Оценка эквивалентности in vitro воспроизведенных нестероидных противовоспалительных средств ii класса биофармацевтической классификационной системы

На правах рукописи

КУЛИНИЧ

Юлия Игоревна

ОЦЕНКА ЭКВИВАЛЕНТНОСТИ IN VITRO ВОСПРОИЗВЕДЕННЫХ НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ

II КЛАССА БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ

КЛАССИФИКАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

Казьмина Эма Максимовна доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова
Каленикова Елена Игоревна доктор фармацевтических наук, доцент, заведующая кафедрой фармации, заместитель декана по учебной работе факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет

Защита состоится: « » 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова (117997, г.Москва, Нахимовский проспект д. 49).

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.09

доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрировано к медицинскому применению большое количество воспроизведенных лекарственных средств (ЛС), доля которых согласно данным розничного аудита колеблется от 77 до 95% (Рейхарт Д.В., 2010 г.; Давыдова К.С., 2011 г.). Воспроизведенное ЛС, в соответствии с Федеральным Законом от 12.04.2010 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», – это ЛС, содержащее такую же фармацевтическую субстанцию или комбинацию таких же фармацевтических субстанций, в такой же лекарственной форме (ЛФ), что и оригинальное (инновационное) ЛС, и поступившее в обращение после поступления в обращение оригинального ЛС. Преимущество воспроизведенных ЛС заключается в относительно невысокой стоимости по сравнению с инновационным ЛС, поскольку создание и регистрация воспроизведенного ЛС требует меньшего объема исследований и соответственно меньше материальных затрат, которые необходимы при разработке, исследовании и внедрении на рынок нового оригинального ЛС.

Важной задачей регуляторных органов здравоохранения является обеспечение надлежащего контроля и организации проведения исследований, которые подтверждают эффективность, безопасность и качество ЛС, в том числе и воспроизведенных. Эквивалентность эффективности и безопасности инновационного и воспроизведенного ЛС обеспечивает их терапевтическую эквивалентность. В РФ с целью установления взаимозаменяемости инновационного и воспроизведенного ЛС проводят исследования биоэквивалентности. В настоящее время за рубежом для ряда воспроизведенных ЛС такую оценку взаимозаменяемости возможно установить на основании сравнительных испытаний in vitro, которые включают в себя изучение биофармацевтических свойств лекарственных веществ (ЛВ), рассмотрение состава вспомогательных веществ, определение скорости растворения и оценку эквивалентности профилей растворения (FDA, 2000 г.; ВОЗ, 2006 г.; EMA, 2010 г.). Подобное установление взаимозаменяемости воспроизведенного с оригинальным или, в случае его отсутствия на фармацевтическом рынке, с широко распространенным референтным ЛС называется процедурой «биовейвер», в основе которой лежит Биофармацевтическая Классификационная Система (БКС) ЛВ. В РФ в сентябре 2010 года для производителей предложены Методические Рекомендации для оценки результатов изучения сравнительной кинетики растворения ЛС, а также эквивалентности in vitro генерических ЛС согласно процедуре «биовейвер» (Утверждены Росздравнадзором, 2010 г.), которые описывают порядок ее проведения.

В РФ направление «биовейвер» в настоящее время интенсивно развивается, перспективы его использования в фармацевтической регуляторной практике имеют большое значение с учетом гармонизации требований в рамках Таможенного союза, с Европейским союзом и FDA. В связи с вышесказанным тема представляется актуальной.

Цель исследования – оценить эквивалентность in vitro воспроизведенных нестероидных противовоспалительных средств II класса Биофармацевтической Классификационной Системы.

Задачи исследования:

1) изучить биофармацевтические свойства ибупрофена, кетопрофена и пироксикама на основании анализа данных, имеющихся в литературе;

2) разработать новые методики определения биофармацевтической растворимости субстанций ибупрофена, кетопрофена и пироксикама;

3) провести сравнительную оценку состава вспомогательных веществ изучаемых ЛС ибупрофена, кетопрофена и пироксикама с учетом биофармацевтических аспектов;

4) подобрать оптимальные условия изучения сравнительной кинетики растворения ЛС ибупрофена, кетопрофена и пироксикама;

5) определить скорость растворения и степень высвобождения ибупрофена, кетопрофена и пироксикама из ЛФ;

6) провести валидацию разработанных методик изучения сравнительной кинетики растворения для исследуемых ЛС;

7) провести комплексный анализ полученных данных и сделать заключение об эквивалентности in vitro согласно процедуре «биовейвер» для изучаемых ЛС.

Научная новизна. Впервые проведена оценка эквивалентности in vitro для воспроизведенных нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) II класса БКС ибупрофена, кетопрофена и пироксикама в соответствии с процедурой «биовейвер». По результатам серии экспериментов показано, что ЛВ II класса БКС, обладающие слабыми кислотными свойствами, являются потенциальными кандидатами для проведения процедуры «биовейвер».

Результаты данного исследования были отмечены Дипломом победителя в номинации «фармация» Открытого конкурса научных работ молодых ученых – медиков, проводимого в рамках научно – практической конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени – поиск инноваций».

Практическая значимость результатов исследования. Методики изучения сравнительной кинетики растворения внедрены в работу филиала «Клиническая фармакология» Научного Центра Биомедицинских Технологий РАМН и в ООО «Технология лекарств».

В сотрудничестве с Международной Фармацевтической Федерацией (FIP) подготовлены проекты монографий по биовейверу на кетопрофен (Biowaiver Monographs for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms: Ketoprofen) и пироксикам (Biowaiver Monographs for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms: Piroxicam). Монография на кетопрофен успешно прошла этап рецензирования специальной группы FIP по БКС и процедуре «биовейвер», монография на пироксикам находится в рассмотрении.

Апробация работы проведена на кафедре фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (27 декабря 2011 г.).

Основные результаты работы доложены и обсуждены на II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (г. Москва, октябрь 2010 г.); VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва, октябрь 2010 г.); Всероссийской конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (г. Санкт-Петербург, декабрь 2010 г.), Итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (г. Москва, январь 2011 г.); 66-й Региональной конференции по фармации и фармакологии (г. Пятигорск, январь 2011 г.); VII научно – практической конференции «Биомедицина и биомоделирование» (г. Москва, май 2011 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично разработаны методики, проведена аналитическая и статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от экспериментально - теоретической реализации поставленных задач до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 7 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ и 2 – в иностранных журналах.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ имени И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Номер государственной регистрации: 01.2.006 06352.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты оценки биофармацевтических свойств ибупрофена, кетопрофена и пироксикама.

2. Методики изучения сравнительной кинетики растворения для ЛС ибупрофена, кетопрофена и пироксикама.

3. Результаты оценки эквивалентности in vitro ЛС ибупрофена, кетопрофена и пироксикама в соответствии с процедурой «биовейвер».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), выводов к разделу обзор литературы, материалов и методов (глава 2), экспериментальной части (глава 3), общих выводов, списка литературы и 11 приложений. Диссертация включает 19 таблиц и 20 рисунков. Библиографический список содержит 118 источников, из них 86 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования, приборы и реактивы

Объекты исследования:

Ибупрофен, ОАО «Биосинтез» (г. Пенза)	Таблетки, покрытые оболочкой, 200 мг
Ибупрофен, ОАО «Татхимфармпрепараты» (г. Казань)
Кетонал, Lek d.d. (Словения)	Капсулы, 50 мг
Фламакс, Replekpharm A.D. (Республика Македония)
Пироксикам, Sopharma A.D. (Болгария)	Капсулы, 10 мг
Пироксикам, ООО «Производство Медикаментов» (г. Ростов-на-Дону)

Все ЛС разрешены к медицинскому применению и были приобретены в розничной сети (аптеки).

В работе использовались стандартные образцы ибупрофена (USP Ibuprofen RS, Cat.№1335508), кетопрофена (USP Ketoprofen RS, Cat.№1356632) и пироксикама (Piroxicam CRS EDQM, Cat.№ P2130000).

Реактивы: солянокислый буферный раствор рН 1,2; ацетатный буферный раствор рН 4,5; фосфатный буферный раствор рН 6,8 (методики приготовления согласно Европейской Фармакопее 6.0); этанол 96%.

Аппаратура: прибор DT 600 H (ERWEKA, Германия), тип «Лопастная мешалка» и «Вращающаяся корзинка», аналитические весы ED224S (Sartorius, Швейцария), рН метр PH-744 (MetroHm, Швейцария), магнитная мешалка RH Basic 2 (IKA, Германия), шейкер «Vortex» Reax Top (Heidolph, Германия), УФ-спектрофотометр Agilent 8453 (Agilent technologies, США), ультразвуковая баня Sonorex Digitec DT 31 H (Bandelin, Германия).

Биофармацевтические свойства

Изучение биофармацевтических свойств для исследуемых НПВС проводилось на основании литературных и экспериментальных данных.

Растворимость

Определение биофармацевтической растворимости проводили в соответствии с требованиями руководства FDA «Guidance for Industry: Waiver of in Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics>

Методики определения биофармацевтической растворимости

- для субстанции ибупрофена

400 мг (точная навеска) субстанции ибупрофена помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл. Доводили средой растворения до метки. Испытание проводили в солянокислом, ацетатном и фосфатном буферных растворах. Колбы помещали на 24 часа в ультразвуковую баню при температуре 37оС. Полученный раствор фильтровали через фильтр «синяя лента». Полученные пробы для фосфатного буферного раствора разбавляли средой растворения в 6 раз. Для каждого значения рН готовили стандартный раствор ибупрофена в соответствующем буферном растворе в концентрации 1,6 мг/мл. Концентрацию ибупрофена в исследуемых образцах определяли на УФ-спектрофотометре при длине волны 264 нм. В качестве раствора сравнения использовали соответствующий буферный раствор.

- для субстанции кетопрофена

50 мг (точная навеска) субстанции кетопрофена помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл. Доводили средой растворения до метки. Испытание проводили в солянокислом, ацетатном и фосфатном буферных растворах. Колбы помещали на 24 часа в ультразвуковую баню при температуре 37оС. Полученный раствор фильтровали через фильтр «синяя лента». Полученные пробы для ацетатного и фосфатного буферных растворов разбавляли средой в 5 раз. Для каждого значения рН готовили стандартный раствор кетопрофена в соответствующем буферном растворе в концентрации 0,2 мг/мл. Концентрацию кетопрофена в исследуемых образцах определяли на УФ-спектрофотометре при длине волны 260 нм. В качестве раствора сравнения использовали соответствующий буферный раствор.

- для субстанции пироксикама

20 мг (точная навеска) субстанции пироксикама помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл. Доводили средой растворения до метки. Испытание проводили в солянокислом, ацетатном и фосфатном буферных растворах. Колбы помещали на 24 часа в ультразвуковую баню при температуре 37оС. Полученный раствор фильтровали через фильтр «синяя лента». Полученные пробы для ацетатного и фосфатного буферных растворов разбавляли средой в 5 раз. Для каждого значения рН готовили стандартный раствор пироксикама в концентрации 0,08 мг/мл. Концентрацию пироксикама в исследуемых образцах определяли методом УФ-спектрофотометрии при следующих длинах волн: 242 нм для солянокислого буфера, 250 нм для ацетатного буфера и 253 нм для фосфатного буфера. В качестве раствора сравнения использовали соответствующий буферный раствор.

Методика определения равновесной биофармацевтической растворимости субстанции пироксикама в приборе для теста «Растворение»

Равновесную растворимость пироксикама определяли на приборе «Лопастная мешалка» при 200 об/мин. Среды растворения – солянокислый, ацетатный и фосфатный буферный раствор, объем среды 500 мл, температура 37оС. Испытание проводили в трех повторностях для каждой из сред растворения. В емкость для растворения вносили субстанцию пироксикама в количестве, превышающем предполагаемую растворимость (около 1000 мг). Последовательный отбор проб проводили через 2, 3 и 4 часа. Для каждого значения рН готовили стандартный раствор пироксикама в концентрации 0,02 мг/мл. Количественное определение пироксикама осуществляли методом УФ-спектрофотометрии при следующих максимумах поглощения: 242 нм для солянокислого буфера, 250 нм для ацетатного буфера и 253 нм для фосфатного буфера. При необходимости отобранные пробы разбавляли средой растворения (в 40 раз для солянокислого и фосфатного буфера) для достижения оптической плотности, пригодной для количественного определения.

В таблице 1 представлены литературные и экспериментально полученные значения растворимости (S) ибупрофена, кетопрофена и пироксикама в диапазоне рН от 1,2 до 6,8 при температуре 37 оС, а также расчет отношения максимальной дозировки ЛВ или высшей суточной дозы к растворимости (D/S). Как видно из представленной таблицы, ибупрофен и кетопрофен при значении рН, которое соответствует физиологическому значению рН желудка, обладают «низкой растворимостью», а при значениях рН 6,8 характеризуются «высокой растворимостью». Наблюдались существенные различия в значениях растворимости пироксикама для солянокислого буферного раствора.

Таблица 1

Растворимость ибупрофена, кетопрофена и пироксикама

pH		ИБУПРОФЕН
		Potthast H., 2005				Экспериментальные данные (ультразвуковая баня)
		S, мг/мл	D/S, мл			S, мг/мл	D/S, мл
			400 мг(1)	800 мг*			400 мг(1)	800 мг*
	1,2	-	-	-		0,098	4082(н)	8163(н)
	4,5	0,084	4762(н)	954(н)		0,145	2759(н)	5517(н)
	6,8	3,370	119(в)	237(в)		10,430	39 (в)	77(в)
	pH	КЕТОПРОФЕН
		Sheng J., 2006				Экспериментальные данные (ультразвуковая баня)
		S, мг/мл	D/S, мл			S, мг/мл	D/S, мл
			50 мг(2)	100 мг*			50 мг(2)	100 мг*
	1,2	0,130	385 (н)	769 (н)		0,118	424(н)	847(н)
	4,5	-	-	-		0,332	151(в)	301(н)
	6,8	40,760	1,2 (в)	2,5 (в)		30,680	2(в)	3(в)
	рН	ПИРОКСИКАМ
		Yazdanian M., 2004			Экспериментальные данные
					Ультразвуковая баня		Прибор для теста «Растворение»
		S, мг/мл	D/S, мл		S, мг/мл	D/S, мл	S, мг/мл	D/S, мл
			20 мг(3),*			20мг(3),*		20мг(3),*
	1,2	0,090	222 (в)		1,083	18,5(в)	1,090	18(в)
	4,5	-	-		0,021	971(н)	0,022	909(н)
	6,8	-	-		0,486	41(в)	0,470	42,5(в)

Примечание к таблице 1:

1 - максимальная зарегистрированная дозировка ибупрофена в ЛФ «таблетки покрытые оболочкой»; 2 - максимальная зарегистрированная дозировка кетопрофена в ЛФ «капсулы»; 3 - максимальная зарегистрированная дозировка пироксикама в ЛФ «капсулы»; * - высшая суточная доза; н - «низкая растворимость» (D/S>250 мл); в - «высокая растворимость» (D/S<250 мл).

На основании экспериментальных данных равновесная биофармацевтическая растворимость субстанции пироксикама в физиологическом диапазоне рН (1,2 – 6,8) может быть классифицирована как «низкая». В то же время, его растворимость при низком значении рН переклассифицирована как «высокая». На примере субстанции пироксикама подтверждено, что значения растворимости, полученные при проведении эксперимента на ультразвуковой бане и в приборе для теста «Растворение» совпадают.

Проницаемость

Ибупрофен, кетопрофен и пироксикам быстро и почти полностью абсорбируются в ЖКТ: абсолютная биодоступность составляет более 90 %. В таблице 2 представлены основные сведения по проницаемости изучаемых ЛС в сравнении с эталонными ЛС (из перечня референтных субстанций FDA для оценки кишечной проницаемости), степень проницаемости которых принято считать «высокой».

Таблица 2

Проницаемость ибупрофена, кетопрофена и пироксикама

	Peff in vivo, см/с	Peff in situ, см/с	Papp in vitro, см/с
Ибупрофен	10,00·10-4	Нет данных	53,00·10-6
Кетопрофен	8,70·10-4	1,90·10-4	40,60·10-6
Пироксикам	6,65·10-4	2,26·10-4	46,25·10-6
Эталон «высокой проницаемости»	Метопролол		Пропранолол
	1,5·10-4	0,2·10-4	27,5·10-6
Заключение	Высокая	Высокая	Высокая

Таким образом, согласно литературным и собственным экспериментальным данным, ибупрофен, кетопрофен и пироксикам следует достоверно классифицировать ко II классу БКС.

Состав вспомогательных веществ

Состав вспомогательных веществ представлен в таблице 3. Как видно из данной таблицы, качественный состав таблеток ибупрофена, покрытых оболочкой, и капсул исследуемых ЛС пироксикама сходный, в отличие от капсул ЛС кетопрофена. В состав капсул Фламакса, кроме наполнителей и скользящих веществ, введено еще и поверхностно-активное вещество (натрия лаурилсульфат), которое может повлиять на степень высвобождения кетопрофена при низких значениях рН.

Таблица 3

Состав вспомогательных веществ исследуемых ЛС

Ибупрофен	ОАО «Биосинтез»	ОАО «Татхимфармпрепараты»
	Крахмал картофельный
	Магния стеарат
Кетопрофен	Кетонал, Lek d.d.	Фламакс, Replekpharm A.D.
	Кремния диоксид коллоидный
	Лактоза
	Магния стеарат	Кроскармелоза натрия
		Натрия лаурилсульфат
		Повидон
Пироксикам	Sopharma A.D.	ООО «Производство Медикаментов»
	Целлюлоза микрокристаллическая
	Кремния диоксид коллоидный
	Тальк
	Крахмал пшеничный	Крахмал картофельный
	Магния стеарат
	Глицин

Сравнительная кинетика растворения и скорость растворения

Разработанные условия изучения сравнительной кинетики растворения представлены в таблице 4. Для каждого ЛС проводили 12 параллельных исследований. Профили растворения приведены на рисунках 1 – 8.

Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляли с использованием пакета Microsoft Office Excel 2007 путем расчета среднего значения количества высвободившегося в среду растворения ЛВ и относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 20% для первой точки отбора и 10% для следующих временных значений. Сравнительную оценку эквивалентности кинетики растворения изучаемых ЛС проводили с помощью фактора различия f1 и фактора сходимости f2. Значения фактора f1 должны укладываться в интервал от 0 до 15, а фактора f2 – от 50 до 100. Если за 15 мин высвобождалось более 85% ЛВ из ЛФ, то кинетику растворения считали эквивалентной без математической оценки.

Оценку скорости растворения проводили в соответствии с критериями ВОЗ: «медленное растворение» - за 30 мин в среду растворения переходит менее 85 % ЛВ; «быстрое растворение» - за 30 мин высвобождается более 85% ЛВ; «очень быстрое растворение» - за 15 мин растворяется более 85 % ЛВ. В таблице 5 представлены результаты изучения сравнительной кинетики растворения и определения скорости растворения.

Таблица 4

Условия изучения сравнительной кинетики растворения ЛС

Условия	Ибупрофен	Кетопрофен			Пироксикам
Тип аппарата	Лопастная мешалка (Аппарат USP II)				Вращающаяся корзинка (Аппарат USP I)
Скорость вращения лопасти или корзинки	75 об/мин				100 об/мин
Среда растворения	Солянокислый (рН 1,2), ацетатный (4,5) и фосфатный (рН 6,8) буферные растворы
Объем	900 мл	500 мл				900 мл
Температура	37 оС
Время отбора проб	10, 15, 20, 30, 45, 60 мин (в фосфатном буфере - через 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин			10, 15, 20, 30, 45 мин	10, 15, 20, 30, 45 мин (в ацетатном буфере - через 10, 15, 30, 45, 60 мин)
Количественное определение	УФ-спектрофотометрия
Длина волны	264 нм		260 нм			242 нм (рН 1,2), 250 нм (рН 4,5), 253 нм (рН 6,8)
Концентрация раствора стандарта	0,200 мг/мл		0,011 мг/мл			0,020 мг/мл
Раствор сравнения	Соответствующий буферный раствор

	Рис. 1. Высвобождение ибупрофена рН 4,5
	Рис. 2. Высвобождение ибупрофена рН 6,8
	Рис. 3. Высвобождение кетопрофена рН 1,2
	Рис. 4. Высвобождение кетопрофена рН 4,5
	Рис. 5. Высвобождение кетопрофена рН 6,8
	Рис. 6. Высвобождение пироксикама рН 1,2
	Рис. 7. Высвобождение пироксикама рН 4,5
	Рис. 8. Высвобождение пироксикама рН 6,8

Таблица 5

Эквивалентность профилей растворения и скорость растворения

ЛС	рН	Процент высвобождения, %		Скорость растворения	Эквивалентность профилей
		15 мин	30 мин		f1	f2	Да/Нет
ЛС Ибупрофена производства ОАО «Биосинтез» (Б) и ОАО «Татхимфармпрепараты» (Т)
Б	1,2	Высвобождение не происходит
	4,5	13	26	медленная	рН 4,5
	6,8	93	99	очень быстрая	13	72	Да
Т	1,2	Высвобождение не происходит
	4,5	10	31	медленная	рН 6,8
	6,8	68	95	быстрая	26	24	Нет
ЛС Кетопрофена, Кетонал (К) и Фламакс (Ф)
К	1,2	56	69	медленная	рН 1,2
	4,5	84	91	быстрая	22	41	Нет
	6,8	95	99	очень быстрая	рН 4,5
Ф	1,2	74	80	медленная	3	80	Да
	4,5	85	89	очень быстрая	рН 6,8
	6,8	98	99	очень быстрая	*	*	Да
ЛС Пироксикама производства Sopharma A.D. (S) и ООО «Производство Медикаментов» (П)
S	1,2	97	103	очень быстрая	рН 1,2
	4,5	47	50	медленная	*	*	Да
	6,8	103	108	очень быстрая	рН 4,5
П	1,2	110	114	очень быстрая	7	71	Да
	4,5	42	50	медленная	рН 6,8
	6,8	101	104	очень быстрая	*	*	Да

Примечание. *- факторы различия и сходимости не рассчитывали, так как в течение 15 мин высвобождается более 85 % ЛВ.

Валидация методики изучения сравнительной кинетики растворения

(на примере ЛС кетопрофена)

Специфичность

В емкости с буферным раствором (рН 6,8) помещали пустые капсулы. Проводили тест «Растворение» как описано в методике выше. Время проведения испытания: 45 минут. Измерение на спектрофотометре показало, что оптическая плотность при длине волны 260 нм пустых капсул изучаемых препаратов нулевая. На рисунке 9 представлен спектр пустых капсул в фосфатном буферном растворе, а на рисунке 10 приведен спектр стандартного раствора кетопрофена.

Рис. 9. Спектр пустых капсул

Рис. 10. Спектр стандартного раствора кетопрофена

Прецизионность (повторяемость (сходимость))

Проводили тест «Растворение» как описано выше. По одной капсуле помещали в емкости с соответствующим буферным раствором. Время испытания: 45 минут. Отобранные пробы фильтровали и разбавляли в 10 раз. Измеряли шесть раз оптическую плотность при длине волны 260 нм для каждой пробы. Оценку повторяемости методики осуществляли путем расчета среднего значения оптической плотности и относительного стандартного отклонения. Полученные значения RSD не превышали 0,08 %, что соответствовало критерию приемлемости RSD 2 %.

Линейность

Готовили стандартные растворы кетопрофена в диапазоне концентрации от 50 % до 120 % от номинальной (0,1 мг/мл) в солянокислом (рН 1,2), ацетатном (рН 4,5) и фосфатном (рН 6,8) буферных растворах. Критерий приемлемости R 0,999. Значения оптической плотности растворов стандарта кетопрофена в концентрации от 50 до 120 % представлены в таблице 6.

Таблица 6

Оптическая плотность испытуемых растворов кетопрофена

Концентрация, %	Значение оптической плотности
	рН 1,2	рН 4,5	рН 6,8
0	0	0	0
50	0,34301	0,35731	0,34942
70	0,47951	0,48466	0,50077
90	0,62342	0,63570	0,64900
100	0,72420	0,73412	0,71541
120	0,83905	0,84233	0,86255
R	0,99919	0,99909	0,99990

Правильность

Известное количество стандарта кетопрофена помещали в емкости для растворения с буферным раствором (рН 6,8), так чтобы концентрация составляла 60 %, 80 % и 100 % от номинальной (0,1 мг/мл). Определение проводили при тех же условиях, что и изучение сравнительной кинетики растворения. Фактическое содержание кетопрофена находилось в интервале 98 – 102 %.

Таким образом, разработанная методика характеризуется достаточной чувствительностью и воспроизводимостью и может быть пригодна для изучения сравнительной кинетики растворения ЛС кетопрофена.

Оценка эквивалентности in vitro согласно процедуре «биовейвер»

ЛВ II класса, обладающие слабыми кислотными свойствами, представляют наибольший интерес в изучении эквивалентности in vitro, поскольку именно для них растворение является лимитирующей стадией их попадания в системный кровоток и, скорее всего, должно отражать поведение в условиях in vivo. Критериями эквивалентности in vitro согласно процедуре «биовейвер» для II класса БКС, согласно требованиям ВОЗ, являются:

- ЛВ, которое входит в состав воспроизведенного ЛС, обладает слабыми кислотными свойствами и имеет высокую растворимость при рН 6,8;

- ЛС относится к «быстрорастворимым» (при рН 6,8);

- профили растворения воспроизведенного и референтного ЛС эквивалентны в буферных средах со значением рН 1,2, 4,5 и 6,8 при использовании лопастной мешалки (75 об/мин) или вращающейся корзинки (100 об/мин);

- ЛС имеет сходный качественный и количественный состав вспомогательных веществ;

- отсутствие вспомогательных веществ, влияющих на абсорбцию ЛВ в ЖКТ.

В итоговой таблице 7 представлены результаты оценки эквивалентности in vitro исследуемых НПВС. Как видно из представленной таблицы, изученные ЛС ибупрофена и ЛС кетопрофена являются неэквивалентными in vitro согласно процедуре «биовейвер», в отличие от ЛС пироксикама для которых такая эквивалентность установлена.

Таблица 7

Оценка эквивалентности in vitro исследуемых НПВС

Критерий	Ибупрофен	Кетопрофен	Пироксикам
рКа	4,4	4,5	рКа1 1,86; рКа2 5,46
Растворимость	низкая	низкая	низкая
Проницаемость	высокая	высокая	высокая
Скорость растворения при рН 6,8	быстрая	очень быстрая	очень быстрая
Эквивалентность профилей растворения при рН 1,2; рН 4,5; рН 6,8	Нет	Нет	Да
Качественный состав вспомогательных веществ	Сходный	Различный	Сходный
Присутствие вспомогательных веществ, влияющих на абсорбцию	Нет	Да	Нет
Соответствие критериям эквивалентности	Нет	Нет	Да

Общие выводы

1. Изучены биофармацевтические свойства ибупрофена, кетопрофена и пироксикама на основании данных полученных их литературных источников и экспериментальным путем. Показано, что исследуемые ЛВ характеризуются «низкой» растворимостью и «высокой» проницаемостью.

2. Разработаны новые методики определения биофармацевтической растворимости ибупрофена, кетопрофена и пироксикама на ультразвуковой бане, а также дополнительно для пироксикама - в приборе для теста «Растворение».

3. Рассмотрен состав вспомогательных веществ изучаемых ЛС. Качественный состав таблеток ибупрофена, покрытых оболочкой, и капсул исследуемых ЛС пироксикама сходный, в отличие от капсул ЛС кетопрофена. По результатам изучения кинетики растворения при рН 1,2 показано влияние натрия лаурилсульфата на скорость высвобождения кетопрофена из капсул Фламакса.

4. Подобраны оптимальные условия проведения изучения сравнительной кинетики растворения для ЛС ибупрофена, кетопрофена и пироксикама. Количественное определение изучаемых ЛС проведено методом УФ-спектрофотометрии.

5. Определена скорость растворения и степень высвобождения ибупрофена из таблеток, покрытых оболочкой, кетопрофена и пироксикама из капсул. Установлено, что ЛС ибупрофена и кетопрофена при рН 6,8 характеризуются «быстрой» и «очень быстрой» скоростью растворения соответственно. Для ЛС пироксикама характерна «очень быстрая» скорость растворения в солянокислом и фосфатном буферных растворах, при рН 4,5 наблюдается «медленное» растворение пироксикама.

6. Проведена валидация разработанных методик изучения сравнительной кинетики растворения для исследуемых ЛС. Доказано, что разработанные методики характеризуются достаточной чувствительностью и воспроизводимостью и могут быть пригодны для изучения сравнительной кинетики растворения.

7. Проведена оценка эквивалентности in vitro исследуемых НПВС. Изученные ЛС ибупрофена и ЛС кетопрофена являются неэквивалентными in vitro согласно процедуре «биовейвер», в отличие от ЛС пироксикама для которых такая эквивалентность установлена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Давыдова К.С., Кулинич Ю.И., Шохин И.Е. Тест «Растворение» в контроле качества лекарственных средств // Ремедиум. 2010. №5. С.42.

2. Шохин И.Е., Раменская Г.В., Кулинич Ю.И. Анализ биофармацевтических свойств и динамики высвобождения in vitro генерических препаратов кетопрофена согласно требованиям ВОЗ // Сборник материалов VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». М., 2010. С.204-205.

3. Кулинич Ю.И. Оценка эквивалентности in vitro генерических лекарственных средств кетопрофена // Биомедицина. 2010. №4. С.97-98.

4. Раменская Г.В., Шохин И.Е., Савченко А.Ю., Кулинич Ю.И., Давыдова К.С. Процедура «биовейвер»: современные подходы и общие рекомендации для оценки эквивалентности in vitro лекарственных средств немедленного высвобождения // Рецепт (Республика Беларусь). 2010. №5. С.33-39.

5. Шохин И.Е., Раменская Г.В., Кулинич Ю.И., Василенко Г.Ф., Давыдова К.С. Кинетика растворения и биофармацевтические свойства лекарственных средств кетопрофена // Фармация. 2010. №8. С.22-25.

6. Кулинич Ю.И., Шохин И.Е., Раменская Г.В. Валидация методики изучения сравнительной кинетики растворения воспроизведенных препаратов кетопрофена // Медицинский Академический Журнал. 2010. Том 10, №5. С.162.

7. Кулинич Ю.И. Процедура «биовейвер» для воспроизведенных лекарственных средств кетопрофена // Тезисы Итоговой всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день». М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. 1 электрон. опт. диск [CD-ROM].

8. Кулинич Ю.И., Раменская Г.В., Шохин И.Е. Сравнительная оценка высвобождения in vitro воспроизведенных лекарственных средств ибупрофена отечественных производителей // Сборник материалов 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии. Пятигорск, 2011. С.409-411.

9. Shohin I.E., Kulinich J.I., Ramenskaya G.V., Vasilenko G.F. Evaluation of In Vitro Equivalence for Drugs Containing BCS>

10. Раменская Г.В., Шохин И.Е., Савченко А.Ю., Кулинич Ю.И., Давыдова К.С. Биофармацевтическая модель оценки взаимозаменяемости воспроизведенных ЛС по их метаболизму и элиминации (BDDCS) // Биомедицина. 2011. №2. С.50-57.

11. Шохин И.Е., Кулинич Ю.И., Раменская Г.В., Кукес В.Г. Важнейшие биофармацевтические свойства лекарственных веществ на стадии абсорбции в ЖКТ (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. 2011. №7. С.37-40.

12. Шохин И.Е., Раменская Г.В., Кулинич Ю.И., Василенко Г.Ф., Давыдова К.С. Определение равновесной биофармацевтической растворимости на примере субстанции пироксикама // Биофармацевтический журнал. 2011. Том 3, №3. С.39-42.

13. Раменская Г.В., Савченко А.Ю., Шохин И.Е., Котлова М.А., Кулинич Ю.И., Василенко Г.Ф., Кукес В.Г. Биофармацевтическая классификация жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств // Фармация. 2011. №5. С.3-11.