Разработка методики определения кортизола и 6- -гидроксикортизола в моче с целью установления активности изофермента cyp 3a4

На правах рукописи

СМИРНОВ

Валерий Валерьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОРТИЗОЛА И 6--ГИДРОКСИКОРТИЗОЛА В МОЧЕ С ЦЕЛЬЮ УСТАНОВЛЕНИЯ

АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТА CYP 3A4

14.04.02. – фармацевтическая химия, фармакогнозия

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный

Медицинский Университет имени И.М.Сеченова

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук

профессор Чистяков Виктор Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Жердев Владимир Павлович

Ведущая организация:

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ».

Защита состоится «____» ___________ 2011 г. в ____ часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Первом Московском Государственном Медицинском Университете имени И.М.Сеченова по адресу: 119992, Москва, Трубецкая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Библиотеке Первого ПМГМУ имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан «____» ___________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор фармацевтических наук,

профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

На сегодняшний день одной из основных проблем, стоящей перед медициной остается оптимизация фармакотерапии. Эта проблема решается путем разработки и внедрения методов и технологий, повышающих эффективность и безопас­ность терапии лекарственными средствами.

Экспериментальные данные, полученные в различных исследованиях, показали, что одним из основных фармакокинетических процессов, определяющих индивидуальный фар­макологический ответ, является метаболизм, или биотрансформация лекарственных средств [Кукес В.Г. и соавт.,2007].

Изучение различных факторов, влияющих на метаболизм ле­карственных средств, помогает повысить эффективность проводимой терапии и из­бежать развития нежелательных лекарственных реакций. Так, на метаболизм ле­карственных средств могут влиять пол, возраст, изменение функционального состо­яния органов метаболизма (печень, кишечник, почки), качественный и количествен­ный состав пищевого рациона [Сычев Д.А. и соавт., 2007]. Кроме того, фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств на уровне метаболизма является, пожалуй, наиболее клини­чески значимым. Велико значение генетических полиморфизмов ферментов мета­болизма лекарственных средств в формировании индивидуального фармакологиче­ского ответа.

Изофермент цитохрома Р450 (CYP) 3A4 участвует в метаболизме большого количества лекарственных средств (около 60% всех применяемых в настоящее время лекарственных средств). Он катализирует несинтетическую стадию биотрансформации. При этом под действием CYP 3A4 лекарственные средства превращаются в более гидрофильные, чем нативные вещества, метаболиты, в результате чего скорость выведения почками данных соединений возрастает. В большинстве случаев, помимо увеличения скорости выведения, в процессе метаболизма так же теряется фармакологическая активность. Однако некоторые лекарственные вещества, так называемые пролекарства, изначально обладают меньшей фармакологической активностью, и только под влиянием CYP 3A4 превращаются в активные метаболиты, которые и вызывают фармакологические эффекты. Кроме того, CYP 3A4 участвует в биотрансформации не только введенных из вне лекарственных средств, но и эндогенных соединений — таких, как стероидные гормоны, метаболиты витамина D и др.

Некоторые вещества влияют на изофермент CYP 3A4, ингибируя или индуцируя его активность. Индукция ведет к ускорению метаболизма ЛС и, как правило, к увеличению скорости выведения вещества и снижению его фармакологической активности. Ингибирование же наоборот, снижает активность ферментов и повышает концентрацию ЛС в крови.

Определение активности изофермента CYP 3A4 является важной задачей для рациональной фармакотерапии, особенно при одновременном назначении нескольких препаратов. Так, например, индукторы или ингибиторы изофермента CYP 3A4 при совместном приеме с субстратом данного изофермента будут изменять фармакокинетические характеристики этого субстрата [Amber Huls, 2007].

Активность CYP 3A4 в организме человека можно определить по концентрации в крови метаболита (возможно, и в других биологических жидкостях), который образуется из введенного ранее лекарственного средства, причем этот метаболит должен образовываться исключительно под действием CYP 3A4. Такие лекарственные средства называют маркерными субстратами. В настоящее время для оценки активности CYP 3A4 в научных целях используется несколько маркерных субстратов: эритромицин, лидокаин, нифидипин, дапсон и мидозалам.

Данные тесты обладают рядом выраженных недостатков, таких как необходимость внутривенного введения препаратов, применение которых сопряжено с риском развития НЛР и, прежде всего — аллергических реакций и аритмогенных эффектов; необходимость, как минимум, двукратного забора крови из вены; тестирование может проводиться только в условиях лечебно-профилактического учреждения; Например, MEGX может образовываться из лидокаина под влиянием не только CYP 3A4, но и CYP1A2, а значит, данный тест отражает суммарную активность этих 2 изоферментов цитохрома Р450.

В связи с этим более перспективны, методы оценки активности CYP 3A4 по концентрации в биологических жидкостях эндогенных метаболитов, которые образуются только под действием CYP 3A4, что исключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, а значит, делает метод на 100% безопасным для больного.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования.

Разработать методику количественного определения кортизола и 6--гидроксикортизола в моче, позволяющую оценивать активность CYP 3А4.

Задачи исследования.

1. Провести информационно-аналитический анализ существующих методик определения активности CYP 3A4.
2. Подобрать оптимальные условия количественного определения 6--гидроксикортизола и кортизола в моче методом LС-MS.
3. Провести валидацию разработанной методики.
4. Изучить активность CYP 3A4 у пациентов с помощью разработанной методики.
5. Изучить изменение активности CYP 3A4 у пациентов при приеме индукторов и ингибиторов активности данного изофермента.
6. Сделать вывод о возможности использования данной методики для определения изменений активности при приеме индукторов и ингибиторов активности CYP 3A4.

Научная новизна.

В работе впервые разработана чувствительная и воспроизводимая методика оценки активности CYP 3A4 с помощью отношения концентраций 6--гидроксикортизола и кортизола в моче методом LС-MS. Данная методика позволяет определить активность CYP 3A4 по концентрации в биологических жидкостях эндогенных соединений, что исключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, а значит, делает метод на 100% безопасным для больного. Существующие на сегодняшний момент методики определения активности CYP 3A4 в основном подразумевают введение экзогенных веществ.

Практическое применение и внедрение результатов в практику.

Разработанная методика количественного определения кортизола и его метаболита в моче методом LC/MS может быть использована для определения изменения активности изофермента CYP 3A4 в процессе лечения, что позволит корректировать дозу препарата и повысить эффективность и безопасность фармакотерапии. Данная методика внедрена для определения активности изофермента CYP 3A4 в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН (акт внедрения от 11.05.2010) и Институте Клинической Фармакологии ФГУ «НЦ ЭСМП» (акт внедрения от 26.05.2010).

Положения, выносимые на защиту.

1. Условия количественного анализа кортизола и его метаболита в моче методом LC/MS.
2. Использование разработанной методики определения активности изофермента CYP 3A4 возможно, в силу того, что данная методика показала высокую эффективность, точность и воспроизводимость.
3. Разработанная методика определения активности изофермента CYP 3A4 является наиболее безопасной для пациента из всех существующий альтернативных методик на сегодняшний день.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 26.08.2010 г.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009 г.), международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шыкмент, 2009 г.), научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009 г.), международном конгрессе Европейского Общества Клинических Фармакологов и Терапевтов (EACPT) (Эдинбург, 2009 г.), международном конгрессе WorldPharma 2010 (Копенгаген, 2010 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом.

Диссертационная работа является частью исследований, которые разрабатываются на кафедре фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, номер Государственной регистрации – 01.2.006 06352.

Публикации:

По результатам диссертационного исследования опубликовано 8 печат­ных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 публикации в зарубежных изданиях.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов и списка литературы из 98 источников (70 из кото­рых зарубежные).

Результаты эксперимента, обобщены в таблицах, проиллюстрированы рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Подбор условий экстракции кортизола и 6--гидроксикортизола из мочи и последующее хроматографическое исследование этих соединений выполнялись на основании анализа данных по их физико-химическим свойствам (кислотность, коэффициент распределения, растворимость и др.). Для разработки методики количественного определения кортизола и 6--гидроксикортизола был выбран метод LC/MS.

1.Аппаратура.

• LC/MS Agilent 1200 series:

• насос высокого давления – градиентный Agilent 1200, смешивающий 4 компонента подвижной фазы;
• резервуары с растворителями (х4) объёмом по 1 л;
• инжектор с автосемплером;
• хроматографическая колонтка Agilent XDB-C18 (4,6x50 мм; 1,8 мкм);
• UV-Vis Спектрофотометр Agilent;
• масс-детектор Agilent 6140 квадруполь;
• ЭВМ с ПО – Chemstaition v1.

• рН-метр «MetroHm 744» (Швейцария);
• водяная баня;
• роторный вакуумный испаритель;
• магнитная мешалка;
• вихревая мешалка Vortex;
• шейкер;
• центрифуга;

2. Реактивы

В работе использовались следующие реактивы: вода деионизированная, кислота муравьиная, этанол 96%, ацетонитрил, этилацетат, изопропанол.

Образцы субстанций кортизола и 6--гидроксикортизола фирмы Sigma-Aldrich - Кортизол (98%, для ВЭЖХ) и 6--гидроксикортизол (98%, для ВЭЖХ). Структурные формулы представлены на рисунках 1,2.

C21H30O5 М.м.362,46

Рисунок 1. Структурная формула кортизола.

C21H30O6 М.м.378,46

Рисунок 2. Структурная формула 6--гидроксикортизола.

3. Оценка активности CYP 3A4.

В качестве объекта исследования была выбрана моча. Исходя из фармакокинетики определяемых эндогенных соединений, была использована утренняя моча. Так как кортизол является гормоном стресса, то его наивысшая концентрация достигается в утренние часы. Необходимо время для того, чтобы кортизол, биотрансформировался до 6--гидроксикортизола и вывелся почками, поэтому первую порцию утренней мочи выливали, а все последующие в течение 8 часов собирали в одну емкость. Затем объем мочи измеряли и аликвоту (около 10 мл) переносили в пластмассовую пробирку. Допускалось замораживание мочи до анализа при -180С.

Для разработки методики LC-MS определения кортизола и 6--гидроксикортизола была выбрана моча пациентов. Для испытания не подходила моча пациентов с заболеваниями почек, сопровождающимися полиурией, олигурией или анурией. А так же моча пациентов с заболеванием надпочечников и нарушением гормональной регуляции и моча поциентов, которые принимали глюкокортикостероиды.

Для возможности сделать вывод о зависимости активности изофермента CYP 3A4 от отношению кортизола и 6--гидроксикортизола, моча у пациентов отбиралась два раза. Сначала до применения ингибитора или индуктора активности изофермента CYP 3А4, а потом спустя неделю после начала систематического приема индуктора или ингибитора изофермента CYP 3A4. В качестве индуктора применялась настойка зверобоя (Hypericum perforatum), а в качестве ингибитора – грейпфрутовый сок.

4. Обработка полученных результатов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью t-теста Стьюдента (доверительный интервал 0,95), используя пакет Microsoft Office Excel 2007. Валидация методики приведена далее.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методики определения отношения кортизола и 6--гидроксикортизола в моче.

Разработка определения кортизола и 6--гидроксикортизола в растворах с помощью LC-MS.

В качестве метода определения был выбран метод обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемными УФ- и масс- детекторами, как один из наиболее чувствительных и специфичных.

Методика.

Определение проводили на приборе «Agilent 1200» с программным обеспечением ChemStation v.1.0.

Стандартный раствор. Стандартный раствор представлял собой спиртовой раствор кортизола и 6--гидроксикортизола с концентрацией кортизола в растворе 10 мкг/мл, и 6--гидроксикортизола - 1 мкг/мл. 1,5 мл стандартного раствора вносили во флакон для автосемплера на 2 мл. Закрывали крышкой, и помещали в автосемплер.

Объем вкола: 50 мкл.

Колонка: Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкм.

Подвижная фаза: вода, подкисленная НСООН (1мл муравьиной кислоты на 1 л воды, рН = 4,5)/ацетонитрил (55/45).

Скорость потока: 1,0 мл/мин.

Детектирование:

• УФ-детектор: при длине волны 246 нм.
• Масс-селективный детектор:

- Режим анализа: SCAN в пределах от 300 – 400 m/z

- Полярность: негативная

- Тип ионизации: MM-ES + APCI.

Так как мы определяем одновременно два вещества, поэтому мы не можем использовать SIM режим, что уменьшает селективность метода, но делает его более универсальным.

Идентификация кортизола и 6--гидроксикортизола: времена удерживания главных пиков на хроматограмме, полученной от УФ-детекора следующие:

время удерживания кортизола: около 2,5 мин.

время удерживания 6--гидроксикортизола: около 4,5 мин.

Относительное время удерживания 6--гидроксикортизол/ кортизола: около 1,81

Этим же пикам на хроматограмме, полученной от масс-селективного детектора, главным пикам с вышеуказанными временами удерживания соответствовали характерные масс-спектры. Образец хроматограммы представлен на рисунке 3.

Пригодность хроматографической системы.

Пригодность хроматографической системы рассчитывали по хроматограмме, полученной от масс-детектора.

Эффективность колонки:

• эффективность колонки, рассчитанная по пику кортизола составила 15000;
• эффективность колонки, рассчитанная по пику 6--гидроксикортизола составила 7800.

Коэффициент разрешения: разрешение пиков кортизола и 6--гидроксикортизола было больше 1,5.

Фактор асимметрии:

• фактор асимметрии пика кортизола составил 1,05;
• фактор асимметрии пика 6--гидроксикортизола составил 0,98.

Рисунок 3. Образец хроматограммы

(А – УФ-детекторирование, Б – масс-детектирование)

Построение калибровочной кривой.

Приготовление калибровочных растворов.

В пять отдельных флаконов переносили 0,1 мл, 0,3 мл, 0,5 мл, 0,7 мл и 1,0 мл стандартного раствора кортизола и 6--гидроксикортизола (концентрация кортизола в растворе 10 мкг/мл, концентрация 6--гидроксикортизола- 1 мкг/мл), и прибавляли 9,9 мл, 9,7 мл, 9,5 мл, 9,3 мл и 9,0 мл воды деионизированной во флаконы соответственно. Интенсивно встряхивали. Концентрации кортизола и 6--гидроксикортизола в полученных растворах приведены в таблице 1.

Таблица 1

Концентрация кортизола и 6--гидроксикортизола в калибровочных растворах

Номер раствора	Концентрация кортизола, нг/мл	Концентрация 6--гидроксикортизола, нг/мл
1	100	10
2	300	30
3	500	50
4	700	70
5	1000	100

Построение калибровочной кривой.

Хроматографировали все полученные растворы в приведенных выше условиях. Записывали площади пиков кортизола и 6--гидроксикортизола, и строили две калибровочные кривые в системе координат зависимости концентрации от площади пика кортизола или 6--гидроксикортизола.

Калибровочная кривая кортизола имела следующие характеристики:

коэффициент корреляции (r) = 0,99998;

уравнение прямой: y = 24,72579934x – 0,01298

Калибровочная кривая 6--гидроксикортизола имела следующие характеристики:

коэффициент корреляции (r) = 0, 99949;

уравнение прямой: y = 35,40994х – 1,41

Методика пробоподготовки мочи для анализа.

Приготовление экстрагента.

В результате серии экспериментов наиболее оптимальным экстрагентом была признана смесь этилацетата и изопропанола в соотношении 85:15. В подходящую колбу отмеряли 85 мл этилацетата и 15 мл изопропанола. Закрывали пробкой и встряхивали в течение 5 минут.

Процедура экстракции.

2 мл исследуемой мочи пипеткой переносили в полипропиленовую пробирку. В эту же пробирку пипеткой переносили 4 мл экстрагента. Встряхивали в течение 10 минут на шейкере, для полноты экстракции, так, чтобы не образовывалась эмульсия. Затем центрифугировали в течение 5 минут при скорости 3000 об/мин. Помещали пробирку в морозильную камеру с температурой -180 С. Спустя 15 минут пробирку вынимали и немедленно отделяли органический слой от замерзшего водного, переливая его в чистую полипропиленовую пробирку, которую сразу плотно закрывали пробкой. Водный слой выстаивали до комнатной температуры. Повторно проводили ту же самую процедуру. Органические слои объединяли. Объединенный органический слой точно и аккуратно переносили в стеклянную колбу для упаривания, помещали ее на водяную баню при температуре 400 С, и при помощи роторного вакуумного испарителя выпаривали органический слой досуха. В колбу для выпаривания вносили 750 мкл фильтрованного 96% этилового спирта. Колбу закрывали притертой пробкой. Взбалтывали колбу на вихревой мешалке Vortex в течение 1 минуты. Прибавляли в колбу еще 750 мкл фильтрованного 96% этилового спирта. Колбу закрывали притертой пробкой, и опять взбалтывали колбу на вихревой мешалке Vortex в течение 1 минуты. Переносили содержимое колбы для упаривания во флакон на 2,5 мл для автосемплера. Закрывали флакон пробкой. Взбалтывали флакон на вихревой мешалке Vortex в течение 30 секунд. Помещали флакон в автосемплер.

Оценка полноты экстракции.

Для того чтобы оценить полноту экстракции из мочи кортизола и 6--гидроксикортизола добавляли к моче не содержащей кортизол и 6--гидроксикортизол известное количество стандартного раствора кортизола и 6--гидроксикортизола, проводили экстракцию и хроматографировали, как описано выше. Полученные значения площади под кривой соотносили со значениями площадей растворов аналогичных концентраций.

Процедура оценки полноты экстракции при пробоподготовке.

В 3 отдельные полипропиленовые пробирки помещали 100 мкл, 500 мкл и 1000 мкл стандартного раствора кортизола и 6--гидроксикортизола (концентрация кортизола в растворе 10 мкг/мл, концентрация 6--гидроксикортизола - 1 мкг/мл). Переносили в эти пробирки мочу, не содержащую кортизол и 6--гидроксикортизол.

Концентрации кортизола и 6--гидроксикортизола в полученных растворах приведены в таблице 2. Экстракцию определяемых соединений проводили, как описано выше (см. Процедура экстракции).

Таблица 2

Концентрация кортизола и 6--гидроксикортизола в моче для определения эффективности экстракции

Номер раствора	Концентрация кортизола, нг/мл	Концентрация 6--гидроксикортизола, нг/мл
1	100	10
2	500	50
3	1000	100

После расчета и усреднения значений было получено, что процент экстракции кортизола равен 83%, а процент экстракции 6--гидроксикортизола равен 79%. Полученные значения процента экстракции подходят для использования данного метода в качестве пробоподготовки.

Метод количественного определения кортизола и 6--гидроксикортизола в моче.

В качестве метода количественного определения был выбран метод абсолютной калибровки. Так как мы определяем одновременно два вещества, и больше всего нас интересует отношение их количеств, то введение внутреннего стандарта нецелесообразно, как утяжеляющее методику.

Приготовление калибровочных растворов.

В 9 различных пробирок помещали 0 мкл, 50 мкл, 100 мкл, 300мкл, 500 мкл, 700 мкл, 1000 мкл, 2500 мкл, 5000 мкл стандартного раствора кортизола и 6--гидроксикортизола (концентрация кортизола в растворе 10 мкг/мл, концентрация 6--гидроксикортизола - 1 мкг/мл). Так как моча обычно содержит какое-либо количество эндогенных кортизола и 6--гидроксикортизола, то ее использование для разбавления образцов недопустимо. Поэтому использовали образцы мочи, не содержащие кортизол и 6--гидроксикортизол. Переносили в эти пробирки мочу, не содержащую кортизол и 6--гидроксикортизол, так, чтобы объем содержимого каждой пробирки равнялся 10 мл.

Концентрации кортизола и 6--гидроксикортизола в полученных образцах приведены в таблице 3.

Отбирали из каждой пробирки аликвоту по 2 мл, и проводили экстракцию, как описано выше (см. Процедура экстракции). После проведения экстракции, хроматографировали, как описано выше.

На полученных хроматограммах отмечали площади пиков кортизола и 6--гидроксикортизола. Строили две калибровочные кривые в системе координат зависимости концентрации от площади пика кортизола или 6--гидроксикортизола.

Таблица 3

Концентрация кортизола и 6--гидроксикортизола в калибровочных образцах

Номер раствора	Концентрация кортизола, нг/мл	Концентрация 6--гидроксикортизола, нг/мл
1	0	0
2	50	5
3	100	10
4	300	30
5	500	50
6	700	70
7	1000	100
8	2500	250
9	5000	500

Калибровочная кривая кортизола имела следующие характеристики:

коэффициент корреляции (r) = 0,99982;

уравнение прямой: y = 1,6736 х – 0,0263

Калибровочная кривая 6--гидроксикортизола имела следующие характеристики:

коэффициент корреляции (r) = 0, 99579;

уравнение прямой: y = 0,927467х – 1,367

Пригодность хроматографической системы.

Эффективность колонки:

• эффективность колонки, рассчитанная по пику кортизола составила 8700;
• эффективность колонки, рассчитанная по пику 6--гидроксикортизола составила 7300.

Коэффициент разрешения между пиками кортизола и 6--гидроксикортизола был больше 1,5.

Фактор асимметрии:

• фактор асимметрии пика кортизола равнялся 1,07;
• фактор асимметрии пика 6--гидроксикортизола равнялся 0,95.

Валидация методики определения кортизола и 6--гидроксикортизола в моче.

Разработанная методика была валидирована по показателям линейности, специфичности, прецизионности и воспроизводимости. Так же был рассчитан предел обнаружения и предел количественного определения, как для кортизола, так и для 6--гидроксикортизола.

Предел обнаружения.

Для определения предела обнаружения готовили следующие образцы.

Для кортизола: готовили серию разведений стандартного раствора кортизола в моче, не содержащей кортизол и 6--гидроксикортизол. Далее проводили экстракцию и хроматографическое определение (см.выше). Предел обнаружения кортизола составил 0,1 нг/мл мочи.

Для 6--гидроксикортизола: готовили серию разведений стандартного раствора 6--гидроксикортизола в моче, не содержащей кортизол и 6--гидроксикортизол. Далее проводили экстракцию и хроматографическое определение (см.выше). Предел обнаружения 6--гидроксикортизола составил 0,5 нг/мл мочи.

Предел количественного определения.

Аналогичным образом для определения предела количественного определения готовили образцы мочи с содержанием кортизола и 6--гидроксикортизола (см.Предел обнаружения).

Минимальная концентрация кортизола в моче, которую было возможно количественно определить по калибровочной кривой, составила 1 нг/мл мочи.

Минимальная концентрация 6--гидроксикортизола в моче, которую было возможно количественно определить по калибровочной кривой, составила 5 нг/мл мочи.

Линейность метода.

Для установления диапазона концентраций кортизола и 6--гидроксикортизола в моче, в которых зависимость их концентрации от площади хроматографических пиков носит линейный характер, были приготовлены следующие растворы.

Для кортизола: помещали 1 мл стандартного раствора кортизола (концентрация кортизола 1 мг/мл) в мерную колбу на 10 мл и доводили до объема фильтрованным 96% этиловым спиртом. Взбалтывали. В 7 пробирок помещали 0 мкл, 10 мкл, 100мкл, 500 мкл, 1000 мкл, 2500 мкл, 5000 мкл полученного раствора.

Концентрации кортизола в полученных растворах приведены в таблице 4.

Таблица 4

Концентрация кортизола в калибровочных растворах

Номер раствора	Концентрация кортизола, нг/мл
1	0
2	10
3	100
4	500
5	1000
6	2500
7	5000

Отбирали из каждой пробирки аликвоту, и проводили экстракцию, как описано выше (см. Процедура экстракции). После проведения экстракции, хроматографировали в тех же условиях, в которых проводят количественное определение. После этого строили калибровочную прямую, и записывали ее характеристики:

коэффициент корреляции (r) = 0,99946 (он больше 0,99, а значит, между анализируемыми величинами имеется прямо пропорциональная зависимость);

уравнение прямой: y = 6,666272x – 0,01298.

Линейность зависимости концентраций была доказана в диапазоне от 10 нг/мл до 5 мкг/мл.

Для 6--гидроксикортизола: помещали 1 мл стандартного раствора 6--гидроксикортизола (концентрация 6--гидроксикортизола 0,1 мг/мл) в мерную колбу на 10 мл и доводили до объема фильтрованным 96% этиловым спиртом. Взбалтывали. В 7 пробирок помещали 0 мкл, 10 мкл, 100мкл, 500 мкл, 1000 мкл, 2500 мкл, 5000 мкл полученного раствора.

Концентрации 6--гидроксикортизола в полученных растворах приведены в таблице 5.

Таблица 5

Концентрация 6--гидроксикортизола в калибровочных растворах

Номер раствора	Концентрация кортизола, нг/мл
1	0
2	1
3	10
4	50
5	100
6	250
7	500

Отбирали из каждой пробирки аликвоту, и проводили экстракцию, как описано выше (см. Процедура экстракции). После проведения экстракции, хроматографировали в тех же условиях, в которых проводили количественное определение. После этого строили калибровочную прямую, и записывали ее характеристики:

коэффициент корреляции: (r) = 0,997775

(он больше 0,99, а значит, между анализируемыми величинами имеется прямо пропорциональная зависимость);

уравнение прямой: y = 0,611729х – 0,075.

Линейность зависимости концентраций была доказана в диапазоне от 1 нг/мл до 0,5 мкг/мл.

Специфичность определения.

У пиков кортизола и 6--гидроксикортизола в определяемых образцах не имелось наслоений другими субстанциями. По времени удерживания пики из исследуемых образцов совпадали с пиками стандартного раствора.

Каждому пику на хроматограмме, полученной от УФ детектора, соответствовал пик, на хроматограмме, полученной от масс-детектора. Причем масс-спектры были специфичны для кортизола и 6--гидроксикортизола.

Прецизионность.

Один и тот же образец с известной концентрацией кортизола и 6--гидроксикортизола анализировали 6 раз подряд в одних и тех же условиях. Полученные результаты отношения концентраций кортизола и 6--гидроксикортизола имели коэффициент вариации 1,07100.

Воспроизводимость.

Образец подвергали повторным исследованиям в разные дни и разными специалистами. Проводили по три измерения. Полученные результаты имели коэффициент вариации 0,90568.

Зависимость активности изофермента CYP 3A4 и изменения отношения кортизола и 6--гидроксикортизола в моче.

Для установления зависимости активности изофермента CYP 3A4 от отношения концентраций эндогенных кортизола и 6--гидроксикортизола в моче проводили серию измерений данного отношения, в динамике при приеме известного индуктора (настойка зверобоя) или ингибитора (грейпфрутовый сок) изофермента CYP 3A4.

Пациенты были разбиты на 3 группы по 24 человека. У каждой группы отбиралась моча, и в ней определялось отношение кортизола и 6--гидроксикортизола с помощью разработанной методики количественного определения. Результаты измерений приведены в таблице 6. Далее, в течение недели, пациенты первой группы принимали настойку зверобоя, в качестве индуктора изофермента CYP 3A4. Пациенты другой группы принимали, так же в течение недели, грейпфрутовый сок, в качестве ингибитора того же изофермента. Третья группа была контрольной – пациенты этой группы не получали ни индукторов ни ингибиторов изофермента CYP 3A4. В результате после измерения у них отношения 6--гидроксикортизола к кортизолу были получены значения, приведенные в таблице 6.

Таблица 6

Отношение 6--гидроксикортизола к кортизолу

	Отношение 6--гидроксикортизола к кортизолу до приема индуктора/ингибитора	Отношение 6--гидроксикортизола к кортизолу после приема индуктора/ингибитора
I группа (прием индуктора)	0,6109	2,3152
II группа (прием ингибитора)	0,6230	0,0417
III группа (контроль)	0,6296	0,6730

Из полученных данных видно, что результаты отношений до и после приема индуктора/ингибитора в I и II группах статистически достоверно различаются, что позволяет использовать разработанную методику определения кортизола и 6--гидроксикортизола в моче с целью оценки активности изофермента CYP 3A4.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведенный информационно-аналитический анализ существующих методик определения активности CYP 3A4 показал, что наиболее часто используемыми на сегодняшний момент методиками оценки активности изофермента CYP3А4 являются MEGX-тест и эритромициновый дыхательный тест. Данные методики обладают рядом недостатков, среди которых введение экзогенных веществ, инвазивность методов (забор крови), возможность возникновения побочных и аллергических реакций.
2. Подобраны условия количественного определения 6--гидроксикортизола и кортизола в моче методом LС-MS. Для экстракции предложен метод жидко-жидкостной экстракции. Данная методика позволяет одновременно определить концентрации кортизола и 6--гидроксикортизола.
3. Проведена валидация разработанной методики по показателям линейности, специфичности, прецизионности и воспроизводимости. Так же был рассчитан предел обнаружения и предел количественного определения, как для кортизола, так и для 6--гидроксикортизола.
4. С помощью данной методики была проведена оценка активности изофермента СYP 3А4 у пациентов.
5. Определено изменение активности CYP 3A4 у пациентов при приеме индукторов и ингибиторов активности данного изофермента. У пациентов принимавших индуктор изофермента CYP 3А4 отношение 6--гидроксикортизола к кортизолу статистически достоверно возросло от 0,6109 до 2,3152. У пациентов принимавших ингибитор изофермента CYP 3А4 отношение 6--гидроксикортизола к кортизолу снизилось от 0,6230 до 0,0417.
6. Разработанная методика количественного определения 6--гидроксикортизола и кортизола в моче методом LС-MS может быть рекомендована для использования оценки изменений активности при приеме индукторов и ингибиторов активности CYP 3A4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сычев Д.А., Аникин Г.С., Александрова Е.К., Шадрина М.В., Смирнов В.В., Раменская Г.В., Кукес В.Г. Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств с фруктовыми соками. Клиническое значение // Клиническая фармакология и фармакоэкономика. – 2008. – № 2. – т.1. – С.57-67.

2. Смирнов В.В. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6--гидроксикортизол в моче // Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». – Санкт-Петербург, 2009. – С.42-43.

3. Смирнов В.В., Раменская Г.В., Красных Л.М. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6--гидроксикортизол в моче // Материалы международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства». – Шымкент, 2009. – т.2. – С.368-370.

4. Смирнов В.В., Раменская Г.В. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6--гидроксикортизол в моче // Клиническая фармакология и терапия. – 2009. – 6 (дополнительный). – С.309-310.

5. Смирнов В.В. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6--гидроксикортизол в моче // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасность». – Москва, 2009. – С. 206-208.

6. Smirnov V.V., Ramenskaya G.V., Sichev D.A., Bubolc A.V., Savchenko A.U., Paukov S.V., Sivkov A.S. Studying of activity of isoenzyme CYP3A4 on cortisol/6 -hydroxycortisol ratio in human urine // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. – Edinburg, UK, 2009. – p. 107.

7. Smirnov V.V., Ramenskaya G.V., Savchenko A.U. Methods for determination 6 -hydroxycortisol/cortisol ratio in human urine by LC-MS // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. Copenhagen, Denmark, 2010 p. 33.

8. Смирнов В.В., А.Ю. Савченко, Г.В. Раменская Разработка методики количественного определения эндогенного кортизола и 6--гидроксикортизола в моче с целью определения активности изофермента CYP 3A4 // Биомедицина. – № 4. - 2010. – С.56-60.