заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта, ассоциированных с НР. Низкая диагностическая значимость метода ПЦР в копрофильтратах и зубных налетах исключает возможность использования этих субстратов для диагностики НР инфекции у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов ЖКТ. Инфи-цированность хеликобактером родителей является фактором риска развития НР-ассоциированных заболеваний у детей и ее установление может быть ис-пользовано для профилактики хронических гастродуоденальных заболеваний. Выбор антибактериального препарата для эрадикационной терапии должен осуществляться с учетом уровня устойчивости штаммов НР, определяемой с помощью метода ПЦР или другими методами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При генотипировании НР методом полимеразной цепной реакции у де-тей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями определяются гено-типы НР, специфичные для развития определенных хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта.

2. Низкая диагностическая значимость метода полимеразной цепной ре-акции в таких биологических субстратах, как зубной налет и копрофильтрат не позволяет использовать эти субстраты для диагностики хеликобактера в СОЖ.

3. Высокий уровень инфицированности H. pylori родителей в семьях обследованных детей способствует появлению хронических НР-ассоциирован-ных заболеваний ЖКТ у детей.

4. Относительно высокая резистентность H.pylori (22%) к препаратам групппы макролидов на примере кларитромицина, выявленная с помощью метода полимеразной цепной реакции, не позволяет использовать кларитро-мицин в схемах антихеликобактерной терапии.

Личное участие автора в проведении исследования. Самостоятельно проведен ПЦР анализ части биоптатов слизистой оболочки желудка, копро-фильтратов. Выполнен аналитический обзор отечественной и зарубежной лите-ратуры по изучаемой проблеме, проведено обобщение полученных данных, статистический анализ результатов исследования с компьютерной обработкой.

Внедрение результатов. Результаты работы внедрены в практику работы консультативно-диагностического центра для детей №2 СПбГУЗ «Городская поликлиника №23» и используются в процессе преподавания на кафедре педи-атрии №2 с курсом гастроэнтерологии ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.

Апробация работы. Основные теоретические и практические поло-жения диссертационной работы прошли апробацию на 8 Славяно-Балтийском форуме (г. Санкт-Петербург, 2006), на XIII, XIV конгрессе детских гастро-энтерологов России «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей» (Москва, 2006, 2007), на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава «Актуальные вопросы экспе-риментальной и клинической медицины-2006» (г. Санкт-Петербург, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в журнале, рекомендуемом ВАК.

Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 107 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 12 рисунками. Список литературы содержит 195 источников (отечественной - 65, иностранной - 130).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Работа проведена на базе консультативно-диагностического центра для детей №2 СПбГУЗ «Городская поликлиника №23». Всего было обследовано 179 детей в возрасте 7-18 лет с хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны. У всех детей прове-дено общеклиническое обследование – фиброгастродуоденоскопия (ФГДС) с биопсией слизистой оболочки желудка (СОЖ) из антрального отдела и тела, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, гастроимпе-дансометрия, осмотры врачей-специалистов. Выраженность проявлений основ-ных синдромов – болевого, диспептического и астеновегетативного, оценивали по 3-балльной шкале. При лабораторном обследовании определяли показатели клинического анализа крови, анализ мочи, копрограммы, исследование на глистно-паразитарную инвазию, по показаниям – биохимическое исследование крови с определением белковых фракций, общего билирубина, холестерина, щелочной фосфатазы.

Диагностику НР-инфекции проводили с использованием комплекса инва-зивных и неинвазивных методов. Уреазную активность НР in vitro исследовали у 179 детей с помощью быстрого уреазного теста (HELPIL-test) производства ООО «Синтана», Санкт-Петербург. Результат при постановке уреазного теста расценивали как положительный при изменении окраски на 1-й (+++), 2-й (++) и 3-й (+) минутах. Гистологическое исследование биоптатов слизистой оболочки антрального отдела (174) и тела (157) желудка проводили в патоморфологической лаборатории ДГБ №5. Для исследования брали 2 биоп-тата, фиксировали материал в 10% растворе формалина, заключали в парафин и делали срезы. Проведение метода полимеразной цепной реакции в биоптатах СОЖ антрального отдела (177) и тела желудка (154) осуществлялось в лабора-тории НИИ Экспериментальной Медицины РАМН. ДНК определяли наборами реагентов «ООО Интерлабсервис», «Литех». Амплификацию проводили в при-боре «Терцик». Затем продукты амплификации идентифицировали в 1,5% ага-розном геле в присутствии бромида этидия.

Полученные в ходе работы результаты регистрировались автором в спе-циально разработанных таблицах, включающих данные анамнеза жизни, осо-бенности клинического течения, данные эндоскопического, лабораторного и инструментального обследования, а также результаты обследования родителей пациентов. Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывались c использованием модулей системы STATISTICA for Windows (версия 5.5). Различия считались достоверными при р 0,05.

Результаты собственных исследований. В настоящем исследовании под наблюдением находилось 179 детей в возрасте 7-18 лет с хроническими забо-леваниями желудка и двенадцатиперстной кишки. Средний возраст обследо-ванных детей составил 13,4±0,2 года, среди них - 96 мальчиков и 83 девочки. Длительность анамнеза заболевания составила в среднем 3,9 года. При обсле-довании у наших пациентов были выявлены следующие нозологические формы: хронический гастродуоденит (ХГД) – 148, эрозивный гастродуоденит (ЭГД) – 21, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) – 10.

Следует отметить, что различные методы диагностики НР в нашем исследовании (быстрый уреазный тест, гистологический метод) демонстри-ровали различную частоту выявления НР-инфекции. Поэтому, окончательное заключение о НР-статусе проводили с учетом оценки результатов ПЦР в биоп-тате слизистой оболочки антрального отдела желудка, который был принят за эталон.

Хеликобактерная инфекция была выявлена у 75,7% (69,281,7) пациентов методом ПЦР в биоптатах слизистой оболочки желудка антрального отдела. По результатам проведения быстрого уреазного теста в биоптатах СОЖ, ин-фекция НР была обнаружена у 140 из 179 детей (78%). Совпадение результатов уреазного теста и метода ПЦР составило 72,8% (66,1 79,1). Количество лож-ноположительных значений уреазного теста - 14,6%, что, вероятно, можно объяснить присутствием в слизистой оболочке других уреазопродуцентов. Ко-личество ложноотрицательных значений – 12,4%, что, возможно, является следствием недостаточной обсемененности биоптата слизистой оболочки. Гис-тологический метод исследования был выполнен у 174 детей, положительный результат метода бы отмечен у 132 детей, что составило 75%. Совпадение результатов гистологического метода и ПЦР наблюдалось в 78,4% (72,2 84,2) случаев. Количество ложноположительных значений составило 10,4%, коли-чество ложноотрицательных–11%. Таким образом, по нашим данным диагнос-тическая значимость этих методов выявления НР в СОЖ сопоставима, но сле-дует отметить, что гистологический метод является более точным (больший процент совпадения результатов), кроме того, он дает информацию о состо-янии слизистой оболочки желудка.

При обследовании у всех детей тщательно оценивались клинические симп-томы (болевой, диспептический, астено-вегетативный), а также данные анам-неза (возрастные особенности, наследственность). Результаты сравнительного анализа частоты и выраженности основных клинических симптомов у НР(-) и НР(+) пациентов приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Частота различной степени выраженности болевого синдрома среди НР- позитивных и НР-негативных пациентов.

НР-статус Степень выра- женности синдрома	НР-негативные Пациенты	НР-позитивные Пациенты
«+»	63,1%**	36,9%
«++»	20,75%	79,2%*
«+++»	17,65%	82,35%*

** различия между группами НР(-) и НР(+), р0,01, * - р 0,05

Болевой абдоминальный синдром у большинства НР(-) детей был представлен как слабо выраженный, а в группе НР(+) детей этот синдром достоверно чаще встречался как умеренно или сильно выраженный (р 0,05).

У большей части пациентов проявления диспептического синдрома также были умеренными, однако, частота и выраженность диспептических проявлений не зависела от наличия НР-инфекции (р 0,05). Следует отметить, что выраженность балльной оценки клинической симптоматики по основным синдромам не зависела от степени тяжести поражения СОЖ (р 0,05).

При изучении данных анамнеза мы определяли зависимость инфи-цирования НР от возраста и отягощенной наследственности по язвенной бо-лезни. Как оказалось, в младшей и средней возрастных группах достоверных различий в уровне инфицированности детей хеликобактером выявлено не было. У детей старшей возрастной группы (14-18 лет) наблюдалось достовер-ное повышение уровня НР инфекции, что согласуется с литературными данными об увеличении частоты инфицирования хеликобактериозом с возрастом (Biecker U.,1997, Fall C.H.,1997).

Анализ влияния наследственности по язвенной болезни и хроническим эрозивным гастродуоденитам на частоту НР инфицирования у детей, представлен в таблице 2.

Таблица 2

Частота наследственной отягощенности по язвенной болезни у обследованных детей в зависимости от НР-инфицирования.

НР-статус Наслед-ть	НР(+)%	НР(-)%
Не отягощена	24,26	58,1
Отягощена	75,2 *	41,9

* различия между группами НР(-) и НР(+), (р 0,05)

Было установлено, что в группе НР-негативных пациентов наслед-ственность была отягощена у 41,9% детей, в то время как у НР-позитивных пациентов наследственность по язвенной болезни встречалась достоверно чаще и составила 75,2%. Эти данные подтверждают значение наследственности как важного этиологического фактора в развитии хронической патологии ЖКТ (Климанская Е.В., 1997, Можейко А.Г., 1999, Щербаков П.Л., 1999).

К настоящему времени, хорошо изучены эндоскопические и гисто-логические изменения СОЖ желудочно-кишечного тракта при НР–инфициро-вании. У большинства детей при эндоскопии обнаруживаются нодулярные элементы в антральном отделе желудка, а также эрозивно-язвенные дефекты СОЖ. Данные о частоте эндоскопических изменений гастродуоденальной слизистой у обследованных нами детей представлены в таблице 3. Среди НР (-) детей достоверно чаще наблюдались поверхностные повреждения или отсут-ствие эндоскопической патологии слизистой оболочки (р 0,05). В группе НР(+) детей достоверно чаще встречались гиперпластические и эрозивно-язвенные повреждения СОЖ.

При поверхностном гастродуодените НР-инфекция обнаруживалась у 54,3% пациентов, в то время, как при нодулярном гастродуодените – у 92%. Наличие эрозий и язвенных дефектов было ассоциировано с НР-инфици-рованием в 86% и 70%, соответственно. Таким образом, наши результаты пол-ностью совпали с литературными данными о тесной взаимосвязи НР-инфи-цирования и развития нодулярных, эрозивно-язвенных изменений СОЖ (Иса-ков В.А., Домарадский И.В., 2003, Chuan Z., Nobutaka Y.,2005, Суворов А.Н., Симаненков В.И.,2006) (таблица 3).

Таблица 3.

Частота НР-инфицирования при различных формах гастродуоденальных заболеваний у детей.

Патология НР		Норма	ПГД	НГД	ГД с МН	ЭГД	ЯЯБ
HP(+)	N	7	19	68	15	18	7
	%	41,2	54,3	91,9*	75*	85,7	70
HP(-)	N	10	16	6	5	3	3
	%	58,8	45,7	8,1	25	14,3	30

* различия между НР(-) и НР(+) группами, ( р 0,05)

Частота встречаемости эндоскопических изменений у НР-негативных детей представлена в таблице 4. По данным нашего исследования, при отсутствии инфекционного агента в СОЖ, эрозивно-язвенные повреждения наблюдаются лишь у 13,8% пациентов, что также согласуется с современными литературными данными (Исаков В.А., Домарадский И.В.,2003).

Как известно, наиболее точным методом диагностики гастритических изменений в слизистой оболочке желудка является морфологический метод. Мы сопоставили эндоскопические изменения, а также степень активности и воспаления при гистологическом исследовании (таблица 5). Следует отметить, что у пациентов без эндоскопических изменений в 100% случаев при гистологическом исследовании были обнаружены изменения, характерные для хронического гастрита (выраженные активность и воспаление). Таким образом, эндоскопический метод диагностики не дает полной информации о состоянии слизистой оболочки желудка.

Таблица 4

Частота эндоскопических изменений у НР-негативных детей.

НР- статус Энд. изменения	НР-негативные дети
	N (43)	%
Без патологии (по ФГДС)	10	23,2*
Поверхностный ХГД	16	37,21*
Нодулярный ГД	6	13,95
ГД с моторными нарушениями	5	11,6
ЭГД	3	6,9
ЯБДПК	3	6,9

* различия в группе НР(-), (р 0,05)

Таблица 5.

Частота эндоскопических изменений СОЖ в зависимости от степени активности и воспаления.

Гистол. Исслед. Энд. Изменения	Активность		Воспаление
	Слабо выражена	значительно выражена	Слабо выражено	значительно выражено
ПГД	2,8	97,1	20	80
Норма	-	100	27,7	72,2
НГД	-	100	2,8	97,1
ГД с МН	-	100	15,7	84,2
ЭГД	-	100	4,7	95,2
ЯБ 12пк	-	100	10	90

У обследованных детей были выявлены сопутствующие заболевания такие как, дискинезия желчевыводящих путей, различные нарушения осанки, аллергические заболевания, нарушения ритма сердца и проводимости, а также глистные инвазии (таблица 6). Наиболее частой сопутствующей патологией у обследованных детей были дискинезии желчевыводящих путей, глистно–протозойные инвазии, а также нарушения осанки.

Таблица 6

Частота сопутствующей патологии у обследованных детей.

Сопутствующая патология	Число детей
	N	%
ДЖВП	179	100
Нарушения осанки	107	59,8
Аллергические заболевания	4	2,3
Глистные инвазии	132	75
Патология ССС	6	3,4

Большое значение имеет проведение генотипирования НР и исследование взаимосвязи генотипов с различными клинико-морфологическими изменени-ями СОЖ. С помощью метода ПЦР мы провели генотипирование 143 НР-позитивных детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями (рис.1). Среди обследованных детей выявились следующие генотипы vacAs1 (1), vacAs2 (2), cagAvacAs1 (3), cagAcagH (4), cagA (5), cagAcagHvacAs1 (6), cagAcagHvacAs2 (7), cagAvacAs2 (8), cagHvacAs1 (9), cagHvacAs2 (10). Для определения значимости различных генотипов хеликобактера в развитии пато-логических изменений в слизистой оболочке желудка большое значение имеет частота их встречаемости у детей. Из диаграммы отчетливо видно преобладание у детей генотипа cagAcagHvacAs1 (6). Было важно установить взаимосвязь определенного генотипа с эндоскопическими, морфологическими изменениями и выявить существование специфических генотипов для развития определенных заболеваний верхних отделов ЖКТ в детском возрасте. Анализ эндоскопических изменений СОЖ у детей с различными генотипами показал, что при поверхностных поражениях слизистой оболочки наблюдались все десять генотипов (рис.1). Преобладали 1 (vacAs1) и 2 (vacAs2) генотипы, в то время, как при нодулярных изменениях, достоверно чаще обнаруживались генотипы cagAcagHvacAs1 (6) и cagAcagHvacAs2 (7) (29% и 16% соответственно), наряду с остальными генотипами (рис.2).

Рис.1. Частота встречаемости различных генотипов у обследованных детей.

У детей с эрозивным хроническим гастродуоденитом количество определяемых генотипов НР было меньшим (6), достоверно чаще мы также наблюдали 6 генотип (cagAcagHvacAs1) (рис.3). При язвенных дефектах наблюдалось всего два генотипа НР, и генотип cagAcagHvacAs1 (6) встречался также достоверно чаще (рис. 4).

Таким образом, данное исследование показало, что при генотипе cagAcagHvacAs1 достоверно чаще встречаются нодулярные, а также эрозивно-язвенные дефекты СОЖ, что позволяет говорить о специфичности данного ге-нотипа для развития определенных изменений в слизистой оболочке желудка, а, следовательно, и для развития определенных гастродуоденальных заболеваний в детском возрасте.

Рис.2 Частота встречаемости генотипов при нодулярном гастродуодените.

В научной литературе в последнее время все чаще появляются работы, опровергающие существование «ульцерогенных» штаммов НР (Циммерман Я.С., 2006). Результаты нашего исследования позволяют сомневаться в категоричности такого утверждения, особенно при НР-инфицировании в детском возрасте. Необходимо отметить, что присутствие обоих маркеров острова патогенности (cagA, cagH) в геноме НР у обследованных пациентов указывает на то, что только полноценный остров патогенности является условием для развития более тяжелого патологического процесса в СОЖ.

При анализе морфологических изменений у НР(+) детей выявлена взаи-мосвязь степени выраженности воспаления и активности процесса с определенными генотипами НР. При поверхностных повреждениях слизистой оболочки воспаление и активность были слабо выражены. При нодулярных изменениях чаще наблюдались более выраженные воспаление (43%) и активность (63%) процесса. У детей с эрозивными изменениями СОЖ высокая степень воспаления и активности процесса наблюдались у 65% и у 95% больных соответственно.

Рис.3 Частота встречаемости генотипов при эрозивном гастродуодените

Рис.4. Частота встречаемости генотипов при ЯБДК.

При язвообразовании воспаление и активность процесса, соответствующие значительно выраженным, были обнаружены у 60 и 90% детей. Следовательно, у пациентов с нодулярными, эрозивно-язвенными изменениями СОЖ досто-верно чаще имеют место выраженные морфологические изменения, что подтверждает литературные данные (Нургалиева Б.К., 2004).

Известно, что НР может быть выявлен не только из антрального отдела, но и из тела желудка. При этом выявляются неодинаковые генотипы хелико-бактера (Russmann H., Kempf V.A., 2001). Это может стать причиной неудач-ных попыток лечения НР у детей с хронической гастродуоденальной патоло-гией. Поэтому в данном исследовании мы проводили определение Нelicobacter Pylori не только в антральном отделе, но и в теле желудка. Получены положи-тельные результаты определения НР в теле желудка у 80% пациентов. При ис-пользовании метода ПЦР, появилась возможность сравнить генотипы, выде-ляемые из антрального отдела и тела желудка. У 12% детей из числа обследо-ванных, мы обнаружили одновременное выделение двух генотипов хели-кобактера, что свидетельствует о нахождении в СОЖ более одного штамма НР. Таким образом, учитывая полученные данные, необходимо при обследовании больных проводить определение НР и в антральном отделе, и в теле желудка. С одной стороны, одновременная контаминация СОЖ более чем одним штаммом НР может явиться причиной неудачной терапии, а также реинфицирования. С другой стороны, до сих пор неизвестно, может ли инфекция смешанной культурой хе-ликобактера увеличить риск серьезных клинических проявлений, таких как язва или рак желудка. Остается также открытым вопрос о подходе к лечению таких пациентов (Корсунский А.А., П.Л. Щербаков, 2003).

В настоящее время активно ведется поиск неинвазивных методов диаг-ностики НР. У взрослых пациентов метод ПЦР проводится в зубном налете, копрофильтрате. Мы проводили выявление НР у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов ЖКТ в таких же субстратах, как зубной налет и копрофильтрат. С помощью метода ПЦР хеликобактер в зубном налете детей с гастродуоденальными заболеваниями определялся в 27,9% случаев. Учитывая разное количество зубного налета в различные возрастные периоды, мы пытались найти различия в частоте обнаружения НР в зубном налете в зависимости от возраста. Наблюдалась тенденция к увеличению частоты обнаружения НР у детей старше 10 лет, но результаты оказались недосто-верными. Частота совпадения результатов выявления НР из биоптатов антраль-ного отдела желудка и из зубного налета составила 43,2%. Подобные результаты проведения ПЦР по выявлению НР в зубном налете, которые наблюдаются во многих исследовательских работах, на настоящий момент рассматривается скорее, как аргумент в пользу несостоятельности попыток выявления НР из ротовой полости, чем в пользу того, что сама ротовая полость является резервуаром этого микроорганизма (Gerguson D., 1993). В копро-фильтрате методом ПЦР хеликобактер определялся также у небольшого коли-чества детей - 27,3%. Частота совпадений результатов определения НР в биоп-татах антрального отдела и копрофильтрата составила 43,8%. Возможно этот факт объясняется тем, что при пассаже по кишечнику НР превращается в кокковидную форму или погибает, начинает выделять другие антигены (Suzuki N.,2002). В результате он не обнаруживается стандартным набором праймеров. Следовательно, из-за низкой чувствительности метода ПЦР в зубном налете и копрофильтрате не представляется возможным на настоящий момент пользоваться данными субстратами для выявления инфицированности НР, а также для контроля за эффективностью эрадикации.

С целью выявления семейной инфицированности и ее значения в развитии заболеваний было обследовано 128 родителей из семей больных детей. Исследования показали, что хеликобактер был обнаружен у 78% родителей, причем чаще у одного (91%) родителя и только в 9% случаев – у двух роди-телей. Особого интереса заслуживают данные, полученные при анализе НР- статуса детей в таких семьях (рис.5). У НР-негативных родителей частота выявления НР-положительных детей составила 50%. При инфицировании хеликобактером одного из родителей, частота выявления НР-позитивных детей составила 90%. В семьях, где были инфицированы оба родителя, по нашим данным все дети также были НР инфицированы. Следовательно, при выделении хеликобактера от обоих родителей, по данным нашего исследования, дети будут всегда инфицированы. Таким образом, подтверждаются литературные данные о значении внутрисемейного пути передачи НР-инфекции (Щербаков П.Л., 2006).

Рис.5 Частота инфицирования НР в семьях обследованных детей.

Современные международные рекомендации предусматривают проведение медикаментозной терапии НР-инфекции по схемам, содержащим ингибитор протонной помпы и два антибактериальных препарата, направленных на эрадикацию хеликобактера. В связи с частым выбором кларитромицина, как антибиотика 1-й линии терапии НР инфекции, представляло интерес проана-лизировать чувствительность выделенных штаммов хеликобактера к этому антибиотику. Использование метода ПЦР в сочетании с рестрикционным анализом (ПДРФ) дает возможность эффективно выявлять точковые мутации в гене 23 рРНК и может служить надежным инструментом определения устой-чивых к кларитромицину штаммов, что позволит выбрать средство для эради-кационной терапии более эффективно. Были обследованы 45 пациентов с целью выявления мутаций в гене 23 рРНК. В нашем исследовании у 10 детей были обнаружены штаммы НР, устойчивые к кларитромицину, что составило 22% (таблица 7).

Использование кларитромицина в терапии 1-й линии, согласно 3–ему Маастрихтскому соглашению, имеет смысл только в том случае, если первичная устойчивость к этому антибиотику составляет менее 15-20%.

Таблица 7

Определение чувствительности штаммов НР к кларитромицину.

Штаммы НР	Число детей
	N	%
0	2	4,4
Чувств. к клари- тромицину	33	73,3
А2142	3	6,7
А2143	6	13,3
Т2717	1	2,3
Всего	45	100

Следовательно, обнаруженный нами уровень устойчивости штаммов НР к кларитромицину, делает нецелесообразным включение антибиотиков ряда макролидов в терапию хеликобактериоза у детей с хронической гастродуоденальной патологией Санкт-Петербурга.

ВЫВОДЫ.

1. Метод полимеразной цепной реакции является высокоэффективным методом диагностики хеликобактера и его генотипирования с целью выявле-ния наиболее вирулентных штаммов H.pylori.

2. Распространенность НР-инфекции среди детей с хроническими гастро-дуоденальными заболеваниями, определяемая методом ПЦР в СОЖ, составила 75,7 %.

3. При генотипировании у детей с НР-ассоциированными хроническими гастродуоденальными заболеваниями достоверно чаще определялись гено-типы: cagAcagHvacAs1, cagAcagHvacAs2. При наиболее тяжелых морфологи-ческих формах гастродуоденитов (нодулярных, эрозивно-язвенных) достовер-но чаще выявлялся генотип cagAcagHvacAs1, что может свидетельствовать о специфичности данного генотипа для развития определенных гастродуо-денальных заболеваний.

4. При сопоставлении диагностической значимости инвазивных методов определения НР в СОЖ, при условии взятия ПЦР за эталон, диагностическая значимость гистологического исследования составила - 78,4%, а быстрого уреазного теста – 72,8%

5. Низкая чувствительность метода ПЦР в зубном налете и копро-фильтрате не позволяет пользоваться данными субстратами для определения НР-инфицированности СОЖ и контроля за эрадикацией.

6. Инфицированность хеликобактером детей в семьях, где один или оба родителя НР(+), составила 90% и 100% соответственно.

7. Уровень устойчивости к кларитромицину выделенных штаммов НР сре-ди детей Санкт-Петербурга составил 22%, что делает нецелесообразным приме-нение препаратов группы макролидов в схемах антихеликобактерной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. С целью выявления вирулентного штамма НР для целенаправленного ведения пациентов рекомендуется проводить его генотипирование с помощью метода полимеразной цепной реакции.

2. Для диагностики НР и контроля за эрадикацией хеликобактер целе-сообразно определять в биоптатах СОЖ антрального отдела и тела желудка.

3. В случае отсутствия патологии при эндоскопическом исследовании, особенно у НР-инфицированных пациентов, необходимо обязательное прове-дение гистологического метода для более точного определения изменений слизистой оболочки желудка.

4. При выявлении генотипа НР cagAcagHvacAs1 у детей с хронической гастродуоденальной патологией следует немедленно проводить эрадикационную терапию, согласно рекомендациям Маастрихт-3.

5. Необходимо проводить обследование детей НР-инфицированных ро-дителей для выявления у них хеликобактера методом полимеразной цепной реакции или другими стандартными методами определения НР.

6. При назначении эрадикационной терапии у детей Санкт-Петербурга с НР-ассоциированными хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны не рекомендуется использовать антибиотики из группы макролидов, в связи с уровнем резистентности, превыщающим 20%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осипов К.В. Генетический анализ устойчивости к кларитромицину штаммов Н.pylori, изолированных у детей, проживающих в Санкт-Петербурге / К.В.Осипов, Т.Г.Зачепило, М.А.Суворова, А.Н.Суворов, Т.В.Мишкина// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга: материалы 8 Славяно-Балтийского форума – 2006. - №1-2 –- С. 114-115.

2. Мишкина Т.В. Новые возможности полимеразной цепной реакции при генотипировании НР у детей с хроническими гастродуоденальными заболе-ваниями/ Т.В.Мишкина, В.А.Александрова, А.Н.Суворов// Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины-2006: сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых и специалистов СПбМАПО - СПб., 2006 – С. 207

3. Мишкина Т.В. Возможности метода полимеразной цепной реакции в диагностике НР – ассоциированных заболеваний у детей/ Т.В.Мишкина, В.А.Александрова, А.НСуворов //Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей: материалы XIII конгресса детских гастроэнтерологов России – М., 2006. – С.237-238.

4. Мишкина Т.В. Диагностика НР у детей с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта методом полимеразной цепной реакции/ Т.В.Мишкина, В.А.Александрова, А.Н.Суворов //Актуальные проблемы абдоминальной патологи и у детей: материалы XIV конгресса детских гастроэнтерологов России – М., 2007. – С.159-160.

5. Мишкина Т.В. Полимеразная цепная реакция в диагностике хели-кобактерной инфекции у детей/ Т.В.Мишкина, В.А.Александрова, А.Н.Суворов // Врач. - 2007. - №7. – С. 74-76.