Методические аспекты оценки суммарной антиоксидантной активности пищевых продуктов в условиях in vitro с использованием интегральных показателей состава

На правах рукописи

Чупрынина Дарья Александровна

МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОЦЕНКИ СУММАРНОЙ

АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

В УСЛОВИЯХ in vitro С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНТЕГРАЛЬНЫХ

ПОКАЗАТЕЛЕЙ СОСТАВА

02.00.02 – аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Краснодар - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный университет», г. Краснодар

Научный руководитель:	доктор химических наук, доцент Цюпко Татьяна Григорьевна
Официальные оппоненты:	Рувинский Овсей Евелевич, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры химии, метрологии и стандартизации ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный технологический университет»
	Якуба Юрий Федорович кандидат технических наук, заведующий проблемно-исследовательской лабораторией ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакдемии
Ведущая организация:	ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет»

Защита состоится 26 декабря 2013г. в ауд. 3030Л в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.101.16 в ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный университет» по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО

«Кубанский государственный университет» по адресу: 350040, г. Краснодар,

ул. Ставропольская, 149.

Автореферат разослан 23 ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Наталия Владимировна Киселева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В пищевой, косметической и фармацевтической промышленности одним из приоритетов является обеспечение качества и полезных свойств выпускаемой продукции. С этой точки зрения, особого внимания заслуживают обнаружение, контроль содержания и исследование свойств антиоксидантов, то есть веществ, проявляющих восстановительные свойства и способных связывать свободные радикалы, тем самым улучшая свойства продукта. Антиоксидантами являются, в частности, фенольные соединения, витамины, некоторые карбоновые кислоты и аминокислоты. Антиоксидантная активность (АОА) пищевых продуктов является одним из показателей, определяющих их биологическую ценность. К сожалению, единое понимание термина «антиоксидантная активность» еще не выработано. В последние годы и в научной периодике, и в средствах массовой информации опубликовано много материалов по антиоксидантной активности пищевых продуктов, однако эти сведения часто имеют противоречивый характер. Проблема в том, что для количественной оценки АОА в условиях in vitro разные авторы применяют разные индикаторные системы, используют разнотипные и нестандартизованные методики, нередко плохо воспроизводимые, длительные и трудоемкие. Механизмы взаимодействия индикаторных систем с антиоксидантами также различны. Формируемые при этом аналитические сигналы характеризуются разной природой, а получаемые результаты имеют неодинаковые размерности, что затрудняет их сопоставление. Кроме того, неясен вклад отдельных групп восстановителей в суммарный показатель антиоксидантной активности.

Очевидно, в этой области аналитической химии необходимы систематические исследования. Необходим общий методический подход к разработке интегральных показателей, характеризующих антиоксидантную активность пищевых продуктов. Поскольку показатели АОА обычно выражают в пересчете на стандартное вещество, особое внимание должно уделяться обоснованному выбору этого вещества. Следует повысить правильность и воспроизводимость результатов анализа, а, следовательно, достоверность оценки качества пищевых продуктов.

Работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-03-96529)

Цель работы. Разработка, проверка и изучение взаимосвязи интегральных показателей состава, характеризующих суммарную антиоксидантную активность пищевых продуктов.

Для достижения этой цели в работе решались следующие задачи:

• обоснование общего алгоритма разработки интегральных показателей, характеризующих суммарную антиоксидантную активность пищевых продуктов;
• выявление взаимосвязи показателей АОА и суммарного содержания антиоксидантов;

• оптимизация условий измерения обобщенных аналитических сигналов, проверка их аддитивности и выбор стандартных веществ;
• сопоставление информативности разных показателей АОА и выявление их взаимосвязи;
• исследование взаимосвязи показателей АОА и других показателей состава пищевых продуктов.

Научная новизна.

• Предложены единый методический подход к разработке показателей, характеризующих суммарную антиоксидантную активность и алгоритм исследований, необходимых для разработки новых и проверки применимости известных показателей АОА пищевых продуктов.
• Сопоставлены и изучены погрешности оценки суммарного содержания антиоксидантов с помощью разных показателей АОА. Сопоставлены результаты, полученные при изучении одних и тех же пищевых продуктов с помощью разных показателей АОА после их оптимизации.

Практическая значимость.

• Оптимизированы методики определения некоторых показателей АОА. Уточнены области применимости метода FRAP и метода Фолина-Чокальтео как способов оценки АОА пищевых продуктов.
• Разработана методика МУ 08-47/275 «Спектрофотометрический метод измерений антиоксидантной активности пищевых продуктов», внесенная в Федеральный реестр методик измерений под № ФР.1.31.2011.09197.

Результаты диссертационной работы используются в образовательном процессе ФГБОУ ВПО «КубГУ» в рамках курса «Современные методы испытаний и сертификации» по направлению подготовки 221700.62.

На защиту выносятся:

• Единый методический подход к разработке интегральных показателей, характеризующих суммарную антиоксидантную активность пищевых продуктов, алгоритм соответствующих методических исследований, а также теоретические обоснования этого алгоритма.
• Результаты исследования модельных систем, включающих индивидуальные антиоксиданты и их смеси, при измерении ряда показателей АОА.
• Результаты исследований формирования аналитического сигнала при определении АОА с использованием различных индикаторных систем.
• Оценки АОА реальных объектов со сложной переменной матрицей.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Волгоград, 2011); III Всероссийском симпозиуме с международным участием «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (г. Краснодар, 2011), VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (г. Санкт-Петербург, 2012), Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием (г. Краснодар, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы сделано 8 публикаций, в том числе 5 тезисов докладов и 3 статьи в рецензируемых журналах, включенных в Перечень ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация представляет собой рукопись, изложенную на 153 страницах, состоящую из введения, 3 глав и выводов. Список использованной литературы включает 219 наименований. Диссертация иллюстрирована 34 рисунками, 33 таблицами.

Во введении обоснована актуальность темы, определены цели и задачи исследования, охарактеризованы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (обзор литературы) рассмотрены способы оценки антиоксидантной активности, их классификация и применимость. Особое внимание уделено методу FRAP, широко используемому для оценки АОА пищевых продуктов. Обсуждаются погрешности определения суммарных показателей состава многокомпонентных смесей, а также стабильность результатов анализа.

Во второй главе охарактеризованы методы исследования, средства измерений, описаны условия и методики эксперимента.

В третьей главе изложены результаты проведенных исследований, обсуждаются полученные результаты.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Алгоритм разработки интегральных показателей, характеризующих суммарную антиоксидантную активность пищевых продуктов

При оценке качества пищевых продуктов по суммарным (интегральным) показателям аналитический сигнал создается однотипными веществами, родственными в структурном или функциональном отношении. Для этого целесообразно выбрать условия анализа, обеспечивающие приблизительно равную степень взаимодействия этих веществ с индикаторной системой. Выполнение этого требования приведет к сближению (в идеальном случае – равенству) определяемого показателя и суммарного содержания соответствующих веществ (аналитов). В таком случае результаты оценки АОА одного и того же продукта с помощью разных индикаторных систем и разных способов измерения сигнала совпадут друг с другом, а результаты исследования разных продуктов будут легко сопоставимы. Этому препятствуют несколько факторов, которые следует учитывать при разработке новых и использовании известных интегральных показателей:

1. разная чувствительность определения индивидуальных аналитов;

2. неаддитивность обобщенного аналитического сигнала;

3. неоптимальный выбор стандартного вещества;

4. нестабильность результатов анализа (случайные погрешности).

В связи с этим целесообразно выработать некоторый алгоритм, позволяющий проверить интегральный характер и корректно определять любой показатель АОА, минимизировав влияние вышеперечисленных факторов. Теоретической основой для разработки такого алгоритма стали совместные исследования аналитиков КубГУ и ОмГУ (Цюпко Т.Г., Николаева Н.А., Вершинин В.И., Власова И.В.), в работах которых было показано, что интегральный показатель с* (например, показатель АОА) является приближенной и субъективной (зависящей от выбора Хст) оценкой суммарного содержания аналитов (с), а разность с = (с* - с ) - систематической погрешностью этой оценки. Коэффициенты чувствительности (Ki) при определении однотипных аналитов, как правило, различаются, причем некоторые Ki достоверно отличаются от коэффициента Kст, характеризующего стандартное вещество, что и приводит к возникновению вышеуказанных погрешностей. Можно прогнозировать абсолютную (с) и относительную (с) погрешности оценки АОА, выраженной в пересчете на некоторое стандартное вещество Хст вне зависимости от его присутствия в пробе:

с = с* - с = с ( - 1), (1а)

с = - 1, (1б)

где сi – концентрация i-го аналита в смеси; pi = Кi/ Кст – относительная величина коэффициента чувствительности i-го аналита, Ri= сi/ с, –значение концентрации i-го аналита, нормированное по суммарной концентрации однотипных аналитов в исследуемой смеси.

Развивая эти представления, можно сформулировать общий методический подход к разработке интегральных показателей состава, который включает изучение чувствительности определения разных аналитов, проверку аддитивности обобщенного аналитического сигнала, нивелирование коэффициентов чувствительности соответствующих аналитов, обоснованный подбор стандартного вещества из числа аналитов (или их смесей), проецирование полученных результатов на реальные объекты и сравнение разрабатываемого показателя с аналогичными характеристиками объектов, полученными другими методами.

Конкретизируя этот подход для показателей АОА, мы предложили алгоритм методических исследований, включающий последовательное выполнение следующих операций:

а) предварительное выявление индивидуальных АО (восстановителей), которые, с одной стороны, входят в состав исследуемого объекта (пищевого продукта) и определяют его качество, с другой, способны реагировать с растворами реагентов-окислителей. Подбор модельных соединений следует проводить по литературным данным о составе пищевых продуктов и свойствах индивидуальных АО;

б) подбор индикаторной системы на основе редокс-потенциала реагента, способной формировать обобщенный аналитический сигнал всех выявленных соединений-антиоксидантов с учетом устойчивости растворов, условий и скорости его взаимодействия с выбранными АО;

в) оптимизация условий измерения обобщенного сигнала (прежде всего по Сmin модельных соединений, а также по сходимости, области линейности, времени анализа и другим характеристикам методики);

г) проверка аддитивности сигнала в оптимизированных условиях и, при необходимости, уточнение этих условий для обеспечения аддитивности;

д) выбор стандартного вещества, удовлетворяющего требованиям - в найденных условиях Хст должно определяться со средней чувствительностью (из всех модельных соединений), при этом стехиометрические коэффициенты его взаимодействия с индикаторной системой должны быть известны или специально определены;

е) оценка степени различия между показателем АОА, найденным для ряда модельных смесей антиоксидантов в пересчете на выбранное стандартное вещество и суммарным содержанием этих соединений (в ммоль-экв/дм3) в тех же смесях. Рассматривая эти различия как погрешности оценки суммарного содержания антиоксидантов, необходимо убедиться, что эта разность пренебрежимо мала, т.е. показатель АОА корректно оценивает суммарное содержание антиоксидантов. При проявлении существенных различий коэффициентов чувствительности необходимо найти причину этого явления и устранить ее;

ж) проверка применимости разработанной методики к реальным объектам (пищевым продуктам данного типа). Следует убедиться, что найденные значения показателя АОА этих продуктов коррелируют с другими показателями их состава, заведомо связанными с АОА (например, содержанием антоцианов в винах), а также другими (ранее принятыми) показателями АОА.

Апробацию предложенного алгоритма проводили, используя следующие показатели антиоксидантной активности:

1. спектрофотометрическое определение методом FRAP с индикаторной системой Fe(III) – о-фенантролин;

2. спектрофотометрическое определение содержания фенольных веществ по Фолину-Чокальтео;

3. показатель АОА, определенный методом потенциометрии с медиаторной системой K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6] [Брайнина Х.З. и сотр.].

Объектами исследования были индивидуальные антиоксиданты фенольной природы (кверцетин (КВ), рутин (РТ), катехол (пирокатехин, КТ), эпикатехин (ЭП), галловая (ГК), феруловая (ФК), протокатеховая (ПКК), мочевая (МК), кофейная (КК) кислоты) и нефенольной природы (аскорбиновая кислота (АК), цистеин (ЦИСТ)) квалификации осч., х.ч., ч.д.а. и их модельные смеси, а также реальные объекты со сложной матрицей (красные вина, чаи, приобретенные в торговой сети, и оригинальные образцы вин от производителей).

Определение показателя «суммарное содержание фенольных веществ» (метод Фолина-Чокальтео)

Определение суммарного содержания веществ фенольной природы (ВФП) методом Фолина-Чокальтео широко используется при анализе вин, фруктовых соков и других пищевых продуктов, а также настоек и отваров лекарственных трав. Исследований, посвященных изучению интегрального характера этого показателя, крайне мало, поэтому использование вышеизложенного алгоритма могло дать практически важные результаты, вплоть до оптимизации методики измерения этого показателя.

Проверка показала, что продукты реакции разных ВФП с реактивом Фолина-Чокальтео (смесь H7[P(W2O7)] и H7[P(Mo2O7)6]) имеют однотипные спектры поглощения. В области 730 – 780 нм наблюдаются наибольшие аналитические сигналы (оптические плотности). Качественный состав окрашенных продуктов реакции по мере её протекания не меняется и практически не зависит от природы восстановителя, что подтверждено корреляционным анализом полученных спектров (r0.900). Увеличение температуры в диапазоне от 25 до 45 °С при колебаниях ±1°С влияет на величины аналитического сигнала лишь в пределах погрешности измерений. Изменение аналитического сигнала при введении в реакционную смесь индифферентного электролита (NaClO4) незначительно в диапазоне от 0,02 до 1 моль/дм3, что позволяет не учитывать ионную силу раствора при определении ВФП в реальных образцах. Наиболее значимыми для данного процесса являются рН и время экспозиции реакционной смеси. Аналитический сигнал максимален в диапазоне рН от 10,5 до 10,9 единиц, за пределами которого его величина уменьшается для различных восстановителей в среднем на 30%.

В выбранных условиях некоторые вещества нефенольной природы, содержащиеся в пищевых продуктах (АК, ЦИСТ и др.), проявляют восстановительные свойства, вступая в реакцию с реактивом Фолина-Чокальтео, и, следовательно, могут вносить вклад в величину суммарного показателя при условии их значительного содержания в объекте.

Индивидуальные вещества фенольной природы, проявляющие свойства восстановителей, могут определяться с разной чувствительностью, даже если имеют одинаковую стехиометрию взаимодействия с реактивом Фолина-Чокальтео, что может быть связано с разной скоростью протекающей реакции. Для ряда восстановителей были получены кинетические кривые, характеризующие усиление аналитического сигнала по мере протекания реакции (рис. 1).

Рисунок 1 – Изменения аналитического сигнала индивидуальных восстановителей от времени реакции (метод Фолина-Чокальтео). САО=5мкмоль/дм3

Для всех изученных восстановителей на начальном участке кинетических кривых (1 – 10 мин) наблюдается быстрое нарастание сигнала. Изменение аналитического сигнала ВФП от времени линейно и по скорости реакции изучаемые вещества можно расположить в ряд: КВ> ГК> РТ> АК> КТ> ПКК> ФК> ЦИСТ. На втором этапе (10 – 50 мин) скорость окисления замедляется, и её вклад в формирование погрешности определения суммарного показателя может нивелироваться. Это приводит к целесообразности определения суммарного показателя при времени экспозиции реакционной смеси 30 мин, когда степень протекания реакции для всех восстановителей составляет более 90%.

Для всех восстановителей ВФП градуировочные графики линейны в широком диапазоне концентраций от 1 до 40 мкмоль/дм3 с различающимися коэффициентами чувствительности. Переход от выражения концентраций в мкмоль/дм3 к мкмоль-экв/дм3, вычисленных для каждого АО с учетом числа отдаваемых ими электронов, приводит к сближению коэффициентов чувствительности индивидуальных АО и сужению веера градуировок для одного и того же набора АО (рис. 2). Величины параметра Т, характеризующего ширину градуировочного веера и определяемого отношением наибольшего и наименьшего коэффициентов чувствительности в выборке, включающей разные аналиты, составляют 2,2 и 1,5 соответственно. Следовательно, переход к нормальным концентрациям должен приводить к более точной оценке суммарного содержания антиоксидантов.

Рисунок 2 – «Веер» градуировочных графиков при разных способах выражения концентрации АО: а – в мкмоль/дм3; б – в мкмоль-экв/дм3

(метод Фолина-Чокальтео)

Для снижения погрешности определения суммарного показателя в качестве стандартного вещества, в рамках соблюдения условий разработанного алгоритма, необходимо выбрать восстановитель с промежуточным значением коэффициента чувствительности и известной стехиометрией реакции. Более всего удовлетворяет этому условию галловая кислота, однако в литературе встречаются рекомендации о применении в этом качестве кверцетина. Априорная оценка погрешности определения суммарного содержания веществ фенольной природы для обоих стандартных веществ показывает, что использование в качестве стандартного вещества ГК приводит к меньшей погрешности результата анализа (табл.1), что позволило рекомендовать ее в качестве стандартного вещества при определении суммарного содержания веществ фенольной природы.

Таблица 1 – Суммарное содержание ВФП в модельных смесях, найденное с использованием разных стандартных веществ

Состав модельной смеси АО (С, мкмоль/дм3)	САО, мкмоль-экв/дм3	Априорная оценка погрешности определения, С,%		Найдено
				Хст = ГК		Хст = Кв
		Хст =ГК	Хст =КВ	С	,%	С	,%
АК(5,0) +РТ(15,0)	40,0	9 (-28)*	-49 (-20)*	22,8 (56,1)*	14 (40)*	10,8 (54,2)*	-46 (36)*
АК(15,0) +КВ(5,0)	55,0	18 (-11)*	- 44 (-1)*	21,5 (53,2)*	7 (-3)*	10,1 (50,9)*	-49 (-7)*
КТ(10,0) +ПКК(10,0)	40,0	15 (15)*	- 46 (28)*	21,0 (52,2)*	5 (31)*	9,9 (49,8)*	-50 (25)*
ГК(10,0) + КТ(10,0)	50,0	11 (9)*	-48 (21)*	24,5 (59,8)*	23 (20)*	11,6 (58,3)*	-42 (17)*
ГК(10,0) +АК(10,0)	50,0	-7 (-5)*	- 56 (6)*	19,4 (48,6)*	-3 (-3)*	9,2 (45,8)*	-54 (-8)*
КВ(5,0) +РТ(15,0)	55,0	41 (-23)*	-34 (-14)*	32,0 (76,2)*	60 (39)*	15,1 (76,4)*	-25 (39)*
КТ(7,5) +ПКК(5,0) +АК(7,5)	40,0	5 (6)*	- 50 (18)*	22,6 (52,7)*	13 (32)*	10,7 (50,4)*	-47 (26)*
АК(6,5) +КВ(2,5) +ГК(5,0) +КТ(6,0)	52,5	16 (1)*	-45 (11)*	22,0 (54,4)*	10 (4)*	10,4 (52,2)*	-48 (-1)*

– для концентраций АО, выраженных в мкмоль/дм3 и * – в (мкмоль-экв/дм3)

При оценке суммарного содержания АО важной проблемой может быть неаддитивность аналитического сигнала. Этот фактор нередко приводит к трудно прогнозируемым систематическим погрешностям анализа. Однако при определении суммарного содержания ВФП (антиоксидантов) по Фолину-Чокальтеу статистически значимые отклонения наблюдались довольно редко. Проверка по критерию Стьюдента и по 3S-критерию показала, что изученные модельные двухкомпонентные смеси (кроме смесей КВ+РТ и КВ+ФК) удовлетворяют условию аддитивности аналитического сигнала (АС), Величина |АС-АС| не превышала 0,030, то есть находится на уровне случайных погрешностей. Для смесей более сложного состава (трех- и четырехкомпонентных) наблюдались большие по величине и нередко статистически достоверные отклонения от аддитивности. Выяснение причин появления отклонений требует специального исследования.

Как видно из табл. 1, погрешность определения суммарного содержания ВФП в модельных смесях по Фолину – Чокальтеу приблизительно совпадает с теоретическими прогнозами по формулам (1) и (1а). Это указывает, что основной причиной возникновения этой погрешности является разная чувствительность определения разных ВФП (антиоксидантов). Погрешность уменьшается (по модулю) при использовании ГК в качестве стандартного вещества, независимо от присутствия ГК в исследуемой пробе.

Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать и доказать правильность выбора ГК в качестве стандартного вещества при определении суммарного содержания веществ фенольной природы и продемонстрировать суммарный характер показателя, определяемого по методу Фолина-Чокальтео.

Определение показателя АОА методом FRAP

Для определения АОА пищевых продуктов используют как прямые методы, основанные на реакциях антиоксидантов с радикалами, генерируемыми в системе, так и косвенные, в основе которых лежат редокс-реакции металлов переменной валентности с АО, проявляющими восстановительные свойства. Среди последних наибольшее применение нашел метод FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power), позволяющий измерять содержание АО на уровне 10-6– 10-3 моль/дм3 и характеризующийся хорошей сходимостью результатов, экспрессностью и низкой стоимостью единичного анализа, простотой аппаратурного оформления. Детектирование аналитического сигнала проводят электрохимическими, спектроскопическими, реже кинетическими методами.

Были выбраны два способа оценки АОА методом FRAP:

- спектрофотометрический с использованием индикаторной системой Fe(III)– о-фенантролин (разработан на кафедре аналитической химии КубГУ);

- потенциометрический на основе медиаторной системой K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (предложен Брайниной Х.З. и сотр.).

Высокие значения Е0 используемых редокс-систем (Е0=+1,19В (отн. Н.В.Э) и Е0=+0,36В (отн. Н.В.Э)) позволяют вовлекать в редокс-реакции широкий круг антиоксидантов, включая дубильные вещества, ВФП, что позволяет применять эти методики для анализа пищевых продуктов.

Определение АОА индивидуальных АО и их смесей с индикаторной системой Fe(ІІІ) - о-фенантролин. При определении АОА первым способом при действии антиоксидантов на индикаторную систему Fe(ІІІ)-о-фенантролин (Fe(ІІІ–Phen) образуется интенсивно окрашенный комплекс Fe(II) с реагентом. Окраска развивается медленно, поэтому аналитический сигнал измеряют через минут после смешивания реагентов, не дожидаясь установления равновесия. АОА находят по градуировочному графику, предварительно построенному по растворам стандартного вещества Хст. При таком методе определения, как отмечалось выше, величина АОА зависит не только от состава пробы, но и от выбора Хст, а также от условий измерения сигнала.

При выборе условий анализа объектами изучения служили индивидуальные АО (АК, КВ, РТ), а варьируемыми факторами были величина рН, ионная сила раствора, начальные концентрации Fe+3 и фотометрического реагента, а также время экспозиции и температура. Было установлено, что ионная сила раствора практически не влияет на аналитические сигналы индивидуальных АО. Измерение АОА методом FRAP возможно в диапазоне величин рН от 2 до 5, причем максимальный сигнал формируется при рН= 3,6. В используемой индикаторной системе окислитель изначально вводили в избытке, дальнейшее увеличение его начальной концентрации при рН=const приводит к росту аналитических сигналов всех АО. Это связано с тем, что за время экспозиции выход продукта реакции не достигает 100% от теоретически возможного и, следовательно, сигнал будет зависеть от скорости окисления АО. Последняя, в свою очередь, тем выше, чем больше СFe(III). Было установлено, что определяя АОА на уровне до 10 мкмоль/дм3 (в пересчете на АК), следует вводить ионы Fe+3 в концентрации 100 – 200 мкмоль/дм3. Концентрация фотометрического реагента должна быть в избытке по отношению к другим компонентам индикаторной системы. Выбор времени экспозиции достоверно влияет на величину сигнала. Принимая во внимание, что увеличение времени экспозиции приводит к повышению чувствительности и наблюдается некоторая тенденция к уменьшению коэффициента вариации при определении АО исследования проводили, в основном, при = 60 мин. Одновременно учитывали, что в этих условиях может возрастать вероятность неаддитивного светопоглощения.

В выбранных условиях были получены градуировочные зависимости для ряда АО в широком диапазоне концентраций, тангенс угла наклона которых достоверно различаются (табл.2). Относительная чувствительность аналитического сигнала (АС) к разным АО снижается в ряду:

КВ> ГК > ПКК РТ > КТ АК ФК.

На чувствительность определения АО влияет скорость его взаимодействия с окислителем. Исследование зависимости формирования аналитического сигнала во времени для разных АО показывает, что эти кривые однотипны и при фиксированном времени экспозиции более «быстрый» антиоксидант будет определяться с большей чувствительностью.

Таблица 2 – Характеристики градуировочных зависимостей для индивидуальных антиоксидантов

АО	Диапазон линейности, мкмоль/дм3 (мкмоль-экв/дм3)	mэксп	Коэффициент чувствительности градуировочного графика, мкмоль/ дм3	Нормированные по АК коэффициенты чувствительности	Коэффициент чувствительности градуировочного графика, мкмоль-экв/ дм3	Нормированные по АК коэффициенты чувствительности
АК	0,5 – 14 (1 – 28)	2	0,043	1,00	0,021	1,00
КВ	0,5 – 6 (2,5 – 30)	–	0,141	3,28	0,028	1,33
ГК	0,5 – 5 (1,5 – 15)	3	0,130	3,02	0,043	2,05
ПКК	1 – 8 (2 – 16)	2	0,068	1,58	0,033	1,57
РТ	0,5 – 10 (1 – 20)	2	0,058	1,35	0,029	1,38
КТ	0,5 – 5 (1 – 10)	2	0,048	1,12	0,024	1,14
ФК	0,5 – 7 (1 – 14)	–	0,043	1,00	0,021	1,00

Влияние стехиометрии может быть нивелировано, если выражать содержание АО в исследуемых объектах в пересчете на эквивалент стандартного вещества, что доказано с использованием модельных смесей (САО составляла 4,0 мкмоль/дм3). При этом предварительно оценивали аддитивность аналитических сигналов компонентов смеси по 3S- и t-критериям, проводили прогнозирование погрешностей определения АОА с пересчетом на разные стандартные вещества, в качестве которых рассматривали аскорбиновую кислоту (как удовлетворяющую условиям выбора стандартного вещества: К1< Кст< Кn и m=2) и галловую кислоту, которую часто рекомендуется в литературе в качестве стандартного вещества.

Результаты априорной оценки погрешности определения АОА, как величины, максимально приближенной к суммарному содержанию антиоксидантов в смеси, совпадают по знаку и величине с погрешностями, рассчитанными на основе экспериментальных измерений (табл.3). При выборе АК в качестве стандартного вещества погрешность определения АОА меньше по сравнению с ГК. Величина погрешности после перехода к нормальным концентрациям снижается в 2-3 раза.

Таблица 3 – Суммарное содержание АО в модельных смесях, определенное с использованием разных стандартных веществ

Состав модельной смеси АО (С, мкмоль/дм3)	САО, мкмоль-экв/дм3	Априорная оценка погрешности определения, С,%		Найдено
				Хст = АК		Хст = ГК
		Хст =АК	Хст =ГК	С	,%	С	,%
АК(1,0) +РТ(3,0)	8,0	26 (29)*	-58 (-37)*	5,3 (8,9) *	32 (11) *	1,6 (4,8) *	60 (-40) *
АК(3,0) +КВ(1,0)	11,0	57 (15)*	-48 (-44)*	7,0 (12,0) *	75 (9) *	2,5 (7,5) *	-37 (32) *
КТ(2,0) +ПКК(2,0)	8,0	35 (36)*	-55 (-34)*	5,2 (8,8) *	30 (10) *	1,5 (4,6) *	-62 (-43) *
АК(2,0) + ГК(2,0)	10,0	101 (63)*	-33 (-20)*	8,0 (13,9) *	100 (39) *	2,5 (7,6) *	-37 (-24) *
АК(1,5) + КТ(1,5) + ПКК(1,0)	8,0	19 (20)*	-61 (-42)*	4,2 (6,7) *	5 (-16) *	1,6 (4,7) *	-60 (-41) *

– для концентраций АО, выраженных в мкмоль/дм3 и * – в (мкмоль-экв/дм3)

Определение АОА индивидуальных АО и их смесей с использованием медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6]. Потенциометрический способ оценки АОА пищевых продуктов с использованием медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6] выбран нами в качестве альтернативного для проведения сопоставления результатов определения по методу FRAP с индикаторной системой Fe(III)-Phen и суммарным содержанием полифенолов по Фолину-Чокальтео. Методика оценки АОА объектов заключается в воздействии антиоксидантов, входящих в его состав, на медиаторную систему K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(N)6], при этом отсутствует необходимость использования стандартного вещества, что является отличительной чертой и преимуществом этого способа. Расчет величины АОА проводят по формуле (2) и выражают результат в ммоль-экв/дм3.

(2)

где Сox – концентрация окисленной формы медиатора, моль-экв/дм3;

Сred – концентрация восстановленной формы медиатора, моль-экв/дм3;

Х – АОА (эквивалентная концентрация антиоксидантов, вступивших во взаимодействие с окисленным компонентом медиаторной системы), моль-экв/дм3;

Е и Е1 – потенциалы, устанавливающиеся в системе до и после введения анализируемого источника антиоксиданта, В; =10(Е-Е1)b·Сred/Сox, b=2,3RT/nF.

Адаптацию данной методики проводили по времени установления потенциала, влиянию изменения ионной силы раствора и оптимальной величине изменения потенциала после введения АО (Е=Е-Е1). Оценивали также суммарный характер показателя АОА. Состав электролита (0,015 моль/дм3 K-Na фосфатный буферный раствор) и соотношение компонентов медиаторной системы 0,01 моль/дм3 K3[Fe(CN)6]/0,0001 моль/дм3 K4[Fe(N)6] оставили без изменений в авторском варианте.

Установлено, что значение потенциала достигает 90-98% от максимальной величины за время 1-3 мин для индивидуальных АО, их смесей и реального образца пищевого продукта.

Введение индифферентного электролита (KNO3) в систему в концентрациях от 5 до 50ммоль/дм3 практически не влияет на аналитически сигнал. При добавлении индивидуальных АО к медиаторной системе в концентрациях от 0,05 до 1,0 ммоль/дм3 для АК, от 0,01до 1,0 ммоль/дм3 для КТ и ГК и от 0,005 до 0,1 ммоль/дм3 для КВ наблюдается изменение потенциала медиаторной системы, согласующееся с уравнением Нернста.

Минимальная погрешность определения АОА индивидуальных АО наблюдается при изменении потенциала медиаторной системы после внесения АО на величину Е от 10 до 30 мВ. При анализе пищевых продуктов, варьируя объем вносимой пробы, добивались изменения значений потенциала Е в этом диапазоне.

Для выявления суммарного характера изучаемого показателя измеряли АОА модельных смесей и индивидуальных АО, входящих в их состав (табл. 4). Погрешность определения АОА смеси антиоксидантов составляет не более 25%, что позволяет предположить суммарный характер показателя.

Таблица 4 – Доказательство суммарного характера величины АОА при определении с использованием медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(N)6] (Р=0,95;n=5)

№	Состав модельной смеси		Введено, ммоль-экв/дм3	Найдено АОА, ммоль-экв/дм3	,%
	АО	САО, ммоль-экв/дм3
1	АК	0,95	1,14	1,21±0,03	5,8
	ГК	0,19
2	АК	0,39	0,66	0,78±0,03	18
	ГК	0,27
3	КВ	0,03	0,58	0,56±0,02	-3,9
	РТ	0,55
4	АК	0,05	0,60	0,48±0,02	-21
	РТ	0,55
5	АК	0,10	0,43	0,32±0,02	-26
	РТ	0,33

Таким образом, проведенные исследования показывают, что в выбранных условиях анализа антиоксидантные активности модельных смесей, найденные методом FRAP с использованием систем Fe(III)-Phen и K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(N)6], носят суммарный характер, погрешность определения составляет менее 30%.

Установление взаимосвязи изучаемых (суммарных) и некоторых

показателей качества пищевых продуктов

В рамках настоящей работы проводился сопоставительный анализ результатов определения показателя АОА по методу FRAP с системами, различающимися по величине редокс-потенциала. Сопоставительный анализ результатов определения АОА модельных двух- и трехкомпонентных смесей разного состава (суммарное содержание АО во всех системах составляло 1,0 мкмоль/дм3) показал удовлетворительную достоверность корреляции ( rэксп= 0,784; rтаб = 0,632).

При проведении аналогичных исследований по отношению к АОА пищевых продуктов необходимо изучить стабильность получаемых результатов анализа с применением контрольных карт Шухарта. Оценку метрологических характеристик методик определения показателя АОА проводили с применением набора образцов для оценивания в виде однородных и стабильных по составу рабочих проб. Распределение случайной погрешности результата анализа считали нормальным. Для оценивания были выбраны образцы чая и красного сухого вина. Данные продукты отличаются составом матрицы и значением величины АОА. Проверка показала, что все метрологические характеристики находятся в стабильном состоянии. Это позволило использовать полученные контрольные карты в дальнейшем для контроля стабильности результатов анализа при проведении корреляционных исследований.

Установлена достоверная корреляция результатов анализа АОА, полученных с использованием изучаемых железосодержащих систем для образцов черного чая (rэксп= 0,964; rтабл= 0,553) и красных сухих вин Каберне и Мерло (rэксп= 0,694; rтабл= 0,632 ).

Была изучена взаимосвязь между показателем АОА и другими суммарными показателями. На образцах вин показана степень взаимосвязи показателей: сумма фенольных веществ по Фолину – Чокальтео, АОА по методу FRAP, сумма антоцианов, и установлена удовлетворительная попарная корреляция для всех показателей (табл.5). Высокая степень увязывания показателя АОА с суммарным содержанием ВФП по Фолину-Чокальтео (для систем Fe(III)-Phen и K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(СN)6]) косвенно свидетельствует о правильности результатов определения АОА методом FRAP с рассматриваемыми системами.

Таблица 5 – Результаты попарной корреляции суммарных показателей (на примере образцов красных сухих вин)

Факторы	Суммарное содержание ВФП	АОА Fe(III)-Phen,	АОАK3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(СN)6],	Суммарное содержание антоцианов
Суммарное содержание ВФП	1	0,893	0,921	0,894
АОА Fe(III)-Phen,	0,893	1	0,694	0,662
АОАK3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(N)6],	0,921	0,694	1	0,789
Суммарное содержание антоцианов	0,894	0,662	0,789	1

rтаб=0,632

Аналогичные корреляционные исследования проводились и для образцов черного чая высшего сорта. Наблюдается высокая степень взаимосвязи между показателями АОА и показателем, определяющим качество чая – содержанием танинов (например, при корреляции с АОАFe(III)-Phen ­– rэксп= 0,906; rтабл= 0,553).

На основе полученного массива экспериментальных данных предложено уравнение регрессии, связывающее величину АОАFe(III)-Phen, определенную с использованием индикаторной системы Fe(III)–Phen, с содержанием танинов в чае. Проверку возможности использования этого уравнения проводили на образцах, не используемых при выводе уравнения, ошибка предсказания составила не более 25%.

В Ы В О Д Ы

1. Предложен единый методический подход к оценке суммарной антиоксидантной активности (АОА) пищевых продуктов с помощью интегральных показателей состава (методы Фолина-Чокальтео и FRAP, потенциометрический метод по Брайниной Х.З.). Установлено, что показатели должны определяться в условиях in vitro с применением индикаторных редокс-реакций и быть приблизительными оценками суммарного содержания антиоксидантов, выраженными в ммоль-экв/дм3.

2. Обоснован алгоритм изучения интегральных показателей АОА, последовательное выполнение операций которого позволяет априорно оценить погрешность определения суммарного содержания однотипных аналитов, аддитивность аналитического сигнала и установить суммарный характер изучаемого показателя. Показано, что при проведении анализа в условиях обеспечивающих максимальное сближение величин суммарного содержания аналитов и изучаемых суммарных показателей удается значительно снизить погрешность определения величины АОА и суммарного содержания ВФП по Фолину-Чокальтео.

Последовательное выполнение предлагаемых операций применительно к методам Фолина-Чокальтео и FRAP позволило подтвердить суммарный характер этих показателей, обоснованно выбрать оптимальные стандартные вещества, количественно охарактеризовать точность оценки АОА, а для продуктов с известным набором антиоксидантов – прогнозировать систематические погрешности соответствующего метода.

3. Проведены априорная и экспериментальная оценки погрешности определения показателя суммарное содержание полифенолов по Фолину-Чокальтео в смесях индивидуальных антиоксидантов с использованием различных стандартных веществ (галловой кислоты и кверцетина). Проведенные исследования позволили обосновать и доказать правильность выбора галловой кислоты в качестве стандартного вещества при определении суммарного содержания веществ фенольной природы и продемонстрировать суммарный характер данного показателя. Погрешности оценки антиоксидантной активности существенно снижаются при применении в качестве стандартного вещества галловой кислоты, что соответствует теоретическим рекомендациям. Добавки индивидуальных антиоксидантов в сухих красных винах определяются по соответствующей методике с погрешностями, не превышающими 25%.

4. Показана применимость этих показателей для оценки АОА сухих красных вин и чайных настоев, а также достоверная закоррелированность разных показателей. По результатам проведенных исследований АОА модельных и реальных объектов со сложной переменной матрицей разработана методика МУ 08-47/275 «Спектрофотометрический метод измерений антиоксидантной активности пищевых продуктов», внесенная в Федеральный реестр методик измерений, № ФР.1.31.2011.09197.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цюпко, Т.Г. Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP / Т.Г. Цюпко, И.С. Петракова, Н.С. Бриленок, Н.А. Николаева, Д.А. Чупрынина, З.А. Темердашев, В.И. Вершинин // Аналитика и контроль. – 2011. – Т.15, №3. – С. 287-298.
2. Цюпко, Т.Г. Изучение антиоксидантной активности антоцианов, выделенных из виноградного вина / Т.Г. Цюпко, Н.А. Николаева, О.Б. Воронова, Д.А. Чупрынина // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. – 2011. – №5-6. – С. 13-16.
3. Цюпко, Т.Г. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов с использованием индикаторной системы на основе фенантролинатных комплексов железа / Т.Г. Цюпко, Д.А. Чупрынина, Н.А. Николаева, О.Б. Воронова, З.А. Темердашев // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. – 2011. – № 5-6. – С.84-87.
4. Цюпко, Т.Г. Оценка региональной принадлежности вин по комплексу обобщенных показателей / Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, Н.А. Николаева, Д.А. Чупрынина // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: тез. докл. – Волгоград. – 25-30 сентября 2011г. – Т.4. – С. 431.
5. Цюпко, Т.Г. Изучение антиоксидантной активности антоцианов, выделенных из виноградного вина / Т.Г. Цюпко, Н.А. Николаева, О.Б. Воронова, Д.А. Чупрынина // «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии»: Материалы III Всероссийского симпозиума с международным участием. – Краснодар. – 2-8 октября 2011. – С. 280.
6. Чупрынина, Д.А. Оценка кинетических методов для целей определения антиоксиднатной активности пищевых продуктов с использованием индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)-органический реагент/ Д.А. Чупрынина, Т.Г. Цюпко // «Менделеев-2012»:тез. докл. VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием. – Санкт-Петербург. – 3-7 апреля 2012. – С. 299
7. Чупрынина, Д.А. Хемометрическая оценка стабильности результатов определения суммы полифенолов/ Д.А. Чупрынина, Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, Д.В. Гиршфельд// Материалы Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием. – Краснодар. – 23-29 сентября 2012. – С. 313.
8. Чупрынина, Д.А. Способ выявления статистически значимых отклонений от аддитивности светопоглощения при анализе смесей/ Д.А. Чупрынина, Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, Н.А. Николаева, Д.О. Мареева // Материалы Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием. – Краснодар. – 23-29 сентября 2012. – С. 300.
9. МУ 08-47/275 «Спектрофотометрический метод измерений антиоксидантной активности пищевых продуктов». Федеральный реестр методик измерений. № ФР.1.31.2011.0197.

Автор выражает благодарность канд. хим. наук Вороновой О.Б. и

канд. хим. наук Николаевой Н.А. за участие в обсуждении результатов.