Изучение химического состава и разработка способов идентификации перца опьяняющего в бадах, фитопрепаратах и сырье для их изготовления

На правах рукописи

Чукарин Андрей Валерьевич

Изучение химического состава и

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ПЕРЦА ОПЬЯНЯЮЩЕГО В БАДах, ФИТОПРЕПАРАТАХ и
СЫРЬЕ для их изготовления

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент

Малкова Тамара Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор,

Фурса Николай Сергеевич

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

доктор фармацевтических наук, профессор

Лазарян Джон Седракович

ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 22 ноября 2011 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru
«19» октября 2011 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://www.pfa.ru «19» октября 2011 г.

Автореферат разослан «14» октября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние два десятилетия большое распространение во всем мире получили фитопрепараты и биологически активные добавки к пище (БАД), содержащие измельченные части или экстракты наземных и подземных органов растения перец опьяняющий (кава-кава, Piper methysticum).

Ежегодно на островах Тихого океана заготавливается до 8000 т корневищ кава-кавы, не менее 50% из которых идет на экспорт. До 2002 года рынок в странах Европейского Союза, США, Канаде, Японии, Китае неуклонно рос: только в Германии за 2002 г. было выпущено более миллиона капсул и таблеток фитопрепаратов и БАД к пище с субстанцией П. опьяняющего (Duopharm, Ratiopharm и др.), которые предназначались, в основном, для борьбы с бессонницей.

С 2002 года в США, Канаде, Австралии, Германии, Франции было зафиксировано и подтверждено несколько десятков случаев серьезных повреждений функции печени в результате приема добавок с кава-кава (в нескольких случаях с летальным исходом). В ходе последующих клинических и научных исследований выяснилось, что основные действующие вещества П. опьяняющего, кавалактоны, помимо положительной роли при лечении целого ряда нозологий, гепатотоксичны, обладают тератогенным действием, их применение вызывает привыкание, а злоупотребление приводит к зависимости. Кроме того, они необратимо связываются с глутатионом, одним из важнейших компонентов системы антиоксидантной защиты организма, экстракты из-за высокого содержания в них кавалактонов ингибируют при этом до 30 раз больше глутатиона, чем тоже количество растительного сырья кава-кава.

В течение 2002-2003 гг. в странах Европейского Союза, в Австралии, Канаде и США было принято решение о запрете использования любых частей растения и его экстрактов в БАД к пище, безрецептурных лекарственных препаратах и фитофармацевтических средствах. Это переориентировало фирмы-производители на страны, в которых еще не существовало законодательного запрета на использование кава-кава. Именно на этот период приходится всплеск активности фирм-производителей в РФ – только официально было зарегистрировано и выпускалось 14 пищевых добавок, в составе которых содержались субстанции кава-кава.

Постоянным комитетом по контролю наркотиков с 2003 г. перец опьяняющий был внесен в Список №1 сильнодействующих веществ. Однако практика показала, что в обороте на территории РФ оставались БАД к пище, содержащие кава-кава, зарегистрированные до 2003 г., а также БАД, содержащие вещества из этого растения, реализуемые по фальсифицированным регистрационным удостоверениям. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 06.10.2004 г. растение было запрещено к использованию в составе БАД к пище, а оборот существовавших добавок на территории РФ приостановлен.

Постановлением Правительства РФ от 29 декабря 2007 г. перец опьяняющий и вещества, входящие в него, отнесены к сильнодействующим веществам, крупный размер (граммов свыше) для целей статьи 234 Уголовного Кодекса РФ (незаконный оборот сильнодействующих или ядовитых веществ в целях сбыта) определен в размере 10 г.

В ноябре 2008 г. с некоторыми ограничениями был отменен запрет на торговлю растением кава-кава, действовавшем с 2002 года на территории стран Европейского Союза, субстанции растения снова стали попадать на российский рынок, хотя в нашей стране запрет на использование в БАД к пище П. опьяняющего сохраняется, а вещества из него находятся в списке сильнодействующих.

Поэтому актуальным явилось изучение основных групп биологически активных веществ, содержащихся в кава-кава, разработка надежных способов идентификации этого растения и его субстанций в анализируемых объектах.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы – изучить химический состав, установить количественные характеристики основных биологически активных веществ, разработать достоверные способы идентификации П. опьяняющего (кава-кава, Piper methysticum) в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи.

• Разработать скрининговые экспрессные методики (предварительные способы) идентификации сырья перца опьяняющего в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье с помощью проведения цветных химических тестов и метода хроматографии в тонком слое.
• Разработать методики (подтверждающие способы) идентификации сырья перца опьяняющего в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье с помощью метода хромато-масс-спектрометрии.
• Установить количественное содержание и соотношение основных биологически активных веществ в корневищах перца опьяняющего (сортов Isa, Kuma Kua) и БАД к пище, содержащей экстракт корневищ Piper methysticum, методом хромато-масс-спектрометрии.
• Установить макро-, микроэлементный состав корневищ Piper methysticum (сортов Isa, Kuma Kua) методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой для получения данных о содержании тяжелых металлов в сырье П. опьяняющего и изучения влияния минерального состава растения на общую токсичность.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проведены исследования в качестве оператора аналитического оборудования, используемого в работе, осуществлен анализ полученных экспериментальных данных. Вклад автора в изучение химического состава и разработку способов идентификации перца опьяняющего в БАДах, фитопрепаратах и сырье для их изготовления, осуществление расчетов и анализ результатов является определяющим.

Научная новизна результатов исследования

Разработан алгоритм проведения цветных химических тестов и методика хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), которые могут быть использованы в качестве скрининговых экспрессных методик (предварительных способов) идентификации сырья П. опьяняющего в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье.

Разработана методика хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с проведением пробоподготовки (твердофазная экстракция) для исследования образцов, применимая в качестве подтверждающего способа идентификации П. опьяняющего в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье. С помощью методики выявлены маркерные вещества для этого растения, а также впервые получены хроматографические портреты сырья на основе 2 сортов корневищ П. опьяняющего (сорта Kuma Kua, Isa) и БАД к пище, содержащей сухой экстракт корневищ Piper methysticum, которые позволяют достоверно идентифицировать сырье, экстракты и препараты на основе кава-кава.

Разработана методика ГХ-МС без проведения пробоподготовки (с использованием приставки динамического парофазного анализатора), применимая в качестве подтверждающего способа идентификации П. опьяняющего в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье. Впервые получены данные о летучих веществах, содержащихся в корневищах кава-кава.

Впервые установлено количественное содержание 30 химических элементов в корневищах кава-кава 2 сортов (Kuma Kua, Isa). С помощью методов атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой (ИСП-АЭС, ИСП-МС) в исходном сырье кава-кава выявлено превышение адекватных и верхних допустимых пределов потребления для ряда элементов, в том числе тяжелых металлов.

Практическое значение результатов исследования

Разработанные методики идентификации кава-кава в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье внедрены в процедуру производства судебно-химических экспертиз и химико-токсикологических исследований и успешно применяются в экспертной работе центров судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны РФ при проведении исследований материалов, изъятых в качестве вещественных доказательств в ходе оперативно-розыскных мероприятий и переданных следственными органами в отделы химико-токсикологической экспертизы (акт внедрения 111 Главного государственного центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз МО РФ от 05.05.2011 г.). Методики также внедрены в работу Городской наркологической больницы №17 г. Москвы (акт внедрения от 04.05.2011 г.), ГУЗ Бюро судебно-медицинской экспертизы Комитета по здравоохранению Правительства Ленинградской области (акт внедрения от 16.05.2011 г.)

Полученные результаты внедрены в учебный процесс дисциплин «Токсикологическая химия», «Экспертиза в допинг- и наркоконтроле» в виде главы (7.3.6. Другие контролируемые вещества) в учебном пособии «Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов» под ред. Н.И. Калетиной, М.: 2008, электронного приложения к нему и в электронном приложении к учебнику «Токсикологическая химия (аналитическая токсикология)» под ред. Н.И. Калетиной и Р.У. Хабриева, М.: 2010. Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры токсикологической химии и Регионального центра аналитической диагностики наркотических средств и психотропных веществ ГОУ ВПО ПГФА Росздрава (акт внедрения от 28.04.2011 г.).

По материалам исследования подготовлено, утверждено Ученым советом ГОУ ВПО ПГФА Росздрава и разослано в ЭКЦ органов УВД и территориальные управления ФСКН Информационное письмо «Способы идентификации перца опьяняющего в БАД, фитопрепаратах и сырье для их изготовления». Получены акты внедрения из ЭКЦ УВД по Тульской области (акт внедрения от 13.05.2011 г.) и ЭКЦ ГУВД по Пермскому краю (акт внедрения от 19.05.2011 г.).

На защиту выносятся

- скрининговые экспрессные методики (предварительные способы) идентификации сырья П. опьяняющего на основе алгоритма проведения цветных химических тестов и методики ТСХ, позволяющие достоверно обнаружить его в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье;

- методики хромато-масс-спектрометрии с проведением и без проведения пробоподготовки образцов, применимые в качестве подтверждающего способа идентификации П. опьяняющего в растительных препаратах, БАД, экстрактах и исходном сырье;

- результаты количественного определения основных биологически активных веществ, содержащихся в корневищах П. опьяняющего (сортов Isa, Kuma Kua) и БАД, содержащей сухой экстракт корневищ P. methysticum, а также их сравнительная характеристика;

- результаты количественного определения 30 химических элементов в корневищах перца опьяняющего (сорта Isa, Kuma Kua), впервые установленные методами ИСП-МС и ИСП-АЭС, которые позволили выявить в исходном сырье кава-кава превышение адекватных и верхних допустимых пределов потребления для ряда элементов, в том числе тяжелых металлов.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на международной специализированной выставке «Аптека 2005» (Москва, 2005), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Социально-медицинские аспекты экологического состояния Центрального экономического района России» (Тверь, 2007), на 2-ом Съезде Российского общества медицинской элементологии (Тверь, 2008), научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Пермь, 2011), научно-практической конференции с международным участием «Морфология критических и терминальных состояний» (Москва, 2011).

Апробация работы проведена на межкафедральной научной конференции кафедр токсикологической химии, фармакогнозии, фармацевтической химии очного факультета, фармацевтической химии ФДПО и ФЗО, промышленной технологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Публикации

По теме исследования опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях Перечня ВАК РФ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (№ государственной регистрации 01.9.50 007417).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 4 экспериментальных глав с описанием проведенных экспериментов и полученных результатов, общих выводов, списка литературы, Приложения.

Материал диссертации изложен на 149 страницах, содержит 19 рисунков и 44 таблицы. Список использованной литературы содержит 191 источник, из них 172 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и задачи исследований, охарактеризована научная новизна полученных результатов и их практическая значимость.

В первой главе (обзор литературы) обобщены данные литературы о растении П. опьяняющий, его химическом составе, фармакологических свойствах. Описаны физико-химические методы анализа, применяемые для основных групп биологически активных веществ (БАВ), в том числе способы выделения, хроматографического разделения и детектирования.

Во второй главе описано используемое в работе оборудование, реактивы, стандартные растворы и образцы, а также объекты исследования. Представлены методики приготовления рабочих реактивов.

В третьей главе представлены предварительные способы идентификации П. опьяняющего (качественные реакции и ТСХ) в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье.

В четвертой главе описаны методики хромато-масс-спектрометрии с проведением и без проведения пробоподготовки образцов, применимые в качестве подтверждающего способа идентификации П. опьяняющего в растительных препаратах, БАД, экстрактах и исходном сырье. Представлены результаты количественного определения основных БАВ в объектах исследования, а также их сравнительная характеристика.

В пятой главе описана разработка методики выполнения измерений содержания макро- и микроэлементов методами ИСП-АЭС и ИСП-МС в корневищах перца опьяняющего (сортов Isa, Kuma Kua). Получены данные о количественном содержании 30 химических элементов, обнаружено превышение адекватного и верхнего допустимого уровня потребления (АУП и ВДУП) по ряду элементов, содержащихся в корневищах перца опьяняющего.

Объекты исследования

• Измельченные корневища перца опьяняющего 2 сортов (Isa, Kuma Kua).
• БАД к пище «Экстракт кава-кава. Безмятежное спокойствие» (ЗАО «Эвалар», Россия), содержащая экстракт корневищ кава-кава.
• Материалы, изъятые в качестве вещественных доказательств и переданные на исследование в отдел экспертизы (химико-токсикологической) 111 Главного государственного центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны Российской Федерации (111 ГГЦСМиКЭ МО РФ).

Оборудование и средства измерений

Для проведения твердофазной экстракции (ТФЭ) использовали картриджи AccuBond II EVIDEX 200 mg, 3 ml (Agilent Technologies, США) и камеру для ТФЭ (Agilent Technologies, США) с вакуумным насосом N811 KN.18 (KNF Neuberger, Германия).

Для разработки ТСХ-методики идентификации перца опьяняющего использовали пластины HPTLC Kieselgel 60F254 (Merck KGaA, Германия), а также пластины ПТСХ-АФ-А-УФ Sorbfil, (ЗАО «Сорбполимер», Россия), столик для нанесения образцов на пластины (с подогревом) УСП 1М № 007-04 и стеклянные хроматографические камеры (Merck KGaA, Германия), размером 18618 см. Для УФ-детектирования результатов – облучатель хроматографический УФС-254/365 (ЗАО «Сорбполимер», Россия).

ГХ-МС исследования выполняли на газовом хроматографе с масс-селективным детектором 6890N-5973N (Agilent Technologies, США), для изучения состава летучих компонентов использовали модификацию хроматографа 6890N-5973N с приставкой анализатора парогазовой фазы Gerstel MPS 2 (Gerstel, Германия).

Данные по макро- микроэлементному составу получены на последовательном атомно-эмиссионном спектрометре Optima 2000 DV (PerkinElmer, США) и квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Elan 9000 (PerkinElmer Sciex, США) после разложения образцов с помощью системы микроволновой пробоподготовки образцов с контролем температуры и давления Multiwave-3000 (Anton Paar, Австрия).

Предварительные способы идентификации перца опьяняющего (качественные реакции и ТСХ)

Подобраны оптимальные условия выделения основных групп БАВ из субстанций, содержащих Piper methysticum: растворитель – 95 % этанол; соотношение сырья и растворителя – 1:10; однократная твердофазная экстракция образца. Разработанная методика получения извлечения анализируемых объектов, пригодна в дальнейшем как для проведения качественных реакций на основные группы БАВ, так и для ТСХ.

Методика приготовления извлечения. В картридж для ТФЭ, вместимостью 3 мл, помещали точную навеску анализируемого объекта массой около 0,3 г и заливали 3 мл (троекратно по 1 мл) 95 % спиртом. После прохождения растворителя через сорбент, извлечение подвергали исследованию с помощью качественных реакций и хроматографирования.

Схема проведения качественных реакций приведена в таблице 1.

Таблица 1 – Сводная таблица результатов качественных реакций

Качественная реакция	Полученные результаты
	Спиртовое извлечение	Ацетоновое извлечение	Водное извлечение
1	2	3	4
1. Цианидиновая проба	помутнение	помутнение, с выпадением аморфного осад-ка желтого цвета	извлечение приобрело розовато-бурый оттенок

Продолжение таблицы 1

1	2	3	4
2. Добавление 1 %-ного раствора (CH3COO)2Pb	желтоватая муть	без изменений	со временем светло-серый осадок
3. Борно-лимонная реакция с реакти-вом Вильсона	извлечение стало ярко-желтым	извлечение стало ярко-желтым	извлечение обесцветилось, слабо желтое
4. Добавление 10 %-ного раствора NaOH и нагрев	извлечение стало более ярко-желтым	извлечение стало более ярко-желтым	извлечение стало более ярко-желтым
5. Добавление реактивов: Майера, Вагнера, Марме	извлечение принимало цвет реактива	извлечение принимало цвет реактива	извлечение принимало цвет реактива
6. Добавление реактива Драгендорфа	оранжево-крас-ное окрашивание	выпадение крас-ного осадка, надосадочная жидкость оран-жевого цвета	мутный оранжевый раствор
7. Добавление реактива Фреде	светло-зеленое окрашивание извлечения, через 10 минут зеленое	изумрудное окрашивание извлечения, через 10 минут темно-зеленое	обесцвечивание извлечения, через 10 минут серо-зеленое с серым осадком
8. Реакция Либермана-Бурхарда	слабо-розовое окрашивание, через 10 минут серое	слабо-розовое окрашивание, через 10 минут серое	розовое окрашивание, через 10 минут серо-зеленое
9. Реакция Сальковского	без изменений	без изменений	красновато-бурое окраши-вание слоя

В результате проведенных химических тестов установлено наличие в П. опьяняющем флавоноидов (1-3 реакции), лактонов (4 реакция), алкалоидов (5-7 реакции) и стеринов (8-9 реакции). Совпадение результатов химических тестов, проведенных по описанной схеме с неизвестным анализируемым образцом, может подтвердить наличие в нем Piper methysticum на предварительном этапе исследования растительных препаратов, БАД к пище, экстрактов и исходного сырья. Полный алгоритм проведения химических тестов представлен в тексте диссертации.

В качестве еще одного предварительного способа идентификации перца опьяняющего на фоне сложного матрикса анализируемых объектов проведен выбор оптимальных условий ТСХ-анализа: выбор системы растворителей, проявляющих агентов и т.д.

Методика хроматографии в тонком слое сорбента: на линию старта пластины Kieselgel 60F254 (Merck KGaA, Германия) размером 1010 см при помощи микрошприца наносили 5 мкл извлечения в точку. Далее пластину помещали в хроматографическую камеру с системой растворителей этилацетат : гексан (2:3) и хроматографировали восходящим способом. Время предварительного насыщения камеры 30 минут. После прохождения фронта растворителей пластину вынимали из камеры и просушивали. Просматривали в видимом и УФ-свете при длинах волн 254 и 365 нм. На пластинах обнаруживали 8 зон абсорбции с четкими границами. Обрабатывали реактивом Эрлиха модифицированным. Просматривали в видимом и УФ-спектре. Полученные результаты описаны в таблице 2.

Таблица 2 – Значение Rf и окраска зон поглощения компонентов смеси, разделенных в системе растворителей этилацетат : гексан (2:3)

Условия детектирования		Значение Rf и цвет зоны поглощения компонентов
		0,18-0,20	0,29-0,31	0,36-0,38	0,59-0,61	0,64-0,66	0,73-0,75	0,78-0,80	0,85-0,87
Видимый спектр	до обработки	зоны поглощения светло-желтого цвета
	после обработки		ТЗ		Б		К
	через сутки	ТЖ	Ж	Р	О		Ж	Р	Р
УФ (254 нм)	до обработки	С	Ф	С	ТБ		ЖЗ	С	ТС
	после обработки	ТС	Б	СЗ	ТБ		ТС
	через сутки	ТС	Б	СЗ	ТБ		ТС	Г	Ж
УФ (365 нм)	до обработки	Г	ТЗ	Ф	ТБ	Г	ТБ	Г
	после обработки	Б	З	СЗ	К	О	ТС	Г
	через сутки	Б	З	Г	К	О	ТС	Г	Ж

Примечание: Б – бурый, Г – голубой, Ж – желтый, ЖЗ – желто-зеленый,
З – зеленый, К – красный, О – оранжевый, Р – розовый, С – синий,
СЗ – светло-зеленый, ТБ – темно-бурый, ТЖ – темно-желтый, ТЗ – темно-зеленый, ТС – темно-синий, ТФ – темно-фиолетовый, Ф – фиолетовый.

Воспроизводимость методики подтверждена на пластинах Sorbfil, достигнуто четкое разделение, как и при использовании пластин Kieselgel 60F254. Сделан вывод, что подобранная система растворителей и проявляющие агенты являются оптимальными для дифференцирования сырья, содержащего кава-каву, от других растительных субстанций и могут служить как способ предварительной идентификации сырья П. опьяняющего и его субстанций в анализируемых объектах.

Подтверждающие способы идентификации перца опьяняющего
(ГХ-МС, ГХ-МС с динамическим анализатором парогазовой смеси)

Исследования проводили на хроматографе Agilent 6890N-5973N, работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой НР-5МS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока составляла 1,2 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса составляли 280°С. Температура колонки программировалась от 90°С до 310°С со скоростью повышения 35°С/мин. Ввод образцов объемом 1 мкл осуществляли методом без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 31 до 550 m/z. Все исследования на хроматографе проводились при этих настройках и параметрах, если не указано обратного.

После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «PMWTOX3», «NIST08» и «Wiley7N».

Масс-спектр исследуемого вещества считали идентифицированным при совпадении с библиотечным масс-спектром при коэффициенте подобия, превышающим 90 %.

В результате проведенного ГХ-МС исследования БАД к пище (рис. 1), был установлен качественный состав и количественное содержание основных групп БАВ. Концентрация кавалактонов составила 77,15 % ± 6,53 % от суммы БАВ, обнаруженных в добавке. Методом внутренней нормализации по площадям хроматографических пиков рассчитано количественное содержание кавалактонов и процентное соотношение от общей суммы кавалактонов (ОСК) в анализируемом объекте (таблица 3).

Таблица 3 – Содержание кавалактонов в БАД к пище (N=8)

№ п/п	RT, мин	Наименование кавалактона	Содержа-ние, %	Отношение к ОСК, %
1	2	3	4	5
1	4,337	дигидрокаваин-СО2	7,46±0,48	9,67
2	4,858	каваин-М-(О-десметил)-СО2	4,92±0,10	6,37
3	4,970	каваин-СО2	6,50±0,27	8,42
4	5,526	дигидрометистицин-СО2	4,41±0,31	5,72
5	6,308 6,680	каваин	12,38±0,87	16,04
6	6,408	7,8-дигидрокаваин	17,75±2,24	23,01
7	6,787	7,8-дигидрокаваин-5-ол	0,63±0,09	0,82

Продолжение таблицы 3

1	2	3	4	5
8	6,893	5,6-дегидрокаваин	6,50±0,42	8,42
9	7,083 7,710	янгонин	5,91±0,33	7,66
10	7,414	7,8-дигидрометистицин	8,17±1,02	10,59
11	7,509	5,6,7,8-тетрагидро-11-метистицин	0,52±0,11	0,67
12	7,763	метистицин	2,01±0,29	2,61

Помимо кавалактонов обнаружены: высшие спирты и углеводороды 7,42 % ± 1,21 %, эфиры жирных кислот 5,82 % ± 0,67 %, 7-метокси-7-(п-метоксифенил)-2-норборнен 2,69 % ± 0,71 %, флавокаваины 1,63 % ± 0,31 %, 6-фенил-3-гексен-2-он 0,94 % ± 0,19 % (некоторые авторы связывают это вещество с инициированием механизмов апоптоза и непосредственно гепатотоксичностью растения кава-кава), 1-циннамоил-пирролидин 0,91 % ± 0,13 %, пиностробин халкон 0,51 % ± 0,22 %.

Рис. 1 – Хроматограмма этанольного извлечения БАД к пище «Кава-кава. Безмятежное спокойствие»: хроматограф Agilent 6890N-5973N, режим ионизации электронным ударом при 70 эВ, капиллярная колонка НР-5МS (номера 1-12 на рисунке соответствуют кавалактонам 1-12 в таблице 3).

Для проведения более подробного газохроматографического исследования и получения данных для нахождения соответствия веществам Rf зон поглощения на пластинах ТСХ были получены и исследованы с помощью ГХ-МС отдельные фракции, элюированные с пластин ТСХ.

Накапливали достаточное количество сконцентрированных фракций этанольного извлечения: на пластины ТСХ наносили точку объемом 10 мкл в двух сантиметрах от края и далее «полосой» по 10 мкл в точку с 3-его по 8-ой сантиметр на линию старта (на каждую пластину около 200 мкл извлечения, всего подготовлено 5 пластин).

Хроматографировали пластины раздельно в системе растворителей этилацетат : гексан (2:3) и элюировали с каждой пластины фракции. Схема разбивки хроматографической пластины на фракции представлена на рисунке 2. Таким образом, с каждой из 5 пластин было снято 6 фракций (с 0 по V). Каждую фракцию аккуратно снимали с пластин и переносили в смоченные этанолом патроны для ТФЭ AccuBond II EVIDEX, в каждый патрон помещалось 5 соответствующих фракций с разных пластин. Троекратно заливали 1 мл этанола 95 %. На выходе получали 6 этанольных объединенных фракций, очищенных от силикагеля. Полученные объединенные фракции подвергали исследованию с помощью ГХ-МС.

Рис. 2 – Схема ТСХ-пластины (сорбент – силикагель, система раствори-телей этилацетат : гексан (2:3) с разбивкой на хроматографические зоны элюирования фракций

Проанализировав полученные в ходе ГХ-МС исследования данные по фракциям, была составлена сводная таблица соответствий (таблица 4).

Таблица 4 – Сводная таблица по идентифицированным веществам из фракций, проанализированных методом ГХ-МС

Rf (ТСХ)	RT, мин (ГХ-МС)	Наименование вещества с максимальным количественным содержанием в пробе
0,85-0,87	6,19	Транс-борнил циннамат
	6,55	Цис-борнил циннамат
0,78-0,80	7,02	Пиностробин халкон
0,73-0,75	7,41; 7,60	Флавокаваин В и его изомеры
0,64-0,66	7,77	Флавокаваин С
0,59-0,61	8,24; 8,65	Флавокаваин А и его изомеры
0,36-0,38*	6,31; 6,42; 6,91	Каваин, 7,8-дигидрокаваин, 5,6-дегидрокаваин
0,29-0,31*	7,12; 7,46; 7,76	Янгонин, 7,8-дигидрометистицин
0,18-0,20*	7,51; 7,80	5,6,7,8-тетрагидро-11-метоксиянгонин, метистицин

Примечания: * – неоднородные зоны поглощения при просматривании в УФ-свете (254 и 365 нм).

Помимо БАД к пище, содержащей экстракт корневищ перца опьяняющего, и сконцентрированных фракций, полученных на ее основе, ГХ-МС исследованию подвергалось сырье перца опьяняющего – корневища 2 сортов Kuma Kua и Isa. Методика приготовления извлечений не отличалась от предложенной выше, так как корневища были измельчены. Таким образом, были получены две хромато-масс-спектрограммы для сорта Kuma Kua (рис. 3А) и сорта Isa (рис. 3Б).

Рис. 3 – Хроматограмма этанольного извлечения корневищ перца опьяняющего сорта Kuma Kua (А) и сорта Isa (Б): хроматограф Agilent 6890N-5973N, режим ионизации электронным ударом при 70 эВ, капиллярная колонка НР-5МS (номера 1-11 на рисунке соответствуют кавалактонам 1-11 в таблице 5)

В результате проведенных ГХ-МС исследований этанольных извлечений из корневищ перца опьяняющего сортов Kuma Kua и Isa, были установлены качественные составы и количественные содержания основных групп БАВ. В сорте Kuma Kua содержится 62,78 % ± 5,70 % кавалактонов 22,83 % ± 3,54 % составляют норборнены, 0,74 % ± 0,18 %
N-циннамоилпирролидин. В сорте Isa содержится 70,00 % ± 6,41 % кавалактонов от суммы БАВ, борненов 16,43 % ± 2,76 %,
N-циннамоилпирролидин 0,44 % ± 0,12 %, 3,4-метилендиокси-циннамилиденацетон 2,38 % ± 0,39 %.

Таблица 5 – Содержание кавалактонов в сортах Kuma Kua и Isa

№ п/п	Наименование вещества	Содержание в Kuma Kua (N=6), %	Содержание в Isa (N=6), %
1	дигидрокаваин-CO2	1,01±0,12	0,75±0,14
2	каваин-CO2	2,31±0,08	2,38±0,35
3	каваин-М-(О-десметил)-СО2	2,17±0,31	не обнаружен
4	дигидрометистицин-СО2	3,76±0,24	2,88±0,40
5	7,8-дигидрокаваин	7,56±1,05	13,82±1,21
6	каваин	3,18±0,41	7,93±0,25
7	5,6-дегидрокаваин	9,41±0,53	5,18±0,43
8	7,8-дигидрометистицин	9,85±0,64	17,46±0,94
9	5,6,7,8-тетрагидро-11-метоксиянгонин	«следы»	0,60±0,23
10	янгонин	22,57±2,10	18,15±2,22
11	метистицин	0,96±0,22	0,85±0,23

Помимо обычной модификации метода хромато-масс-спектрометрии, была использована вариация ГХ-МС с методом равновесной парогазовой фазы, как оптимальный способ изучения летучих компонентов.

Исследование проводили на хроматографе 6890N-5973N (Agilent Technologies, США) с приставкой анализатора парогазовой фазы Gerstel MPS 2 (Gerstel, Германия), оборудованном капиллярной колонкой HP FFAP длиной 60 м и внутренним диаметром 0,32 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий. Напряжение электронного умножителя устанавливали по результатам работы программы ATUNE из стандартного пакета математического обеспечения фирмы-производителя при автоматической настройке по перфторбутиламину. Температура колонки устанавливалась равной 180°С. Температуры инжектора и интерфейса были равны и составляли 200°С. Ввод парогазовой фазы образцов объемом 25 мкл осуществляли методом с делением потока газа-носителя (1:10).

После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «PMW_TOX3», «NIST08» и «Wiley7N». Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечным, с коэффициентом подобия, рассчитанным по стандартной методике, превышающим 90%.

Специальной пробоподготовки образца не требовалось, так как эффективность выделения летучих веществ этим методом составляет до 97%, более того, масс-спектрографическое детектирование позволяет идентифицировать вещества на уровне фоновых концентраций в твердых образцах.

Точную навеску (около 3,0 г) анализируемого объекта помещали во флакон Gerstel объемом 20 мл, закрывали завинчивающейся крышкой и ставили на подставку. Термостат-инкубатор и отсек шприца выставляли на температурный режим 70°С, орбитальное встряхивание с паузами выставляли на скорость 450 оборотов/мин.

Была получена хромато-масс-спектрограмма, представленная на рисунке 4.

Рис. 4 – Хроматограмма равновесной парогазовой фазы БАД к пище, содержащей сухой экстракт перца опьяняющего: хроматограф Agilent 6890N-5973N с приставкой анализатора парогазовой фазы Gerstel MPS 2, капиллярная колонка HP FFAP (номера 1-8 на рисунке соответствуют кавалактонам 1-8 в таблице 6)

В результате проведенного ГХ-МС исследования был установлен качественный состав и количественное содержание основных групп БАВ в равновесной парогазовой фазе: кавалактонов содержится 64,07 % ± 5,61 % от суммы БАВ, также обнаружены компоненты эфирного масла, которые раньше в этом растении не обнаруживались, кариофиллен, кариофиллена оксид, элемол и кадинол.

Таблица 6 – Содержание кавалактонов в парогазовой фазе БАД (N=5)

№ п/п	RT, мин	Наименование кавалактона	Содержа-ние, %	Отношение к ОСК, %
1	6,393	7,8-дигидрокаваин	22,76±1,77	35,52
2	6,677	каваин	13,18±1,41	20,57
3	6,808	дигидрокаваин-5-ол	«следы»	-
4	6,914	5,6-дегидрокаваин	5,99±0,32	9,35
5	7,157 8,021	янгонин	13,83±1,44	21,59
6	7,589	7,8-дигидрометистицин	«следы»	-
7	7,737	5,6,7,8-тетрагидро-11-метистицин	«следы»	-
8	8,104	метистицин	8,31±0,67	12,97

В таблице 7 собраны характеристики кавалактонов – формула и масс-спектр.

Таблица 7 – Характеристики кавалактонов

Наименование БАВ и его формула	Масс-спектр
1	2
каваин
7,8-дигидрокаваин

Продолжение таблицы 7

1	2
дигидрокаваин-5-ол
5,6-дегидрокаваин (деметоксиянгонин)
7,8-дигидро-метистицин
5,6,7,8-тетрагидро-11-метоксиянгонин

Продолжение таблицы 7

1	2
янгонин (метоксикаваин)
метистицин (метоксиянгонин)

Изучение макро-, микроэлементного состава корневищ перца опьяняющего сортов Isa и Kuma Kua

Международная гармонизация требований к качеству фитопрепаратов и сырья для его изготовления предусматривает нормирование содержания тяжелых металлов. В странах-заготовителях, контроль за минеральным составом получаемых экстрактов и исходного сырья П. опьяняющего не осуществляется или осуществляется недостаточно и на устаревшем оборудовании. Однако подверженность населения, регулярно употребляющего исходное сырье, различного рода дерматитам позволяет предположить о возможной роли минерального состава растения в развитии данных нозологий. По данным L.A. Dyer, A.N. Palmer и N.J. Pollock, островные жители для приготовления своих напитков используют от 240 до 700 г корневищ перца опьяняющего в неделю.

Таким образом, было решено установить количественное содержание макро- и микроэлементов, входящих в состав измельченных корневищ. Перерасчет на минимальное (34,3 г / в день) и максимальное (100 г / в день) количество потребления по сравнению с уровнями адекватного и верхнего допустимого уровня потребления химических элементов с пищей проводили согласно МР 2.3.1.1915-04 от 2 июля 2004 года «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ».

Всего в ходе исследования были установлены количественные характеристики 30 макро- и микроэлементов для корневищ 2 сортов перца опьяняющего Kuma Kua и Isa. Сводная таблица по элементам, превышающим АУП и ВДУП, представлена ниже.

Таблица 8 – Макро-, микроэлементный состав корневищ П. опьяняющего и перерасчет минимального и максимального потребления согласно адекватным и верхним допустимым уровням потребления элементов*

Элемент	Содержание, мкг/г	Максимальное потребление (100 г / в день)		Минимальное потребление (34,3 г / в день)		Метод анализа
		% АУП	% ВДУП	% АУП	% ВДУП
Сорт Kuma Kua
As	0,3463	346,33	115,44	118,74	39,58	ИСП-МС
Cd	1,28	-	638,50	-	218,91	ИСП-МС
Co	0,2485	248,52	82,84	85,21	28,40	ИСП-МС
Cr	1,02	204,35	40,87	70,06	14,01	ИСП-МС
Fe	260,3	208,27	57,85	71,41	19,83	ИСП-АЭС
Ni	2,49	248,61	41,43	85,24	14,21	ИСП-МС
Si	721	1441,93	720,97	494,38	247,19	ИСП-АЭС
Sr	22,20	-	222,04	-	76,13	ИСП-МС
V	0,6015	150,37	60,15	51,56	20,62	ИСП-МС
Zn	164	136,67	41,00	46,86	14,06	ИСП-АЭС
Сорт Isa
As	0,6554	655,38	218,46	224,70	74,90	ИСП-МС
Cd	0,3068	-	153,38	-	52,59	ИСП-МС
Co	0,1839	183,89	61,30	63,05	21,02	ИСП-МС
Cr	1,20	239,97	47,99	82,28	16,45	ИСП-МС
Fe	453	362,40	100,67	124,25	34,52	ИСП-АЭС
Ni	1,93	192,62	32,10	66,04	11,01	ИСП-МС
Si	885	1770,67	885,33	607,09	303,54	ИСП-АЭС
Sr	25,69	-	256,90	-	88,08	ИСП-МС
V	0,5527	138,19	55,27	47,38	18,95	ИСП-МС

* согласно МР 2.3.1.1915-04 от 2 июля 2004 года «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ»

«-» - нет данных АУП для элемента

Высокие концентрации мышьяка, кадмия, железа и кремния, найденные в корневищах кава-кавы, могут угнетать антиоксидантную систему организма человека. А мышьяк и кадмий, являясь тиоловыми ядами, инактивируют сульфгидридные группы глутатиона и таким образом кумулируют эффект кавалактонов.

ВЫВОДЫ

1. Подобранные условия выделения основных биологически активных веществ перца опьяняющего (растворитель – 95 % этанол; соотношение сырья и экстрагента – 1:10; ТФЭ) позволили разработать экспрессные предварительные способы идентификации кава-кава в растительных препаратах, БАД к пище, экстрактах и исходном сырье. На основе химических тестов разработан алгоритм выбора реагентов для обнаружения в Piper methysticum флавоноидов (водное извлечение), алкалоидов, лактонов, стеринов. Разработана методика ТСХ, система растворителей этилацетат : гексан (2:3), проявляющий агент – реактив Эрлиха модифицированный, при детектировании обнаруживается 8 хроматографических зон, изменяющих окраску в видимом и УФ-диапазоне в течение времени. Методики внедрены в практику проведения судебно-химических экспертиз и химико-токсикологических исследований.
2. Разработаны методики хромато-масс-спектрометрии и вариации метода ГХ-МС с приставкой динамического парофазного анализатора, которые рекомендованы в качестве подтверждающих способов идентификации перца опьяняющего при проведении исследований, в том числе судебно-химических и химико-токсикологических. Методики отличаются экспрессностью, специфичностью и высокой степенью чувствительности.
3. Изучен химический состав БАД, содержащей сухой экстракт корневищ перца опьяняющего, и измельченных корневищ Piper methysticum 2 сортов (Kuma Kua и Isa) методом ГХ-МС, в изученных объектах обнаружены стерины, флавоноиды, халконы, сексвитерпены, кавалактоны. Методом внутренней нормализации по площадям хроматографических пиков установлено содержание кавалактонов: в БАД – 77,15% ± 6,53 %, в сорте Kuma Kua – 62,78 % ± 5,70 %, в сорте Isa – 70,00 % ± 6,41 %, в парогазовой фазе БАД – 64,07 % ± 5,61 %. Использование приставки динамической равновесной парогазовой фазы в методе ГХ-МС позволило впервые получить данные о компонентах эфирного масла П. опьяняющего (кариофиллене, кариофиллена оксиде, элемоле, кадиноле).
4. Методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой впервые установлен минеральный состав измельченных корневищ перца опьяняющего 2 сортов (Kuma Kua, Isa). Получены данные о количественном содержании 30 химических элементов, которые позволили выявить превышение адекватных и верхних допустимых уровней потребления макро- и микроэлементов. Установлено, что при регулярном потреблении корневищ перца опьяняющего в организм в токсических дозах поступают тиоловые токсиканты мышьяк и кадмий. Это обуславливает проявление токсичности исходного сырья кава-кава наряду с действием кавалактонов, а также совместное негативное влияние на металло-лигандный гомеостаз организма.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Чукарин, А.В. Фитохимическое изучение сухого экстракта корневищ Piper methysticum и препаратов из него. / А.В. Чукарин // Тезисы работ участников Открытого российского конкурса на лучшую работу студентов 2005 года по разделу «Медицинские науки», Школы молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» и итоговой научной студенческой конференции «Татьянин день». – 2006. – с. 16-17.

2. Чукарин, A.B. Анализ сухого экстракта корневищ перца опьяняющего методами хроматографии в тонком слое сорбента и газовой хроматографии масс-спектрометрии. / A.B. Чукарин, Е.А. Симонов, А.В. Киричек, В.Е. Саломатин // Микроэлементы в медицине. – 2005. – Т.6.. – Вып.3. – с. 62-67.

3. Чукарин, А.В. Использование гибридных методов исследования в контроле качества растительного сырья. Исследование химического состава кавы (перца опьяняющего, Piper methysticum) и препаратов на её основе. / А.В. Чукарин, Е.А. Симонов, Т.Л. Киселева, Н.И. Калетина // Тезисы Международной конференции Академии медико-технических наук РФ «Современные аспекты медицины». – Ереван. – 2006. – с. 263-264.

4. Chukarin, A.V. Determination of microelements composition from rhizomes of Piper methysticum Forst. by ICP-MS and ICP-AES. / A.V. Chukarin, V.A. Demidov, E.P. Serebryansky // Quimica Clinica. – 2007. – 26 (S1). Special supplement. – p. 46.

5. Калетина, Н.И. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учеб. пособие / Е.Я. Борисова, Г.Ф. Иванова, Н.И. Калетина, В.А. Мищихин, Е.А. Симонов, А.В. Скальный, А.В. Смирнов, А.В. Чукарин и др. под ред. Н.И. Калетиной. // Москва: ГЭОТАР-Медиа. – 2008. – с. 1016: ил.

6. Скальный, А.В. Технологии исследования элементного состава организма: теоретические и прикладные аспекты / А.В. Скальный, М.Г. Скальная, Е.В. Лакарова, Ю.В. Ломакин, А.В. Чукарин // Технологии живых систем. – 2008. – Т.5. – № 4. – c. 54-59.

7. Чукарин, А.В. Изучение возможных последствий употребления перца опьяняющего (Piper methysticum) для человека. / А.В. Чукарин // Вестник восстановительной медицины. – 2008. – № 5(28). – с. 70-72.

8. Чукарин, А.В. Элементный и -пиронный состав корневища перца опьяняющего (кава-кава, Piper methysticum) / А.В. Чукарин, Т.Л. Малкова // Естественные технические науки. – 2011. – № 2(25). – c. 228-234.

9. Чукарин, А.В. Правовой статус перца опьяняющего. / А.В. Чукарин // Научно-практический журнал «Вестник Пермской государственной фармацевтической академии». – 2011. – № 8. – c. 56-57.

10. Чукарин, А.В. Способы идентификации перца опьяняющего. / А.В. Чукарин // Научно-практический журнал «Вестник Пермской государственной фармацевтической академии». – 2011. – № 8. – c. 134-136.

11. Чукарин, А.В. Проблема анализа биологически активных добавок к пище с целью поиска психоактивных, сильнодействующих и наркотических компонентов / А.В. Чукарин, А.В. Киричек, Т.Л. Малкова // Морфология критических и терминальных состояний. Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ, профессора В.И. Алисиевича. – 2011. – c. 193-200.

Чукарин Андрей Валерьевич (Россия)

Изучение химического состава и разработка способов идентификации перца опьяняющего в БАДах, фитопрепаратах и сырье для их изготовления

Установлен химический состав корневищ перца опьяняющего и экстракта из него. Органические компоненты определяли методами хроматографии в тонком слое сорбента и газовой хроматографии – масс-спектрометрии после пробоподготовки с использованием твердофазной экстракции; минеральный состав – методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой после кислотного разложения с использованием систем микроволновой пробоподготовки. Разработаны экспрессные предварительные и подтверждающие способы идентификации основных действующих веществ кава-кава (кавалактонов, флавокаваинов и др.). Установлено содержание 30 макро- и микроэлементов двух сортов корневищ перца опьяняющего – Kuma Kua, Isa.

Chukarin Andrew V. (Russia)

Study of chemical composition and development of methods for identification Pepper intoxicating in biologically active food additives, herbal preparations and raw materials for their production

For the purpose of research liable consequences of usage Piper methysticum chemical composition were investigated. Organic components determined by thin layer chromatography and gas chromatography mass-spectrometry after solid phase extraction, inorganic components – by atomic emission spectrometry and mass-spectrometry with inductively coupled plasma after acid digestion using a microwave sample preparation systems. Express preliminary and confirmation methods for identification major substances (kavalactones, flavokavains and etc.) from Piper methysticum were made. 30 Macro- and trace elements composition rhizomes of Kava from 2 species (Kuma Kua, Isa) were observed.