Квинх получение и изучение фармакологической активности спарфлоксацина, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот
На правах рукописи
Буй Тхи Зыонг Квинх
ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СПАРФЛОКСАЦИНА, ВКЛЮЧЕННОГО В НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ
СОПОЛИМЕРА МОЛОЧНОЙ И ГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ
КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК
МОСКВА - 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова».
| Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор доктор фармацевтических наук, профессор | Аляутдин Ренад Николаевич Раменская Галина Владиславовна |
| Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор фармацевтических наук, профессор | Чельцов Виктор Владимирович Казьмина Эмма Максимовна |
Ведущая организация: ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Защита состоится _____________ 2010 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.09 в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова по адресу 119019, Москва, Никитский б-р, 13
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу 117998, Москва, Нахимовский пр-т, д.49.
Автореферат разослан «___» ____________2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Туберкулез сегодня - пандемия, распространяющаяся по планете с катастрофической скоростью - два миллиарда человек - треть населения мира инфицировано микобактерией туберкулеза (ВОЗ, 2006г.). Каждый десятый заболевает активной формой туберкулеза, 95% которого приходится на туберкулёз органов дыхания. Огромной проблемой является стремительное распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (при резистентности к препаратам первой линии – рифампицину и изониазиду: ежегодно регистрируется 500 000 новых случаев). Для лечения необходима длительная (до двух лет) терапия дорогостоящими препаратами, вызывающими выраженные побочные реакции. При неэффективности стандартной терапии каждый больной активной формой туберкулеза может заразить еще 10-15 человек в год. В связи с этим, возникла острая необходимость в разработке качественно нового подхода в лечении туберкулеза. Создание наносомальной формы противотуберкулезных средств позволит значительно повысить их эффективность и уменьшить токсичность. В практической медицине, по мере повышения эффективности и безопасности лечения туберкулеза используют нетрадиционные группы антимикробных препаратов, обладающих высокой противотуберкулезной активностью и к которым еще не возникла резистенность, такие как фторхинолоны [Jeong YI и др., 2008].
Особо перспективным путем при лечении туберкулеза является использование направленной системы транспорта лекарственных веществ на основе биодеградирующих, биосовместимых, низкотоксичных полимеров (например, сополимер молочной и гликолевой кислот) в инфицированные клетки, например в макрофаги [О’Hara P. и др.,2000; Anisimova Y.V., 2000]. При циркуляции таких полимерных носителей, содержащееся в них биологически активное вещество защищено от инактивации. Благодаря своему подходящему размеру, наносомальная форма может целенаправленно проникать в очаг, и постепенно освобождать включенный препарат, поэтому она обладает пролонгированным свойством [Аляутдин Р.Н. и др. 2003]. В последнее время в литературе появились также данные о высокой активности наносомальных препаратов при лечении туберкулеза у мышей и морских свинок [Khuller G.K., and Pandey R, 2005]. Однако эта область применения наночастиц мало изучена. Данное направление исследований приобретает особую актуальность в условиях значительного роста заболеваемости туберкулезом во всех странах мира.
Исходя из вышесказанного, представляется целесообразно получить наносомальную форму препаратов из группы фторхинолонов, в частности спарфлоксацина (СПФ), состоящую из биодеградирующих, биосовместимых полимеров, и включенных в них лекарственные вещества. Можно полагать, что создание такой формы позволит повысить эффективность, уменьшить кратность дозирования и снизить токсичность применяемых в клинической практике противотуберкулезных средств.
Цель и задачи исследования
Цель исследования: Разработать наносомальную лекарственную форму спарфлоксацина (СПФ-НЧ) для перорального введения на основе наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГ), с последующим изучением антибактериальной активности и фармакокинетики.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи.
- Разработать методику получения наносомальной формы спарфлоксацина на основе наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот; изучить влияние различных параметров технологического процесса на характеристики наночастиц.
- Разработать методику анализа спарфлоксацина в наносомальной форме и в биологических образцах. Разработать методику оценки качества наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина.
- Сравнить противотуберкулезную активность наносомального спарфлоксацина и свободной лекарственной формы спарфлоксацина (субстанция спарфлоксацина).
- Сравнить фармакокинетику наносомального спарфлоксацина и зарегистрированной лекарственной формы спарфлоксацина (таблетки 200 мг).
Научная новизна
Впервые разработана наносомальная лекарственная форма спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Впервые изучены технологические параметры процесса получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина путем наносоосаждения (нанопрецитации).
Впервые изучена противотуберкулезная активность наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Практическая значимость
Показано, что применение наночастиц позволило целенаправленно изменять фармакокинетику спарфлоксацина, способствуя его прологирующему действию. Антибактериальная активность наносомальной формы спарфлоксацина в отношении Mycobacterium tuberculosis аналогична свободной форме.
Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной формы спарфлоксацина, могут быть использованы при создании наносомальных систем транспорта других препаратов.
Cформулирован ряд критериев для стандартизации наносомальных лекарственных форм и предложены соответствующие методы оценки качества.
Результаты фармакокинетического исследования могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы спарфлоксацина.
Основные положения, выносимые на зашиту
1. Технология получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, также методы оценки качества полученной лекарственной формы.
2. Результаты оценки антибактериальной активности лекарственных форм спарфлоксацина в отношении микобактерий.
3. Результаты фармакокинетического исследования наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина по сравнению со свободной формой (таблетки 200мг).
Апробация работы
Апробация диссертационной работы прошла на совместном заседании кафедры фармакологии и фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (Москва, 2010).
Материалы работы представлены на: Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008); V Всероссийской Бурденковской научной конференции (Белгород, 2009); Всероссийской научной школе для молодежи, «Наномедицина и нанотоксикология» (Москва, 2009); IV Всероссийской конференции – школе, «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» (Московская область, 2009); Х международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Иновационые технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009).
Публикации
Основное содержание диссертации опубликовано в 7 печатных изданиях, в том числе 2 - в ВАК журналах
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, главы I «Обзор литературы», главы II «Материалы и методы», главы III «Результаты и их обсуждение», общих выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 113 листах машинописного текста и содержит 29 рисунков, 27 таблиц. Список литературы состоит из 135 наименований (115 из которых зарубежные).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Метод получения. ПЛГ - наночастицы получали методом наносоосаждения в ацетоне. В процессе исследования проводили подбор количества спарфлоксацина и сополимера: спарфлоксацин (в интервале 1 - 20 мг), полимер ПЛГ (в интервале 10-100 мг) растворяли в 2,5 мл ацетона. К полученному раствору при перемешивании на магнитной мешалке (Magnetic Stirrer, Kika Werke – RT 10 power) при 500 об/мин, температуре 500С медленно добавляли 5 мл водного раствора плюроника F-68 - 1%. Синтез продолжали еще 2,5 часа, при температуре 40-500С для выпаривания органического растворителя ацетона. Добавляли криопротектор – маннит (0,3 г), фильтровали через пористый стеклянный фильтр, разливали по флаконам (обычно по 1-2 мл), замораживали и лиофилизовали (лиофильная сушка Heto drywinner, Германия) в течение 24 часов.
Из лиофилизированного порошка, содержащего ПЛГ-наночатицы спарфлоксацина получены твердые капсулы «спарфлоксацина – 0,4».
Методы оценки качества полученной наносомальной формы спарфлоксацина. Определение размера наночастиц (методом фотонной корреляционной спектроскопии на наносайзере (Submicron Particle Sizer NICOMP 380, Santa Barbara, California, USA); изучение стабильности спарфлоксацина (по изменению размеров наночастиц и спектрофотометрическим методом); устойчивость лиофилизированных наночастиц к длительному хранению (по показателям размеров частиц); определение степени включения спарфлоксацина (методом ультрацентрифугирования); ресуспендируемось (визуально); количественное определения (спектрофотометрическим методом и методом ВЭЖХ).
Определение антибактериальной активности лекарственных форм спарфлоксацина в отношении микобактерий.
Исследование проведено на базе Национального института фтизиопульмонологии (Вьетнам), в экспериментальных условиях, выполненных in vitro с применением комплекса микробиологических методов исследования.
В качестве биотестов в работе использовали лабораторный штамм Mycobacerium tuberculosis H37Rv и клинический штамм, выделенный из диагностического материала больных туберкулезом, находящихся на лечении в стационаре больницы туберкулеза.
В соответствии с планом исследования на начальном этапе проводили наращивание биомассы тест-штаммов, для чего выбранную культуру засевали на плотную питательную среду Левенштейиа-Иенсена (международный стандарт). Через 21 день из выросшей культуры готовили суспензию микобактерий соответствующую V стандарт оптической плотности (5x108 млн. микробных тел в 1 мл). Готовую суспензию засевали (по 0,2 мл) в пробирки с 2 мл жидкой питательной среды Школьниковой, содержащей изучаемые соединения в соответствующих концентрациях - от 50,0 до 0,05 мкг/мл. Необходимая концентрация препаратов в пробирках достигалась титрованием (метод серийных разведений).
После 14 суток инкубации в термостате при 37°С пробирки с жидкой средой центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин., надосадочную жидкость сливали, а осадок суспензировали в 0,8 мл стерильного 0,9% NaCl. Из 0,1 мл суспензии готовили мазки, которые затем окрашивали по методу Циля-Нильсена. Оставшуюся часть осадка засевали по 0,2 мл в две пробирки с плотной питательной средой Левенштейна-Иенсена. Рост микобактерий на плотной среде учитывали через 21-28 дней культивирования в термостате при 37°С. Контролем служили пробирки, с посевом тест-штаммов не подвергавшихся воздействию СПФ-НЧ и препарата сравнения (спарфлоксацина).
Тактика фармакокинетического исследования.
Для исследования использовали 12 здоровых кроликов-самцов породы Шиншилла (6 животным вводили капсулы, 6 - таблетки). Масса тела кроликов 2,9±0,1 кг, удельные дозы препарата, полученные животными 138,1±5,4 мг/кг.
Животных содержали в стационарных условиях при естественном световом режиме и стандартном рационе (комбикорм, вода). За 12 часов до начала эксперимента животных лишали пищи, оставляя свободный доступ к воде. Исследуемые лекарственные формы спарфлоксацина вводили кроликам однократно внутрижелудочно в дозе 400 мг (2 таблетки по 200 мг или 1 капсула по 400 мг).
Пробы крови в объеме, достаточном для получения 0,5 мл плазмы, отбирали из краевой ушной вены кроликов шприцом в пластмассовые гепаринизированные пробирки до применения препарата (контрольная проба) и через 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 и 48 часов после введения. Плазму крови отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в лабораторной центрифуге Beckman J-6B (США) и хранили до анализа при температуре -200С.
Экстракцию спарфлоксацина из плазмы крови осуществляли по следующей схеме: к пробам плазмы крови (0,5 мл) добавляли 2,5 мл этилацетата, встряхивали пробирку в течение 15 минут в аппарате для встряхивания (Laboratory shaker type 358S, Польша) и центрифугировали 10 минут при 5000 об/мин. Органическую фазу отделяли и выпаривали на водяной бане при 700С в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,1 мл подвижной фазы. 50 мкл полученного раствора вводили в хроматографическую колонку с помощью петлевого крана-дозатора фирмы «Rheodyne» (США), модель 7125.
Изучение сравнительной фармакокинетики различных лекарственных форм препарата и его относительной биодоступности возможно лишь при наличии высокочувствительного и специфичного метода анализа. Таковым в настоящее время для большинства препаратов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методику количественного определения спарфлоксацина в биологическом материале с использованием обращённо-фазной ВЭЖХ разрабатывали на основе ранее известных методик.
Хроматографический анализ содержания спарфлоксацина в плазме крови кроликов проводили на жидкостном хроматографе Series 200 фирмы Perkin Elmer (США), оснащенном градиентным насосом, cпектрофотометрическим детектором и компьютером Pentium 4 с программным обеспечением «MultiChrom».
Условия хроматографирования:
Неподвижная фаза – колонка «X Terra MS» фирмы Waters с обращённо-фазным сорбентом C18 (3.050 мм; 5 мкм), температура колонки 400С. При исследовании проводили подбор оптимальный состав подвижной фазы из следующих составов:
Подвижная фаза I – ацетонитрил – вода (рН 2,5; H3PO4) 20:80
Подвижная фаза II – ацетонитрил – вода (рН 2,5; фосфатный буфер) 15:85
Подвижная фаза III - ацетонитрил – вода (рН 2,5; фосфатный буфер) 20:80
Cкорость подвижной фазы – 1,0 мл/мин; изократический режим работы насоса; детектирование на УФ-спектрофотометре при =297 нм, соответствующей максимуму поглощения вещества; объем петли хроматографа – 50 мкл. Хроматографировали при комнатной температуре. Перед хроматографированием подвижную фазу фильтровали и дегазировали на ультразвуковой бане. Такая система очистки позволила избежать появления дополнительных пиков во время анализа.
Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Statistica v6.0». В таблицах представлены средние арифметические значения величин (M), стандартные отклонения среднего результата (SD), стандартная ошибка среднего арифметического (SEM), доверительный интервал (=0,05), ошибка среднего результата (%). Данные на рисунках представляются в виде M±SD. Достоверность различий фармакокинетических параметров оценивали по t–критерию Стьюдента для независимых выборок. Иллюстративный материал представлен с использованием программы «OriginPro».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение экспериментальной лекарственной формы и оценка ее качества
Выбор условий проведения получения ПЛГ-наночастиц, содержащих спарфлоксацин.
Для оптимизации процесса получения и стандартизации ПЛГ-наночастиц были проведены исследования, в результате которых определили оптимальные условия получения.
В ходе проведенных исследований выявили, что оптимальными условиями для получения ПЛГ-наночастиц являются:
- рН среды получения - в пределах от 6,8 до 7.0 (наночастицы с спарфлоксацином, полученные при указанных условиях, были стабильными, имели оптимальный размер частиц (270 - 300нм), не образовывали агломератов, процесса коагуляции также не наблюдали);
- Соотношение СПФ:ПЛГ –1:2. Как рассмотривали раньше, способность наноночастиц проникать внутрь клеток наиболее эффективно для частиц размером от 250 до 500 нм. Поэтому полученные результаты по размеру наночастиц при разных отношениях СПФ:ПЛГ находятся в этом пределе. При увеличении отношения СПФ:ПЛГ выше 1:2, дальнейшего возрастания степени включения не происходит, в связи с тем целесообразно остановиться на указанном соотношении 1:2.
- Выбор растворителя. При использовании ацетона отмечаются, что с увеличением отношения ПЛГ: ацетон выше 4:1, степень включения в дальнейшем не возрастает, поэтому целесообразно остановиться на указанном соотношении 4:1.
- скорость перемешивания – 500 об/мин, при такой скорости перемешивания процесс получения происходил с минимальным вспениванием, а наночастицы, полученные при перемешивании с данной скоростью, были относительно однородны по размеру частиц.
- стабилизатор и его концентрация - оптимальным при синтезе ПЛГ-наночастиц является использование в качестве стабилизатора плюроника-F68 концентрацией 1%.
- Выбор концентрации спарфлоксацина - Размер наночастиц установляется на постоянном уровне со значения концентрации спарфлоксацина 2,0 мг/мл. Поэтому оптимальной исходной концентрацией спарфлоксацина в среде мы сочли 2,0 мг/мл.
Таким образом, полученные нами результаты позволяют рекомендовать следующие условия получения наносомальной формы спарфлоксацина на основе наночастиц из ПЛГ (таблица 1):
Таблица 1
Состав среды синтеза (для получения 5мл лиофилизата)
| № | Компонент | Количество |
| 1 | Ацетон | 2,5мл |
| 2 | Сополимер ПЛГ | 10 мг |
| 3 | Спарфлоксацин-субстанция | 5 мг |
| 4 | Плюроник F68, 1% | 5 мл |
Оценка качества полученных наночастиц
В ходе проведенных исследований выявили, что суспензия, приготовленная из наночастиц, полученных при описанных выше условиях, остается стабильной в течение 24 часов. Также при ресуспендировании лиофилизированных наночастиц образуется слегка опалесцирующая суспензия без видимых включений и агломератов.
Следует отметить, что методика отличается хорошей воспроизводимостью: размер наночастиц 270 ± 6,51 нм, степень включения 68,33 ± 2,11 %, выход по спарфлоксацина 87%, содержание спарфлоксацина в 1 мл полученного лиофилизата - 0,445г ± 0,01, соответственно соотношение СПФ на полимер в полученной лекарственной форме составляет 0,445г ± 0,01/1мг.
Предварительная оценка стабильности наносомальной формы спарфлоксацина показала, что через 12 месяцев хранения лиофилизата при 4°С размер частиц несколько увеличился (на 20-30%), однако не превысил установленного нами предела (<0,5 мкм).
Изучение антибактериальной активности наночастиц с спарфлоксацином в отношении культуры Mycobacterium tuberculosis
Нами были осуществлены микробиологические исследования на предмет изучения антибактериального действия СПФ-НЧ в опытах in vitro. Целью данного исследования было выяснить, эффективны СПФ-НЧ в отношении культуры Mycobacterium tuberculosis, которые, собственно и являются агентом, вызывающим характерные для туберкулеза поражения органов и тканей.
В работе использовали порошок-субстанцию спарфлоксацина (Dr Reddy's, India) и полученную наносомальную форму спарфлоксацина.
В опытах in vitro определены минимальная подавляющая и минимальная бактерицидная концентрации изучаемого препарата для различных штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ). Всего изучено 2 штамма М. tuberculosis, из них 1 лабораторный - H37Rv и 1 клинический. Клинические изоляты охарактеризованы в отношении противотуберкулезных препаратов как чувствительные. Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) препарата определяется как наименьшая концентрация антибиотика при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного времени. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) определяется как наименьшая концентрация антибиотика, способная подавить видимый рост микроорганизмов in vitro.
Подавление видимого роста микобактерий лабораторного штамма H37Rv наблюдалось при достаточно близких значениях концентраций СПФ-НЧ во всех 2 сериях и определялось в пределах от 0,174 ± 0,005 до 0.184 ± 0,005 мг/л в пересчете на спарфлоксацин, для контрольного спарфлоксацина от 0.170 ± 0,006 до 0.190 ± 0,004 мг/л. Средние значения МБК, полученные по результатам 2 серий опытов, составляют для СПФ-НЧ 0.222 мт/л в пересчете спарфлоксацина, для контрольного спарфлоксацина - 0.225 мг/л. (таблица 2).
Таблица 2
Минимальные бактерицидная и подавляющая концентрации СПФ и СПФ-НЧ (мкг/мл) ) для лабораторного и клинических штаммов Mycobacerium tuberculosis
| Лабораторный штамм | Клинический штамм | |||
| СПФ | СПФ-НЧ | СПФ | СПФ-НЧ | |
| Минимальная бактерицидная концентрация, мкг/мл | 0,210 ± 0,007 | 0,200 ± 0,005 | 0,240 ± 0,004 | 0,244 ± 0,006 |
| Минимальная подавляющая концентрация, мкг/мл | 0,170 ± 0,006 | 0,174 ± 0,005 | 0,190 ± 0,004 | 0,184 ± 0,005 |
Наночастицы с спарфлоксацином обладает высокой бактерицидной активностью в отношении микобактерий туберкулеза как лабораторных, так и клинических штаммов, не уступая спарфлоксацину в традиционной форме. Величины МБК и МПК для лабораторного штамма и клинического штамма статистически достоверно не различаются. Это говорит о том, что спарфлоксацин в достаточном количестве высвобождается из наночастиц, что позволяет ему воздействовать на микобактерий.
Таким образом, можно считать наночастицы перспективной терапевтической системой доставки спарфлоксацина во внутриклеточную среду организма.
Сравнительная фармакокинетика лекарственных форм спарфлоксацина
Параметры для оценки пригодности хроматографической системы представлены в таблице 3 – эффективность колонки по основному пику (число теоретических тарелок N) и фактор симметрии (T), так же указано абсолютное время удерживания (tr)
Таблица 3
Хроматографические характеристики при использовании различных ПФ
| Лекарственное вещество | Параметр | ПФ I | ПФ II | ПФ III |
| Спарфлоксацин | tr, мин | 11,72 | 10,94 | 9,84 |
| N | 7700 | 9400 | 17500 | |
| T | 1,92 | 1,57 | 1,21 |
Экспериментально установлено, что лучшими показателями при определении спарфлоксацина в лекарственной форме отличалась система ПФ III - ацетонитрил – вода (рН 2,5; фосфатный буфер) 20:80. При этом эффективность составила максимальное - около 17500 теоретических тарелок (нормативное значение более 2000) и фактор симметрии 1,21, что соответствует стандартным фармакопейным требованием для фактора симметрии – 0,8-1,5
Таким образом, было установлено, что в условиях обращено фазовой ВЭЖХ наиболее оптимальное значение эффективности, фактора симметрии и время удерживания пика спарфлоксацина наблюдаются в подвижной фазе ацетилнитрил – вода (рН 2,5; фосфатный буфер) 20:80 при температуре колонки 400С. Предел обнаружения разработанной методики 80,0 нг/мл.
Концентрацию спарфлоксацина измеряли в плазме крови кроликов в моменты времени, определенные протоколом исследования, и рассчитывали фармакокинетические параметры по полученным фармакокинетическим кривым.
Полученные значения процента экстракции приведены в таблице 4. Установлено, что процент экстракции спарфлоксацина (среднее из 3-х определений на точку) составил: 90,54±1,59%.
Таблица 4
Определение процента экстракции спарфлоксацина
из плазмы крови животных
| Взято (мкг/мл) | Найдено (%) | М | SEM | SD | ||
| 1.0 | 92.1 | 88.3 | 89.9 | 90.10 | 1.10 | 1.91 |
| 5.0 | 91.2 | 89.6 | 90.7 | 90.50 | 0.47 | 0.82 |
| 10.0 | 89.8 | 89.9 | 93.4 | 91.03 | 1.18 | 2.05 |
| 90.54 | 0.92 | 1.59 | ||||
Метрологическая характеристика методики количественного определения спарфлоксацина в плазме крови (in vitro) представлена в таблице 5.
Таблица 5
Метрологическая характеристика методики количественного определения спарфлоксацина с применением ВЭЖХ в плазме крови
(при t(95%;9) =2,26)
| Взято (мкг/мл) | М | SD | Доверит. интервал | % (ошибка метода) |
| 1.00 | 1.03 | 0.06 | 0.052 | 5.035 |
| 5.00 | 5.05 | 0.16 | 0.131 | 2.590 |
| 10.00 | 10.02 | 0.08 | 0.067 | 0.665 |
Линейность калибровочных кривых в диапазоне концентраций 0.5 - 50.0 мкг/мл спарфлоксацина плазмы демонстрируется средними коэффициентами корреляции r=0,9989. Калибровочная кривая описывается уравнением: S=19.84*Cх + 3.49 (где S – площадь пика, мВ*с; Сх – концентрация спарфлоксацина, мкг/мл). Калибровочная кривая приведена на рис. 1
Рис. 1. Зависимость концентрации спарфлоксацина от площади хроматографических пиков.
Концентрацию (С) анализируемого вещества в опытных образцах рассчитывали по формуле:
С = 
, где
Сх – концентрация вещества, найденная по калибровочной кривой, мкг/мл;
V1 – объем растворителя сухого остатка, мл;
V2 – объем пробы, мл.
В нулевое время (до введения препарата) исследование проб крови у всех животных не показало присутствия в плазме спарфлоксацина. На рисунке 2 представлены фармакокинетические кривые усредненного содержания спарфлоксацина после внутрижелудочного введения изучаемых лекарственных форм (таблеток и капсул) кроликам в дозе 400 мг.
Рис. 2. Фармакокинетические кривые усредненных концентраций спарфлоксацина в плазме крови кроликов после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул в дозе 400 мг.
Из приведенного рисунка 2 видно, что спарфлоксацин, как после введения капсул, так и после введения таблеток, определяется в плазме крови кроликов на протяжении 48 часов. При этом Cmax составляет 28,09 ± 2,31 мкг/мл, Tmax - 4 часа для таблеток, а Cmax составляет 20,24 ± 2,55 мкг/мл, Tmax - 10 часов для капсул.
В таблице 6 приведены рассчитанные по полученным кривым фармакокинетические параметры: Cmax, Tmax, AUC(048), T1/2, kel, MRT, Cl, Vd и отношение Сmax/AUC(048), отражающие степень, скорость всасывания и элиминацию спарфлоксацина при применении изучаемых лекарственных форм и позволяющие оценить его относительную биодоступность.
Таблица 6
Усредненные значения фармакокинетических параметров спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения капсул и таблеток спарфлоксацина кроликам в дозе 400 мг
| №№ | Tmax | Cmax | AUC(048) | T1/2 | kel | Cl | MRT | Vd | Сmax/ AUC(048) |
| Таблетки | |||||||||
| М | 4 | 28.09 | 617.48 | 14.52 | 0.048 | 0.595 | 15.84 | 12.20 | 0.046 |
| SD | - | 2.31 | 88.81 | 1.83 | 0.007 | 0.121 | 1.04 | 0.72 | 0.004 |
| Довер. инт-л =0,05 | 1.85 | 71.06 | 1.47 | 0.006 | 0.097 | 0.84 | 0.58 | 0.003 | |
| Капсулы | |||||||||
| М | 10 | 20.24* | 647.25 | 29.23** | 0.024* | 0.432 | 22.11 ** | 17.97* | 0.031 |
| SD | - | 2.55 | 95.69 | 2.72 | 0.002 | 0.086 | 0.43 | 2.40 | 0.001 |
| Довер. инт-л =0,05 | - | 2.04 | 76.57 | 2.17 | 0.002 | 0.069 | 0.34 | 1.92 | 0.001 |
* - достоверность различий фармакинетических параметров спарфлоксацина в плазме крови (* - р 0,05; ** - р0,01).
Рис. 3. Период полуэлиминации спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул препарата в дозе 400 мг (n=6).
** - статистически достоверное различие параметра (р 0,01)
Рис. 4. Среднее время удерживания спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул препарата в дозе 400 мг.
** - статистически достоверное различие параметра (р 0,01)
Рис. 5. Кажущий объем распределения спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул препарата в дозе 400 мг.
* - статистически достоверное различие параметра (р 0,05)
Из материалов основных фармакокинетических параметров спарфлоксацина, представленных в таблице 6 и рис. 3,4,5 видно, что действующее вещество всасывается быстрее из желудочно-кишечного тракта при применении таблетированной лекарственной формы. Максимальные концентрации спарфлоксацина достигаются быстрее после введения таблеток (Тmax=4,0 ч) по сравнению с капсулами (Тmax=10,0 ч) и составляют соответственно 28,09±2,31 мкг/мл и 20,24±2,55 мкг/мл, Величины Сmax для таблеток и капсул достоверно различаются (р 0,05). Периоды полуэлиминации препарата (T1/2) статистически достоверно (р0,01) увеличивается в 2 раза после введения капсул (Т1/2=29,23±2,72 ч) по сравнению с Т1/2 таблеток (Т1/2=14,52±1,83 ч) (рис.3), поэтому препарат медленнее выводится и соответственно дольше находится в кровяном русле после введения капсул. Дополнительным подтверждением более интенсивной элиминации действующего вещества из плазмы крови животных после введения таблеток также является низкая величина среднего времени удерживания лекарственного вещества в организме (MRT=15,84±1,04 ч) в сравнении с аналогичными фармакокинетическими параметрами, рассчитанными для капсул (MRT=22,11±0,43 ч). Величины MRT для капсул и таблеток между собой достоверно различаются (р0,01) (рис.4). Статистически достоверно увеличивается кажущийся объем распределения (Vd) после введения капсул (р0,05) (рис.5), что свидетельствует о более полном распределении и большем степени проникновения препарата в ткани и клетки организма.
Таким образом, проведенное на кроликах исследование особенностей фармакокинетики разработанной лекарственной формы спарфлоксацина (капсулы желатиновые, действующее вещество в виде ПЛГ-наночастиц 400 мг) и оценка его относительной биодоступности в сравнении с таблетками (200 мг), выпускаемыми промышленностью, показало, что пероральное введение спарфлоксацина в виде ПЛГ - наночастиц в капсулах приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: статистически достоверно (р0,01) увеличивается период полуэлиминации (Т1/2), статистически достоверно возрастает среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT) (р0,01) и кажущийся объем распределения (Vd) (р0,05), но при этом площадь под фармакокинетической кривой «концентрация – время» (AUC(048)) достоверно не изменяется и относительная биодоступность составляет 104,8%.
Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле в концентрациях достаточных для эффективного воздействия, что позволяет предположить пролонгацию действия спарфлоксацина в виде ПЛГ-наночастиц в капсулах.
ВЫВОДЫ
- Создана методика получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе биодеградирующих наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот. Оптимизация ряда технологических параметров.
- Предложены методы оценки качества наносомальной лекарственной формы.
- Показана высокая антибактериальная активность наночастиц с спарфлоксацином в отношении микобактерий туберкулеза как лабораторных, так и клинических штаммов.
- Отработана методика изучения фармакокинетики наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе ПЛГ. Пероральное введение спарфлоксацина в виде ПЛГ-наночастиц в капсулах приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: статистически достоверно увеличиваются период полуэлиминации (Т1/2) (р0,01), среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT) (р0,01) и кажущийся объем распределения (Vd) (р0,05). Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле, что соответствует более полное и длительное распределение препарата в тканях и позволяет предположить пролонгацию действия спарфлоксацина в виде ПЛГ - наночастиц в капсулах.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Буй Т.К. Разработка наносомальных противотуберкулезных средств // Международный форум по нанотехнологиям, 2008. – С. 499-450.
2. Буй Т.З.К, Блынская Е.В., Аляутдин Р.Н. Изучение фармакокинетической особенности наносомальной формы спарфлоксацина по сравнению с свободной формой // Х международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Иновационые технологии в биологии и медицине», 2009. – С. 18-19.
3. Блынская Е.В., Буй Зыонг Квинх, Аляутдин Р.Н., Алексеев К.В. Разработка технологии и фармакокинетическое исследование наноразмерных систем доставки лекарственных веществ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот // Всероссийская научная школа для молодежи, раздел «наномедицина и нанотоксикология», 2009. – С. 7-9.
4. Блынская Е.В., Буй Зыонг Квинх, Аляутдин Р.Н., Алексеев К.В. Исследование динамики фармакокинетических наноразмерных систем доставки лекарственных веществ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот // IV Всероссийская конференция – школа, СhemInt 2009.- С.5.
5. Блынская Е.В., Буй Зыонг Квинх. Обоснование составов и технологических режимов создания наносомальных систем направленного транспорта лекарственных веществ на основе сополимеров молочной кислоты. // V Всероссийской Бурденковской научной конференции (Белгород, 2009). – С. 38-39;
6. Алексеев К.В., Аляутдин Р.Н., Блынская Е.В., Квинх Буй.Т. Основные направления в технологии получения наноносителей лекарственных веществ // Вестник новых медицинских технологий. – 2009. – № 2. - С. 142 – 145.
7. Буй Тхи Зыонг Квинх, Блынская Е.В., Аляутдин Р.Н., Раменская Г.В., Балабаньян В.Ю. Фармакокинетическое изучение наносомальной формы спарфлоксацина по сравнению со свободной формой // Фармация. – 2010. - № 2. – С 42-44.
