Ботанико-фармакогностическое изучение караганы древовидной ( caragana arborescens lam.)
На правах рукописи
Хасаншина Алиса Рашидовна
БОТАНИКО-ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
КАРАГАНЫ ДРЕВОВИДНОЙ (CARAGANA ARBORESCENS LAM.)
14.04.02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия
имени И.М.Сеченова
Научные руководители:
кандидат биологических наук,
профессор Барабанов Евгений Иванович
доктор фармацевтических наук Бабаскина Людмила Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук,
профессор Сорокина Алла Анатольевна
кандидат фармацевтических наук,
доцент Вандышев Виктор Васильевич
Ведущее учреждение:
ГОУ ВПО Ярославская Государственная медицинская академия
Защита диссертации состоится «____» _______2010 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова (119019, Москва, Никитский бульвар, д. 13).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49).
Автореферат разослан «____» _____________________ 2010 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д.208.040.09,
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из приоритетных задач здравоохранения в настоящее время является расширение ассортимента отечественных лекарственных средств за счет внедрения в лечебную практику новых препаратов растительного происхождения. Важная роль в укреплении отечественной растительной базы отводится культивируемым лекарственным растениям. Однако, ассортимент их недостаточно широк. Введение дикорастущих растений в культуру достаточно длительно и требует больших затрат. Использование известных ценных декоративных культур в качестве источника лекарственных растительных средств является более рациональным и перспективным для расширения сырьевой базы и производства отечественной фармацевтической продукции, имеющей важное значение для народного хозяйства и способствующей сохранению здоровья населения.
Карагана древовидная (Caragana arborescens Lam.) известна как декоративная культура и кормовое растение в естественных условиях произрастания. Она издавна используется в народной медицине для получения средств, обладающих противовоспалительным, антибактериальным, гепатопротекторным и гипогликемическим действием при самых разнообразных заболеваниях.
В научной медицине карагана древовидная до настоящего времени не применялась. Отсюда очевидно, что научное обоснование возможности расширения сырьевой базы для производства лекарственных растительных средств за счет караганы древовидной является актуальным.
Цель исследования: ботанико-фармакогностическое обоснование возможности использования караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.) в качестве источника лекарственного растительного сырья с учетом онтогенеза.
Основные задачи исследования:
- изучить особенности онтогенеза и ритма сезонного развития караганы древовидной, интродуцированной в Московской области, и установить морфолого-анатомические характеристики каждого этапа развития растений;
- исследовать химический состав биологически активных веществ сырья караганы древовидной в ходе онтогенеза для разработки технологии получения сырья в определенных возрастных состояниях растений;
- изучить специфическую фармакологическую активность и токсичность экстрактов из сырья караганы древовидной;
- решить вопросы стандартизации качества сырья и сухого экстракта караганы, исследовать стабильность в процессе хранения;
- разработать технологические регламенты производства и нормативную документацию на сырье побегов караганы древовидной и сухой экстракт.
Научная новизна. Проведено ботанико-фармакогностическое изучение нового лекарственного растительного сырья побегов караганы древовидной. Установлены особенности онтогенеза в условиях интродукции и впервые исследован ритм сезонного развития растений. Впервые проведено комплексное изучение химического состава сырья и фармакологической активности экстракта с учетом онтогенеза караганы. Изучены флавоноидный, аминокислотный и минеральный составы лекарственного растительного сырья караганы древовидной. Получены новые данные, характеризующие динамику содержания флавоноидов в ходе онтогенеза. Исследована гепатопротекторная, гипогликемическая, противовоспалительная и ранозаживляющая активность экстракта караганы. Разработаны характеристики подлинности, номенклатура показателей качества и их нормы для сырья и сухого экстракта. Изучена стабильность сырья и сухого экстракта караганы в процессе хранения.
Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования показали, что побеги караганы древовидной являются ценным лекарственным растительным сырьем и могут служить источником флавоноидов, аминокислот и минеральных веществ. Результаты исследования могут быть использованы при разработке новых лекарственных форм с использованием сырья караганы древовидной.
На основании проведенных исследований разработаны и утверждены: Инструкция по сбору и сушке побегов караганы древовидной; Технические условия (ТУ) «Побеги караганы древовидной»; Опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство сырья побегов караганы древовидной.
Созданы проекты Технических условий (ТУ) «Сухой экстракт караганы древовидной»; Опытно-промышленного регламента (ОПР) на производство сухого экстракта караганы древовидной.
Результаты исследований использованы при разработке пелоидных композиций, включающих сухой экстракт караганы.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международной конференции «Приоритеты фармацевтической науки и практики» (Москва, 2006); научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета ЯГМА (Ярославль, 2007); международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации» (Ташкент, 2008); научно- практической конференции "Интеграция образования, науки и производства в фармации" (Ташкент, 2008); ХVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР кафедры ботаники ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова «Онтогенез, ритм сезонного развития и динамика накопления биологически активных веществ лекарственных растений различных ботанико-географических зон СНГ».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты исследования особенностей онтогенеза и ритма сезонного развития караганы древовидной, интродуцированной в Московской области;
- результаты фармакогностического изучения сырья побегов караганы древовидной;
- результаты исследования фармакологической активности (гепатопротекторной, гипогликемической, противовоспалительной и ранозаживляющей) и токсичности экстракта побегов караганы древовидной;
- данные по стандартизации качества сырья побегов и сухого экстракта караганы древовидной.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2-7), общих выводов, списка литературы и приложения. В работе 41 таблица и 15 рисунков. Библиографический указатель включает 172 источника, из которых 46 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Основными объектами изучения были разновозрастные растения караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.), интродуцированной в Московской области. Основным источником растительного сырья являлись побеги караганы древовидной.
Стационарные наблюдения за ходом онтогенеза растений, сбор материала (гербарного и фиксированного в 70% этаноле), заготовка сырья проводились в Щелковском и Истринском районах Московской области с 2005 по 2007 годы. Для сравнения и уточнения биоморфологических характеристик были использованы образцы растений, произрастающих в Курской области (п. Лобухино) и в Ботаническом саду ММА имени И.М.Сеченова.
Изучение онтогенеза и ритма сезонного развития караганы древовидной проводили по общепринятым методикам. Периодизация большого жизненного цикла осуществлялась по методике Т.А.Работнова (1950) с дополнениями А.А.Уранова (1975). Анализ морфологической структуры особей проводился по методике И.Г.Серебрякова (1962). При описании побегов использовалась терминология, принятая И.Г.Серебряковым (1962, 2964), М.Т.Мазуренко и А.П.Хохренковым (1977).
В работе использовались современные физико-химические методы анализа. Изучение флавоноидов проводили с использованием хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) на пластинках «Silufol» марки ПТСХ-А-П-УФ и «Merk» с сорбентом Kieselgel 60F254 в системе растворителей этилацетат кислота муравьиная безводная вода (8:1:1); применяли спектрофотометрию в ультрафиолетовой области на приборе Specord M40 с автоматической регистрацией спектров и с использованием программы Scan Graph.
Аминокислотный состав определяли на аминокислотном анализаторе Hewlett-Packard 1090 с автоинжектором и детекцией в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.
Анализ макро- и микроэлементного состава сырья проводили методом атомно-эмисионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой с использованием ICP MS-спектрометра Elan-6100 (Perkin Elmer, США) и AES-спектрометра Optima-4300 (Perkin Elmer, США).
При проведении исследований руководствовались требованиями общих статей ГФ XI «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа», «Листья», «Трава». Разработку числовых показателей сырья караганы, микроскопические исследования по установлению диагностических признаков проводили в соответствии с требованиями ГФ XI. При получении экстракта, изучении его физико-химических показателей руководствовались требованиями общей статьи ГФ XI «Экстракты».
Определение микробиологической чистоты растительного сырья проводили в соответствии с требованиями ГФ XII «Микробиологическая чистота» (ОФС 42-0067-07).
Изучение острой токсичности экстрактов проводили в соответствии со статьей ГФ XII «Аномальная токсичность» (ОФС 42-0060-07). Гепатопротекторная активность экстрактов оценивалась на модели экспериментального гепатита у крыс по восстановлению уровня маркерных ферментов крови. В работе использовался набор биохимических реактивов «Лахема» (Чехия). Исследования гипогликемической активности экстрактов проводились на модели адреналиновой (эпинефриновой) гипергликемии у крыс. Противовоспалительное и ранозаживляющее действия экстрактов изучались на модели гнойной раны у кроликов.
Особенности онтогенеза и ритма сезонного развития караганы древовидной, интродуцированной в Московской области
В онтогенезе караганы древовидной было выделено 4 возрастных периода и 9 возрастных состояний (таблица 1).
Таблица 1 Основные этапы онтогенеза караганы древовидной
| Возрастной период | Возрастное состояние | Индекс * |
| 1. Латентный | 1.1. Семена | sm |
| 2. Прегенеративный (виргинильный) | 2.1. Проростки 2.2. Ювенильные 2.3. Имматурные 2.4. Виргинильные | p j im v |
| 3. Генеративный | 3.1. Молодые генеративные 3.2. Средневозрастные (зрелые) генеративные 3.3. Старые (поздние) генеративные | g1 g2 g3 |
| 4. Постгенеративный (сенильный) | 4.1. Сенильные | s |
| * Индексы возрастных состояний предложены А.А. Урановым (1975) | ||
По особенностям хода онтогенеза карагана древовидная была отнесена к моноцентрическому типу биоморф с полной поздней неспециализированной дезинтеграцией.
Первичный «Главная Первичный Кустящаяся Некустящаяся
побег ось» куст партикула партикула
p-g1 [ j-g1] g1, g2 g3 s
В течение прегенеративного и отчасти генеративного периодов растение караганы существовало в виде единого компактного образования, распределение биомассы характеризовалось наличием одного максимум – в центре разрастания особи. В генеративном периоде проявлялась частичная партикуляция, новообразования побегов и почек возобновления происходило всё ближе к периферии, появлялся отмерший центр. В постгенеративном периоде осуществлялась полная партикуляция, возникали вторичные моноцентрические особи.
Критериями выделения возрастных состояний выступали качественные и количественные морфологические признаки (таблица 2).
Было установлено, что в условиях интродукции в Московской области растения караганы древовидной имели более медленный темп развития в генеративном периоде по сравнению с особями естественных караганников. Высота интродуцированных генеративных растений была больше на 26-28%, чем у особей в зоне естественного произрастания. Однако относительный средний годовой прирост растений оставался примерно одинаковым. Количество осей у инродуцированых молодых и средневозрастных генеративных растений было больше, чем у особей естественных карагаников. Соответственно и биомасса генеративных растений, интродуцированных в Московской области, была выше. Однако средний годовой прирост биомассы на 1 м оси у интродуцированных растений был ниже, чем у особей естественных караганников. Было установлено, что для заготовки на сырье рациональнее использовать генеративные растения караганы.
Таблица 2 Сравнительная характеристика разновозрастных растений
караганы древовидной, произрастающих в естественных условиях и
в условиях интродукции
| Условия произ-растания | Показатель | Возрастное состояние | ||||||
| j | im | v | g1 | g2 | g3 | s | ||
| В естественных условиях | Календарный возраст растений, годы | 9+2 | 13+2 | 17+2 | 29+3 | 58+3 | 78+4 | 88+4 |
| Количество скелетных осей | 1 | 1-2 | 2+1 | 4+1 | 12+2 | 7+2 | 4+1 | |
| Высота растений, м | 0,2±0,1 | 1,2±0,1 | 2,4±0,1 | 3,1±0,2 | 3,6±0,2 | 3,8±0,2 | 3,9±0,2 | |
| Годовой прирост растений, % | 11,1 | 20,8 | 12,5 | 1,9 | 0,5 | 0,3 | 0,3 | |
| Годовой при-рост боковых образцовых осей, см | 1,44 ±0,09 | 6,18 ±0,19 | 7,82 ±0,43 | 21,52 ±0,47 | 19,65 ±0,38 | 17,10 ±0,39 | 6,42 ±0,24 | |
| Биомасса листьев, г | 1,5 ±0,2 | 4,1 ±0,4 | 38,4 ±2,9 | 153,2 ±4,5 | 384,3 ±8,2 | 196,9 ±17,1 | 72,4 ±4,2 | |
| В условиях интродукции | Календарный возраст растений, годы | 9+1 | 14+2 | 19+2 | 36+3 | 68+3 | 78+2 | - |
| Количество скелетных осей | 1 | 1-2 | 3+1 | 8+1 | 18+2 | 8+2 | - | |
| Высота растений, м | 0,2±0,1 | 1,4±0,1 | 3,0±0,1 | 4,3±0,1 | 4,9±0,2 | 5,1±0,2 | - | |
| Годовой прирост растений, % | 11,1 | 17,1 | 10,7 | 1,8 | 0,4 | 0,4 | - | |
| Годовой при-рост боковых образцовых осей, см | 2,13 ±0,12 | 7,82 ±0,15 | 13,14 ±0,28 | 23,60 ±0,39 | 21,38 ±0,54 | 19,25 ±0,62 | - | |
| Биомасса листьев, г | 1,2 ±0,2 | 4,3 ±0,5 | 52,5 ±2,9 | 321,2 ±8,2 | 648,2 ±12,4 | 247,4 ±8,3 | - | |
Изучение особенностей ритма сезонного развития особей караганы древовидной в интродукции показало, что продолжительность их фенологических фаз вегетационного периода более длительная, чем у растений в естественных условиях произрастания. Это связано, вероятно, с большей продолжительностью теплого периода в Московской области (предварительно были исследованы климатические условия Московской области в 2005-2007 годах). Карагана древовидная по периодизации фенологических фаз относится к группе растений с ранним началом и поздним окончанием вегетации (таблица 3). Выявлена существенная коррелятивная зависимость темпов прироста боковых осей от среднесуточной температуры. Генеративные растения имели максимальную биомассу в начале фазы плодоношения, что не характерно для большинства покрытосеменных растений, у которых рост вегетативной части замедляется в начале фазы цветения. Учитывая это, для заготовки на сырье целесообразно использовать генеративные растения караганы древовидной в фазах массового цветения и конца цветения-начала плодоношения.
Таблица 3 Характеристика фенологических фаз ритма сезонного
развития генеративных растений караганы древовидной,
интродуцированных в Московской области
| Фенологическая фаза | Условное обозна-чение | Параметр* | Год исследования | |||
| 2005 | 2006 | 2007 | ||||
| Начало вегетации | Ф1 | 1 | 04.04 | 31.03 | 27.03 | |
| Бутонизация | Ф2 | 1 | 03.05 | 27.04 | 23.04 | |
| 2 | 4,13+0,07 | 3,81+0,03 | 3,74+0,09 | |||
| 3 | 4,28+0,03 | 4,25+0,02 | 3,96+0,08 | |||
| Массовое цветение | Ф3 | 1 | 13.05 | 15.05 | 08.05 | |
| 2 | 3,22+0,02 | 3,12+0,06 | 2,86+0,07 | |||
| 3 | 7,64+0,04 | 7,39+0,09 | 8,02+0,21 | |||
| Конец цветения- начало плодоношения | Ф4 | 1 | 10.06 | 06.06 | 03.06 | |
| 2 | 6,12+0,04 | 5,96+0,04 | 6,02+0,09 | |||
| 3 | 11,24+0,14 | 12,95+0,82 | 10,45+0,57 | |||
| Массовое созревание плодов | Ф5 | 1 | 23.07 | 26.07 | 17.07 | |
| 2 | 7,51+0,11 | 7,02+0,07 | 7,48+0,09 | |||
| 3 | 8,28+0,21 | 8,36+0,12 | 7,12+0,39 | |||
| Массовый листопад | Ф6 | 1 | 02.10 | 07.10 | 03.10 | |
| 2 | 2,12+0,09 | 3,29+0,07 | 1,75+0,07 | |||
| 3 | 1,12+0,08 | 1,25+0,04 | 1,02+0,05 | |||
| * Исследуемые параметры: 1 – календарная дата начала фенофазы; 2 – прирост боковой образцовой оси, см; 3 – биомасса листьев, цветков, плодов на 1 м образцовой оси, г. | ||||||
Химический состав побегов караганы древовидной
Было проведено изучение качественного состава и количественного содержания биологически активных веществ в побегах караганы древовидной. С помощью качественных реакций и ТСХ установлено наличие в сырье флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, аминокислот, полисахаридов, дубильных веществ, кумаринов. Также в сырье были обнаружены следовые количества сапонинов. Во всех образцах наличия алкалоидов и антраценпроизводных нами не обнаружено.
Методом ТСХ в сырье были обнаружены и идентифицированы флавоноиды: апигенин, кверцетин, кемпферол, лютеолин, лютеолин-7-гликозид и рутин (рисунок 1) и фенолкарбоновые кислоты: кофейная, феруловая и хлорогеновая. Предварительно была исследована эффективность разделения смеси стандартных образцов рутина, лютеолина-7-гликозида, кверцетина и лютеолина в различных хроматографических системах (таблица 4). В результате была выбрана система этилацетат – кислота муравьиная безводная – вода (8:1:1), имеющая наибольший суммарный коэффициент разделения (сумм).
1. Рутин (Rf = 0,23)
2. Лютеолин-7-гликозид (Rf = 0,43)
3. Лютеолин (Rf = 0,92)
4. Кемпферол (Rf = 0,93)
5. Апигенин (Rf = 0,96)
6. Кверцетин (Rf = 0,97)
7. Водное извлечение
8. Спиртовое извлечение
1 2 3 4 5 6 7 8
Рисунок 1 – Схема хроматограммы водного и спиртового извлечения
из побегов караганы древовидной в системе
этилацетат – кислота муравьиная безводная – вода (8:1:1).
Таблица 4 – Величины Rf флавоноидов в апробированных хроматографических системах и коэффициенты разделения смеси флавоноидов
| Наименование флавоноида | Хроматографическия система | |||
| этилацетат-муравьиная кислота безводная-вода (80:10:10) | бензол-этанол-кислота ледяная уксусная (45:8:3) | толуол-этилацетат-муравьиная кислота безводная (40:40:20) | хлороформ-этанол (40:10) | |
| Рутин | 0,21 | 0,02 | 0,10 | 0,02 |
| Лютеолин-7-гликозид | 0,33 | 0,08 | 0,12 | 0,03 |
| Кверцетин | 0,64 | 0,30 | 0,55 | 0,18 |
| Лютеолин | 0,72 | 0,44 | 0,60 | 0,25 |
| Коэффициент разделения гликозидов (гли)* | 3,0 | 1,5 | 0,5 | 0,2 |
| Коэффициент разделения агликонов (агл)* | 2,6 | 3,5 | 1,0 | 2,3 |
| Суммарный коэффициент разделения (сумм) | 5,6 | 5,0 | 1,5 | 2,5 |
| * = Rf(1-2) • L / 0,5(l1+l2), где: Rf(1-2) – разность величин Rf соседних зон; L – длина пробега, мм; l1 и l2 – длина продольного сечения соседних зон адсорбции, мм. | ||||
Сравнительную оценку количественного содержания флавоноидов в сырье побегов караганы древовидной по этапам онтогенеза и фенологическим фазам проводили по разработанной нами методике с применением спектрофотометрического метода в пересчете на рутин. На рисунок 2 приведены УФ-спектры рутина и спиртового извлечения из побегов караганы. Предварительно были изучены оптимальные условия экстракции флавоноидов. Установлено, что наиболее полное извлечение флавонодиов из сырья достигается при экстрагировании 70% этанолом, при соотношении сырья и экстрагента 1:30 и времени экстракции – 1 час. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 5. Относительная ошибка методики не превышала + 1%. Отсутствие систематических ошибок было подтверждено методом добавок рутина.
При использовании разработанной методики было установлено, что максимальное содержание флавоноидов имеют побеги молодых и средневозрастных генеративных растений в фазу массового цветения (рисунок 3).
А Б
Рисунок 2 – Спектры поглощения ГСО рутина (А) и
спиртового извлечения из побегов караганы древовидной (Б).
Таблица 5 – Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в сырье побегов караганы древовидной
| n | f | х, % | S2 | S | Sх | Р | t (P, f) | х | х | , % |
| 8 | 7 | 3,1915 | 0,001296 | 0,03600 | 0,0127 | 0,95 | 2,36 | 0,0850 | 0,0249 | 0,78 |
А Б
Рисунок 3 – Содержание флавоноидов в сырье побегов караганы древовидной в онтогенезе (А) и по фазам вегетации (Б).
Инструментальными методами анализа был изучен аминокислотный состав сырья караганы древовидной (таблица 6).
Таблица 6 Аминокислотный состав сырья побегов караганы древовидной
| Наименование аминокислоты | ||
| Содержание аминокислоты | ||
| в г/кг абс.сух.сырья | в % от суммы аминокислот | |
| Аспарагиновая кислота | 0,77 | 2,0 |
| Серин | 9,74 | 32,0 |
| Глютаминовая кислота | 0,64 | 1,5 |
| Глицин | 0,36 | 1,7 |
| Гистидин | 0,86 | 2,0 |
| Аргинин | 0,41 | 0,7 |
| Треонин | 1,10 | 3,1 |
| Алании | 3,83 | 14,8 |
| Пролин | 8,41 | 25,2 |
| Цистин | 0,62 | 0,9 |
| Тирозин | 0,39 | 0,7 |
| Валин* | 1,56 | 4,6 |
| Метионин* | 0,23 | 0,5 |
| Лизин* | 0,54 | 1,3 |
| Изолейцин* | 1,05 | 2,8 |
| Лейцин* | 0,89 | 2,4 |
| Фенилаланин* | 0,68 | 1,4 |
| Триптофан* | 1,21 | 2,4 |
| * - Незаменимые аминокислоты | ||
Суммарное содержание незаменимых аминокислот составило 15,4%, что позволяет считать сырье караганы древовидной перспективным источником получения аминокислот.
Нами впервые был проведен анализ сопряженного состава 58 химических элементов сырья и почвы из прикорневой зоны караганы древовидной (таблица 7). Установлено значительное содержание таких биологически важных и условно важных элементов как железо, марганец, медь, цинк.
Из токсичных и условно токсичных элементов только содержание алюминия может считаться значительным (до 130 мкг/г). Количество токсичных элементов в исследованных образцах сырья караганы не превышало ПДК, установленных Гигиеническими требованиями к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов (Сан ПиН 2.3.2.560-02).
Таблица 7 Содержание некоторых элементов в образцах почвы и сырье караганы древовидной из трех регионов заготовки сырья (в мкг/г)
| Эле-мент | Московская область | Ботанический сад ММА | Курская область | |||
| почва | сырье | почва | сырье | почва | сырье | |
| Li | 14,00±3,60 | 0,12±0,01 | 21,00±0,05 | 0,07±0,01 | 19,00±0,12 | 0,10±0,01 |
| Be | 0,99±0,30 | 0,01±0,00 | 1,60±0,01 | 0,01±0,00 | 1,20±0,01 | 0,01±0,00 |
| В | 24,60±0,26 | 21,00±0,18 | 38,00±0,22 | 11,00±0,08 | 26,00±0,24 | 14,00±0,18 |
| Na | 2,48±0,09 | 25,00±0,07 | 2,99±0,05 | 28,00±0,03 | 5,99±0,02 | 29,00±0,05 |
| Mg | 1,92±0,09 | 1200,00±10,19 | 1,30±0,04 | 670,00±8,08 | 3,78±0,01 | 1100,00±9,66 |
| Al | 2,22±0,70 | 130,00±1,80 | 22,98±0,43 | 31,00±1,20 | 43,63±0,43 | 92,00±1,79 |
| Si | 65324±291 | 220,00±2,79 | 54263±125 | 74,00±2,18 | 49625±212 | 190,00±2,65 |
| К | 3,15±2,24 | 25000±182 | 3,29±0,07 | 15000±119 | 7,11±0,02 | 21000±181 |
| Ca | 20,02±6,74 | 7900,00±81,46 | 8,17±0,08 | 3400,00±47,73 | 8,52±0,21 | 5700,00±81,45 |
| Ti | 0,93±1,09 | 5,40±0,09 | 0,64±0,03 | 0,70±0,08 | 2,67±0,01 | 5,10±0,08 |
| V | 14,00±15,17 | 0,10±0,00 | 33,00±0,26 | 0,20±0,01 | 44,00±0,37 | 0,20±0,00 |
| Cr | 170,00±77,42 | 0,90±0,00 | 33,00±0,93 | 0,80±0,00 | 39,00±2,51 | 0,90±0,00 |
| Mn | 1,29±0,55 | 14,00±2,17 | 0,23±0,01 | 18,00±1,88 | 0,51±0,01 | 120,00±0,72 |
| Fe | 63,65±26,89 | 140,00±1,34 | 18,90±0,32 | 66,00±0,69 | 15,44±0,82 | 97,00±1,34 |
| Co | 25,00±9,30 | 0,18±0,00 | 22,00±0,27 | 0,07±0,00 | 7,60±0,12 | 0,08±0,00 |
| Ni | 79,00±29,02 | 7,20±0,11 | 52,00±0,63 | 5,80±0,11 | 21,00±0,57 | 12,00±0,04 |
| Cu | 520,00±276,17 | 18,00±0,09 | 59,00±3,38 | 16,00±0,05 | 26,00±8,54 | 13,00±0,04 |
| Zn | 1500,00±74,76 | 46,00±0,47 | 210,00±9,02 | 27,00±0,18 | 200,00±23,79 | 21,00±0,36 |
| Ga | 7,90±1,92 | 0,05±0,00 | 5,50±0,06 | 0,05±0,00 | 9,30±0,04 | 0,05±0,00 |
| As | 56,00±7,57 | 0,04±0,00 | 17,00±0,49 | 0,04±0,00 | 39,32±0,70 | 0,04±0,00 |
| Br | - | 5,70±0,04 | - | 6,80±0,04 | - | 4,50±0,02 |
| Se | 0,80±0,00 | 0,40±0,00 | 0,90±0,00 | 0,50±0,00 | 0,90±0,00 | 0,40±0,00 |
| Rb | 30,00±3,06 | 7,60±0,01 | 26,00±0,67 | 7,50±0,01 | 63,00±0,25 | 7,20±0,00 |
| Sr | 150,00±3,56 | 40,00±0,54 | 81,00±0,53 | 11,00±0,22 | 100,00±1,25 | 19,00±0,52 |
| Y | 8,90±0,21 | 0,10±0,01 | 9,5000±0,0654 | 0,0220±0,0041 | 13,00±0,0286 | 0,250±0,0019 |
| Zr | 110,00±13,82 | 0,24±0,00 | 88,00±4,43 | 0,12±0,00 | 330,00±1,65 | 0,17±0,00 |
| Mo | 14,00±0,89 | 0,34±0,01 | 3,90±0,09 | 0,22±0,00 | 0,82±0,19 | 0,07±0,00 |
| Ag | 4,20±0,25 | 0,04±0,00 | 0,30±0,00 | 0,04±0,00 | 0,30±0,01 | 0,04±0,00 |
| Cd | 3,70±0,61 | 0,08±0,00 | 1,70±0,02 | 0,02±0,00 | 0,50±0,03 | 0,04±0,00 |
| Sn | 132,00±40,59 | 0,30±0,00 | 6,50±9,00 | 0,30±0,00 | 9,50±23,84 | 0,30±0,00 |
| Sb | 8,60±4,07 | 0,11±0,00 | 3,50±0,07 | 0,04±0,00 | 0,54±0,10 | 0,01±0,00 |
| Cs | 1,40±0,50 | 0,01±0,00 | 1,80±0,01 | 0,01±0,00 | 2,40±0,01 | 0,01±0,00 |
| Ba | 730,00±20,59 | 17,00±0,25 | 340,00±2,83 | 5,20±0,23 | 420,00±7,10 | 18,00±0,21 |
| La | 17,00±7,09 | 0,16±0,01 | 12,00±0,25 | 0,12±0,01 | 26,00±0,12 | 0,39±0,00 |
| Се | 32,00±1,53 | 0,29±0,01 | 23,00±0,54 | 0,09±0,01 | 53,00±0,24 | 0,64±0,01 |
| Yb | 1,00±0,09 | 0,01±0,00 | 1,10±0,01 | 0,01±0,00 | 1,90±0,01 | 0,02±0,00 |
| W | 23,00±2,14 | 0,90±0,02 | 2,70±0,14 | 2,30±0,02 | 1,30±0,07 | 0,90±0,02 |
| Hg | 0,21±0,01 | 0,03±0,00 | 0,22±0,01 | 0,03±0,00 | 0,20±0,01 | 0,03±0,00 |
| Tl | 0,29±0,01 | 0,01±0,00 | 0,52±0,00 | 0,01±0,00 | 0,41±0,00 | 0,01±0,00 |
| Pb | 220,00±14,40 | 1,50±0,02 | 68,00±1,50 | 0,35±0,01 | 20,00±2,88 | 0,37±0,01 |
| Bi | 1,50±0,02 | 0,02±0,00 | 0,25±0,01 | 0,02±0,00 | 0,29±0,00 | 0,02±0,00 |
Были выявлены элементы, которые могут накапливаться в растениях караганы. К ним относятся: магний, кальций и потенциально токсичный титан.
Результаты исследований позволили считать сырье караганы древовидной перспективным источником биологически важных элементов; была выявлена экологическая безопасность сырья для организма человека в отношении содержания тяжелых металлов и радиоактивных элементов.
Фармакологическая активность и токсичность
экстрактов караганы древовидной
Испытания на острую и хроническую токсичность проводили на здоровых белых мышах при внутрибрюшинном введении и на половозрелых беспородных белых крысах при пероральном введении. Рабочие растворы готовили из сухих экстрактов караганы, полученных с использованием воды очищенной и этанола 70% и 90%.
Сухие экстракты растворяли в горячей воде очищенной в концентрации 50 мг/мл и 200 мг/мл. Каждую серию растворов испытывали на 6-12 животных в дозах 100, 500, 1000, 1500, 2000 мг/кг. Полученные данные свидетельствовали о том, что вещества караганы древовидной относятся к категории нетоксичных.
Гепатопротекторная активность оценивалась по восстановлению уровня маркерных ферментов крови аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартат-аминотрансферазы (АсАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) после воспроизведения гепатита 50% масляным раствором четыреххлористого углерода (таблица 8). Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах. Сухие экстракты растворяли в горячей воде очищенной в концентрации 50 мг/мл, вводили животным внутрижелудочно в течение 7 дней.
Установлено достоверное снижение уровней АлАТ и АсАТ в сыворотке крови животных по сравнению с контролем при введении растворов сухих экстрактов, полученных с использованием этанола. Результаты гепатопротекторной активности караганы древовидной были сопоставимы с действием лекарственного препарата «Карсил».
Таблица 8 – Гепатопротекторная активность экстрактов караганы древовидной
| Рабочий раствор | Доза, мг/кг | Уровень маркерных ферментов крови | ||
| АлАТ, мкМоль/л·ч | АсАТ, мкМоль/л·ч | ЩФ, ед/л·ч 10-2 | ||
| Раствор сухого экстракта, полученного с использованием воды очищенной | 125 | 0,39±0,08 | 0,72±0,05 | 5,38±0,01 |
| Раствор сухого экстракта, полученного с использованием 70% этанола | 125 | 0,35±0,03* | 0,62±0,04* | 5,34±0,02 |
| Раствор сухого экстракта, полученного с использованием 90% этанола | 125 | 0,36±0,04* | 0,60±0,02* | 5,26±0,03 |
| Препарат «Карсил» | 2,1 | 0,36±0,03* | 0,63±0,06* | 5,02±0,03 |
| Контроль | 0 | 0,42±0,07 | 0,75±0,05 | 5,45±0,02 |
| Интактные животные | 0 | 0,27±0,02 | 0,54±0,05 | 4,18±0,02 |
| * - Достоверное снижение уровня маркерных ферментов крови при р<0,05. | ||||
Исследована гипогликемическая активность экстрактов караганы древовидной на модели эпинефринового диабета у белых крыс-самцов. Показано достоверное снижение уровня глюкозы в крови животных по сравнению с контролем при введении растворов сухих экстрактов, полученных с использованием воды очищенной, что сопоставимо с действием гипогликемического растительного сбора «Арфазетин» (таблица 9).
| Рабочий раствор | Время с начала эксперимента, мин. | |||||
| 30 | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 | |
| Раствор сухого экстракта, полученного с использованием воды очищенной | 9,92+ 0,10* | 10,24+ 0,06* | 8,22+ 0,09* | 6,86+ 0,05* | 7,24+ 0,05* | 7,24+ 0,05* |
| Раствор сухого экстракта, полученного с использованием 70% этанола | 16,62+ 0,12 | 16,91+ 0,09 | 15,44+ 0,06 | 9,63+ 0,10 | 8,45+ 0,08 | 8,40+ 0,09 |
| Раствор сухого экстракта, полученного с использованием 90% этанола | 16,25+ 0,08 | 16,43+ 0,11 | 15,98+ 0,12 | 9,95+ 0,13 | 9,23+ 0,10 | 8,48+ 0,11 |
| Настой сбора «Арфазетин» | 10,75+ 0,09* | 11,22+ 0,11* | 7,57+ 0,09* | 6,94+ 0,08* | 7,12+ 0,08* | 7,12+ 0,08* |
| Контроль | 15,93+ 0,13 | 16,22+ 0,09 | 15,75+ 0,10 | 9,46+ 0,06 | 8,23+ 0,09 | 8,23+ 0,09 |
| * - Достоверное снижение содержания глюкозы в крови при р<0,05. | ||||||
Таблица 9 – Гипогликемическая активность экстрактов караганы древовидной (содержание глюкозы в крови животных, Моль/мл)
Изучение противовоспалительного и ранозаживляющего действий караганы древовидной проводили на модели экспериментальной гнойной раны у кроликов. Образование струпа и уменьшение раневой поверхности на 60-70% наблюдали на 1-2 сутки при нанесении раствора сухого экстракта, полученного с использованием 70% этанола, и на 2-3 сутки – раствора сухого экстракта, полученного с использованием 90% этанола. Эпителизация ран наступала на 4-7 сутки. В контрольной группе животных образование струпа и эпителизация ран наблюдались позднее на 2-4 суток.
При исследовании антимикробной активности экстрактов караганы древовидной методом диффузии в агар антимикробного действия не установлено.
Стандартизация качества сырья караганы древовидной
С целью стандартизации сырья побегов караганы древовидной были установлены его диагностические морфологические и анатомические признаки. Диагностическое значение имели: форма и размер листа, наличие и вид прилистников, цвет и строение цветка и цветоноса. Характерными отличительными особенностями анатомического строения являлись: форма и расположение волосков, отсутствие устьиц на верхней эпидерме листа, наличие жилок с кристаллоносной обкладкой.
Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в сырье караганы.
Исследованы показатели качества побегов караганы древовидной с учетом результатов товароведческого анализа проб тестируемых партий сырья, заготовленных с различных мест произрастания. Для цельного и измельченного сырья установлены следующие показатели: влажность – не более 8,0%; золы общей – не более 9,0%; золы, нерастворимой в 10% растворе НСl – не более 1,0%. Предложены нормы содержания органической примеси – не более 1,0%; минеральной примеси – не более 0,5%; содержание стеблей – не более 20,0%; содержание флавоноидов – не менее 2,5%. С целью установления сроков годности сырья были проведены исследования стабильности показателей качества сырья в процессе хранения. Рекомендован срок хранения – 2 года. На основании полученных данных были разработаны и утверждены: Технические условия (ТУ) «Побеги караганы древовидной», Опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство сырья побегов караганы древовидной, Инструкция по сбору и сушке побегов караганы древовидной.
Получение сухого экстракта караганы древовидной
и стандартизация его качества
Для получения сухого экстракта караганы была разработана и апробирована в лабораторных условиях технологическая схема производства. Она включала две технологические стадии и заключалась в экстрагировании биологически активных веществ 70% этанолом способом дробной мацерации по типу противотока, с последующим концентрированием извлечения, сепарированием, вакуумной сушкой, фасовкой, упаковкой и маркировкой товара. Предварительно были определены технологические показатели цельного и измельченного сырья; оптимизирован процесс экстракции биологически активных веществ из сырья по факторам: измельченность сырья, гидромодуль, продолжительность экстракции, количество экстракции.
С целью стандартизации сухого экстракта караганы были изучены его потребительские свойства, предложены показатели качества, установлены их нормы: влажность - не более 5,0 %; растворимость: растворим в спирте этиловом 70%, умеренно растворим в горячей воде, мало растворим в холодной воде, очень мало растворим в хлороформе; гигроскопичность – малогигроскопичен, наличие тяжелых металлов - отсутствуют. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в сухом экстракте. Предложена норма содержания флавоноидов в сухом экстракте – не менее 9,0 %. Исследована стабильность сухого экстракта в процессе хранения. Рекомендован срок хранения – 2 года.
Полученные результаты позволили разработать проекты нормативной документации: технические условия (ТУ) и опытно-промышленный регламент (ОПР) на сухой экстракт караганы древовидной.
ВЫВОДЫ
- В результате проведенных исследований дано ботанико-фармакогностическое обоснование возможности расширения сырьевой базы лекарственных растений за счет использования караганы древовидной.
- Изучены особенности онтогенеза и ритма сезонного развития караганы древовидной, интродуцированной в Московской области. Жизненный цикл караганы дифференцирован на четыре возрастных периода и девять возрастных состояний. В ходе онтогенеза выявлены изменения морфолого-анатомических признаков. Показано влияние интродукции на продолжительность вегетационного периода и возрастных состояний онтогенеза растений. Установлено, что для заготовки на сырье целесообразнее использовать побеги генеративных растений.
- Исследован качественный химический состав биологически активных веществ в побегах караганы. Установлено наличие в сырье флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, аминокислот, полисахаридов, дубильных веществ, кумаринов. Выделено и идентифицировано шесть основных флавоноидов: апигенин, кверцетин, кемпферол, лютеолин, лютеолин-7-гликозид, рутин. Проведен сравнительный анализ количественного содержания флавоноидов в сырье растений различных возрастных состояний и фенологических фаз. Установлено, что для рационального и эффективного использования караганы древовидной следует заготавливать на сырьё побеги молодых и средневозрастных генеративных растений в фазу массового цветения.
- Изучен качественный и количественный аминокислотный и минеральный состав сырья караганы древовидной. Установлено наличие 18 аминокислот, среди которых 7 – незаменимые. Суммарное содержание незаменимых аминокислот составило 15,4% от общего количества аминокислот в сырье. Идентифицировано 58 макро- и микроэлементов в сырье караганы. Показана перспектива использования сырья караганы древовидной в качестве источника аминокислот и биологически важных макро- и микроэлементов.
- Изучена гепатопротекторная активность экстрактов караганы древовидной. Показано на модели экспериментального гепатита у крыс соответствие влияния экстрактов на восстановление уровней маркерных ферментов крови действию препарата «Карсил». При исследовании гипогликемической активности экстрактов караганы на модели эпинефринового диабета у крыс было установлено соответствие результатов по снижению уровня глюкозы в крови действию настоя из сбора «Арфазетин». Изучены противовоспалительное и ранозаживляющее действия экстрактов караганы. Установлено, что вещества караганы древовидной относятся к категории нетоксичных.
- С целью стандартизации качества сырья караганы древовидной были установлены диагностические морфологические и анатомические признаки, предложены показатели качества и их нормы. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в сырье и сухом экстракте караганы. Относительные ошибки методик определения количественного содержания флавоноидов не превышали + 1%. Изучена стабильность сырья и сухих экстрактов караганы в процессе хранения.
- На основании проведенных исследований разработаны и утверждены технические условия на побеги караганы древовидной, опытно-промышленный регламент на производство сырья, инструкция по сбору и сушке побегов караганы; разработаны проекты технических условий и опытно-промышленного регламента на производство сухого экстракта караганы древовидной.
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
- Барабанов Е.И., Хасаншина А.Р. Перспективность медицинского применения растений рода карагана (Caragana Lam.) // Материалы заочной международной конференции «Приоритеты фармацевтической науки и практики». М., 2006. – С. 234-235.
- Барабанов Е.И., Хасаншина А.Р. Изучение элементного состава караганы древовидной // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета ЯГМА «Современные вопросы теории и практики лекарствоведения». – Ярославль, 2007. – С. 302-304.
- Барабанов Е.И., Хасаншина А.Р. Изучение диагностических признаков сырья караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.) // Материалы научно-практической конференции, посвящённой 70-летию Ташкентского фармацевтического института, "Интеграция образования, науки и производства в фармации". – Ташкент, 2008. – С. 215-216.
- Хасаншина А.Р., Абизов Е.А., Бабаскина Л.И. и др. Разработка пелоидных композиций, содержащих экстракты растений семейства бобовых // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации». – Ташкент, 2008. – С. 71-72.
- Хасаншина А.Р., Абизов Е.А., Бабаскина Л.И. и др. Изучение высвобождения флавоноидов из пелоидных композиций, содержащих экстракты растений семейства бобовых // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации». – Ташкент, 2008. – С. 334-335.
- Хасаншина А.Р., Абизов Е.А., Бабаскина Л.И. и др. Изучение факторов, влияющих на высвобождение биологически активных веществ из пелоидных композиций // Сборник материалов ХVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (тезисы докладов). – М., 2009. – С. 613.
- Хасаншина А.Р., Абизов Е.А., Бабаскина Л.И. и др. Высвобождение биологически активных веществ из пелоидных композиций в опытах in vivo// Сборник материалов ХVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (тезисы докладов). – М., 2009. – С. 613.
- Хасаншина А.Р., Барабанов Е.И., Бабаскина Л.И. Определение флавоноидов в побегах караганы древовидной // Фармация. – 2009. – №5. – С. 20-22.
