Получение и стандартизация стоматологических гелей и жидких лекарственных средств на основе корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева

На правах рукописи

НЕЙМАН ПОЛИНА ЛЕОНИДОВНА

Получение и стандартизация стоматологических гелей и жидких лекарственных средств на основе корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Москва-2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Среди проблем современной стоматологии заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Актуальность профилактики и лечения данных заболеваний обусловлена высокой распространенностью данной патологии. По данным ВОЗ, около 95% взрослого населения планеты и 80% детей имеют те или иные признаки заболевания пародонта.

Лекарственные средства растительного происхождения и препараты, содержащие в своем составе растительные компоненты, давно и успешно применяются в стоматологии. Несмотря на это, интерес к препаратам на основе лекарственного растительного сырья повышается с каждым годом. Такую тенденцию возрождения интереса к лекарственным растениям объясняют следующие недостатки синтетических лекарственных средств: токсичность, побочные действия и аллергии. По данным ВОЗ, аллергические явления, возникающие в результате применения синтетических лекарственных средств, возникают у 12-18% населения.

Принимая во внимание полиэтиологичность заболеваний тканей пародонта и слизистой оболочки полости рта, к стоматологическим лекарственным формам предъявляются такие требования, как противовоспалительная, антибактериальная активность, способность улучшать кровообращение и усиливать регенерацию тканей пародонта.

Согласно современным представлениям именно бактериальная агрессия, являясь одним из инициирующих факторов возникновения заболеваний пародонта, обуславливает развитие различных форм поражения пародонтального комплекса. Именно поэтому разработка лекарственных средств с бактериостатическим эффектом представляет собой актуальную задачу для стоматологии. В экспериментальных исследованиях выявлено, что действие повреждающего фактора (микробной агрессии) на ткани пародонта вызывает активацию перекисного окисления липидов при параллельном снижении активности антиоксидантных ферментов (цитохромоксидазы, глутатионпероксидазы), что указывает на целесообразность использования для профилактики и лечения заболеваний пародонта комплексных средств, включающих эффективное антимикробное, фунгистатическое начало и, параллельно, антиоксидантные и стабилизирующие мембраны компоненты.

Таким образом, разработка жидкого средства и геля для лечения и профилактики заболеваний пародонта на основе растительного сырья (корневища и корни хрена обыкновенного, бутоны гвоздичного дерева, корневища имбиря, плоды черемухи и эфирное масло чайного дерева), является актуальной задачей, так как предложенные нами в качестве действующих веществ растения по своей биоцидной активности, противовоспалительному и иммуномодулирующему действию эффективнее многих используемых в стоматологической практике, а гель позволяет пролонгировать действие активных компонентов и снижать раздражающее действие за счет вспомогательных веществ.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явились получение и стандартизация лекарственных средств на основе растительного сырья для применения в стоматологической практике (профилактика и лечение заболеваний пародонта). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. обосновать состав многокомпонентной растительной композиции с позиции расширения спектра антибактериальной активности и способности влиять на различные механизмы патогенетического процесса в тканях пародонта;
2. оценить влияние различных факторов на процесс экстракции и определить наиболее оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ (БАВ) из корневища и корней хрена обыкновенного;
3. разработать способы получения жидкого лекарственного средства и стоматологического геля с растительной композицией, их технологические схемы производства;
4. установить показатели качества для жидкого лекарственного средства и стоматологического геля и провести их стандартизацию;
5. обобщить полученные данные и на их основе разработать нормативную документацию (проект фармакопейной статьи - ФС) на жидкое лекарственное средство и стоматологический гель.

Научная новизна работы. Впервые разработан и обоснован состав и соотношение компонентов растительной композиции, входящей в жидкое лекарственное средство и в гель для профилактики и лечения заболеваний пародонта.

На основании методов математического моделирования определены наиболее значимые параметры экстракции для получения водно-спиртовых извлечений из корневища и корней хрена обыкновенного.

На основании изучения химического состава и приоритетности групп БАВ каждого из входящего в состав композиции компонентов, предложены методики определения действующих веществ жидкого лекарственного средства и геля.

Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом № 2259206 от 27 августа 2005 г. «Способ получения средства для лечения заболеваний пародонта»; разработанное средство было представлено на конкурс "Изобретения и инновационные разработки" VI московского международного салона инноваций и инвестиций (7-10 февраля 2006 г.) и было отмечено бронзовой медалью.

Практическая значимость работы. Установлены показатели подлинности, качества и их нормы для полученного жидкого лекарственного средства и стоматологического геля, которые описаны в созданной нормативной документации (проекты ФС).

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс курса стоматологического материаловедения кафедры общей химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Разработаны методические указания к модулю «Клинические стоматологические материалы» раздел «Эвгенолсодержащие материалы» (Контрольно-измерительные материалы для оценки учебно-познавательной деятельности по курсу стоматологического материаловедения, Методическое пособие/ - М.: Медицина для всех, 2007).

Результаты диссертационной работы использованы в проекте «Методическое руководство по определению качества лекарственных форм с экстрактами на основе корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева» (акт внедрения от 30.04.2009).

Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры общей химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические и экологические аспекты)», номер государственной регистрации 01.200.118796.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ХIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.), IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (4-5 июня 2007 г., Москва), Международной научно-практической конференции: «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (г. Шымкент, май 2009 г.), Учебно-методической конференции кафедры общей химии стоматологического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (22 декабря 2010г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК и 1 патент на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. результаты по разработке и обоснованию состава многокомпонентной растительной композиции;
2. результаты исследований по установлению оптимальных технологических условий получения извлечения из корневища и корней хрена обыкновенного;
3. способы получения жидкого лекарственного средства и геля с предложенной растительной композицией и технологические схемы их производства;
4. результаты качественного и количественного анализа действующих веществ, антиоксидантной и антимикробной активности разработанных средств и обоснование методов стандартизации предложенных лекарственных форм.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), собственных исследований (главы 3,4), заключения, выводов, списка литературы, который включает в себя 173 источников, из них 22 на иностранных языках и приложения. Работа иллюстрирована 42 таблицами, 19 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали корневища и корни хрена обыкновенного и бутоны гвоздичного дерева, на основе водно-спиртовых извлечений из которых проводилась разработка жидких лекарственных форм и гелей для лечения и профилактики заболеваний пародонта:

- корневища и корни хрена обыкновенного (Rizomata et radices Armoraciae rustikanae, семейство Brassicaceae - капустные) – стандартизованы в соответствии с общими статьями ГФ XI «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы»;

- бутоны гвоздичного дерева (Alabastra Caryophylli, семейство Myrtaceae - миртовые) – стандартизованы в соответствии с ГОСТами 28875-90-28880-90 «Пряности и приправы. Приемка и методы анализа»;

В качестве дополнительных активных компонентов (с целью расширения спектра антимикробной активности разрабатываемых лекарственных средств) использовали:

- плоды черемухи обыкновенной (Fructus Padi, семейство Rosaceaе – розоцветные) - стандартизованы в соответствии с требованиями фармакопейной статьи 36 ГФ XI и ГОСТ 3318-74;

- корневища имбиря лекарственного (Rhizomata Zingiberis, семейство Zingiberaceae – имбирные) – стандартизованные в соответствии с ГОСТом 29046-91 «Пряности. Имбирь. Технические условия»;

- эфирное масло чайного дерева (Oleum Melaleucae, семейство Myrtaceae - миртовые) – стандартизовано в соответствии с ГОСТ 17-237-93.

Вспомогательные вещества: спирт этиловый производства ООО Производственно-фармацевтическая компания «Фармспирт» (Россия) и вода очищенная (ФС 42 - 2619 –89).

Носители (гелеобразующие вещества):

гидроксипропилцеллюлоза ГПЦ Pharm(«HERCULES», Бельгия) сорта КЛУЦЕЛ, типа MF; гидроксиэтилцеллюлоза ГЭЦ Pharm («HERCULES», Бельгия), сорта НАТРОКСОЛ, типа 250 М; поливиниловый спирт ПВС (ГОСТ 10779-78) производства АЗОТ Борис®-Авогадро; полиэтиленгликолевые основы ПЭГ 400, ПЭГ 1500 марок Лутрол Е 400 и Е 1500 производства BASF; Коллидон марки Коллидон VA 64 производства BASF.

Пластификатор: глицерин производства ОАО «Лабтех» (ГОСТ 6824-76).

Водно-спиртовые извлечения получали по экспериментально разработанной методике методом перколяции в несколько этапов (70% и 40% этиловым спиртом).

Математическое планирование эксперимента по получению водно-спиртовых извлечений и оптимизацию процесса экстракции по наиболее значимым факторам проводили согласно правилам построения многофакторного эксперимента и методу крутого восхождения по Боксу-Уилсону.

При изготовлении стоматологических гелей придерживались общепринятой технологической схемы изготовления мягких лекарственных форм. В качестве активного компонента в гели вводились полученные водно-спиртовые извлечения.

Хроматографический анализ на основные группы БАВ проводили методами тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

При изучении качественного состава извлечений методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) использовали пластины Kieselgel 40 F254 (фирма Меrck, Германия). Анализ флавоноидов проводили в сис­теме растворителей этилацетат-уксусная кислота-вода (30:6:6); кумарины элюировали в смеси толуол-эфир диэтиловый (40:60), насыщенной раствором 10% уксусной кислоты; эфирные масла – в системах растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) и гексан-этилацетат (85:15). Флавоноиды проявляли 5 % спиртовым раствором хлористого алюминия, эфирные масла — раствором анисового альдегида в серной кислоте, кумарины — в УФ-свете после проявления 20% раствором аммиака. В качестве стандартных образцов использовали: рутин, кверцетин, скополетин, эскулетин, эвгенол, ацетэвгенол, кариофиллен, ванилин, гераниол, -пинен, -пинен, борнилацетат, цитраль, 1,8-цинеол.

Идентификацию флавоноидов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием. Условия хроматографического анализа: колонка Phenomenex Luna 5u C18(2), 5µ, 4,6*250, подвижная фаза: фосфорная кислота и ацетонитрил, скорость подачи растворителя 1 мл/мин, длина волны детектора 360 нм, объем вводимой пробы 10 мкл.

Органические кислоты определяли методом ВЭЖХ с фотометрическим детектированием. Условия хроматографического анализа: колонка октадецилсиликагель, 5 m, 250*4,6 мм (Wakosil C18 RS); подвижная фаза: 0,2М фосфатный буфер, рН=2,2; скорость подачи подвижной фазы: 1,0 мл/мин; детектирование: фотометрическое, =210 нм; объем вводимой пробы: 10 мкл; температура 20С.

Содержание антоцианов определяли с помощью рН-дифференциальной спектрофотометрии, качественны состав — с помощью ВЭЖХ. Условия хроматографического анализа: колонка октадецилсиликагель 5мкм, 4,6250 мм (Wakosil SR); подвижная фаза: 4% ортофосфорная кислота (рН 2,1): ацетонитрил (88:12); скорость подачи подвижной фазы: 1,0 мл/мин; детектирование: УФ =510нм; объем вводимой пробы: 10 мкл.

Количественное содержание фенольных соединений определяли спектрофотометрически относительно раствора РСО рутина на приборе «Unix».

Определение содержания экстрактивных веществ (при изучении оптимальных условий получения водно-спиртового извлечения) проводили по методике ГФ XI, вып.1, стр. 295, модифицированной под водно-спиртовое извлечение.

Качество жидкого лекарственного средства контролировали по основным показателям: описание, тяжелые металлы, содержание спирта, или плотность, сухой остаток и микробиологическая чистота (по ГФ XI).

Качество геля контролировали по основным показателям: описание (по ГФ XI), рН (по ГФ XI), структурно-механические свойства (на ротационном вискозиметре ''Полимер — РПЭ — 1М''), осмотическая активность (методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану), способность к высвобождению действующих веществ (методом диффузии в агаровый гель) и стабильность и срок годности методом «ускоренного хранения».

Характер окраски жидких средств и гелей определяли визуально и методом отражательной спектрофотометрии на спектроколориметре «Пульсар», при расчете использовалась система CIELAB.

Определение антимикробной активности проводили «методом цилиндров» в соответствии с ГФ ХI изд., вып. 2, стр. 210-213.

Определение антиоксидантного потенциала проводили на приборе ''Антиоксидант-Яуза'' (производства НПО ХимАвтоматика) с амперометрическим детектором. Условия определения: детектор амперометрический со стеклоуглеродным электродом, рабочая температура — 400С, напряжение на электроде +1,3 В, элюэнт — дистиллированная вода, стандарт — рутин, объем вводимой пробы — 20мкл.

Определение пероксидазной активности проводили на спектрофотометре «Shimadzu UV 120-02» при 250С; метод основан на способности субстратов окисляться пероксидом водорода при активном участии пероксидаз. Определяли пероксидазную активность с гваяколом и ABTS (2,2-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония) в качестве субстратов.

РАЗРАБОТКА ЖИДКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА

Хрен обыкновенный и гвоздичное дерево не являются фармакопейными растениями, но представляют значительный интерес в стоматологии как источник БАВ. Препараты на основе бутонов гвоздичного дерева широко применяются в медицине и стоматологии с давних времен, корневища же и корни хрена обыкновенного менее изучены и пока не применяются в традиционной медицине. Это и обусловило необходимость изучения оптимальных условий получения водно-спиртовых извлечений из подземных органов хрена обыкновенного.

Изучение оптимальных условий получения водно-спиртового извлечения из корневищ и корней хрена обыкновенного

Оценку влияния факторов на процесс экстракции проводили по уравнению регрессии. Поиск оптимальных условий получения водно-спиртового извлечения осуществляли методом крутого восхождения по Боксу-Уилсону.

Изучалось влияние четырех факторов (соотношение сырье-экстрагент (x1), продолжительность процесса экстракции (x2), измельченность сырья (x3) и концентрация экстрагента (x4)) на экстрагирование сырья. Для оценки влияния выбранных факторов на процесс экстрагирования БАВ из корневища и корней хрена обыкновенного был поставлен четырехфакторный эксперимент, в рамках которого было проведено 16 опытов плана типа 24 в двухкратной повторности, и, кроме того, n0=6 опытов в центре его. Разработку оптимального режима экстракции из корневища и корней хрена обыкновенного проводили с использованием приведенных в таблице 1 основных факторов и уровней их варьирования.

Таблица 1

Основные факторы и уровни их варьирования

Характеристика плана	Переменные факторы
	x1	x2	x3	x4
Основной уровень (0)	1:10	45	2	70
Шаг варьирования	1:5	15	1	25
Верхний уровень (+)	1:15	60	3	95
Нижний уровень (-)	1:5	30	1	45

В качестве выходного параметра оптимизации выбраны два фактора — выход экстрактивных веществ (Y, %) и выход флавоноидов (X, %), как основной группы БАВ корневищ и корней хрена обыкновенного.

В результате математической обработки экспериментальных данных получено 2 уравнения регрессии:

• уравнение регрессии с выходным параметром оптимизции — экстрактивные вещества

у=15,934+2,991х1+(-0,582)х2+(-1,456)х3+(-5,573)х4

• уравнение регрессии с выходным параметром оптимизции — флавоноиды у=3,503+0,031х1+0,218х2+(-0,142)х3+(-0,447)х4

Проверка ошибок параллельных опытов и однородности дисперсий по критерию Кохнера (Gэксп.=0,476 и 0,306, Gтабл.=0,734, Gэксп.<Gтабл.), проверка гипотезы об адекватности модели по критерию Фишера (Fэксп.=3,85 и 3,0 Fтабл.(11,5)=4,71 Fэксп.<Fтабл.), значимости коэффициентов регрессии (ti>tтабл., tтабл.=2,57) по доверительному интервалу и критерию Стьюдента при уровне значимости 0,05 показала, что приведенные уравнения адекватно описывают рассматриваемый процесс получения извлечения из корневищ и корней хрена обыкновенного.

Анализ знаков коэффициентов уравнений регрессии позволяет сделать вывод, что выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов из корневищ и корней хрена обыкновенного возрастает при увеличении соотношения сырье-экстрагент, а также при уменьшении измельченности сырья и концентрации спирта в экстрагирующем растворе. Продолжительность процесса экстракции сказывается положительно на выходе суммы флавоноидов. Наибольшее влияние на процесс экстракции оказывает концентрация экстрагента (коэффициенты уравнений регрессии 5,573 и 0,447 для экстрактивных веществ и флавоноидов соответственно).

Оптимизацию процесса экстрагирования проводили методом крутого восхождения по наиболее значимому фактору — концентрации экстрагента.

На данном этапе исследований определяли выход экстрактивных веществ и флавоноидов при обработке сырья (корневища и корни хрена обыкновенного) этанолом различной концентрции. Для повышения выхода действующих веществ было проведено исследование влияния кратности процесса экстракции на выход суммы экстрактивных веществ и флавоноидов. Экстракцию проводили однократно и двухкратно (табл. 2, 3).

Таблица 2

Содержание экстрактивных веществ (схема опытов крутого восхождения по фактору Х4-концентрация экстрагента)

	70% этанол	65% этанол	60% этанол	55% этанол	50% этанол	45% этанол	40% этанол	35% этанол
1-кратная экстракция	16,50% ±0,34	16,75% ±0,34	17,26% ±0,35	17,94% ±0,35	18,67% ±0,37	18,30% ±0,37	18,30% ±0,37	18,65% ±0,37
2-кратная экстракция	19,51% ±0,40	22,67% ±0,45	23,56% ±0,47	24,10% ±0,48	34,85% ±0,70	33,74% ±0,67	33,72% ±0,67	32,34% ±0,65

Таблица 3

Содержание суммы флавоноидов (схема опытов крутого восхождения по фактору Х4-концентрация экстрагента)

	70% этанол	65% этанол	60% этанол	55% этанол	50% этанол	45% этанол	40% этанол	35% этанол
1-кратная экстракция	2,45% ±0,05	2,97% ±0,06	3,245% ±0,06	3,87% ±0,08	4,140% ±0,08	4,24% ±0,08	4,37% ±0,08	4,27% ±0,08
2-кратная экстракция	2,99% ±0,06	3,125% ±0,06	3,76% ±0,07	4,02% ±0,08	4,98% ±0,09	5,10% ±0,09	5,29% ±0,10	5,015% ±0,10

С целью более полного извлечения всего комплекса биологически активных веществ (БАВ) из сырья проводили последовательную экстракцию этанолом различных концентрации (при этом получаются фракции, содержащие различный набор БАВ). На первой стадии использовали 70% этиловый спирт для извлечения веществ терпеноидной природы (аллилгорчичное масло хрена обыкновенного, синегрин, лиоподобные соединения), последующую экстракцию проводили 50% или 40% этанолом, что позволяет извлечь биологически активные вещества флавоноидной и полифенольной природы и их гликозидированные производные. Далее полученные извлечения объединяли и определяли содержание экстрактивных веществ и флавоноидов в % (табл. 4).

Таблица 4

Выход экстрактивных веществ и флавоноидов при последовательной экстракции сырья этанолом различных концентраций

Используемые экстрагенты	70% и 40% этанол	70% и 50% этанол
Выход экстрактивных веществ, %	48,83% ± 0,97	39,73% ± 0,80
Выход флавоноидов, %	4,99% ± 0,10	4,44% ± 0,09

Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее полное извлечение БАВ происходит при последовательной обработке сырья 70%, а затем 40% этанолом, такая последовательность использования экстрагентов и рекомендована для получения водно-спиртового извлечения из корневища и корней хрена обыкновенного.

На основании проведенных исследований была разработана технологическая схема получения водно-спиртового извлечения. Навеску измельченного сырья, проходящего сквозь сито с диаметром 2 мм, экстрагируют в два этапа, сначала более крепким (70%), затем менее крепким этиловым спиртом (40%) в соотношении сырье-экстрагент 1:10. Это позволяет максимально истощить сырье. Экстракцию проводят в течение 45 минут, при комнатной температуре во избежание потерь летучих компонентов.

Получение водно-спиртовых извлечений из корневищ и корней хрена обыкновенного, из бутонов гвоздичного дерева и объединенного извлечения из обоих видов сырья

В аналогичных условиях было получено извлечение из бутонов гвоздичного дерева, а также объединенное извлечение из корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева (в соотношении 7:3). Характеристики полученных извлечений приведены в таблице 5.

Таблица 5

Характеристики водно-спиртовых извлечений

Водно-спиртовое извлечение	Описание	Плотность, г/мл
Извлечение из корневищ и корней хрена обыкновенного	Прозрачная жидкость желто-зеленого цвета с характерным запахом и пряно-горьким вкусом.	0,9410±0,028
Извлечение из бутонов гвоздичного дерева	Прозрачная жидкость коричневого цвета, имеющая приятный ароматический запах лекарственных трав и горковато-пряный вкус.	0,9320±0,028
Объединенное извлечение	Прозрачная жидкость желто-красного цвета с характерным запахом и пряно-горьким вкусом.	0,9500±0,029

Спектральные характеристики полученных водно-спиртовых извлечений

В ходе контроля часто возникают затруднения в определении оттенков цвета, поэтому актуальным вопросом является разработка методик адекватного определения цветности с помощью объективных методов анализа. Определение цветности водно-спиртовых извлечений из ЛРС проводили методом отражательной спектрофотометрии (рис. 1).

Рис. 1. Спектры пропускания водно-спиртовых извлечений из корневища и корней хрена обыкновенного, бутонов гвоздичного дерева и объединенного извлечения.

Анализируя представленные спектры пропускания, следует отметить, что спектр образца объединенного извлечения является «усредненным» вариантом спектров пропускания моноизвлечений, при этом он сохраняет отличительные черты спектров извлечения из корневища и корней хрена обыкновенного и извлечения из бутонов гвоздичного дерева. Спектр объединенного извлечения имеет некоторое снижение R (%) в области длин волн 600-620 нм и увеличение (пик) R (%) при 490 нм, что характерно для извлечения из бутонов гвоздичного дерева, а при длинах волн 410-430 нм наблюдается плато, характерное для извлечения из корневища и корней хрена обыкновенного. Подобное сохранение индивидуальности позволяет детерминировать внутри объединенных извлечений индивидуальные компоненты и может быть использовано при анализе данных извлечений по показателю «подлинность». По программам, приложенным к прибору, рассчитывали цветовые характеристики по системе CIELAB. Показатели цветового тона H0 извлечения из бутонов гвоздичного дерева и объединенного извлечения попадают в предел значений H0 72-104 и соответствует цветовому оттенку — желтый, а извлечения из корневища и корней хрена обыкновенного — в предел 104-153 и соответствует цветовому оттенку — желто-зеленый.

Разработка технологической схемы получения комплексного извлечения.

Нами предложено стоматологическое средство, в состав которого кроме корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева были введены плоды черемухи, корневища имбиря и эфирное масло чайного дерева (табл. 6).

Таблица 6

Средство для лечения заболеваний пародонта.

компоненты	вес.ч.	Состав №1 (с min содержанием компанентов)	Состав №2 (с max содержанием компанентов)
Плоды черемухи	2,0—3,0	2,0	3,0
Корневища и корни хрена	4,0—5,5	4,0	5,5
Бутоны гвоздичного дерева	2,0—2,5	2,0	2,5
Корневища имбиря	1,5—2,5	1,5	2,5
Эфирное масло чайного дерева	0,5—1,5	0,5	1,5

соотношение сырье : экстрагент 1:6,7—10

На основе разработанной композиции (табл. 6) путем последовательной перколяции 70%, а затем 40% этанолом (при соотношении сырье : экстрагент 1:6,7-10) получают водно-спиртовое извлечение. Применение метода перколяции вместо мацерации позволяет более полно извлекать весь комплекс БАВ за счет более высокого градиента концентрации, который создается при пропускании чистого экстрагента через сырье. При этом переход от мацерации к перколяции не сопровождается увеличением времени, которое затрачивается на процесс экстракции.

Анализ и стандартизация комплексного средства для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта.

Полученное комплексное средство относится к жидким спиртосодержащим фитопрепаратам. В действующей ГФ XI изд. содержатся общие статьи на такие лекарственные формы как «Настойки» и «Экстракты», для которых обязательными являются следующие показатели: описание, подлинность, тяжелые металлы, содержание спирта, или плотность, сухой остаток, количественное определение и микробиологическая чистота. Аналогичные испытания указаны в ГОСТе Р 51577-2000 «Средства гигиены полости рта жидкие». Мы в своих исследованиях также придерживались общих требований. Все количественные результаты приведены для 2-х композиций с минимальным и максимальным содержанием компонентов (соотношение компонентов приведено в вес.ч.) (табл. 6).

«Описание». Средство представляет собой прозрачную жидкость коричневого цвета, имеющую приятный ароматический запах лекарственных трав и горковато-пряный вкус. Характер окраски полученного средства определяли также методом отражательной спектрофотометрии на спектроколориметре «Пульсар». Показатели цветового тона H0 попадают в предел значений H0 72-104 и соответствует цветовому оттенку — желтый.

«Подлинность» и «Количественное определение».

Для определения состава и количества БАВ, содержащихся в полученном средстве, применялись хроматографические и спектральные методы исследований.

Идентификация и количественное определение флавоноидов

Согласно наработанным ранее данным, флавоноиды являются БАВ корневища и корней хрена обыкновенного, плодов черемухи обыкновенной, следовыми количествами представлены в корневищах имбиря аптечного, что предопределяет их определение для идентификации полученного средства.

Методом тонкослойной хроматографии в присутствии свидетелей идентифицированы рутин (Rf=0,26) и кверцетин (Rf=0,82). Методом ВЭЖХ в исследуемом средстве обнаружены следующие соединения из группы флавоноидов: рутин, гиперозид, витексин, астрагалин, кверценин (рис.2, табл.7).

Рис. 2. Хроматограмма (ВЭЖХ) флавоноидных соединений средства для лечения и профилактики заболеваний пародонта (состав №1)

Таблица 7

Содержание флавоноидных соединений в средстве (состав №1)

Пик	Время удерживания, мин	Исследуемый показатель	Содержание, мг/л
1.	6,551	рутин	2,4
2.	7,087	гиперозид	1,1
3.	7,234	витексин	2,3
4.	8, 394	астрагалин	2,2
5.	12,743	квертецин	1,2

В составе №2 методом ВЭЖХ определено: рутина-2,6 мг/л, гиперозида-1,2 мг/л, витексина-2,5 мг/л, астрагалина-2,4 мг/л, кверцетина-1,3 мг/л.

Идентификация кумаринов

Методом ТСХ в присутствии свидетелей идентифицированы кумарины, характерные для сырья корневища и корни хрена обыкновенного. При рассматривании в УФ-свете (=360 нм) на хроматограмме обнаруживались флуоресцирующие пятна:Rf=0,22- голубое (эскулетин) и Rf=0,26 – фиолетовое (скополетин).

Определение содержания антоцианов

Поставщиком антоцианов в комплексное средство являются плоды черемухи обыкновенной. Суммарное содержание антоцианов и качественный состав представлены в таблице 9 и на рисунке 4.

Рис. 4. Хроматограмма (ВЭЖХ) антоцианов средства для лечения и профилактики заболеваний пародонта (состав №1)

Таблица 9

Относительное содержание индивидуальных антоцианов в средстве

для лечения и профилактики заболеваний пародонта (состав №1)

содержание в продукте, %	индивидуальные антоцианы	время удерживания, мин	относительное содержание, %
0,0005	Cyd-3-glu	10,486	16
	Ptd-3-gal	12,356	14
	Cyd-3-ara	12,526	24
	Ptd-3-glu	13,011	33
	Mvd-3-gal	14,660	6
	Mvd-3-glu	15,132	7

В составе №2 методом ВЭЖХ определено 0,0006% антоцианов с идентичным относительным содержанием индивидуальных антоцианов.

Определение органических кислот

Методом ВЭЖХ в полученном средстве идентифицированы яблочная, шикимовая и лимонная кислоты (рис.3, табл.8).

Рис. 3. Хроматограмма (ВЭЖХ) органических кислот средства для лечения и профилактики заболеваний пародонта (состав №1)

Таблица 8

Содержание органических кислот в средстве (состав №1)

Пик	Время удерживания, мин	органические кислоты	содержание, г/л
1.	4,974	яблочная кислота	1,0
2.	5,665	шикимовая кислота	0,02
3.	11,610	лимонная кислота	0,63

В составе №2 методом ВЭЖХ определено: яблочная кислота-1,05 г/л, шикимовая кислота-0,022 г/л, лимонная кислота-0,68 г/л.

Определение эфирных масел

Для анализа летучих компонентов средства применяли метод ТСХ со свидетелями (табл. 10), в средстве установлено присутствие эвгенола, ацетэвгенола, кариофиллена, ванилина, гераниола, -пинена, -пинена, борнилацетата, цитраля,1,8-цинеола.

Таблица 10

Результаты идентификации компонентов эфирных масел лекарственного препарата «Средство для лечения заболеваний пародонта» методом ТСХ.

Условия хроматографирования	Rf	Rf РСО	Идентифицировано
Сорбент: силикагель марки Kieselgel 60 F254 Система растворителей: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) Проявитель: раствор анисового альдегида в H2SO4	0,22 0,38 0,45 0,57 0,62 0,65 0,91 0,93	эвгенол Rf = 0,57 ацетэвгенол Rf = 0,91 кариофиллен Rf =0,93 ванилин Rf =0,62	эвгенол, ацетэвгенол, кариофиллен, ванилин
Сорбент: силикагель марки Kieselgel 60 F254 Система растворителей: гексан-этилацетат (85:15) Проявитель: раствор анисового альдегида в H2SO4	0,21 0,25 0,32 0,34 0,42 0,45 0,47 0,53 0,64 0,72 0,92	гераниол Rf =0,25 -пинен Rf =0,45 -пинен Rf =0,34 борнилацетат Rf =0,72 цитраль Rf =0,53 1,8-цинеол Rf =0,47	гераниол, -пинен, -пинен, борнилацетат, цитраль, 1,8-цинеол

Определение суммы фенольных соединений

Для количественного определения суммы фенольных соединений за основу взят спектрофотометрический метод после проведения реакции комплексообразования с хлоридом алюминия в пересчете на рутин. Выбор аналитической длины волны (415 нм) был осуществлен на основе совпадения максимумов поглощения окрашенных комплексов рутина и суммы фенольных соединений корневищ и корней хрена обыкновенного, а также плодов черемухи обыкновенной, которые являются основными поставщиками флавоноидных соединений в лекарственный препарат. В результате исследования на пяти экспериментальных сериях лекарственных средств (составов №1 и №2) установлено, что содержание суммы фенольных соединений в пересчете на рутин — 0,28%0,013 (2,671 г/л ±0,124) и 0,37%±0,016 (3,534 г/л ±0,154) для составов №1 и №2 соответственно. Метрологические характеристики анализа приведены в таблице 11.

Таблица 11

Метрологические характеристики содержания фенольных соединений

Состав	Единицы измерения	n	f	P, %	t (P,f)	Содержание фенольных соединений	S2	S	Sx	x	E%
№1	Х,%	5	4	95	2,78	0,28	0,00011	0,0105	0,0235	0,013	4,65
	С, г/л	5	4	95	2,78	2,671	0,0099	0,0999	0,2235	0,124	4,65
№2	Х, %	5	4	95	2,78	0,37	0,00017	0,013	0,0291	0,016	4,36
	С, г/л	5	4	95	2,78	3,534	0,0154	0,124	0,2776	0,154	4,36

Методом добавок выявлено отсутствие систематической ошибки (табл.12).

Таблица 12

Результаты количественного определения суммы фенольных соединений с использованием метода добавок

№ п/п	Содержание фенольных соединений в пробе, г	Добавлено рутина, г	Должно быть, г	Найдено, г	Абсолют. ошибка, г	Относит. ошибка, %
1.	0,0125	0,0010	0,0135	0,0129	-0,0006	-4,44
2.	0,0125	0,0015	0,0140	0,0144	0,0004	+2,86
3.	0,0130	0,0020	0,0150	0,0155	-0,0005	+3,33
4.	0,0130	0,0025	0,0155	0,0161	0,0006	+3,87
5.	0,0135	0,0030	0,0165	0,0159	-0,0006	-3,63

Относительная ошибка единичного определения находится в пределах случайной ошибки и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.

«Содержание спирта этилового». Определяли по температуре кипения и оно составило 45 и 43% для состава №1 и №2 соответственно.

«Тяжелые металлы». Проводили определение тяжелых металлов, содержание которых не превышало 0,002%.

«Микробиологическая чистота». Полученные жидкие лекарственные средства соответствуют данному показателю, в соответствии с которым такие препараты должны содержать не более 5103 аэробных бактерий, 102 дрожжевых плесневых грибов при отсутствии Pseudomonas aureginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella и не более 102 других кишечных бактерий.

Биологические исследования жидких лекарственных средств

Определение антимикробной активности

Исследование антимикробной активности проводили методом цилиндров, в соответствии с ГФ ХI изд. Результаты исследований представлены в таблице 13.

Таблица 13

Средние значения диаметра зон задержки роста тестовых культур под действием фитопрепаратов

Водно-спиртовые извлечения	Значения диаметра зоны задержки роста, мм
	St. aureus	Ps. aeruginosa	E. Coli	C. utilis
из корневищ и корней хрена обыкн.	2,2	9,0	0,1	7,2
из бутонов гвоздичного дерева	3,2	7,1	5,1	7,2
из корневища и корней хрена обыкн. и бутонов гвоздичного дерева	5,0	9,0	3,1	8,2
Состав №1	6,0	9,5	4,2	8,7
Состав №2	6,5	10,3	4,5	9,2

По результатам испытаний образец-извлечение из корневища и корней хрена обыкновенного не обладает бактерицидной активностью в отношении Е. Coli; обладает слабой бактерицидной активностью в отношении S. Aureus; обладает бактерицидной активностью в отношении Ps. Aeruginosa и обладает фунгицидной активностью в отношении C. Utilis.

Образец-извлечение из бутонов гвоздичного дерева обладает слабой бактерицидной активностью в отношении S. Aureus ; обладает бактерицидной активностью в отношении Е. Coli и Ps. Aeruginosa; обладает фунгицидной активностью в отношении C. Utilis.

Образец-извлечение из корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева обладает слабой бактерицидной активностью в отношении Е. Coli; обладает бактерицидной активностью в отношении S. Aureus и Ps. Aeruginosa; обладает фунгицидной активностью в отношении C. Utilis.

Наибольшей антимикробной активностью обладают комплексные составы.

Определение антиоксидантной активности

Антиоксидантная активность средства в зависимости от соотношения компонентов в пересчете на рутин составила 5,9-8,2 мг/мл (определяли амперометрически, на основе окислительно-восстановительного потенциала).

Определение пероксидазной активности

Проведено исследование пероксидазной активности корневища и корней хрена в зависимости от навески сырья и используемого экстрагента (измерения проводились в водном и кальциевом экстрактах с использованием гваякола и ABTS в качестве субстратов). Метод основан на способности субстратов окисляться перекисью водорода при активном участии пероксидаз. Результаты приведены в таблице 14.

Таблица 14

Ферментативная активность пероксидазы корневища и корней хрена обыкновенного в зависимости от навески сырья

	Водное извлечение					Кальциевое извлечение 5%
Навеска, г	0,25	0,5	1,0	1,5	2,0	0,25	0,5	1,0	1,5	2,0
А(ABTS), Е/мл	0,283	0,495	0,991	1,345	2,194	1,592	3,184	6,016	8,421	8,845
А(Гваякол), Е/мл	0,177	0,310	0,620	0,840	1,371	0,995	1,990	3,760	5,263	5,528

В водном извлечении с увеличением навески ферментативная активность пероксидазы увеличивается незначительно, в случае кальциевого извлечения пероксидазная активность значительно выше, что объясняется присутствием иона кальция в составе молекулы пероксидазы хрена. Таким образом, в итоговую композицию жидкого лекарственного средства рекомендовано добавлять хлорид кальция для повышения пероксидазной активность, что позволяет использовать средство в качестве дезинфицирующего, а также для предотвращения перекисного окисления в пораженных тканях пародонта.

Для изучения стабильности пероксидазной активности в образцах была использована радиационная инактивация, что может служить моделью радикалообразующих процессов. Наблюдалась достаточно высокая стабильность пероксидазной активности и в водном, и в кальциевом экстракте, что может свидетельствовать об отсутствии глобальных повреждений субстрат-связывающих центров даже при 45 Гр и позволяет сделать вывод о возможности длительном хранения препарата на основе экстракта корневища и корней хрена обыкновенного без изменения его полезных свойств.

При изучении стабильности «Средства для лечения заболеваний пародонта» установлено, что все показатели качества при его хранении во флаконах из темного стекла и при комнатной температуре остаются в норме в течение 2 лет.

На основании проведенных исследований предложен проект ФС на разработанное «Средство для лечения заболеваний пародонта».

РАЗРАБОТКА МЯГКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ ВОДНО-СПИРТОВЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ИЗ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ ХРЕНА ОБЫКНОВЕННОГО И БУТОНОВ ГВОЗДИЧНОГО ДЕРЕВА

Объектами исследования служили водно-спиртовые извлечения из корневища и корней хрена обыкновенного, из бутонов гвоздичного дерева и объединенное извлечение из корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева, которые вводились в состав гелей (извлечения предварительно упаривали в 2 раза).

При изготовлении стоматологических гелей придерживались общепринятой технологической схемы приготовления мягких лекарственных форм. В качестве гелеобразователей использовались ГЭЦ, ГПЦ (2-4%), а также различные марки ПЭГ: 400 (20-40%), 1500 (20-40%) и ПВС. Объединенное извлечение из корневища и корней хрена и бутонов гвоздичного дерева вводилось в количестве 25%. В процессе работы были исключены из эксперимента основы ПВС и основы из смеси ПЭГ-400 и ПЭГ-1500 в различных соотношениях как не соответствующие реологическим характеристикам, не образующие структуры геля (за счет высокого содержания спирта, в котором они растворимы). Также отказались от 2% и 3% гелей ГПЦ и ГЭЦ как не имеющих структуры геля и вытекающих из туб. Отбраковали все гели на ГПЦ, т.к. проявлялась фармацевтическая несовместимость, выражавшаяся в «высаливании» основы, при введении в данный гель объединенного извлечения. При использовании однокомпонентных извлечений, подобный эффект наблюдался только при введении в гелевую композицию извлечения из бутонов гвоздичного дерева, гель с извлечением из корневищ и корней хрена обыкновенного получался однородным. Помимо основы и водно-спиртовых извлечений из ЛРС в состав прописей вводили местный анестетик лидокаин (2,5%) для купирования болевого синдрома и хлорид кальция (5%) для увеличения пероксидазной активности. В качестве подсластителя в гель вводили ''Цикламат натрия''.

Методика получения геля: к сухой основе (4% ГЭЦ) одномоментно прилить весь объем жидкости (вода и водно-спиртовое извлечение с добавлением лидокаина и кальция хлорида), тщательно перемешать в течение 1 минуты и оставить до образования структуры геля. Затем при легком перемешивании ввести глицерин и цикламат.

Полученные гели представляют собой полупрозрачную массу, желто-зеленого или желтого цвета (показатели цветового тона H0 составили 118,9; 73,3; 70,9 для геля с извлечением из корневища и корней хрена, геля с извлечением из бутонов гвоздичного дерева и геля с объединенным извлечением соответственно) с характерным запахом. рН исследуемых образцов составило 6,8—7,07, что является удовлетворительным показателем для гелей, предназначенных для лечения заболеваний пародонта.

Результаты проведенного анализа методом ТСХ показали, что в водно-спиртовых извлечениях и в гелях на их основе обнаружены идентичные БАВ из группы флаводоидов (рутин, кверцетин), кумаринов (скополетин, эскулетин) и эфирных масел (эвгенол, ацетэвгенол).

При разработке метода стандартизации по показателю «количественное определение» полученного стоматологического геля использовали группу фенольных соединений. Метрологические характеристики методики приведены в таблице 15.

Таблица 15

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин в геле (с объединенным извлечением) методом спектрофотометрии.

n	f	Р%	t (Р,f)	_ Х%	S2	S	_ Sх	_ Х	_ E%
5	4	95	2,78	0,1504	0,0000083	0,0029	0,0013	0,0016	±1,07

Оценку способности гелей высвобождать действующее вещество проводили методом диффузии в агаровый гель. В качестве индикатора используется FeCl3, который в комплексе с фенольными соединениями дает интенсивно бурое окрашивание. По величине зон окрашивания судили о степени диффузии лекарственного вещества из геля. Лучшие результаты высвобождения активных компонентов из гелей показали составы на 4% ГЭЦ. Определено время активного высвобождения фенольных соединений –20 минут. Результаты эксперимента представлены в таблице 16.

Таблица 16

Динамика окрашивания зон агара при исследовании высвобождения

Образец / время	5мин	10мин	15мин	20мин	30мин	40мин	50мин	60мин
	Среднее значение зоны окрашивания по трем измерениям, мм
Гель с объед извлечением	8,0±0,1	9,3±0,7	10,3±0,7	10,3±0,8	11,3±0,9	11,3±0,9	12,3±1,0	12,3±1,0

Консистентные свойства геля, показавшего лучшие результаты по высвобождению действующих веществ, изучали на приборе ''Полимер—РПЭ—1М''. По рассчитанным значениям эффективной вязкости гелей построена логарифмическая зависимость эффективной вязкости от напряжения сдвига, которая обратно пропорциональна и характеризует гели как структурированную систему.

Для определения тиксотропных свойств гелей исследована зависимость касательного напряжения сдвига от скорости сдвига. Наличие петли гистерезиса служит подтверждением наличия тиксотропности исследуемой системы. Гель проходит через район реологического оптимума намазываемости, что свидетельствует об удовлетворительных свойствах гелей.

Исследована осмотическая активность гелей (по степени поглощения воды методом равновесного диализа), которая составляет почти 50% (за 2 часа), гель обладает умеренной осмотической активностью.

Изучена антимикробная активность гелей (табл. 17), гель с объединенным извлечением оказывается с более широким спектром бактерицидной активности, что аналогично полученным данным по антимикробной активности водно-спиртовых извлечений. Можно отметить, что в гелях сохраняется достаточно высокая антимикробная активность с тем же спектром действия, что и у исходного водно-спиртового извлечения.

Таблица 17

Антимикробная активность гелей

Гель с извлечением из	Тест-микроорганизмы / Величина зоны задержки роста
	St. aureus	Ps. Aeruginosa	E. coli	C. utilis
корневищ и корней хрена обыкн.	0,2	3,0	0,1	3,0
бутонов гвоздичного дерева	1,2	3,2	3,0	3,2
корневища и корней хрена обыкн. и бутонов гвоздичного дерева	2,5	4,2	2,2	3,2

Изучена стабильность гелей при хранении в естественных условиях и по методу ''ускоренного хранения''. Гели стабильны в течение 4 месяцев (время наблюдения), рассчитанный срок годности составляет 9 месяцев.

Таким образом, на основании проведенных исследований в качестве геля для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта предложен состав:

Водно-спиртовое извлечение из корневища и корней

хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева 25,0 ГЭЦ 4,0 Лидокаина гидрохлорид 2,5 Кальция хлорид 5,0 Цикламат q.s. Глицерин 10,0 Вода до 100,0

Разработанная лекарственная форма — гель с объединенным водно-спиртовым извлечением из корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева — расширяет арсенал средств для лечения и профилактики заболеваний пародонта. На разработанный гель предложен проект ФС.

ВЫВОДЫ

1. Установлены оптимальные условия экстракции БАВ (по уравнению регрессии, методом крутого восхождения) из корневища и корней хрена обыкновенного. Разработана методика получения водно-спиртовых извлечений из корневища и корней хрена обыкновенного, из бутонов гвоздичного дерева и объединенного извлечения.

2. Определены спектральные характеристики полученных водно-спиртовых извлечений методом отражательной спектрофотометрии; в комплексных извлечениях сохраняется индивидуальность спектров пропускания компонентов композиции, что позволяет детерминировать внутри объединенных извлечений индивидуальные компоненты, и может быть использовано при анализе данных извлечений по показателю «подлинность».

3. Теоретически обоснован и экспериментально разработан состав нового экстракционного «Средства для лечения заболеваний пародонта», содержащего плоды черемухи, корневища и корни хрена, бутоны гвоздичного дерева, корневища имбиря и эфирное масло чайного дерева.

4. Проведена стандартизация «Средства для лечения заболеваний пародонта» по основным показателям: цвет (визуально и методом отражательной спетрофотометрии), запах, вкус, подлинность (ТСХ и ВЭЖХ на вещества полифенольной природы, терпеноидной природы, органические кислоты, антоцианы), количественное определение (суммы фенольных соединений — не менее 2,5 г/л в пересчете на рутин, суммы антоцианов — не менее 0,0005%), антимикробная активность (умеренная), антиоксодантная активность (5,9—8,2 мг/мл в пересчете на рутин), пероксидазная активность.

5. Проведена разработка состава, технологии получения и показателей качества лекарственной формы — геля с водно-спиртовым извлечением из корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева. Для оценки качества геля предложено использовать следующие показатели — внешний вид, величина рН, осмотическая и антимикробная активности, подлинность (методом ТСХ) и количественное определение (суммы фенольных соединений 0,15%±0,002). Подтверждена сохранность в геле БАВ, присущих водно-спиртовому извлечению.

6. Изучена стабильность гелей при хранении в естественных условиях (4 месяца) и по методу ''ускоренного хранения'' (9 месяцев); стабильность «Средства для лечения заболеваний пародонта» в естественных условиях — 2 года.

7. Предложены проекты фармакопейных статей на разработанные гель и жидкое лекарственное средство.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аверцева И.Н., Александрова Е.Ю., Бекетов Е.В., Кондрашев С.В., Нейман П.Л., Нестерова О.В., Орлова С.Н., Решетняк В.Ю., Таланова С.А. Патентное изобретение № 2259206 РФ. Способ получения средства для лечения заболеваний пародонта. // "Бюллетень Федерального Института промышленной собственности. Изобретения. Полезные модели"— Москва, 2005. — №24 (IIч.) — С. 398.
2. Нейман П.Л.. Александрова Е.Ю., Ермакова В.Ю.. Кондрашев С.В., Нестерова О.В. Разработка геля на основе объединенных экстрактов корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева для применения в стоматологической практике. // Приоритеты фармацевтической науки и практики. — Материалы заочной международной конференции.— Россия, 2006.-С.218-220.
3. Александрова Е.Ю., Орлова М.А., Нейман П.Л. Изучение пероксидазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена и ее стабильности к различным воздействиям. // Вестник Московского Университета-Сер.2. Химия-Москва, 2006. -Т.47-№5-С.350-352.
4. Нейман П.Л., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Поиск нового средства для лечения заболеваний пародонта. // Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья.- Материалы конференции.- Ташкент, 2006.-С.95-96.
5. Нейман П.Л., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Оценка эффективности средства для лечения заболеваний пародонта. // Сборник тезисов 14 Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М.: Медицина, 2007.—С.569-570.
6. Нейман П.Л., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Количественная оценка содержания фенольных соединений в препаратах на основе экстракта корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дерева. // Сборник тезисов 14 Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М.: Медицина, 2007.—С. 854-855.
7. Нейман П.Л., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Перспективы использования фитопрепаратов для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта. // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты.- Сборник научных трудов.- М.: РАЕН, 2007.-С.135-140.
8. Нейман П.Л Анализ и стандартизация комплексного экстракта для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта. // Фармацевтический вестник Узбекистана.- Ташкент, 2007.-С.22-25.
9. Нейман П.Л., Нестерова О.В., Попков В.А., Кондрашев С.В. Экстракты корневища и корней хрена обыкновенного в стоматологической практике: активность, стабильность и перспективы использования. // Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства. - Материалы международной научно-практической конференции. – Шымкент, 2009.-Т.2-С.335-338.
10. Нейман П.Л., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Идентификация и количественное определение эвгенола в составе жидких лекарственных форм для лечения заболеваний тканей пародонта. // Стоматология XXI века. Эстафета поколений. – Сборник трудов научно-практической конференции, посвященной 5-летию студенческого научного общества стоматологического факультета. - М., 2009.-С.99-100.