Фармацевтический анализ и стандартизация лекарственных форм тропоксина и ладастена - препаратов нейротропного действия

На правах рукописи

ДУДЕНКОВА Мария Евгеньевна

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ Анализ и стандартизация лекарственных форм тропоксина и ладастена - препаратов нейротропного действия

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (г. Москва).

Научный руководитель:

Кандидат фармацевтических наук Грушевская Любовь Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, начальник лаборатории химико – фармацевтических препаратов № 1 Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России Боковикова Татьяна Николаевна

Кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Щепочкина Ольга Юрьевна

Ведущая организация:

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ»)

Защита диссертации состоится « _____ » ___________ 2012 г. в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, строение 1, НИЦ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « _____ » ______________ 2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема головной боли – одна из самых распространенных в современной медицине, при этом значительная роль в возникновении головной боли принадлежит мигрени. В настоящее время существует много препаратов, созданных для облегчения или купирования приступов мигрени, но большинство из них малоэффективны (неспецифические анальгетики) или обладают серьезными побочными эффектами (препараты спорыньи).

Не менее актуальной проблемой в настоящее время является лечение астенических состояний различной этиологии. Для коррекции этих состояний применяются лекарственные средства различных фармакотерапевтических групп, в их числе и психостимуляторы. Вместе с тем для применяемых в мировой практике психостимуляторов характерно нежелательное последействие в виде истощающего влияния и существенного снижения резервных возможностей организма, узкий дозовый диапазон психостимулирующего действия, зависимость фармакологического эффекта как от вида осуществляемой деятельности, так и от исходного состояния субъекта, индивидуальная чувствительность, довольно высокая токсичность и способность вызывать лекарственную зависимость.

Выбор рационального курса лечения указанных заболеваний – сложная проблема, одним из путей решения которой является поиск и разработка новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов с противомигренозной и антиастенической активностью.

В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН были синтезированы лекарственные средства, одно из группы производных оксима тропинона – противомигренозное средство тропоксин, второе, производное адамантана – психостимулятор ладастен. Эффективность этих лекарственных средств подтверждена фармакологическими исследованиями, разработаны твёрдые дозированные лекарственные формы препаратов.

Необходимым условием внедрения новых лекарственных препаратов в медицинскую практику является разработка современных методик их анализа и установление экспериментально обоснованных норм, позволяющих поддерживать их качество на современном уровне эффективности и безопасности.

Цель исследования. Целью исследований являлось изучение физико-химических свойств, разработка современных методик фармацевтического анализа и стандартизации лекарственных форм препаратов нейротропного действия тропоксина и ладастена и создание соответствующих нормативных документов – проектов фармакопейных статей предприятия (ФСП).

Задачи исследования

1. Изучить физико-химические свойства и спектральные характеристики лекарственных форм тропоксина и ладастена для дальнейшей оценки их фармакопейных показателей качества;
2. Изучить хроматографическую подвижность исследуемых лекарственных средств, полупродуктов их синтеза, продуктов деструкции с помощью методов тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной (ВЭЖХ) хроматографии;
3. Разработать методики качественного и количественного анализа тропоксина и ладастена в лекарственных формах;
4. Провести изучение стабильности лекарственных форм тропоксина и ладастена, определить условия их хранения и сроки годности;
5. Установить экспериментально обоснованные нормы качества лекарственных форм тропоксина и ладастена, оформить проекты фармакопейных статей предприятия на эти препараты.

Научная новизна. Изучены физико-химические свойства и спектральные характеристики лекарственных форм тропоксина и ладастена, их хроматографическая подвижность методами изократической и градиентной ВЭЖХ. Подобраны оптимальные условия, позволяющие разделить действующие вещества, их промежуточные продукты синтеза, продукты разложения и неидентифицированные примеси. Показана возможность использования разработанных методов в качественном и количественном анализе, как субстанций, так и лекарственных форм тропоксина и ладастена.

Изучена стабильность таблеток тропоксина и ладастена, полученных прямым прессованием, и таблеток ладастена, полученных влажным гранулированием. Показано, что таблетки тропоксина, полученные прямым прессованием, и таблетки ладастена, полученные как прямым прессованием, так и влажным гранулированием, выдерживают хранение методом «ускоренного старения», предварительный срок годности составил 2 года.

Практическая значимость работы

Разработаны методики фармацевтического анализа лекарственных форм ладастена и тропоксина. По результатам проведенных исследований установлены научно-обоснованные нормы качества и сроки годности этих препаратов.

На основании проведенных исследований разработаны два проекта ФСП на лекарственные формы: таблетки тропоксина 50 мг, полученные прямым прессованием и таблетки ладастена 50 мг, полученные прямым прессованием.

Утверждена ФСП на ладастен, таблетки 50 мг (ФСП 42-9474-08, ЗАО «ЛЕККО»).

Апробация работы

Основные результаты проведенных исследований были представлены на межлабораторных конференциях НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, на X, XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2003, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН в рамках комплексной темы исследований: «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств», номер государственной регистрации 01.2.006.06601.

Личный вклад автора

Экспериментальные исследования выполнены автором лично. Изучены физико-химические свойства, разработаны и валидированы методики фармацевтического анализа лекарственных форм тропоксина и ладастена. Проведена статистическая обработка полученных результатов. Установлены научно обоснованные нормы качества изучаемых лекарственных препаратов и разработаны проекты ФСП.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности 14.04.02 «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Основные положения, выносимые на защиту:

• Результаты изучения физико-химических, спектральных свойств и хроматографической подвижности лекарственных форм тропоксина и ладастена и обоснование использования полученных результатов в анализе качества этих препаратов;
• Методики качественного и количественного анализа лекарственных форм тропоксина и ладастена с валидационными характеристиками;
• Оценка стабильности лекарственных форм ладастена и тропоксина при различных режимах хранения;
• Экспериментальное обоснование норм качества лекарственных форм ладастена и тропоксина.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», двух глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы и трех приложений. Работа изложена на 202 страницах машинописного текста, содержит 49 таблиц и 23 рисунка. Библиография включает 158 источников, из них 107 отечественных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Исследования по разработке методик фармацевтического анализа лекарственных препаратов были проведены на следующих объектах: серийные образцы таблеток тропоксина 50мг, полученные прямым прессованием; образцы субстанции тропоксина, исходные и промежуточные продукты его синтеза (таблица 1); серийные образцы таблеток ладастена 50 мг, полученные прямым прессованием и влажным гранулированием; образцы субстанции ладастена, исходные и промежуточные продукты его синтеза (таблица 2).

В процессе исследований были использованы методы УФ-спектрофотометрии (УФ-СФМ), ТСХ, ВЭЖХ.

Для изучения спектральных характеристик использовали УФ-спектрофотометр UV-1700 (Shimadzu, Япония), Для хроматографического анализа в тонком слое сорбента использовали пластинки Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия). Анализ методом ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Golden System (Beckman, США) со спектрофотометрическими детекторами с переменной длиной волны.

Таблица 1

Структурные формулы тропоксина и веществ-свидетелей

Тропоксин
Исходные и промежуточные продукты синтеза тропоксина: Тропинон (ТН); Оксим тропинона (ОТН); 3,4,5-триметоксибензойная кислота (ТМБК); Этиловый эфир 3,4,5-триметокси-бензойной кислоты (ЭТМБК).	1 2 34

Таблица 2

Структурные формулы ладастена и веществ-свидетелей

Ладастен
Исходные и промежуточные продукты синтеза ладастена: п-броманилин (ПБА); N(2-адамантил)п-бромформанилид (АПБФА)	1 2

Фармацевтический анализ и стандартизация лекарственной формы тропоксина

По внешнему виду таблетки тропоксина белого или белого со слегка кремоватым оттенком цвета плоскоцилиндрической формы без риски. Средняя масса и однородность по массе, а так же распадаемость серийных образцов соответствовали требованиям ГФ СССР XI издания.

Хроматографические методы в анализе чистоты таблеток тропоксин

Исследования хроматографической чистоты таблеток тропоксина проводили с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ.

Анализ методом тонкослойной хроматографии проводили в системе растворителей хлороформ – спирт этиловый 95% – аммиака раствор концентрированный (7:3:0,1). В качестве экстрагента для извлечения тропоксина и примесей из таблеточной массы использовали хлороформ. Обнаружение зон адсорбции исследуемых соединений проводили в УФ-свете при длине волны 254 нм.

В этих условиях величины Rf тропоксина, ТН, ОТН, ТМБК и ЭТМБК составляли около 0,74; 0,54; 0,23; 0,11; 0,45 соответственно. На хроматограмме извлечения из плацебо зон адсорбции не наблюдалось.

Для проверки пригодности хроматографической системы готовили раствор с содержанием РСО тропоксина 0,4 мг/мл и образца примеси ТМБК 0,1 мг/мл. Пригодность хроматографической системы оценивали по следующим параметрам: на хроматограмме раствора ППХС должны четко делились пятна тропоксина и 3,4,5-триметоксибензойной кислоты; величина Rf основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора составляла около 0,74.

В указанных условиях был проведен анализ серийных образцов таблеток тропоксина. На хроматографическую пластинку наносили 10 мкл извлечения из таблеток тропоксина (50 мкг тропоксина). Содержание посторонних примесей в серийных образцах таблеток оценивали визуально, путем сравнения величины и интенсивности зон адсорбции примесей и раствора сравнения образца ТМБК, нанесенного на хроматографическую пластинку в объеме, эквивалентном 0,25 и 0,5 мкг (0,5% и 1,0%).

В образцах таблеток тропоксина были обнаружены примесь ТМБК (Rf0,11) и одна неидентифицированная примесь (Rf0,90) в содержании менее 0,5% каждая. Суммарное содержание примесей не превышало 1,0%.

Хроматографическая подвижность тропоксина и свидетелей исходных и промежуточных продуктов синтеза (ТН, ОТН, ТМБК, ЭТМБК) с помощью метода ВЭЖХ была изучена в подвижных фазах, включавших ацетонитрил, метанол, воду, добавки фосфорной кислоты и 0,1М раствора натрия гидроксида, фосфатных буферных растворов с различными значениями рН.

В результате проведенных исследований были выбраны следующие условия хроматографирования: колонка Ultra C18 BDS 5мкм (250 x 4,6 мм), градиентный режим хроматографирования с применением подвижных фаз (ПФ): 0,02М фосфатного буфера с рН 7,65 и ацетонитрила (85:15, по объему) (ПФА); смесь ацетонитрил ацетонитрила, метанола и 0,02М фосфатного буфера с рН 7,65 (77:77:46, по объему) (ПФ Б). Режим градиента: соотношение ПФ А/ПФ Б от 100:0 до 0:100 за 6 минут, скорость потока – 1 мл/мин, температура колонки комнатная. Аналитическая длина волны (220 нм) лежала в области совпадения максимумов поглощения УФ-спектров тропоксина и примесей.

В выбранных условиях относительные времена удерживания ТН, ОТН, ТМБК, ЭТМБК (относительно тропоксина) составляли 0,50; 0,34; 0,40; 1,12 соответственно. Пределы обнаружения составляли: ТН-2,2 10-3 мкг; ОТН-4,0 10-4 мкг; ТМБК-4,5 10-4 мкг; ЭТМБК-5,25 10-4 мкг; тропоксин-1,0 10-3 мкг.

На модельных смесях тропоксина, свидетелей примесей и плацебо было показано, что пики извлечения из вспомогательных веществ не перекрывают пики тропоксина и примесей и их определению не мешают (рис. 1).

Рисунок 1. Хроматограмма раствора таблеток тропоксина (1 мг/мл) с добавлением веществ-свидетелей: 1-ОТН; 2-ТМБК; 3-ТН; 4-Тропоксин; 5- ЭТМБК (по 0,005 мг/мл каждого соединения).

Для проверки пригодности хроматографической системы готовили раствор с содержанием РСО тропоксина 0,01 мг/мл и образца примеси ТМБК 0,01 мг/мл. Пригодность хроматографической системы оценивали по эффективности хроматографической колонки, рассчитанной по пику тропоксина (не менее 5000 теоретических тарелок), коэффициенту асимметрии пика тропоксина (не более 1,5), относительному стандартному отклонению, рассчитанному для площадей пиков тропоксина в пяти параллельных измерениях (не более 2%) и tотн ТМБК относительно тропоксина (около 0,40).

Оценку содержания примесей в серийных образцах таблеток тропоксина проводили относительно раствора сравнения РСО тропоксина с концентрацией 0,01 мг/мл. В образцах таблеток были обнаружены две примеси (ТМБК и ОТН) и одна неидентифицированная примесь с относительным временем удерживания 0,64. Содержание единичной примеси не превышало 0,05%, суммарное содержание примесей не превышало 0,10%.

Количественное определение таблеток тропоксина

В качестве методов количественного определения тропоксина в таблетках опробованы методы УФ-СФМ и ВЭЖХ.

При разработке методики УФ-СФМ для извлечения тропоксина из таблеточной массы использовали воду очищенную, измерение оптической плотности проводили при длине волны 272 нм, соответствующей положению максимума водных растворов тропоксина.

Извлечение из компонентов плацебо не мешало проведению анализа, поскольку при аналитической длине волны (272 нм) электромагнитное излучение оно практически не поглощало.

На модельных смесях тропоксина и плацебо показано, что линейная зависимость оптической плотности растворов тропоксина от концентрации наблюдается в интервале от 0,001 мг/мл до 0,1 мг/мл; коэффициент корреляции 0,9998. При концентрации тропоксина 0,02 мг/мл оптическая плотность составляла около 0,573, эта концентрация была выбрана как рабочая.

Правильность и сходимость результатов определения оценивали путем анализа модельных смесей плацебо с известным содержанием тропоксина (около 100% от рабочей концентрации). Относительная погрешность методики, определенная на модельных смесях, не превышала 1,0% (см. табл. 3).

Анализ серийных образцов таблеток тропоксина показал, что содержание действующего вещества во всех сериях таблеток соответствовало требованиям ГФ СССР XI издания (50 мг ± 7,5%) и составляло от 0,04978 г до 0,05115 г тропоксина (см. табл. 4).

Таблица 3.

Результаты количественного определения тропоксина в модельных

растворах методом УФ-СФМ

Взято тропоксина, г	0,2004	0,2007	0,1994	0,2005	0,2003
Найдено тропоксина, г	0,2004	0,2006	0,1993	0,2006	0,2005
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,0005 =0,0006 =0,30%	=0,0002 =0,0002 =0,10%	=0,0005 =0,0006 =0,32%	=0,0005 =0,0006 =0,28%	=0,0005 =0,0007 =0,34%

Таблица 4

Результаты количественного определения таблеток тропоксина

методом УФ-СФМ

Номер серии	Серия 1	Серия 2	Серия 3	Серия 4	Серия 5
Содержание, г/табл	0,04978	0,05115	0,05099	0,05065	0,05105
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,4061 =0,504 =0,51%	=0,3754 =0,4660 =0,46%	=0,2184 =0,2711 =0,27%	=0,377 =0,4679 =0,46%	=0,3389 =0,4206 =0,41%

Оценку количественного содержания тропоксина в таблетках методом ВЭЖХ проводили по методике, разработанной для определения посторонних примесей, детектирование – при специфической длине волны – 272 нм.

Прямолинейная зависимость площади пика от концентрации растворов тропоксина наблюдалась в интервале от 0,001 до 0,02 мг/мл; коэффициент корреляции 0,9998. Предел обнаружения тропоксина – 0,01 мкг, предел количественного определения – 0,02 мкг, рабочая концентрация 0,01 мг/мл.

Точность и сходимость методики оценивали путем анализа модельных смесей плацебо с известным содержанием тропоксина (от 80 до 120% от рабочей концентрации). Относительная ошибка разработанной методики, определенная на модельных смесях не превышала 1,1 % (см. табл. 5).

Анализ серийных образцов таблеток показал, что содержание тропоксина в таблетках составило от 0,04978 до 0,05115 г (табл. 6), относительная ошибка определения не превышала 0,5%.

Таблица 5

Результаты количественного определения тропоксина методом ВЭЖХ

на модельных смесях

Взято тропоксина, г	0,0398	0,0424	0,0449	0,0477	0,0502
Найдено тропоксина, г	0,0396	0,0424	0,0450	0,0478	0,0502
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,0003 =0,0004 =1,06%	=0,0003 =0,0004 =0,94%	=0,0003 =0,0004 =0,94%	=0,0003 =0,0004 =0,86%	=0,0003 =0,0005 =0,93%
Взято тропоксина, г	0,0526	0,0551	0,0575	0,0602
Найдено тропоксина, г	0,0529	0,0554	0,0579	0,0603
Метрологические характеристики (Р=95%, n=4)	=0,0003 =0,0004 =0,80%	=0,0003 =0,0005 =0,97%	=0,0003 =0,0005 =0,82%	=0,0002 =0,0003 =0,54%

Таблица 6.

Результаты количественного определения таблеток тропоксина методом ВЭЖХ

Номер серии	Серия 1	Серия 2	Серия 3	Серия 4	Серия 5
Содержание, г/табл	0,0502	0,0509	0,0504	0,0502	0,0504
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,0969 =0,1016 =0,102%	=0,3324 =0,3487 =0,34%	=0,3553 =0,3727 =0,37%	=0,2198 =0,2306 =0,24%	=0,2944 =0,3088 =0,31%

Определение однородности дозирования таблеток тропоксина проводили методом ВЭЖХ в условиях количественного определения. Отклонения по этому показателю всех образцов таблеток тропоксина не превышали норм установленных ГФ СССР XI издания и составляли ± 11%.

Определение показателя «Растворение» проведено на приборе «Лопастная мешалка», скорость вращения мешалки – 100 об/мин, среда растворения – вода очищенная (1000 мл), температура среды растворения 37±0,5 °С. Содержание тропоксина в растворе определяли методом УФ-СФМ при длине волны 272 нм.

За 30 мин из всех образцов таблеток в раствор переходило от 92 до 95% действующего вещества. Кинетика высвобождения тропоксина в среду растворения представлена на рисунке 2.

Таким образом, определение содержания посторонних примесей в препарате возможно проводить и методом ТСХ, и ВЭЖХ, а количественное содержание – с помощью методов УФ-СФМ и ВЭЖХ.

В качестве основного метода для определения показателей «Посторонние примеси» и «Количественное определение» был выбран более селективный метод ВЭЖХ. Определение показателя «Растворение» из-за большого количества проб, экономичнее проводить методом УФ-СФМ.

Рисунок 2. Кривая зависимости высвобождения тропоксина в раствор от времени эксперимента.

Определение подлинности таблеток тропоксина мы предложили проводить с помощью метода УФ-СФМ и ВЭЖХ.

Установление сроков годности таблеток тропоксина

Стабильность таблеток тропоксина, полученных методом прямого прессования, при хранении была изучена методом «ускоренного старения» при 60 С и в естественных условиях, в защищенном от света месте.

Качество таблеток практически не изменялось как при хранении в естественных условиях, так и методом «ускоренного старения» в течение срока, эквивалентного 2 годам естественного хранения. Установлен предварительный срок годности 2 года.

По результатам проведенных экспериментов установлены нормы качества твердой дозированной лекарственной формы таблеток тропоксина 50 мг (табл. 7). Установленные нормы включены в проект ФСП на таблетки тропоксина 50 мг, выполненные методом прямого прессования.

Таблица 7

Нормы качества таблеток тропоксина 50 мг

Показатели	Методы	Нормы
Описание	Визуальный	Таблетки белого или белого со слегка кремоватым оттенком цвета плоскоцилиндрической формы без риски
Подлинность	УФ-СФМ	УФ-спектр поглощения испытуемого раствора тропоксина в диапазоне длин волн от 250 – 350 нм должен иметь максимум поглощения при (272±2) нм
	ВЭЖХ	Времена удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора тропоксина должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора РСО тропоксина
Средняя масса	ГФ XI	От 0,1388 до 0,1613 г (± 7,5%)
Распадаемость	ГФ XI	Не более 15 мин
Однородность дозирования	ВЭЖХ	1/10 ± 15 %; 0/10 ± 25 %
Растворение	ОФС 42-0003-04 УФ-СФМ	Не менее 90% за 30 минут
Посторонние примеси	ВЭЖХ	Единичной примеси – не более 0,2% Суммы примесей – не более 1,0 %
Микробиологи-ческая чистота	ГФ XII	Категория 3А
Количественное определение	ВЭЖХ	От 0,04625 до 0,05375 г/табл (0,05 ± 7,5 %)
Срок годности	2 года
Условия хранения	В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25 °С.

Фармацевтический анализ и стандартизация таблеток ладастена

Исследования проведены на таблетках двух составов, для влажного гранулирования и для прямого прессования, с содержанием ладастена 50 мг.

По внешнему виду таблетки, изготовленные как методом прямого прессования, так и влажным гранулированием представляли собой таблетки белого или почти белого цвета, плоскоцилиндрической формы с риской.

Средняя масса и однородность по средней массе, а так же распадаемость серийных образцов соответствовали требованиям ГФ СССР XI издания.

Хроматографические методы в анализе чистоты таблеток ладастена

Согласно схеме синтеза ладастена, технологическими примесями в его субстанции могут быть адамантан-2-он, N(2-адамантил)п-бромформанилид (АПБФА) и п-броманилин (ПБА). Примесь адамантан-2-она в лекарственной форме мы, посчитали возможным не определять, поскольку в нормативной документации на субстанцию ладастена нормируется ее отсутствие.

Определение хроматографической чистоты таблеток методом ТСХ было проведено на хроматографических пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck) в системе гексан – ацетон (6:1). Для извлечения ладастена из лекарственных форм использовали ацетон. Детектирование проводили в УФ-свете при 254 нм, затем пластинку помещали в камеру, насыщенную парами окислов азота, а затем опрыскивали 0,5% раствором -нафтола в спирте этиловом 95% и помещали в сушильный шкаф при температуре 100 - 105 °С на три минуты.

На модельных смесях ладастена, технологических примесей и плацебо показано, что вспомогательные вещества не мешают извлечению и разделению ладастена и примесей, и не являются источниками дополнительных пятен на хроматограмме.

При анализе серийных образцов таблеток ладастена на линию старта наносили извлечение из таблеток в объеме, эквивалентном 200 мкг ладастена. Содержание примесей оценивали визуально, путем сравнения величины и интенсивности зон адсорбции примесей и растворов сравнения РСО ладастена, нанесенных на хроматографическую пластинку в количестве, эквивалентном 0,4 мкг (0,2%), 0,3 мкг (0,15%), 0,2 мкг (0,1%) и 0,1 мкг (0,05%) ладастена.

Для проверки пригодности хроматографической системы готовили раствор с содержанием РСО ладастена 1 мг/мл и образца примеси ПБА 0,2 мг/мл. Пригодность хроматографической системы оценивали по следующим параметрам: на хроматограмме свидетеля ладастена, нанесенного в количестве 0,1 мкг должна быть четко видна зона его адсорбции; значение Rs п-броманилина относительно ладастена должно быть 0,22±0,03.

При анализе образцов таблеток ладастена двух составов при выпуске примесей обнаружено не было.

Разработку методики ВЭЖХ проводили на стальной колонке Ultra 5 мкм C18 (250 x 4,6 мм) с предколонкой Ultra 5 мкм C18 (30 x 4,6 мм). Хроматографическая подвижность ладастена и идентифицированных примесей была изучена в подвижных фазах, включавших ацетонитрил, метанол, воду, добавки фосфорной кислоты и 0,1М NaOH, фосфатных буферных растворов с различным значением рН. Выбор аналитической длины волны проводили с учетом совпадения максимумов областей поглощения в УФ-области спектра растворов всех исследуемых соединений.

Наилучшего разделения ладастена и примесей удалось в подвижной фазе (ПФ): ацетонитрил – метанол – вода, доведенная до рН 2,50 ± 0,05 фосфорной кислотой (7:2:2) с применением программирования скорости. Скорость потока ПФ – 1 мл/мин в течение 4 мин, затем увеличение от 1 до 1,9 мл/мин за 0,2 мин. Температура колонки комнатная, аналитическая длина волны 245 нм, концентрация испытуемого раствора 1 мг/мл, объем пробы 20 мкл.

В этих условиях относительные времена удерживания АПБФА и ПБА (относительно ладастена) составляли 0,22 и 0,24 соответственно. Пределы обнаружения составляли для АПБФА-0,002 мкг; ПБА-0,0021 мкг; ладастена-0,01 мкг. Хроматограмма серийного образца субстанции ладастена с добавлением свидетелей примесей в содержании 1% от концентрации ладастена в пробе представлена на рисунке 3.

Рисунок 3. Хроматограмма раствора ладастена (1 мг/мл) и свидетелей примесей (1- АПБФА; 2- ПБА, концентрация каждого соединения 0,01 мг/мл)

Для проверки пригодности хроматографической системы готовили раствор с содержанием РСО ладастена 0,01 мг/мл и образца примеси ПБА 0,01 мг/мл. Пригодность системы оценивали по эффективности хроматографической колонки, рассчитанной по пику ладастена (не менее 5000 теоретических тарелок), коэффициенту асимметрии пика ладастена (не более 1,5), относительному стандартному отклонению, рассчитанному для площадей пиков ладастена по пяти измерениям (не более 2%) и относительному времени удерживания ПБА относительно ладастена (0,24±0,01).

Анализ извлечений из плацебо таблеток ладастена двух составов показал, что вспомогательные вещества проведению анализа не мешают.

В указанных условиях был проведен анализ серийных образцов таблеток ладастена. Оценку содержания примесей проводили относительно раствора сравнения РСО ладастена с концентрацией 0,01 мг/мл.

В образцах таблеток обоих составов были обнаружены как идентифицированные (ПБА), так и неидентифицированные примеси (tотн=0,344; 0,484; 0,556 – прямое прессование; tотн=0,344; 0,465; 0,484; 0,556 – влажное гранулирование). Содержание единичной примеси не превышало 0,2%, суммарное содержание примесей не превышало 0,5% (см. табл. 9, 10).

Разработка методов количественного анализа ладастена в таблетках

Для количественного определения ладастена в таблетках двух составов были предложены методы УФ-СФМ и ВЭЖХ.

При разработке методики УФ-СФМ извлечение ладастена из таблеточной массы проводили смесью хлороформ-спирт этиловый 95% (1:99).

Линейная зависимость оптической плотности растворов ладастена от концентрации при длине волны 260 нм (максимум поглощения растворов в УФ-области спектра), наблюдалась в интервале от 0,001 до 0,04 мг/мл (коэффициент корреляции 0,9998), рабочая концентрация 0,01 мг/мл.

Извлечение из плацебо таблеток обоих составов электромагнитное излучение при 260 нм не поглощало и не влияло на полученные результаты.

Таблица 9

Результаты определения содержания посторонних примесей

в таблетках ладастена, полученных методом прямого прессования

Обнаруженные примеси, %		Номер образца таблеток
		Образец 1	Образец 2	Образец 3
ПБА (tотн=0,235)		---	0,007	0,004
Неидентифицированные примеси:	tотн=0,344	0,042	0,053	0,021
	tотн=0,484	0,084	0,054	0,075
	tотн=0,556	0,06	0,04	0,012
Сумма примесей, %		0,186	0,147	0,112

Таблица 10

Результаты определения содержания посторонних примесей

в таблетках ладастена, полученных методом влажного гранулирования

Обнаруженные примеси, %		Номер образца таблеток
		Образец 1	Образец 2	Образец 3
ПБА (tотн=0,235)		0,001	---	---
Неидентифицированные примеси:	tотн=0,344	0,053	0,049	0,055
	tотн=0,465	---	---	0,021
	tотн=0,484	0,094	0,093	0,095
	tотн=0,556	0,045	0,043	0,046
Сумма примесей, %		0,193	0,185	0,217

Точность и сходимость, а также диапазон применения методики оценивали путем анализа модельных смесей плацебо с известным содержанием ледестена (от 80 до 120% от рабочей концентрации ладастена). Относительная ошибка разработанной методики количественного определения содержания тропоксина, определенная на модельных смесях не превышает 1,0 % (табл. 11).

Таблица 11

Результаты количественного определения ладастена методом УФ-СФМ на модельных смесях для таблеток, полученных прямым прессованием

Взято ладастена, г	0,0802	0,0852	0,0905	0,0953	0,1022
Найдено ладастена, г	0,0800	0,0851	0,0905	0,0951	0,1012
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,0002 =0,0002 =0,23%	=0,0002 =0,0002 =0,22%	=0,0001 =0,0001 =0,13%	=0,0001 =0,0001 =0,15%	=0,0003 =0,0004 =0,38%
Взято ладастена, г	0,1037	0,1121	0,1163	0,1225
Найдено ладастена, г	0,1034	0,1118	0,1160	0,1213
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,0002 =0,0003 =0,29%	=0,0004 =0,0005 =0,43%	=0,0003 =0,0003 =0,28%	=0,0005 =0,0006 =0,46%

Количественное содержание действующего вещества во всех серийных образцах таблеток ладастена соответствовало требованиям ГФ СССР XI издания (50 мг ± 7,5%) и составляло от 4,87 до 50,13 мг/табл. (см. табл. 12, 13).

Таблица 12

Результаты количественного определения таблеток ладастена

(прямое прессование) методом УФ-СФМ

Номер серии	Серия 1	Серия 2	Серия 3
Содержание, г/табл	0,05008	0,04897	0,04934
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	= 0,00004 = 0,00005 = 0,11%	= 0,00008 = 0,0001 = 0,21%	= 0,00006 = 0,00008 = 0,16%

Таблица 13

Результаты количественного определения таблеток ладастена

(влажное гранулирование) методом УФ-СФМ

Номер серии	Серия 1	Серия 2	Серия 3
Содержание, г/табл	0,0509	0,0505	0,0501
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	= 0,00032 = 0,0004 = 0,78%	= 0,0004 = 0,0005 = 0,99%	= 0,00036 = 0,00045 = 0,90%

В качестве альтернативного метода определения количественного содержания ладастена в лекарственной форме был применен метод ВЭЖХ.

Исследования проведены на колонке Ultra 5 мкм C18 (250 x 4,6 мм) с предколонкой Ultra 5 мкм C18 (30 x 4,6 мм), в подвижной фазе – ацетонитрил – метанол – вода очищенная, доведенная до рН 2,50 ± 0,05 фосфорной кислотой (7:2:1); скорость потока 1,0 мл/мин; режим элюирования – изократический, аналитическая длина волны – 260 нм.

В этих условиях разделение пиков АПБФА и ПБА происходило не полностью, однако скорость проведения анализа значительно увеличивалась, по сравнению со скоростью анализа при определении посторонних примесей.

Линейная зависимость площадей пиков от концентрации растворов ладастена наблюдалась в интервале от 0,0005 до 0,015 мг/мл; коэффициент корреляции 0,9998. Рабочая концентрация растворов ладастена – 0,01 мг/мл. Предел количественного определения ладастена составлял 0,016 мкг, предел обнаружения – 0,008 мкг.

Точность и сходимость методики оценивали для обоих составов таблеток, путем анализа модельных смесей известных количеств ладастена с плацебо на уровне 80 – 120% от концентрации действующего вещества в испытуемом растворе (0,01 мг/мл). Относительная ошибка разработанной методики количественного определения содержания ладастена в модельных смесях разного состава не превышала 0,5 % (табл. 14, 15).

Содержание ладастена во всех образцах таблеток соответствовало требованиям ГФ XI издания (50 мг ± 7,5%) (см. табл. 16, 17).

Таблица 14

Результаты количественного определения ладастена методом ВЭЖХ

на модельных смесях для таблеток, полученных прямым прессованием

Взято ладастена, г	0,0202	0,0213	0,0225	0,0242	0,0250
Найдено ладастена, г	0,02024	0,02142	0,02233	0,02401	0,02501
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,00001 =0,00002 =0,08%	=0,00002 =0,00002 =0,10%	=0,00005 =0,00006 =0,26%	=0,00008 =0,0001 =0,44%	=0,00003 =0,00004 =0,16%
Взято ладастена, г	0,0263	0,0276	0,0290	0,0300
Найдено ладастена, г	0,02633	0,02725	0,02910	0,02963
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,00004 =0,00005 =0,20%	=0,00003 =0,00004 =0,13%	=0,00006 =0,00007 =0,24%	=0,00009 =0,00011 =0,37%

Таблица 15

Результаты количественного определения ладастена методом ВЭЖХ

на модельных смесях для таблеток, полученных влажным гранулированием

Взято ладастена, г	0,0202	0,0213	0,0224	0,0238	0,0250
Найдено ладастена, г	0,02023	0,02141	0,02231	0,02362	0,02501
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,00001 =0,00002 =0,08%	=0,00002 =0,00003 =0,15%	=0,00005 =0,00006 =0,27%	=0,00002 =0,00003 =0,12%	=0,00004 =0,00005 =0,18%
Взято ладастена, г	0,0265	0,0276	0,0288	0,0300
Найдено ладастена, г	0,02634	0,02762	0,02901	0,02985
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,00004 =0,00005 =0,20%	=0,00005 =0,00007 =0,25%	=0,00003 =0,00004 =0,15%	=0,0001 =0,00012 =0,41%

Подлинность таблеток ладастена обоих составов было предложено определять с помощью методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.

Разработку теста «Растворение» таблеток ладастена проводили на приборе «Лопастная мешалка», скорость вращения – 100 об/мин, температура – 37 ± 1°С. Среда растворения – 2% водный раствор натрия додецилсульфата (NaДС). Объем среды растворения 900 мл. Количественное содержание ладастена в растворе определяли методом УФ-спектрофотометрии при 258 нм.

Из всех образцов таблеток за 300 минут в раствор высвобождалось не менее 60% ладастена. Кинетика растворения представлена на рисунке 4.

Таблица 16

Результаты количественного определения таблеток ладастена

(прямое прессование) методом УФ-спектрофотометрии

Номер серии	Серия 1	Серия 2	Серия 3
Содержание, г/табл	0,04992	0,04891	0,04930
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,00004 = 0,00005 =0,11%	=0,00006 = 0,00008 =0,15%	= 0,00006 = 0,00008 =0,16%

Таблица 17

Результаты количественного определения таблеток ладастена

(влажное гранулирование) методом УФ-спектрофотометрии

Номер серии	Серия 1	Серия 2	Серия 3
Содержание, г/табл	0,05072	0,05015	0,05001
Метрологические характеристики (Р=95%, n=5)	=0,00005 = 0,00006 =0,13%	=0,00004 = 0,00005 =0,10%	= 0,00007 = 0,00008 =0,16%

Рис. 4. Кривая зависимости высвобождения ладастена из таблеток от времени эксперимента

Установление сроков годности таблеток ладастена

Для изучения стабильности таблеток ладастена, полученных прямым прессованием, при хранении, был использован метод «ускоренного старения» при 40 С. Качество препарата по истечении срока хранения, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях, практически не изменилось. Установлен предварительный срок годности 2 года.

Таблетки ладастена, полученные влажным гранулированием, хранили в естественных условиях, в защищенном от света месте. Качество препарата не изменилось при хранении в течение 1 года, исследования продолжаются.

На основании проведенных исследований были установлены предварительные нормы качества таблеток ладастена полученных прямым прессованием и влажным гранулированием, представленные в таблицах 18, 19.

Таблица 18

Нормы качества таблеток ладастена 50 мг, полученных прямым прессованием

Показатели	Метод испытания	Нормы
Описание	Визуально	Таблетки белого или почти белого цвета плоскоцилиндрической формы, с риской
Подлинность	УФ-спектрофотометрия	УФ-спектр испытуемого раствора в области от 200 до 350 нм должен иметь максимум поглощения при (258±2) нм
	ВЭЖХ	Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно совпадать со временем удерживания пика ладастена на хроматограмме раствора стандарта
Средняя масса	ГФ ХI, вып.2, с.154	От 0,185 г до 0,215 г (0,2 ± 7,5%)
Отклонение от средней массы	ГФ ХI, вып.2, с.154	18/20: ± 7,5%; 2/20: ± 15%
Распадаемость	ГФ ХI, вып.2, с.154	Не более 15 мин
Однородность дозирования	ВЭЖХ	1/10 ± 15 %; 0/10 ± 25 %
Посторонние примеси	ВЭЖХ	Единичной примеси: не более 0,2%; сумма примесей: не более 0,5%
Микробиологи-ческая чистота	ГФ ХII	Категория 3А
Растворение	ГФ ХI, вып.2, с.154 и ОФС 42-0003-04, СФМ	Не менее 60% за 240 минут
Количественное определение	ВЭЖХ	От 0,04625 г до 0,05375 г (0,05 ±7,5%)
Срок годности		2 года

Таблица 19

Нормы качества таблеток ладастена 50 мг, полученных влажным гранулированием

Показатели	Метод испытания	Нормы
Описание	Визуально	Таблетки белого или почти белого цвета плоскоцилиндрической формы, без риски
Подлинность	СФМ	УФ-спектр испытуемого раствора в области от 200 до 350 нм должен иметь максимум поглощения при длине волны (258±2) нм
	ВЭЖХ	Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно совпадать со временем удерживания пика ладастена на хроматограмме раствора стандарта
Средняя масса	ГФ ХI, вып.2, с.154	От 0,09 г до 0,110 г (0,1 ± 10 %)
Отклонение от средней массы	ГФ ХI, вып.2, с.154	± 10%
Распадаемость	ГФ ХI, вып.2, с.154	Не более 15 мин
Однородность дозирования	СФМ	1/10 ± 15 %; 0/10 ± 25 %
	ВЭЖХ
Посторонние примеси	ТСХ	Единичной примеси: не более 0,2%; сумма примесей: не более 0,5%
	ВЭЖХ
Микробиологи-ческая чистота	ГФ ХII	Категория 3А
Растворение	ГФ ХI, вып.2, с.154 и ОФС 42-0003-04, СФМ	Не менее 60% за 240 минут
Количественное содержание	СФМ	от 0,04625 г до 0,05375 г (0,05 ± 7,5%)
	ВЭЖХ
Срок годности		2 года

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Впервые изучены физико-химические свойства, спектральные характеристики и основные показатели качества лекарственных форм тропоксина и ладастена.
2. Проведены исследования хроматографического поведения тропоксина и ладастена в лекарственных формах, а также полупродуктов их синтеза и продуктов деструкции методами ТСХ и ВЭЖХ. Разработаны методики определения посторонних примесей в лекарственных формах тропоксина и ладастена.
3. Разработаны методики количественного определения тропоксина и ладастена в таблетках с помощью методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.
4. Разработаны методики проведения теста «Растворение» и установлены нормы качества по этому показателю для таблеток ладастена обоих составов и таблеток тропоксина, изготовленных методом прямого прессования.
5. Изучена устойчивость лекарственных форм тропоксина и ладастена при хранении методом «ускоренного старения» и в естественных условиях, установлены предварительные сроки годности лекарственных препаратов.
6. На основании проведенных исследований установлены нормы качества лекарственных форм тропоксина и ладастена. Разработаны проекты ФСП на препараты.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Караванова Д.Е., Цветкова Е.А., Шаменкова Н.В., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И., Климова Н.В., Прокофьева В.И., Коночкина (Дуденкова) М.Е., Пятин Б.М. Разработка методов анализа субстанции ладастена и сиднокарба при их совместном присутствии // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», тезисы докладов. Москва. 2003. с. 612.
2. Сульдин А.С., Грушевская Л.Н., Блынская Е.В., Коночкина (Дуденкова) М.Е., Волкова М.Ю., Пятин Б.М., Суслина С.Н., Алексеев К.В. Разработка состава и методик анализа таблеток ладастена, полученных прямым прессованием // Вестник Российского Университета Дружбы Народов. 2008. №4. С. 10-15.
3. Коночкина (Дуденкова) М.Е., Грушевская Л.Н., Блынская Е.В., Алексеев К.В., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методик и норм качества таблеток ладастена, изготовленных методом прямого прессования // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», тезисы докладов. Москва. 2010. с. 525.
4. Коночкина (Дуденкова) М.Е., Грушевская Л.Н., Блынская Е.В., Карбушева Е.Ю., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методик и норм качества таблеток тропоксина, изготовленных методом прямого прессования. // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», тезисы докладов. Москва. 2010. с. 525.
5. Коночкина (Дуденкова) М.Е., Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методики определения остаточных растворителей (ОР) в субстанции тропоксина. // 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». Москва. 2010. с. 53.
6. Дуденкова М.Е., Грушевская Л.Н., Сергеева М.С.,Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Алексеев К.В., Блынская Е.В., Карбушева Е.Ю. Разработка методики определения посторонних примесей в субстанции и таблетках тропоксина с помощью ВЭЖХ. // Химико-фармацевтический журнал. 2011. Т.45. № 12. С. 52-56.